第３３卷 第 １期 　　　　　　 仲恺农业工程学院学报 　　 　　　　　 Ｖｏｌ

．３３，Ｎｏ．１
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０２０年 ３月 Ｊ
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６６３．
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１．０
０６

水稻叶片徒手切片的荧光显微镜观察
邓绮雯１，２，刘志霞２，张　强２，高　云２，江奕君２，郑奕雄１ ，胡　巍２
（１．仲恺农业工程学院 农业与生物学院，广东 广州 ５１０２２５；
２．广东省农业科学院水稻研究所 广东省水稻育种新技术重点实验室，广东 广州 ５１０６４
０）

摘要：徒手切片常用于植物细胞结构的研究，但传统徒手切片方法对操作技术要求较高，且需要经历复杂的脱
色和染色．利用双面剃须刀将新鲜水稻叶片切成薄片，分别在可见光和紫外光下观察显微结构．结果显示，叶片
横切面在蓝色荧光下，可以获得清晰的表皮细胞、维管束、泡状细胞大小和数目的图像．该图像满足计量分析．
采用改进的徒手切片方法操作简便、快速，适合水稻叶片维管束和泡状细胞变异的快速筛选．
关键词：水稻叶片；徒手切片；自发荧光
中图分类号：Ｓ
５１１　　　　　文献标志码：Ａ　　　　　文章编号：１
６７４－５
６６３（２
０２０）０
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０２４－０
４

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　　徒手切片是一种将新鲜或固定过的植物材料快 徒手切片在快速植物组织观察中仍然有不可替代
速切成薄片的方法，常用于研究植物解剖结构、细 的优势．
胞组织化学成分和植物资源鉴定等．徒手切片不需 徒手切片操作步骤简单．传统徒手切片的方法
要专门的仪器设备，植物材料不需要化学试剂处 是单手握住一个刀片进行切片．然而对于水稻叶片
理，避免了石蜡切片流程长、耗 时 久、挥 发 性 有 较窄，质地较软，初学者不易切出理想样品．采用
机试剂利用 量 大，对 人 体 有 危 害 的 弊 端．因 而， ３个刀片进行切片，不仅容易造成手指划伤，而且

收稿日期：２
０１９－０４－２４
基金项目：广 东 省 科 技 计 划 （２
０１５Ａ０２
０２０
９０４
２，２０
１６Ａ０２
０２１
００４
０，２
０１６Ｂ０７
０７０
１０１
１，２０
１７Ａ０７０
７０２０
０６，２
０１７Ｂ０２
０２０
１００３）、广 州 市 科 技 计 划
（２０１６０
７０１
００３
２）和广东省农业科学院院长基金（２０
１５０３）资助项目．
作者简介：邓绮雯（１９
９４－），女，广东肇庆人，在读硕士研究生．　通信作者：Ｅ
ｍａｉ
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　第 １期 　　　　　邓绮雯，等：水稻叶片徒手切片的荧光显微镜观察
切片的力度和角度较难掌握 ［１］．张书敏等 ［２］使用两
刀片进行切片，获得较薄的样品．但该方法也容易
造成手指划伤和刀口钝化，较薄的切片在放置观察
时导致样品变形．因而，有必要提高徒手切片技术
安全性和稳定性．
徒手切片通常在显微镜可见光下进行显微透射
观察．这就需要切片切得越薄越好．由于叶片叶肉细
胞中叶绿体的影响，在可见光下很难获得清晰的维
［２］
管束、厚壁细胞和表皮细胞的边界．张书敏等
切片进行脱色和染色处理，获得了清晰的细胞边界
图像，然而该方法的实验步骤较复杂且需使用化学
试剂．
最近十年来，荧光显微分析技术被广泛应用于
植物细 胞 学 研 究．其 中 普 通 荧 光 显 微 镜 （Ｆｌ
ｕｏｒ
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ｃｒｏ
ｓｃｏ
ｐｅ）是研究荧光细胞化学的基本 工
具，在对活体材料的观测方面具有突出的优势，已
成为细胞实验室必备的仪器．植物细胞壁的成分具
有特定自发荧光特性．在紫外光下显微镜可以观察
植物细胞自发荧光的图像，辨别组织的结构和大
小．水稻叶片中的自发荧光物质变化已被用于研究
稻瘟病菌侵染 ［３］和类病斑部位形成机理等 ［４］．
叶片是水稻进行光合作用和呼吸作用的主要器
官，其形态（长、宽、厚）直接关系到光合速率和
蒸腾速率，与水稻产量密切相关．发掘和鉴定叶片
形态特异的水稻材料是其高产品种培育基础．本研
究改进了水稻叶片徒手切片技术，通过荧光显微镜
观察，获得清晰的维管束数目和图像，便于叶片形
态和结构观察．
１　材料与方法
１１　材料
籼稻品种合美占，于 ４叶期和分蘖期取完全展
开的叶置于含水的塑料瓶中保存待用．
１２　试验方法
徒手切片的方法： ① 马铃薯块茎砧板的制作：
用小刀将马铃薯块茎修切成长方形 ４ｃ
ｍ×２ｃ
ｍ×
０５ｃ
ｍ（长、宽和高）的块，对于叶片内卷的材料，
还需要将茎块修成双斜坡面，以便于叶片呈自然状
态放置于块茎砧板上．②刀片的准备：选两个新的
双面剃须刀片，其中一个刀片中上部粘一层透明胶
带，将两个刀片重叠放置，双手各执刀片一边中
部．③将刀口对准叶片主脉，沿着叶脉垂直方向用
　　　 ２５
力快速切下，刀片切到马铃薯块茎即可停止．④ 取
出刀片，用毛笔轻轻剥去附着在刀片外侧的叶片，
再用手轻轻拨开两个刀片，将附着有叶片的刀片浸
入盛有清水的玻璃培养皿中，轻轻抖动，使其脱落
于水中．按此方法连续切 ３～４刀． ⑤ 在干净的载
玻片上滴一滴水，用吸管从中挑取完整的切片放置
在载玻片的水滴中，轻轻摆好切片，使其横切面平
行于载玻片．一张载玻片上可放 ２～３个厚度相同
对 的切片，将盖玻片一边接触载玻片，另一边使用解
剖针控制盖玻片．同时在盖玻片另一侧放置吸水
纸，防止切片随水移动出盖玻片外或重叠．这时可
用另一个解剖针调整好叶片的位置，然后缓缓放低
盖玻片一边的解剖针，使其缓缓盖上．为了避免在
ｅｓ 盖玻片时叶片周边及其气腔中出现气泡，切好的切
片应立即进行制片，以免叶片在培养皿中放置过长
时间而导致表皮失水．
显微镜观察：利用 Ａｘ
ｉｏＳｃ
ｏｐｅＡ１荧光正置显微
镜对 样 品 进 行 观 察，并 采 用 蓝 光 （ＦＩ
ＴＣ）、 绿 光
（ＰＩ
）和黄光（Ｒｈｏ
ｄ）三色荧光进行拍照．
２　结果与分析
２１　徒手切片的明场观察
在可见光下观察，可以辨别叶片的上下表皮细
胞、维管束和运动细胞（泡状细胞），薄壁组织及
叶肉，但叶肉细胞模糊不清（图 １）．主要由于叶绿
体扩散遮盖了叶肉细胞形态，致使细胞无法辨认，
因而，不能对叶脉间的细胞数目进行测量．在 １０
倍和 ４０倍下观察发现，维管束和泡状细胞边界也
变得模糊也可能与叶绿体的色彩干扰有关．
２２　徒手切片的紫外光显微观察
在紫外光下观察，ＦＩ
ＴＣ、ＰＩ和 Ｒｈｏ
ｄ三色荧光
显示出不同组织结构．在 ５倍镜下，荧光显示的图
像比较暗，在 ２
０倍镜下荧光显示的图像比较清晰
明亮．ＦＩ
ＴＣ蓝光主要显示出维管束鞘及机械组织
及韧皮部．ＰＩ绿色荧光主要显示表皮细胞和机械组
织．Ｒｈｏ
ｄ黄 色 荧 光 主 要 显 示 维 管 束 及 薄 壁 组 织，
然而韧皮部组织呈黑色，类似于木质部的气腔（图
２）．因此，在 ２０倍镜下，紫外光下与同等倍数下
的可见光下的图片一样，叶肉细胞的结构与轮廓
无法辨别，但是 ３种荧光都能显示出叶片较清晰
表皮细胞、维管束、薄壁组织及泡状细胞的结构
轮廓．
２６ 　　 仲恺农业工程学院学报 第３
３卷　

１、２和 ３分别表示 ５×、１０×和 ４

０×１，２ａ
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ｃａｔ
ｅ５×，１
０×ａ
ｎｄ４０×，ｒ
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；Ａ、Ｂ、Ｃ和 Ｄ依次为可见光、蓝光、绿光和黄光，
Ａ，Ｂ，Ｃａ
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．
图 １　水稻叶片在可见光与紫外光下显微结构
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１．泡状细胞 ｂｕｌ
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ｅｌｌ
；２．表皮细胞 ｅ
ｐｉｔ
ｈｅｌ
ｉａ
ｌｃｅ
ｌｌ；３．维管束鞘 ｂｕ
ｎｄｌ
ｅｓｈ
ｅａｔ
ｈ；４．韧皮部 ｐ
ｈｌｏ
ｅｍ；５．木质部 ｘ
ｙｌｅ
ｍ；６．维管束 ｖ
ａｓｃ
ｕｌａ
ｒ
ｂｕｎ ｅ；７．薄壁组织 ｐ
ｄｌ ａｒｅ
ｎｃｈｙ
ｍａｔ
ｉｓ
ｓｕｅ
；８．机械组织 ｍｅ
ｃｈａ
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ａｌｔ
ｉｓ
ｓｕｅ
；Ａ、Ｂ、Ｃ和 Ｄ分别表示可见光、蓝光、绿光和黄光 Ａ，Ｂ，Ｃａ
ｎｄＤｉ
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ｉｃａ
ｔｅｖ
ｉｓｉ
ｂｌｅｌ
ｉｇ
ｈｔ，ｂｌ
ｕｅ，ｇ
ｒｅｅ
ｎａｎｄｙ
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．
图 ２　水稻叶片的徒手切片观察
Ｆｉ
ｇ２　Ｍｉ
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ｂｌｅａ
ｎｄｕｌ
ｔｒａ
ｖｉｏ
ｌｅｔｌ
ｉｇｈｔ（２
０×）

用一个片刀片切片．由于水稻叶片窄小、质地软，
３　讨论
包夹在马铃薯块茎中，进行单手切片，初学者很难
传统徒手切片方法是将叶片放置在夹物中，利 获得理想的切片．包夹物的大小、双面剃须刀中间
　第 １期 　　　　　邓绮雯，等：水稻叶片徒手切片的荧光显微镜观察 　　　 ２７

的空洞面积、单手切刀的动作是否平稳，都会影响 产生蓝色自发荧光．禾本科植物细胞壁中的酚类物
切片的平整和厚薄，从而影响了切片的观察效果． 质成分较为复杂，除了木质素之外，还有结合于半
［２］
张书敏等 采用了两个双面刀片进行切片，切片 纤维素中的酚酸，如阿魏酸 （Ｆｅ
ｒｕｌ
ｉｃａ
ｃｉｄ）、对 －
切口整齐、厚薄均一，且避免了切片时由于来回拉 香豆酸（ｐ
Ｃｏｕｍａ
ｒｉｃａ
ｃｉｄ）等，这类植物细胞壁自发
切对材料造成的损伤．为了避免取 Ａ４纸对刀片形 荧光则是由木质素及结合于半纤维素中的酚酸共同
成的阻力，我们改进两个双面刀片法．采用马铃薯 产生的 ［５］．自发荧光能够反映出植物发育过程中细
块茎作为砧板，针对叶片的内卷程度修切成相应的 胞壁酚类物质成分的变化．梁艳丽 ［３］通过水稻叶
砧板接触面，这样避免了平面砧板下刀片切割时 片中的自发荧光物质变化研究稻瘟病菌侵染过程，
用力挤压 导 致 泡 状 细 胞 的 破 裂．在 操 作 过 程 中， 刘宝玉等 ［４］利用叶绿体自发荧光研究类病斑的部
双手捏住部位和力度需要调试，以获得完整的切 位发生了叶绿素降解．通过三色荧光图像的叠加合
片为宜． 成图像，能更好的显示叶片的维管束组织和薄壁细
徒手切片在可见光下观察，使用的是透射光， 胞的结构，完全满足对维管束、泡状细胞、薄壁细
切片越薄，叶绿体的色彩越真实，观察的效果越 胞和表皮细胞的分析．本试验优化的徒手切片的制
好．然而，切片越薄，在制片中切片在载玻片上形 片技术和观察方法，为水稻组织切片提供简易方
态容易变形、不自然．荧光显微镜的紫外光观察的 法．试验只需要荧光显微镜，无需其它贵重仪器，
是切片上表面的反射光，只要切片平整就能获得清 适用于对大批量样品的观察．
晰的图像．因而，紫外光观察对切片的厚度要求可
参考文献：
以适当的放宽．在一个刀片中上部粘了一层透明胶
带，其作用有两个，一作为切片的厚度，增加一定 ［１］　华跃进，介绍一种徒手切片的方法［Ｊ
］．植物杂志，１９８
８（４）：
４０－４
１．
厚度可以有效保持叶片的自然形态；其二可以封住
［２］　张书敏，刘红云，程金金，等．快速徒手切片法观察谷子和水
双面剃须刀的中间空洞，防止手指划伤．
稻叶片显微结构［Ｊ
］．基因组学与应用生物学，２０
１５，３４（７）：
徒手切片在可见光的低倍镜（５×）下仅能观察 １５
２７－１５
３０．
叶片横切的形态、维管束组织结构及泡状细胞轮 ［３］　刘宝玉，刘军化，杜丹，等．水稻类病斑突变体 ｓ
ｐｌ３
４的鉴定
廓．在 １０倍镜下观察，叶绿体和水的折射而模糊 与基因精细定位［Ｊ
］．作物学报，２
０１８，４
４（３）：３３２－３
４２．

了上述结构边界，因而无法准确地计量细胞数目和 ［４］　梁艳丽．水稻苗期叶片细胞壁对稻 瘟病菌 侵染的 响应研 究

［Ｄ］．昆明：云南农业大学，２０
１６．
大小．而在紫外光 １０倍镜 下 观 察，不 论 是 蓝 光、
［５］　贺新强，李素文，胡玉熹，等．毛竹细胞壁自发荧光的显微荧
绿光和黄光，其维管束组织结构及泡状细胞的结构
光分光光度分析［Ｊ
］．植物学报，１
９９９，４
１（７）：３８－４
１．
和边界都清晰可见．蓝光下能看见最清晰的结构图
像，可用于细胞数目和大小的准确计量． 【责任编辑　施祖荣】
细胞壁由于酚类物质的存在而在紫外光激发下