KỸ THUẬT SHPT CƠ BẢN – AN TOÀN SINH HỌC

A. Xử lý rác thải sinh học

Dịch nuôi cấy vi sinh vật sống: Đổ bỏ vào bình đựng có nắp chứa dung dịch sát khuẩn
Rác thải liên quan đến vi sinh vật sống: đĩa petri, đầu tip, eppendorf... thao tác trực tiếp trên vi sinh vật sống được
cho vào các hộp nhựa ở vị trí quy định. Được hấp ở 121oC trước khi xử lý
Rác thải liên quan dung môi độc, ăn mòn: đầu tip, eppendorf dùng để hút hoá chất, dung môi có tính ăn mòn hoặc
độc được cho vào thùng rác có nắp đặt trong tủ hốt và sẽ được xử lý theo rác thải đặc biệt.
Rác thải thông thường: đầu tip, eppendorf dùng để hút hoá chất, dung môi không ăn mòn, không độc và không liên
quan đến vi sinh vật sống sẽ được đựng vào trong các hộp nhựa đựng rác thải.
Rác thải liên quan đến các chất nhuộm DNA: gel điện di, đầu tip... được tập trung vào thùng rác có nắp tại khu vực
điện di và sẽ được xử lý theo rác thải đặc biệt.
B. Kính bảo hộ
 Bảo vệ khu vực mắt khỏi giọt bắn, hơi dung môi, hoá chất độc, ăn
mòn
 Bảo vệ mắt khỏi bức xạ UV khi quan sát gel điện di
C. Eppendorf
 Ống đựng nhỏ bằng nhựa có nắp bật hay nắp vặn dung tích 2 ml,
1,5 ml hay 0,5 ml.
*Lưu ý:
 Đậy chặt nắp sau khi sử dụng (ngón cái bật nắp, ngón trỏ đậy lại)
 Cắm eppendorf lên giá đựng thích hợp
 Không chạm tay vào phần miệng eppendorf hoặc vành trong của phần nắp
Kỹ thuật Mẫu áp dụng Yêu cầu
Lắc rung Cần F phân tán mạnh Tạo đc dòng xoáy, đậy chặt
Vd: Phân tán VK vào nắp
200 μl đệm ly giải
Trộn = pipet Phân tán TB, khi dịch dễ tạo bọt V hút nhỏ hơn V dịch cần
trộn, đầu tip luôn nhúng
trong dịch
Trộn = khẩy ngón tay V nhỏ (<100 μl) Kiểm soát lực khẩy, đậy
Vd: Phân tán AND vào chặt nắp
20 μl đệm TE
Trộn = úp ngửa Cần F phân tán nhẹ, V lớn > ½ eppendorf Đậy chặt nắp
Vd: Trộn 300 μl ADN
và 1ml Etanol

D. Micropipet
 Là dụng cụ dùng để lấy chất lỏng có thể tích nhỏ hàng microlit và có thể điều chỉnh được thể tích cần lấy
 Có nhiều cỡ: 0,1 - 1 μl, 1 - 10 μl, 1 - 20 μl, 10 - 100 μl, 10 - 200 μl, 100 - 1000 μl ...
 Pipet được tên theo V max: P2 (0.2-2), P20 (2-20), P200 (20-200), P1000 (100-1000)
 Sai số: khoảng 2% V max
 Khi sử dụng phải kèm theo đầu tip nhựa tương ứng:
o P (0.1-10) xài tip trắng
o P20, 200 xài tip vàng
o P1000 xài tip xanh
o Có loại tip lọc để tránh lây nhiễm
* Các bước thực hiện:
1. Xoay núm chỉnh thể tích để chọn V cần hút c. Loại P200: 1 5 2  152 μl
*Thay đổi tùy loại pipet: d. Loại P1000: 0 5 2  520 (0: ml)
a. Loại P2: 1 5 2  1,52 μl 2. Cầm pipet bằng 1 tay, ngàm tựa đặt lên
b. Loại P20: 1 5 2  15,2 μl ngón trỏ, đầu hút hướng xuống

Nguyễn Thanh Huy – D21

 3. Nhấn nhẹ nhàng vào tip trên đế nhựa để lấy (quan trọng để tránh hút không khí và dung
tip dịch nhớt khó hút lên)
4. Dùng ngón cái bấm cần bơm nhẹ nhàng đến 7. Chuyển sang ống khác, bấm cần bơm vượt
“nấc 1” (tùy V), giữ yên “nấc 1”, qua “nấc 2” để đẩy chất lỏng ra hết
5. Nhúng tip khoảng 2 mm dưới bề mặt chất (vẫn giữ tip trong chất lỏng đến hết nấc 2)
lỏng cần hút (đảm bảo tip ở dưới bề mặt 8. Rút đầu tip hoàn toàn ra khỏi dung dịch rồi
suốt quá trình hút) nhả cần bơm từ từ
6. Thả cần bơm để trả về vị trí ban đầu (thả từ 9. Nhả tip ra bằng núm đẩy tip (đảm bảo tip rơi
từ, không vội làm dd bắn lên đo sai), dừng 1 vào thùng chứa tip thải)
chút để đảm bảo lượng dung dịch đã lên đủ
*Lưu ý:
 Độ nhúng sâu tip phụ thuộc V cần
 Nhúng tip vào chất lỏng đủ sâu, quá sâu sẽ gây sai số do chất lỏng bám ngoài tip
 Với lượng nhỏ dung dịch, khi nhỏ giọt, chạm đầu tip vào thành ống
 Sử dụng đầu tip sạch (mới) cho mỗi dung dịch mới hoặc lỡ chạm đầu tip vào vật dụng khác
 Không sử dụng pipet khi không có tip
 Không được lấy ngoài khoảng giới hạn của pipet
 Nếu nhấn mà không lấy được tip, chọn tip khác
 Không đặt pipet đang chứa dung dịch xuống bàn
 Bơm một 1 nấc: bơm từ từ thể tích cần lấy; Nấc thứ 2: đẩy hết phần chất lỏng còn dính ở đầu tip
E. Máy lắc rung – Máy Vortex
 Cấu tạo: Thành phần chính là một rotor có tâm sai với bán kính tâm sai nhỏ
 Công dụng: Lắc trộn dung dịch hoặc phân tán cắn trong eppendorf, tube
 Chế độ vận hành:
o Liên tục (On): rotor quay liên tục
o Kích hoạt (Touch): khi đặt và ấn tube lên rotor thì rotor mới quay
*Lưu ý:
 Đậy và giữ chặt nắp của tube chứa khi thao tác
 Thực hiện ngắt quãng: 10s – 10s – 10s
 Sử dụng cho các mẫu bền lực cơ học (cấm protein, ADN lớn)
 Không sử dụng máy vortex để trộn các dịch có thể tích chiếm quá đầy (không vortex
được) hoặc quá ít (dính lên thành ống) bên trong tube (1/2, 2/3 V eppendorf là ok)
F. Máy li tâm nhỏ (dùng cho Eppendrof, tube) - Microcentrifuge
 Nguyên tắc hoạt động: Rotor quay ở tốc độ cao tạo lực ly tâm để đẩy nhanh tốc độ lắng cặn (tủa, tế bào...)
hay tách pha (hỗn dịch, nhũ tương...)
*Lưu ý: Máy trong lab là rotor góc (có thể thay đổi tùy slg và loại tube) , tube 1.5ml, 24 giếng (24 mẫu)
 Chế độ vận hành:
o Ly tâm nhanh (pulse/quick/spin): ấn giữ để vận hành, thả tay khi muốn dừng (không cần chỉnh
time và vận tốc), dùng để dồn các thành phần đang dính trên thành tube xuống đáy (dành cho
lượng hóa chất nhỏ)
o Ly tâm: để lắng cặn, TB hay tách pha (chọn tốc độ, time phù hợp)
 Lưu ý khi vận hành:
o Đặt các tube vào các vị trí trên rotor theo nguyên tắc đối xứng và đồng lượng (thể tích)
*Đối xứng: đặt các eppendorf đối diện nhau, nếu số lượng lẻ, đặt đối diện 1 eppendorf nước
o Phần quai của eppendorf được đặt quay ra phía ngoài (để sau ly tâm, tủa sẽ lắng ở đáy và thành
ống phía xa nhất so với tâm rotor  dễ hút phần dịch nổi, không ảnh hưởng cắn)
o Đóng nắp để giảm tiếng ồn và để trong khi ly tâm, nếu thành eppendorf bị vỡ, hóa chất không
văng ra ngoài
o Chọn fast để vận tốc tối đa, slow để giảm tốc

Nguyễn Thanh Huy – D21

 o Một số tube, eppendorf thành mỏng (tube PCR) không chịu được tốc độ ly tâm
cao nên có thể bị thủng

CHIẾT TÁCH DNA BỘ GEN VI KHUẨN

1/ Nguyên tắc chung (môi trường LB broth):

 Phá vỡ tế bào: bằng pp vl/hh

 Chiết tách với phenol/ choloroform/ isoamyl alcohol đệm tủa khác để loại bỏ protein,
mảnh vỡ tế bào, thu dịch acid nucleic.
 Tủa acid nucleic bằng ethanol với hiện diện muối cation hóa trị 1, hoặc tủa bằng isopropanol

2/ Nguyên liệu:

a. Đệm giải Bacillus: để phân tán cắn tế bào và làm môi trường gồm:
 50 mM EDTA (ổn định pH, khóa Mg2+ làm ADN không hoạt động)
 0,1M NaCl (duy trì áp suất thẩm thấu, đẳng trương), pH 7,5
b. Lysozym: 10mg/ml pha trong a để phân hủy thành tế bào của vi khuẩn (peptidoglycan) (điều kiện
hoạt động ở 37oC)
c. Đệm ly giải nucleic: phân tán cắn tế bào, phá vỡ màng tế bào để bộc lộ tế bào chất. Nếu nồng độ >
300 μl, kết tủa DNA hình thành mà ko cần làm lạnh
d. Đệm tủa protein: tủa protein, các mảnh vỡ tế bào
e. Isopropanol : tủa ADN tỉ lệ 0.6 : 1; khó bay hơi, một số muối khó tan trong isopropanol còn lại
f. Tủa bằng ethanol với hiện diện muối cation hóa trị 1 : tỉ lệ 2.5:1
g. Ethanol 70% : kém phân cực, ko hòa tan ADN, dùng rửa ADN, cồn 80% 90% vẫn dùng để rửa được,
nhưng không dùng cồn tuyệt đối.
h. RNAse : loại bỏ ARN
i. Phenol/choloroform/isoamyl alcohol : tỉ lệ 25/24/1

3/ So sánh các phương pháp thu hồi DNA từ dịch chiết

 Quy trình kết tủa với etanol

- Đơn giản, rẻ, etanol dễ bay hơi, hòa tan trong muối tốt
- Tỷ lệ dịch ADN thấp 1:2.5
- Cần cation hóa trị I
 Qui trình kết tủa khác :
- Isopropanol : tủa được nhiều dịch ADN hơn (1:0.7), không cần cation, bay hơi và hòa tan muối kém
- LiCL 8M mà không có etanol : tủa ARN lớn
 Thu hồi bằng hấp phụ
- Dễ thực hiện, tự động hóa, hiệu suất thu hồi và chất lượng tốt
- Đắt tiền không hiệu quả đối với acid nucleic nhỏ

4/ Quá trình tách chiết ADN cần chú ý bước nào để tăng hiệu suất?

 Loại bỏ tạp chất (hút bỏ dịch nổi bằng micropipet)

 Tủa ADN (càng nhiều càng tốt)

5/ Các bước tách chiếc ADN

 Phá vỡ tế bào  Tinh sạch DNA

 Loại bỏ tạp chất  Bảo quản
 Kết tủa DNA
6/ Sau bước 4 trong dung dịch bao gồm: ADN, các mảnh vỡ tế bào, protein.

Nguyễn Thanh Huy – D21

7/ Điền đúng/sai (thông thường là 4 sai 1 đúng hoặc 1 đúng 4 sai)
1. Micropipet là có thể lấy thể tích 1ml (Đ)
2. Chế độ vận hành kích hoạt của máy Vortex là Rotor quay liên tục (S)
3. Không thể dùng ethanol 80% để rửa ADN (S)
4. Đệm tủa protein làm tủa ADN và protein (S)
5. Tủa bằng ethanol cần sự hiện diện của Cation hóa trị II (S) -> Cation hóa trị I

*Các bước tiến hành: Kiểm tra vi khuẩn đã sinh trưởng chưa: bình chứa môi trường LB bị đục
PHÁ VỠ (LY GIẢI) TẾ BÀO
1. Thêm 1.5 ml VK vào các eppendorf, ghi tên VK vào nắp/phần nhám trên thân eppendorf (PY79)
2. Đặt vào máy ly tâm (đối xứng, quai hướng ngoài), đậy nắp nhựa, nắp máy (ấn mạnh và chờ chốt)
Chỉnh 20000g, 1 min, start
*Hiện tượng: TB VK bị lắng
3. Đổ bỏ phần nước nổi vào bình có nắp đậy chứa dd sát khuẩn: nghiêng, trút hết nước, vẩy nhẹ, giữ nguyên
vị trí úp, để lên tờ giấy thấm (thoát hết phần dịch), chấm nhẹ cho hết dịch hoặc xài micropipet hút nhẹ,
tránh phần cắn
4. Thêm 400 μl Đệm ly giải Bacillus cho vào các eppendorf  Vortex 30s (chế độ On)
*Hiện tượng: hỗn dịch trắng đục do cắn phân tán
5. Thêm 50 μl Lysozym  úp ngửa eppendorf Tủ hấp VK (370C, 10min) (đã thay bằng block nhiệt)
6. Đem ly tâm 20000g, 2 min  đổ bỏ phần nước nổi (như trên)
*Hiện tượng: Lysozym làm yếu thành TB, VK dễ bị phá vỡ ở gđ tiếp theo
7. Thêm 600 μl Đệm ly giải nucleic vào eppendorf sử dụng tip để hút lên xuống, phân tán cắn (không
vortex)
*Hiện tượng: hỗn dịch trắng đục
8. Cho vào block nhiệt ở 800C, 5min; để nguội ở nhiệt độ phòng
*Hiện tượng: TB phá vỡ  dung dịch trong suốt
CHIẾT LẤY ADN (LOẠI BỎ ADN BẰNG CÁCH KẾT TỦA VỚI MUỐI)
9. Thêm 200 μl Đệm tủa protein  Vortex 30s  Ủ đá 5min  Ly tâm 20000g 5min
10. Hút 600 μl phần nước nổi sang eppendorf mới (không chạm cắn, dịch chuyển tip xuống dưới)
KẾT TỦA VÀ TINH CHẾ ADN
11. Cho 400 μl Isopropanol tuyệt đối lạnh vào  úp ngửa tube nhiều lần
12. Đem ly tâm 20000g, 5min  đổ bỏ phần nước nổi (như trên)
*Hiện tượng: Kết tủa trắng ở đáy
13. Cho 100 μl Ethanol 70%  ly tâm 20000 vòng, 1min  đổ bỏ Ethanol
*Hiện tượng: Kết tủa trắng ở đáy
14. Khô cắn: mở nắp để bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đưa vào block nhiệt 550C
15. Cho 100 μl TE 0.1 vào cắn, vortex 10s, để nhiệt độ 40C qua đêm
*Hiện tượng: cắn ADN tan hoàn toàn
*Lưu ý:
 Ủ eppendorf trong đá để tăng hiệu suất protein
 Sau khi cho Isopropanol lanh vào, dd gồm Ethanol 70%, Protein tạp, DNA plasmid, Isopropanol, ARN, Ion
kim loại

Nguyễn Thanh Huy – D21