DEPARTAMENT DE FARMACOLOGIA

QUADERN DE PRÀCTIQUES DE FARMACOLOGIA I

3er Curs Grau en Farmàcia

FARMACOLOGIA EXPERIMENTAL
1. DESENVOLUPAMENT DE NOUS FÀRMACS
1. OBJECTIUS
- Proporcionar una visió de la farmacologia experimental, en particular la seua utilitat en el descobriment i desenvolupament de nous
fàrmacs.
- Justificar l’interès de l’experimentació animal i les seues consideracions ètiques.
- Familiaritzar a l’estudiant amb la manipulació d’animals d’experimentació i las vies d’administració de fàrmacs en experimentació animal.

2. CONSIDERACIONS TEÒRIQUES
- Animals d’experimentació: manipulació i vies d’administració de fàrmacs. Consideracions ètiques de l’ús d’animals en experimentació (són
interessants les pàgines web: Societat Espanyola de Ciència dels Animals de Laboratori (www.secal.es) i la Societat Britànica de Defensa
de la Investigació: www.rds-online.org.uk/ethics/index.html).
- Fases preclíniques del desenvolupament de nous fàrmacs.
- Estudis de toxicitat: aguda, crònica, mutagènesi, carcinogènesi y teratogènesi.
- Dosis eficaç 50. Índex terapèutic

2. FARMACOLOGIA DEL SISTEMA NERVIÓS CENTRAL

PROBES DE SCREENING NEUROFARMACOLÒGIC
1. OBJECTIUS
- Familiaritzar a l’estudiant amb l’observació d’algunes de les funcions vitals i de conducta del ratolí.
- Proporcionar una visió de las proves de l’anomenat “screening” farmacològic general, en particular el relacionat amb el sistema nerviós
central i el sistema nerviós autònom.
Activitats
- Assaig de l’acció dels fàrmacs sobre el sistema nerviós central: efecte excitador i depressor.

2. CONSIDERACIONS TEÒRIQUES
- Esquema d’Irwin
- Activitat espontània
- Coordinació motora
- Vigor i coordinació neuromuscular.

3. PROTOCOLS
S'utilitzaran 20 ratolins albí Swiss. Es distribueixen aleatòriament en 5 lots de 4 animals cadascun. A un lot se li injecten per via peritoneal
(i.p.) 0,2 ml de sèrum fisiològic (grup control). A un altre lot se li administren 10 mg/kg del fàrmac en estudi (F) en el mateix volum de sèrum
fisiològic. Als restants lots se'ls administra els fàrmacs de referència: cafeïna (10 mg/kg) , clorpromazina (3 mg/kg) o codeïna (40 mg/kg)
sempre dissolts en 0,2 ml de sèrum fisiològic. Es realitzen les proves que s'indiquen a continuació amb tots els ratolins

1
4. EXPRESSIÓ DE RESULTATS

ACTIVITAT ESPONTÀNIA
Es valora l’activitat espontània mitjançant l’actímetre. Es col·loca cada lot d’animals a l’interior de l’actímetre i desprès d’un període
d’adaptació de 2 minuts, s’anota els moviments que realitzen en un temps determinat (per exemple 5 min).
Es calcula el percentatge d’augment o disminució de l’activitat espontània dels animals tractats respecte als valors del grup control (sèrum
fisiològic):
Xp - Xc
____________ Xc = moviments que realitza el grup control
% AE = x 100
Xc Xp = moviments del grup problema

COORDINACIÓ MOTORA
Es realitza l’assaig en el cilindre rotatori (Rotarod), s’anota el temps que romanen compassant el ritme del seu caminar amb la velocitat de
rotació, fins un màxim de 3 minuts.
S’anoten els resultats. Es calcula el percentatge d’alteració de la coordinació motora dels animals tractats amb clorpromazina respecte al
grup control.
Xp – Xc
% Alteració C.M. = -------------- x 100 Xc = mitjana de temps del grup control
Xc Xp = mitjana de temps del grup problema

VIGOR I COORDINACIÓ NEUROMUSCULAR

L’animal d’experimentació es deixa agafat al centre d’una corda tensa, suspesa per els seus extrems a dos suports fixos separats 60 cm, i
es comença a contar el temps. Es considera que l’animal ha superat la prova quan tarda 1 minut o menys en arribar a un extrem de la corda, al
primer o segon intent.

ESQUEMA D’IRWIN
En l'Esquema d’Irwin es valoren als 60 min els paràmetres indicats per als ratolins tractats amb fàrmacs, comparant amb l’activitat dels
animals control (tractats amb sèrum fisiològic). S’expressa en una tabla, assignant a cada una de les proves una puntuació, per tal de deduir el
perfil de cada fàrmac. Els valors per als animals control ja estan escrits en la taula. Quan la puntuació normal és de 4: el valor per al grup de
tractament podria ser 4 (si la resposta és similar a la del grup de control), 0-3 (si la resposta es redueix respecte al grup control), o 5 -8 si la
resposta és augmentada respecte al grup control. Quan la puntuació normal és 0, això indica que un comportament normal seria l'absència
d'aquesta resposta. En aquest cas, el valor per al grup de tractament podria ser 0 (si similar al control de grup), o 1-8 (si la resposta és
augmentada respecte al grup control). S'analitza l'activitat del fàrmac (F) respecte al control i als fàrmacs de referència.

2
 .

PERFIL COMPORTAMENT

Fàrmacs a assajar i dosis:

ANIMAL D EXPERIMENTACIÓ
CLORPROMAZINA
Fàrmac (F)

NORMALS
CODEÏNA

CAFEÏNA

VALORS
60 min

60 min

60 min

60 min
’

Estat d’alerta

Vigilància
4
Estereotípia
0

Passivitat
0

Neteja

Espècie
Ànim
4

Intranquil·litat
0

Irritabilitat/agressivitat
0

Por

Activitat
motora
0

Activitat espontània

PERFIL NEUROLÒGIC
4

Resposta al tacte
4

Excitació SNC

ESQUEMA D IRWIN
Sobresalt al soroll
0

Fenomen de Straub
0

Tremolor
0

Vehicle:
’
Coordinació To

Convulsions
motora muscular
0

Pes:
Reflex d'adreçament
0

Incoordinació en la marxa
0

To m. d’extremitats
4

Força prensora
4

Reflexes

Reflex ipsolateral flexor

4

Reflex corneal
4

R. en el pavelló auricular
4

PERFIL S.N. AUTÒNOM

Mida de pupil·la
Via d’ administració:
4

Apertura palpebral
Sistema nerviós autònom
4

Exoftàlmies
0

Micció
0

Sialorrea
0

Piloerecció
0

Hipotèrmia
0

Freqüència i amplitud
4

respiratòria

3
3. ANÁLISI DE LA INTERACCIÓ FUNCIONAL FÀRMAC-RECEPTOR
AGONISME I ANTAGONISME COMPETITIU
1. OBJECTIUS
- Quantificar l’efecte d’un fàrmac agonista y la seua modificació per un fàrmac antagonista competitiu.
- Calcular els paràmetres característics d'aquests fàrmacs a partir dels resultats experimentals..
Activitats
- Realitzar les corbes dosi-resposta i calcular gràficament els paràmetres característics de l'agonista i l'antagonista.

2. CONSIDERACIONS TEÒRIQUES
- Quantificació de les interaccions fàrmac-receptor i resposta produïda
- Muntatge de la preparació (intestí) i protocol d'obtenció de les corbes concentració-resposta.
- Antagonisme competitiu entre acetilcolina i atropina a nivell de receptors muscarínics.
- Anàlisi del registre i construcció de la gràfica:% Efecte respecte a logaritme de la concentració molar de l'agonista.
- Càlcul de: concentració de l'agonista que produeix el 50% del seu efecte màxim (CE50), potència de l'agonista (pEC50 = pD2) i potència de
l'antagonista competitiu (pA2). Demostració del caràcter competitiu de l'antagonista.

3. PROTOCOL
Preparació de solucions:
a) Solució nutrícia: Tyrode
b) Clorhidrat d'acetilcolina (PM=181,66).
A partir d'una solució d'acetilcolina 10-2 M, , prepareu les següents solucions:
Solució 9: es prenen 300 µl de la solució 10-2 M i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 8: es prenen 100 µl de la solució 10-2 M i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 7: es prenen 100 µl de la solució 9 i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 6: es prenen 100 µl de la solució 8 i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 5: es prenen 100 µl de la solució 7 i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 4: es prenen 100 µl de la solució 6 i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 3: es prenen 100 µl de la solució 5 i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 2: es prenen 100 µl de la solució 4 i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
Solució 1: es prenen 100 µl de la solució 3 i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
De cadascuna d'aquestes solucions s'afegeix 0,15 ml al bany d'òrgans de 15 ml (segons es descriu en l'apartat “Protocol d'obtenció de la
corba concentració-resposta (CCR)”). Calculeu les concentracions molars d'acetilcolina en el bany d'òrgans.
c) Atropina: sulfat d'atropina (PM = 694,8). Es pren 1 ml de sulfat d'atropina (1mg/ml) i es dilueix fins a 100 ml amb Tyrode i es preparen les
següents solucions:
Solució II: es prenen 0,5 ml de la solució anterior i es dilueix fins 14,3 ml amb Tyrode (professor)
Solució I: es prenen 0,1 ml de la solució II i es dilueix fins a 1 ml amb Tyrode
De cadascuna d'aquestes solucions s'afegeix 0,15 ml al bany d'òrgans de 15 ml (segons es descriu en l'apartat “Protocol d'obtenció de la
corba concentració-resposta”). Calculeu les concentracions molars d'atropina al bany d'òrgans.

Protocol d'obtenció de la corba concentració-resposta (CCR)

CORBES DE L’AGONISTA (CCR A i CCR B):
Addicioneu concentracions acumulatives creixents de les diferents solucions d'acetilcolina (0,15 ml de cada solució en un bany de 15 ml,
començant amb la solució 1 fins a la solució 9). Cada concentració s'afegeix al bany un cop assolit l'efecte màxim de l'anterior. Anoteu el valor
de la contracció observada al registre (g) en cada cas. En finalitzar l'addició de totes les concentracions, es renta la preparació amb líquid
Tyrode per eliminar l'agonista del medi, de manera que l'òrgan recuperarà el to basal inicial. Repetiu la corba concentració-resposta per
demostrar que la resposta farmacològica de la preparació és reproduïble.

4
CORBA DE L’AGONISTA EN PRESÈNCIA DE L'ANTAGONISTA
Després del rentat de la preparació i un cop estabilitzada la línia basal, s'afegeix 0,15 ml de la solució l'antagonista atropina I i es deixa
actuar durant 5 minuts. A continuació i sense rentar el preparat, es realitzarà una corba concentració-resposta de l'agonista, tal com s'ha
comentat en l'apartat anterior.
Aquest protocol s'ha de fer utilitzant diferents concentracions de l'antagonista, obtenint 2 corbes concentració-resposta de l'agonista en
presència de concentracions creixents de l'antagonista:
- CCR C: Corba d'acetilcolina en presència d'atropina (solució I)
- CCR D: Corba d'acetilcolina en presència d'atropina (solució II)

4. EXPRESSIÓ DE RESULTATS
Les concentracions molars en copa d'acetilcolina es transformen en logaritmes. En el registre mesurem l'efecte farmacològic (contracció
expressada en g) que es va obtenir en presència de cadascuna de les concentracions de agonista. Els efectes es transformen en % respecte a
l’efecte màxim de la corba d'acetilcolina (alçada màxima obtinguda en la corba B). (Veure quadre annex).
Es representa gràficament en ordenades % efecte davant log de les concentracions molars d'acetilcolina, en abscisses, per a les quatre
corbes realitzades. Obtindrem quatre sigmoides en la mateixa gràfica, les corbes A, B, C i D. Es calculen la CE50 i el pCE50 (pD2) l'agonista (a
partir de la corba B).
pCE50 = pD2 = - log (CE50)
Es calcula el PA2 de l'antagonista competitiu, per al que s'aplica la fórmula:
pA2 = pAx+ log (x - 1)
pAx = -log de la concentració molar d’antagonista present a la copa.

x = CE50 (agonista en presència de l’antagonista )/ CE50 (agonista)

PATRÓ ATROPINA

(CORBA A) (CORBA B) Sol. I (CORBA C) Sol. II (CORBA D)

Ach (M) log Efecte % efecte Efecte % efecte Efecte % efecte Efecte % efecte
(g) (g) (g) (g)

5
4. ESTUDI DE FÀRMACS ANALGÈSICS I ANTIINFLAMATORIS

A. ESTUDI DE L’ACTIVITAT ANTIINFLAMATÒRIA

1. OBJECTIUS
- Mostrar l'acció antiinflamatòria d'un fàrmac al llarg del temps en un procés agut.
Activitats
- Realitzar els càlculs i les gràfiques que evidencien l'acció antiinflamatòria aguda.

2. CONSIDERACIONS TEÒRIQUES
- El procés inflamatori: mediadors i signes característics.
- Mètodes d'estudi de fàrmacs antiinflamatoris

3. PROTOCOL I RESULTATS
Aquesta pràctica està dissenyada per estudiar l'efecte antiinflamatori basant-nos en la determinació de la formació de l'edema plantar com
a paràmetre de la inflamació. El procés inflamatori s'indueix en l'aponeurosi plantar de la rata mitjançant la injecció subcutània d'un agent
flogogen com carragenina. La quantificació de l'edema es realitza utilitzant un pletismòmetre.
Es fan dos grups de rates. Al grup problema s'administra la dosi de fàrmac (indometacina, 1mg/Kg) solubilitzat en 1ml d'una mescla
d'etanol / tween 20/agua (5/5/90) amb una cànula per via oral, i al grup control se li administra 1 ml de la solució utilitzada com a vehicle. Mitja
hora més tard, s'injecta per via subcutània en l'aponeurosi plantar de la pota posterior dreta de cada animal, 0,1 ml d'una suspensió de
carragenina al 2% en sèrum fisiològic.
La mesura del volum de la pota dreta (inflamada) i esquerra (no inflamada), es realitza per immersió en el líquid que conté el vaset del
pletismòmetre, fins al mal·lèol lateral. Aquests mesuraments es realitzen 1 h després d'injectar l'agent flogogen (1ª fase de la inflamació), a les
3 h i a les 5 h.

4. EXPRESSIÓ DE RESULTATS
Es troba la diferència entre els valors obtinguts per la pota dreta i l'esquerra (increment de volum o edema). Amb aquests valors es calcula
la mitjana aritmètica dins de cada lot. Es pot representar gràficament l'increment de volum (ml) respecte al temps en abscisses, per observar la
cronologia del procés.
El percentatge d'inhibició de l'edema (% I) ve donat per la disminució de l'increment de volum en el grup problema, respecte al grup control,
segons la següent fórmula, a cada un dels temps mesurats:

Vc - Vp
%I = -------------- 100
Vc

Vc = increment de volum en el grup control (mitjana aritmètica)

Vp = increment de volum en el grup problema (mitjana aritmètica)

B. ESTUDI DE L’ACTIVITAT ANALGÈSICA

1. OBJECTIUS
- Mostrar les modificacions de conducta de l'animal normal davant estímuls nociceptius.
- Mostrar la acció analgèsica d'un fàrmac davant diferents estímuls dolorosos.
Activitats
- Realitzar els càlculs de l'activitat analgèsica i valorar els resultats

6
2. CONSIDERACIONS TEÒRIQUES
- Classificació dels analgèsics
- Mètodes d'estudi de l'activitat analgèsica, segons l'estímul dolorós:
a) Calor: mètode de la irradiació focus calorífic, mètode de la placa calenta.
b) Pressió mecànica: analgesímetre de Randall i Selitto.
c) Substàncies químiques: estiraments per la injecció intraperitoneal d'àcid acètic, fenilbenzoquinona, etc.

3. PROTOCOLS I RESULTATS
B.1.- ANALGÈSIA MECÀNICA
Es determina la resistència a la pressió a la pota posterior de la rata, emprant el analgesímetre de Randall i Selitto. S'incrementa la
sensibilitat dolorosa a l'estímul nociceptiu en provocar prèviament inflamació a la pota de la rata tal com s'ha descrit en l'apartat A, de
manera que utilitzarem els mateixos animals.
La valoració de l'analgèsia s'assaja en ambdues potes de cada animal, sotmetent-lo a una pressió creixent fins que l'animal intenta
retirar la pota. Es registra la pressió (g) suportada en cada pota.

EXPRESSIÓ DE RESULTATS
El percentatge d'analgèsia mostra el grau de tolerància a la pressió en els grups problema, respecte al control. Es calcula el %
analgèsia, segons la següent fórmula:

Xp - Xc
%A = -------------- 100
Xc
Xp = mitjana aritmètica de les unitats de pressió que resisteix el grup problema (tractats amb indometacina)
Xc = mitjana aritmètica de les unitats de pressió que resisteix el grup control.

B.2.- ANALGÈSIA TÈRMICA: Focus calorífic

Utilitzant els mateixos animals de l’apartat anterior, es situa a l'animal dirigint el focus calorífic a la cua, s'anota el temps que resisteix
la irradiació, es fan 3 determinacions consecutives sobre diferents punts dins d'una zona teòrica situada entre 3 i 5 cm de la inserció de la
cua.
EXPRESSIÓ DE RESULTATS
El percentatge d'analgèsia (% A) mostra el grau de tolerància a la irradiació en els grups tractats, respecte al control. Es calcula
segons la següent fórmula:

Xp - Xc
%A = -------------- 100
Xc
Xp = mitjana aritmètica del temps que tarda a retirar la cua el grup problema (tractat amb indometacina)
Xc = mitjana aritmètica del temps que tarda a retirar la cua el grup control.

B.3.- ANALGÈSIA TÈRMICA: Placa calenta

Es procedeix a injectar i.p. als lots de 2 ratolins el sèrum fisiològic o la codeïna (40 mg/kg). Als 30 min es col·loquen en la placa
calenta i s'anota per a cada animal el temps de reacció al dolor (llepar-se, saltar i sortir).
EXPRESSIÓ DE RESULTATS
Es calcula el percentatge d'analgèsia (% A) referit al temps de llepada i / o salt per a cada fàrmac respecte al control
Xp - Xc
%A = -------------- 100
Xc
Xp = mitjana aritmètica del temps (segons) que resisteix el grup d'animals tractats amb fàrmac (codeïna), abans de la demostració
de dolor (problema).
Xc = mitjana aritmètica del temps (segons) que resisteix el grup d'animals sense tractar (sèrum fisiològic) abans de la demostració
de dolor (control).

7
4. VALORACIÓ DELS MÈTODES
El mètode de la placa calenta és característic per detectar l'analgèsia dels fàrmacs opiacis. Aquests analgèsics responen tant en aquestes
tècniques d'estímuls superficials com davant estímuls profunds (test peritoneal), però són especialment efectius enfront dels estímuls tèrmics,
elèctrics o mecànics. A més, la seva acció pot ser antagonitzada per la nalorfina. Els analgèsics no narcòtics febles (tipus salicilat) són poc
efectius en el mètode de la placa calenta, sent més actius en les proves d'estímul profund amb substàncies químiques.
El test de l'analgèsia mecànica dóna resultats positius tant per als analgèsics opiacis com per als no narcòtics tipus salicilat. En valorar
l'analgèsia en ambdues potes (inflamada i no inflamada), es pot distingir entre els fàrmacs que actuen a nivell central produint una elevació del
llindar del dolor en ambdues potes, i els que ho fan a nivell perifèric, ja que no modifiquen el llindar del dolor en la pota normal i sí en la
inflamada, com passa amb els analgèsics-antitèrmics (no opiacis).

C. MEDIADORS DE LA INFLAMACIÓ

DETERMINACIÓ DE RADICALS OXIGENATS EN CÈL·LULES RAW 264.7

1. OBJECTIUS
- Estudiar la modulació farmacològica de la generació de radicals oxigenats en la línia cel·lular RAW 264.7 de macròfags de ratolí.
- Identificar diferents dianes terapèutiques per al control de la inflamació.

Activitats
- Estudiar l'activitat antioxidant d'un producte problema en un cultiu cel·lular.

2. CONSIDERACIONS TEÒRIQUES
Durant l'activació de les cèl·lules fagocítiques, es produeix un augment del consum d'oxigen, donant lloc a la producció d'espècies
reactives derivades de l'oxigen (ROS), com l'anió superòxid. Aquestes espècies radicalàries són les responsables directes de l'acció
bactericida de les cèl·lules fagocítiques però poden danyar els teixits propers al lloc de la inflamació, actuant alhora com a segons missatgers
capaços d'activar noves vies de senyalització que agreugen i cronifiquen el procés inflamatori.
L'estimulació de macròfags amb 13-acetat de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA), produeix l'activació directa de la protein-cinasa C,
responsable de la fosforilació i activació de l'enzim NADPH-oxidasa cel·lular, que catalitza la reducció de l'oxigen molecular a anió superòxid.
La detecció de l'anió superòxid generat pot realitzar-se per mètodes químics senzills, a causa del caràcter reductor d'aquesta molècula. En
el següent protocol ens basarem en la capacitat del superòxid per reduir el blau de nitrotetrazoli (NBT) de color groc, a un diformazá, derivat
insoluble que forma dipòsits intracel·lulars de color blau fosc, que posteriorment són dissolts en una mescla de dimetilsulfòxid (DMSO) i KOH
(2N), determinant per colorimetria l'absorbància a 620 nm. Aquest model ens servirà per a l'estudi de fàrmacs potencialment antioxidants.

3. PROTOCOL
L'assaig es realitza emprant macròfags de ratolí de la línia cel·lular RAW 264.7 sembrats en plaques de 96 pouets amb medi de cultiu
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle's medium) suplementat amb sèrum boví fetal (SBF) 10% i antibiòtic. La concentració de cèl·lules emprada
serà 200.000 cèl·lules / pouet (en volum final de 200 µl).
Les variables a assajar són:
Grup blanc: Cèl·lules en estat basal, no estimulades.
Grup control: Cèl·lules estimulades amb TPA 10-6M.
Grup problema: Cèl·lules prèviament tractades amb l'agent antioxidant a diferents concentracions (fraxetina Cf: 10-5M, 10-6M, 10-7M) i
estimulades amb TPA 10-6M.

Anem a treballar amb n = 4. Un cop sembrades les cèl·lules es deixen incubant 1h perquè s'adhereixin al fons dels pouets i posteriorment
es canvia el medi, afegint 200 μl de DMEM sense SBF per iniciar l'assaig tal com mostra l'esquema.

8
 S'utilitzen plaques de cultiu estèrils de 96 pouets
Blanc Control Fraxetina

Cèl·lules en DMEM
amb 10% SBF 200 µl 200 µl 200 µl

Deixar pegar 1h aprox. En incubador 37ºC 5% CO2

Eliminar el medi
DMEM sense SBF 200 µl 200 µl 180 µl

Fraxetina Cf
- - 20 µl
10-5 10-6 10-7

30 min 37ºC

NBT 1,5 mg/ml

20 µl 20 µl 20 µl
(preparat en el moment)

TPA 10-6 Cf - 20 µl 20 µl
1h 37ºC
Eliminar el medi de cultiu
Llavat EtOH 96º 100 µl
Eliminar l’EtOH
Deixar assecar 5 min a Tª ambient
KOH (2N) 60 µl
DMSO 70 µl
Agitar placa
Mesurar absorbància a 620nm

La solució mare de fraxetina: 10-4M, les dilucions es preparen en H2O.

Les solucions de NBT i TPA es preparen en solució salina de PBS (solució salina tamponada amb fosfat).

4. EXPRESSIÓ DE RESULTATS
Finalitzat l’assaig es calcula el % de inhibició de la generació de radical superòxid.
Els resultats del producte problema es poden expressar com percentatge d'inhibició de la generació de anió superòxid, utilitzant la
següent expressió:

Ac = absorbància control
Ap = absorbància producte problema
Ab = absorbància blanc