CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP (trang 299,300,301,302)
Quá trình dịch mã tạo ra chuỗi polypeptide được mã hóa bởi cDNA đã nhân bản.
Các vấn đề thực tế để tạo ra các
bản sao bằng cách sử dụng một
vector biểu hiện. Bất kể vật chủ là gì,
vấn đề then chốt để biểu hiện một gen là
chèn gen đó vào vector biểu hiện sao cho
quá trình phiên mã của gen tạo ra mRNA
cho protein mong muốn. Trong cách làm
được minh hoạ ở hình 1, cDNA được đưa
vào vector biểu hiện bằng cách cắt các vị trí
hạn chế ở mỗi đầu của cDNA bằng BamHI,
và chèn cDNA đã được tiêu hóa vào vector
được cắt tại vị trí BamHI trong vị trí nhân
bản nhiều lần. Trong thực tế, cDNA được
tiêu hoá bằng BamHI có thể được chèn vào
vector theo hai hướng có thể. Theo hướng
được trình bày trong Hình 1, cDNA nằm ở
hướng chính xác để quá trình phiên mã tạo
ra một mARN mã hóa polypeptide mong
muốn. Tuy nhiên, nếu cDNA được tiêu hoá
bằng BamHI được chèn vào vector theo
hướng ngược lại, thì mRNA được phiên mã
từ trình tự khởi đầu sẽ bổ sung vào mRNA
chính xác. mRNA này không mã hóa
polypeptide mong muốn.
Lập bản đồ giới hạn
Làm cách nào có thể phân biệt được bản sao
chính xác với bản sao không chính xác? Một
cách để phân biệt được là bằng cách giải
trình tự ADN. Thông thường, các vectơ biểu
hiện có các vị trí liên kết cho các đoạn mồi
giải trình tự phổ biến ở bên cạnh nhiều vị trí
nhân bản. Điều này cho phép các nhà nghiên
cứu giải trình tự DNA chèn của một bản sao
và do đó xác định hướng của phần chèn vào.
Một cách tiếp cận khác là sử dụng lập bản
đồ giới hạn, việc xác định số lượng và vị trí
của các vị trí giới hạn đối với một hoặc
nhiều enzyme giới hạn trong một đoạn DNA
hoặc bản sao. Kết quả của lập bản đồ giới
hạn là một bản đồ giới hạn hiển thị các vị trí
và vị trí của các địa điểm giới hạn được lập
bản đồ. Nghĩa là, DNA được tiêu hóa bởi
các enzyme cắt giới hạn, các đoạn được
phân tách bởi điện di trên gel agarose, và các
mẫu và kích thước của chúng được sử dụng
để xây dựng bản đồ.
Hình 2 minh hoạ một cách lý thuyết việc sử
dụng bản đồ giới hạn để phân biệt giữa các
bản sao chính xác và không chính xác. Ví dụ
được dựa trên Hình 1. Giả sử cDNA với các
trình tự liên kết BamHI dài 2.000 bp, và
chúng ta biết được từ các thí nghiệm giải
trình tự rằng có một vị trí giới hạn cho AatII
("a-a-t-two") dài 1.800 bp từ khi bắt đầu của
cDNA. Giả sử chúng ta nhân bản cDNA này
vào vị trí BamHI trong MCS của một vector
biểu hiện 3.500-bp có vị trí AatII cách vị trí
BamHI đó 500 bp ngược chiều kim đồng hồ.
Nếu cDNA chèn đúng hướng để polypeptide
được mã hoá của nó có thể được biểu diễn,
thì chúng ta có được bản sao 5.500-bp ở
phía dưới bên trái của Hình 2. Bản sao có
hướng ngược lại, không chính xác nằm ở
phía dưới bên phải của Hình 2. Việc AatII
tiêu hóa các dòng vô tính được tạo ra sẽ cho
phép chúng ta sàng lọc các dòng vô tính để
xác định đâu là những dòng chính xác cho
biểu hiện polypeptide. Nghĩa là, đối với một
bản sao chính xác, quá trình tiêu hóa AatII
tạo ra hai đoạn 3.200 và 2.300 bp, trong khi
đối với một bản sao không chính xác, qúa
trình tiêu hóa AatII tạo ra hai đoạn 4.800 và
700 bp (xem Hình 2). Những kết quả thay
thế này có thể được phân biệt dễ dàng bằng
điện di trên gel agarose.
Nhìn chung, tốt hơn hết là tránh phải xử lí
các bản sao có phần chèn sai hướng nếu có
thể. Như chúng ta vừa thấy, nếu một enzyme
giới hạn duy nhất được sử dụng để chuẩn bị
phần chèn và vector, thì bất kì dòng vô tính
cụ thể nào cũng có thể có phần chèn theo
một trong hai hướng có thể. Tuy nhiên, nếu
chúng ta sử dụng hai enzyme cắt giới hạn, ta
có thể chèn một đoạn ADN vào một vector
theo một cách có định hướng; nghĩa là,
không thể tạo ra một bản sao có hướng
ngược lại, không chính xác của phần chèn
bằng cách tiếp cận hai enzyme.
Chúng ta hãy xem lại véc tơ biểu hiện ở
Hình 1. Có một vị trí KpnI ("k-p-n-one")
gần vùng khởi động của nhiều trang nhân
bản và một vị trí SalI ("Sallone") trong
nhiều trang nhân bản gần yếu tố kết thúc
phiên mã. Do đó, nếu chúng ta tạo ra một
cDNA với một vị trí KpnI được thêm vào ở
đầu codon khởi đầu và một vị trí SalI được
thêm vào ở đầu codon kết thúc, thì cDNA có
thể được chèn vào vector chỉ được tiêu hóa
bằng KpnI và SalI theo đúng hướng biểu
hiện polypeptide. Nghĩa là hai đầu dính
KpnI có thể ghép đôi và hai đầu dính SalI có
thể ghép đôi, nhưng một đầu dính KpnI
không thể ghép đôi với một đầu dính SalI.
Cách tiếp cận nhân bản này thường được gọi
là nhân bản cưỡng chế, bởi vì chúng ta
"buộc" những mảnh này chỉ kết nối theo một
hướng. Nó còn được gọi là nhân bản định
hướng.
Làm thế nào chúng ta có thể tạo ra một
cDNA như thế? Hãy nhớ lại rằng khi sử
dụng PCR (phản ứng chuỗi polymerase),
chúng ta thiết kế đầu mút của vùng khuếch
đại khi thiết kế mồi. Do đó, thông qua việc
thiết kế các đoạn mồi PCR, các vị trí giới
hạn có thể được thêm vào các đầu mút của
cDNA trong quá trình khuếch đại DNA
(Hình 3). Điểm khởi đầu là một cDNA được
tạo ra từ một mRNA trong phản ứng phiên
mã ngược. cDNA đó là bản sao DNA mạch
kép của mRNA mạch đơn. Bằng cách nhân
bản cDNA như đã mô tả, trình tự của nó có
thể được xác định. Trình tự này sau đó có
thể được sử dụng để thiết kế hai đoạn mồi
cho phản ứng PCR. Mồi bên trái được thiết
kế có hai vùng. Một vùng có khoảng hai
mươi nucleotide ở đầu 3' có thể bắt cặp bổ
sung với đầu bên trái của cDNA (giống với
đoạn mồi PCR), trong khi đầu 5' của đoạn
mồi chứa trình tự của vị trí giới hạn KpnI,
không thể bắt cặp bổ sung với cDNA khuôn
mẫu (xem Hình 3). Tương tự, mồi bên phải
cũng có hai vùng. 20 nucleotide ở đầu 3 'có
thể bắt cặp bổ sung với đầu bên phải của
cDNA, trong khi đầu 5' chứa trình tự giới
hạn SalI, không thể bắt cặp bổ sung với
cDNA khuôn mẫu (xem Hình 3). Khi các
đoạn mồi này anneal (*) vào khuôn mẫu
(xem Hình 3), enzyme sẽ có thể mở rộng
bằng cách sử dụng đầu 3’ của các đoạn mồi.
(*) anneal: các đoạn mồi bám vào sợi ADN
khuôn tại vị trí khởi đầu để bắt đầu quá trình
tổng hợp sợi ADN mới.
Hình 2: Ví dụ minh họa về bản đồ vị trí cắt giới hạn để xác định rằng bản sao plasmid chính xác đã được tái
bản
Vùng khởi động
Vectơ biểu
hiện
ADN bổ sung
được tái bản đúng
hướng
Vectơ biểu
hiện đúng
Tuy nhiên, đoạn cắt được tạo ra từ việc kéo dài sẽ
lần lượt được sử dụng như một khuôn mẫu cho
quá trình tiếp theo của PCR, đoạn kéo dài sẽ tạo
một chuỗi bổ sung cho tất cả các đoạn mổi, ngay
cả những đoạn không bám vào sợi ADN khuôn tại
vị trí khởi đầu. Các sản phẩm khuếch đại PCR có
thể được cắt bằng KpnI và SalI, tạo ra một đoạn
lớn (ADN bổ sung-cADN) với hai đầu dính khác
nhau và hai đoạn nhỏ. Đoạn được tinh chế và
được đưa vào trong vectơ biểu hiện được cắt bởi
KpnI và SalI. Sự digestion cũng tạo ra một đoạn
lớn và một đoạn nhỏ (một phần của vùng
Polylinker giữa các vùng cắt giới hạn KpnI và
SalI). Mảnh lớn được tinh chế và sau đó được nối
với đoạn ADN bổ sung đã được khuếch đại tạo ra
bản sao chính xác của chuỗi poly-peptit trong E.
Coli.
VECTƠ NHÂN BẢN PCR
Dường như quá đơn giản để sao chép một đoạn
được tạo ra từ phản ứng chuỗi polymerase vì bạn
Yếu tố kết thúc
phiên mã
ADN bổ sung
ADN bổ sung được
tái bản sai hướng
Vectơ biểu
hiện sai
Được cắt
bởi
cho rằng những mảnh này đã kết thúc với đầu
bằng. Nhưng, thực tế, các polymerase DNA ổn
định ở nhiệt độ cao thường được sử dụng trong
PCR để tạo một đoạn trống chưa được sao mã.
Trong hầu hết các trường hợp này, enzyme này
thêm vào một nucleotit A không bắt cặp ở các đầu
3’ của DNA được tạo ra trong quá trình PCR mà
không được xác định bởi DNA mẫu.Về bản chất,
các phân đoạn PCR được tạo ra bởi các enzym
này có cái mà ta có thể nghĩ là đầu dính nhỏ. Thật
không may, không có một enzyme giới hạn nào
mà ta biết có thể tạo ra một đầu dính phù hợp với
đoạn trống không được sao mã là nucleotit A đơn
lẻ này. Có những vectơ sẵn có được thiết kế để
làm việc với những đầu dính này. Những vectơ
này được đưa đến dưới dạng mạch thẳng với một
nucleotit đơn lẻ ở cuối mỗi đầu 5’.
Hình 3: Ứng dụng của các đoạn mồi đặc biệt trong phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để tạo cái vị trí cắt
hạn chế ở cuối các ADN bổ sung để tái bản thành một vectơ biểu hiện.

ADN bổ sung tái bản

Biến tính ADN và đoạn mồi gắn vào Các đoạn mồi PCR
vị trí mở đầu của sợi ADN khuôn

Vùng KpnI

Vùng SalI

Khuếch đại ADN

ADN bổ sung với vùng Kpnl và SalI

Digest với
Kpnl và SalI

ADN bổ sung với đầu dính để tái bản thành

những vectơ được cắt bởi Kpnl và SalI

VECTƠ CÓ THỂ ĐƯỢC PHIÊN MÃ
Vectơ phiên mã được là một vectơ plasmid có
vùng khởi động cho polymerase ARN bám vào
nằm ở trên vùng polylinker (Hình 4). Các đặc
điểm khác của các vectơ nhân bản plasmid thường
cũng sẽ được biểu hiện nếu vectơ có trong một tế
bào chủ. Vectơ có thể được phiên mã được phát
triển cho quá trình phiên mã in vitro, và, đối với
một vài hệ thống, cũng được sử dụng cho quá
trình in vivo. Ngược lại, vectơ biểu hiện chỉ được
phát triển cho sự biểu hiện in vivo của gen tái bản.
Các vùng khởi động của các vectơ có thể được
phiên mã, do đó, được chọn để cho một ra quá
trình phiên mã hiệu quả của một gen tái bản in
vitro. Thông thường, vùng khởi động đến từ một
trong ba thể thực khuẩn: T7, T3 hoặc SP6. Vùng
khởi động trong Hình 4 là của ARN polymerase
T7. Vì sao ta lại sử dụng vùng khởi động của một
thể thực khuẩn? Chính là vì những enzyme này có
tính hoạt hóa cao và có thể tổng hợp rất nhiều
ARN trong một khoảng thời gian tương đối ngắn.
Để phiên mã một gen tái bản từ một vectơ có thể
được phiên mã in vitro, một mẩu plasmid tinh chế
phải được digested với một enzyme cắt giới hạn ở
một vùng là những gì còn dư lại của vùng
polylinker ở phía dưới của gen (xem hình 4). Việc
này được thực hiện bởi vì thực khuẩn thể ARN
polymerase năng suất hơn trong môi trường in
vitro nếu plasmid không trong trạng thái siêu
xoắn, trường hợp cũng tương tự với những
plasmid undigested.
ARN polymerase T7, NTPs, một chất đệm sinh
học được thêm vào, và phản ứng xảy ra với nhiệt
độ 37 độ C. Các phân tử mARN trong phiên mã
được tổng hợp ở các nucleotit ngay dưới vùng
khởi động và kết thúc ở cuối của plasmid dạng mạch thẳng: đó là, chỉ dưới điểm kết thúc của một
gen được tái bản. Những phân tử mARN được tạo
Hình 4: Một vectơ có thể được phiên mã chứ một đoạn ADN bổ sung. Vectơ có thể phiên mã được này có
vùng khởi động T7 liền kề vùng polylinker (vùng MCS). Vectơ có thể phiên mã được có thể được sử dụng
trong cả môi trường in vitro bằng cách biến chúng thành dạng mạch thẳng và chèn vào ARN polymerase
phù hợp (trong trường hợp này là ARN polymerase T7) và NTPs, hoặc trong môi trường in vivo bằng cách
biến nạp các vectơ này vào tế bào chủ (tế bào chủ trong trường hợp này là E. Coli) mà biểu hiện được ARN
polymerase phù hơp.

Gen quan tâm đến

Vùng MCS Vùng MCS
Vùng khởi động T7

Gen quan tâm đến được tái

bản thành một vectơ phiên
mã

Điểm khởi đầu sao chép

Đối với quá trình phiên mã in Đối với quá trình phiên mã in
vitro, cắt ở vùng sau vùng MCS vivo, biến nạp vào E. coli biểu
để biến thành dạng mạch thẳng hiện ARN polymerase T7

Phiên mã

Phiên mã Phiên mã
Dịch mã Dịch mã

Protein mã hóa
bởi GOI
ARN polymerase
tế bào chủ

Phiên mã
Dịch mã

ra bằng cách này được sử dụng cho những mục xạ. Điều này được thực hiện bằng cách thêm vào
đích khác nhau. Một mục đích đó chính là được quá trình phiên mã chất phóng xạ hoặc những
thêm vào, trong môi trường in vitro các hệ thống NTP đã được sửa đổi để đánh dấu. Ví dụ, về cách
phiên mã ngoại bào nhằm tổng hợp mã polypeptit đánh dấu bằng phóng xạ, 34 P−NTPs rất thông
được mã hóa bởi gen tái bản hoặc ADN bổ sung. dụng.
Các hệ thống ngoại bào là tổ hợp được tinh chế
Đoạn gen hoặc ADN bổ sung tái bản trong một
của axit amin, protein, tARN và những ribosome
vectơ có thể được biểu hiện trong môi trường in
cần thiết cho quá trình phiên mã, nhưng thiếu
vivo nếu đoạn tái bản ấy được biến nạp vào một tế
mARN. Thêm mARN vào giúp hệ thống bắt đầu
bào mà biểu hiện được ARN polymerase cụ thể
hoạt động. Một mục đích khác nữa, đoạn ARN tạo
dành cho vùng khởi động của vectơ (xem hình 4).
ra được sử dụng như là một mẫu dò ADN – probe
Ví dụ, bằng cách biến nạp đoạn tái bản vào tế bào
được gọi là riboprobe – trong nhiều kỹ thuật phân
E. Coli có chứa, thêm vào đó, là một vectơ biểu
tích (một số kỹ thuật sẽ được trình bày sau trong
hiện với gen dành cho ARN polymerase, đoạn gen
chương này). Trong trường hợp này, đoạn ARN
trong vectơ có thể được phiên mã có thể được
được phiên mã phải được đánh dấu, bằng cách sử
phiên mã một cách cụ thể. Đó là, nếu vùng khởi
dụng chất phóng xạ hoặc không sử dụng phóng
động T7 là cụ thể dành cho ARN polymerase T7,
dẫn đến quá trình phiên mã của gen tái bản phụ
thuộc vào sự tổng hợp của ARN polymerase T7.
Trong trường hợp này, quá trình phiên mã diễn ra
từ plasmid dạng vòng, ở trạng thái siêu xoắn. Như
đã nhắc đến từ trước, tính hoạt hóa cao của ARN
polymerase dẫn đến quá trình phiên mã diễn ra
với tần suất cao. Hơn nữa, bởi vì chỉ có vectơ có
thể được phiên mã được biến nạp vào trong tế bào
có vùng khởi động T7, có độ chính xác và cụ thể
nhất định trong quá trình phiên mã vì tất cả ARN
polymerase được tạo ra sẽ phiên mã tạo ra gen tái
bản. Những đoạn mARN được tạo ra bằng cách
này sẽ được dịch mã bởi hệ thống dịch mã của tế
bào để tạo ra nhiều chuỗi polypeptit mã hóa.
Trong môi trường in vivo, quá trình mã hóa của
một gen có thể thực hiện được qua cách này với
bất kì loại tế bào nào mà ARN polymerase có thể
được chèn vào và biểu hiện.