CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP (trang 299,300,301)

Quá trình dịch mã tạo ra chuỗi polypeptide được mã hóa bởi cDNA đã nhân bản.

Các vấn đề thực tế để tạo ra các bản sao bằng cách sử dụng một vector biểu hiện. Bất kể vật
chủ là gì, vấn đề then chốt để biểu hiện một gen là chèn gen đó vào vector biểu hiện sao cho quá
trình phiên mã của gen tạo ra mRNA cho protein mong muốn. Trong cách làm được minh hoạ ở
hình 1, cDNA được đưa vào vector biểu hiện bằng cách cắt các vị trí hạn chế ở mỗi đầu của
cDNA bằng BamHI, và chèn cDNA đã được tiêu hóa vào vector được cắt tại vị trí BamHI trong
vị trí nhân bản nhiều lần. Trong thực tế, cDNA được tiêu hoá bằng BamHI có thể được chèn vào
vector theo hai hướng có thể. Theo hướng được trình bày trong Hình 1, cDNA nằm ở hướng
chính xác để quá trình phiên mã tạo ra một mARN mã hóa polypeptide mong muốn. Tuy nhiên,
nếu cDNA được tiêu hoá bằng BamHI được chèn vào vector theo hướng ngược lại, thì mRNA
được phiên mã từ trình tự khởi đầu sẽ bổ sung vào mRNA chính xác. mRNA này không mã hóa
polypeptide mong muốn.

Lập bản đồ giới hạn

Làm cách nào có thể phân biệt được bản sao chính xác với bản sao không chính xác? Một cách
để phân biệt được là bằng cách giải trình tự ADN. Thông thường, các vectơ biểu hiện có các vị
trí liên kết cho các đoạn mồi giải trình tự phổ biến ở bên cạnh nhiều vị trí nhân bản. Điều này
cho phép các nhà nghiên cứu giải trình tự DNA chèn của một bản sao và do đó xác định hướng
của phần chèn vào. Một cách tiếp cận khác là sử dụng lập bản đồ giới hạn, việc xác định số
lượng và vị trí của các vị trí giới hạn đối với một hoặc nhiều enzyme giới hạn trong một đoạn
DNA hoặc bản sao. Kết quả của lập bản đồ giới hạn là một bản đồ giới hạn hiển thị các vị trí và
vị trí của các địa điểm giới hạn được lập bản đồ. Nghĩa là, DNA được tiêu hóa bởi các enzyme
cắt giới hạn, các đoạn được phân tách bởi điện di trên gel agarose, và các mẫu và kích thước của
chúng được sử dụng để xây dựng bản đồ.

Hình 2 minh hoạ một cách lý thuyết việc sử dụng bản đồ giới hạn để phân biệt giữa các bản sao
chính xác và không chính xác. Ví dụ được dựa trên Hình 1. Giả sử cDNA với các trình tự liên
kết BamHI dài 2.000 bp, và chúng ta biết được từ các thí nghiệm giải trình tự rằng có một vị trí
giới hạn cho AatII ("a-a-t-two") dài 1.800 bp từ khi bắt đầu của cDNA. Giả sử chúng ta nhân bản
cDNA này vào vị trí BamHI trong MCS của một vector biểu hiện 3.500-bp có vị trí AatII cách vị
trí BamHI đó 500 bp ngược chiều kim đồng hồ. Nếu cDNA chèn đúng hướng để polypeptide
được mã hoá của nó có thể được biểu diễn, thì chúng ta có được bản sao 5.500-bp ở phía dưới
bên trái của Hình 2. Bản sao có hướng ngược lại, không chính xác nằm ở phía dưới bên phải của
Hình 2. Việc AatII tiêu hóa các dòng vô tính được tạo ra sẽ cho phép chúng ta sàng lọc các dòng
vô tính để xác định đâu là những dòng chính xác cho biểu hiện polypeptide. Nghĩa là, đối với
một bản sao chính xác, quá trình tiêu hóa AatII tạo ra hai đoạn 3.200 và 2.300 bp, trong khi đối
với một bản sao không chính xác, qúa trình tiêu hóa AatII tạo ra hai đoạn 4.800 và 700 bp (xem
Hình 2). Những kết quả thay thế này có thể được phân biệt dễ dàng bằng điện di trên gel agarose.

Nhìn chung, tốt hơn hết là tránh phải xử lí các bản sao có phần chèn sai hướng nếu có thể. Như
chúng ta vừa thấy, nếu một enzyme giới hạn duy nhất được sử dụng để chuẩn bị phần chèn và
vector, thì bất kì dòng vô tính cụ thể nào cũng có thể có phần chèn theo một trong hai hướng có
thể. Tuy nhiên, nếu chúng ta sử dụng hai enzyme cắt giới hạn, ta có thể chèn một đoạn ADN vào
một vector theo một cách có định hướng; nghĩa là, không thể tạo ra một bản sao có hướng ngược
lại, không chính xác của phần chèn bằng cách tiếp cận hai enzyme.
Chúng ta hãy xem lại véc tơ biểu hiện ở Hình 1. Có một vị trí KpnI ("k-p-n-one") gần vùng khởi
động của nhiều trang nhân bản và một vị trí SalI ("Sallone") trong nhiều trang nhân bản gần yếu
tố kết thúc phiên mã. Do đó, nếu chúng ta tạo ra một cDNA với một vị trí KpnI được thêm vào ở
đầu codon khởi đầu và một vị trí SalI được thêm vào ở đầu codon kết thúc, thì cDNA có thể
được chèn vào vector chỉ được tiêu hóa bằng KpnI và SalI theo đúng hướng biểu hiện
polypeptide. Nghĩa là hai đầu dính KpnI có thể ghép đôi và hai đầu dính SalI có thể ghép đôi,
nhưng một đầu dính KpnI không thể ghép đôi với một đầu dính SalI. Cách tiếp cận nhân bản này
thường được gọi là nhân bản cưỡng chế, bởi vì chúng ta "buộc" những mảnh này chỉ kết nối theo
một hướng. Nó còn được gọi là nhân bản định hướng.

Làm thế nào chúng ta có thể tạo ra một cDNA như thế? Hãy nhớ lại rằng khi sử dụng PCR (phản
ứng chuỗi polymerase), chúng ta thiết kế đầu mút của vùng khuếch đại khi thiết kế mồi. Do đó,
thông qua việc thiết kế các đoạn mồi PCR, các vị trí giới hạn có thể được thêm vào các đầu mút
của cDNA trong quá trình khuếch đại DNA (Hình 3). Điểm khởi đầu là một cDNA được tạo ra
từ một mRNA trong phản ứng phiên mã ngược. cDNA đó là bản sao DNA mạch kép của mRNA
mạch đơn. Bằng cách nhân bản cDNA như đã mô tả, trình tự của nó có thể được xác định. Trình
tự này sau đó có thể được sử dụng để thiết kế hai đoạn mồi cho phản ứng PCR. Mồi bên trái
được thiết kế có hai vùng. Một vùng có khoảng hai mươi nucleotide ở đầu 3' có thể bắt cặp bổ
sung với đầu bên trái của cDNA (giống với đoạn mồi PCR), trong khi đầu 5' của đoạn mồi chứa
trình tự của vị trí giới hạn KpnI, không thể bắt cặp bổ sung với cDNA khuôn mẫu (xem Hình 3).
Tương tự, mồi bên phải cũng có hai vùng. 20 nucleotide ở đầu 3 'có thể bắt cặp bổ sung với đầu
bên phải của cDNA, trong khi đầu 5' chứa trình tự giới hạn SalI, không thể bắt cặp bổ sung với
cDNA khuôn mẫu (xem Hình 3). Khi các đoạn mồi này anneal (*) vào khuôn mẫu (xem Hình 3),
enzyme sẽ có thể mở rộng bằng cách sử dụng đầu 3’ của các đoạn mồi.

(*) anneal: các đoạn mồi bám vào sợi ADN khuôn tại vị trí khởi đầu để bắt đầu quá trình tổng
hợp sợi ADN mới.