微生物学免疫学进展　２０１５ 年 ８ 月第 ４３ 卷第 ４ 期　Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ａｕｇ．２０１５， Ｖｏｌ．

４３ Ｎｏ．
４ ・３１・

・ 论　著・

Ａ 型 肉 毒 毒 素 ＥＬＩＳＡ 鉴 别 试 验 方 法 的 建 立
１ １ ２ １ ２ １ ２
萧在澜 ，王媛 ，顾磊 ，杨雨生 ，赵建荣 ，徐永浩 ，张华捷
１．兰州生物制品研究所有限责任公司 甘肃省疫苗工程技术研究中心， 甘肃 兰州 ７３００４６；
２．中国食品药品检定研究院，北京 １０００５０

摘要： 目的　建立鉴定 Ａ 型肉毒毒素的 ＥＬＩＳＡ 鉴别试验方法以替代传统的动物试验法。 方法　采用现代免疫学

技术，制备马源性和兔源性抗 Ａ 型肉毒毒素多克隆抗体，建立了双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ，并就此初步进行方法学验证。
结果　所建立的 ＥＬＩＳＡ 具有良好的特异性、灵敏度、精密度和耐用性，具有替代动物试验方法的良好前景。 结
论　在进一步验证和确认之后，该方法有望正式成为可用于鉴定 Ａ 型肉毒毒素的试验方法以替代动物试验法。
关键词：注射用 Ａ 型肉毒毒素；鉴别试验；酶联免疫吸附分析；替代；动物试验法
中图分类号： Ｒ３７８． 文献标志码： Ａ
＋
８ ３ 文章编号： １００５－
５６７３（２０１５）０４－
００３１－
０３
ＤＯＩ： １０． ｊ．
１３３０９ ／ ｃｎｋｉ．
ｐｍｉ．
２０１５．
０４．
００５

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ＥＬＩＳＡ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ

ＸＩＡＯ Ｚａｉ－
ｌａｎ ，ＷＡＮＧ Ｙｕａｎ， ＧＵ Ｌｅｉ， ＹＡＮＧ Ｙｕ－
ｓｈｅｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｉａｎ－
ｒｕｎ，ＸＵ Ｙｏｎｇ－
ｈａｏ，ＺＨＡＮＧ Ｈｕａ－
ｊｉｅ
倡

Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．

， Ｌｔｄ．
， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
倡

Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６， Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＮＧ Ｈｕａ－
ｊｉｅ， Ｅ－
ｍａｉｌ： ｚｈｊｈｚ１９７９＠１６３．
ｃｏｍ
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｎｅｗ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ （ｂｏｔＡ） ｔｏ ｒｅｐｌａｃｅ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
ａｎｉｍａｌ ｔｅｓｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｄｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏ－
ｇｙ， ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ａｎｔｉ－
ｂｏｔＡ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｑｕｉｎｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ｏｒｉｇｉｎ， ａｎｄ ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ
ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｒｅ－
ｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｅｓｔ， ｉｔ ｉｓ ｏｆ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ 　 Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｌｌ ｂｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｔｅｓｔ ｂｙ ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ； Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ； ＥＬＩＳＡ； Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ； Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｔｅｓｔ

　　注射用 Ａ 型肉毒毒素是一种以 Ａ 型肉毒毒素 实验动物，已不符合当前对实验动物“３Ｒ” 原则的要

为有效成分的注射剂，主要用于治疗和缓解肌肉痉 求。 英国动物学家 Ｗｉｌｌｉａｍ 和 Ｒｅｘ 曾于 １９５９ 年提出
挛性疾病，如眼睑痉挛、斜视等，也可用于除皱等医 “３Ｒ”原则， 即对于动物试验的替代（ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、
学美容领域。 由于肉毒毒素有 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、
［ ３］
减少（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）和优化（Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ） 的原则 。 随
Ｈ ８ 种血清型 ，因此在对注射用 Ａ 型肉毒毒素的 着社会经济的发展和人们对动物福利认识的不断提
［１］

质量控制中，鉴别试验尤为重要。 高，开发动物替代试验方法以减少实验动物的使用
现行 Ａ 型肉毒毒素鉴别试验采用动物中和试 已成为当今实验室检测技术发展的一大趋势。 在此
［ ２］
验法 ，通过将待检品与不同型别的肉毒抗毒素中 背景下，研究拟通过建立可用于快速鉴别 Ａ 型肉毒
和后注射小鼠，根据动物发病和死亡情况来推断待 毒素 的 ＥＬＩＳＡ 法， 并 评 估 其 替 代 动 物 试 验 的 可
检品所含的肉毒毒素型别。 该方法经多年运用，结 行性。
果稳定可靠，但操作复杂，试验周期长，需使用大量
１　材料和方法

作者简介：萧在澜，医学生物学工程 师，主 要从 事生 物制品 质量控 制 １．１　材料　注射用 Ａ 型肉毒毒素“ 衡力” （ 批号：

与质量管理工作。 ２０１４０１０３、２０１４０１０４ 和 ２０１４０４０９） 由兰州生物制品
通讯作者：张华捷， Ｅ－
ｍａｉｌ：ｚｈｊｈｚ１９７９＠１６３．ｃｏｍ 研究所有限责任公司（ 简称兰州公司） 毒素室提供；
 ・３２・ 微生物学免疫学进展　２０１５ 年 ８ 月第 ４３ 卷第 ４ 期　Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ａｕｇ．２０１５， Ｖｏｌ．
４３ Ｎｏ．
４

１４ 批疑似注射用 Ａ 型肉毒毒素样品由中国食品药 表 １　ＥＬＩＳＡ 方法的特异性验证

品检定研究院提供；各型肉毒类毒素、马抗 Ａ 型肉 １　Ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ
Ｔａｂ．

毒毒素 ＩｇＧ 和兔抗 Ａ 型肉毒毒素 ＩｇＧ 均由兰州公司 样品 Ａ４５０ Ｃｕｔ－

ｏｆｆ 值
血清室提供；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ） 标记马抗 Ａ 型 Ａ 型肉毒类毒素 ２．
５５８ ０．
１９４
肉毒毒素 ＩｇＧ 由中国食品药品检定研究院提供；四 Ｂ 型肉毒类毒素 ０．
１７２ ０．
１９４

甲基联苯胺（ＴＭＢ） 显色剂购自美国 Ｓｉｇｍａ 公司；其 Ｃ 型肉毒类毒素 ０．

０７０ ０．
１９４

他试剂均为分析纯。 Ｄ 型肉毒类毒素 ０．
０６５ ０．
１９４

１．２　建立双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ　用 １０ μｇ ／ ｍＬ 的兔抗 Ｅ 型肉毒类毒素 ０．

０７４ ０．
１９４
Ｆ 型肉毒类毒素
Ａ 型肉毒毒素 ＩｇＧ 包被 ９６ 孔酶标板，每孔 １００ μＬ，
０．
１３２ ０．
１９４

２ ～８ ℃放置过夜； 用洗液（ 含 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－

破伤风类毒素 ０．
０７３ ０．
１９４
２０ 的
金葡菌肠毒素 Ｃ２
ＰＢＳ 缓冲液） 洗板 ３ 次，每孔加入 ２００ μＬ 封闭液
０．
０７５ ０．
１９４
ＰＢＳ（阴性对照）
（含 １％ＢＳＡ 的 ＰＢＳ 缓冲液），３７ ℃孵育 １ ｈ，洗板 ３
０．
０９２ ０．
１９４

次；每孔加入待检样品，３７ ℃孵育 １ ｈ，洗板 ６ 次；每

２．２　双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ 方法的灵敏度验证　如表
孔加入 １００ μＬ １ ∶５ ０００ 稀释的 ＨＲＰ 标记马抗 Ａ 型
２ 所列，建立的 ＥＬＩＳＡ 法，对“ 衡力” 中 Ａ 型肉毒毒
肉毒毒素 ＩｇＧ，３７ ℃孵育 １ ｈ，洗板 ６ 次；每孔加入
素的检出限可达 １２． ５ Ｕ／ｍＬ，完全能够满足对于市
１００ μＬ ＴＭＢ 显 色 剂， 显 色 ５ ～１０ ｍｉｎ； 每 孔 加 入
场上 １００ Ｕ ／
瓶和 ５０ Ｕ ／
瓶两种规格产品进行检测的
５０ μＬ 终止液（２ ｍｏｌ ／Ｌ Ｈ２ ＳＯ４ ），在酶标仪 Ａ４５０ 波长
需要。
读板。 以 ＰＢＳ 缓冲液为阴性对照，阴性对照孔的吸
光度值的 ２． １ 倍为 Ｃｕｔ－ｏｆｆ 值，如待检品孔吸光度值 表 ２　ＥＬＩＳＡ 方法的灵敏度验证
超过 Ｃｕｔ－ｏｆｆ 值，则判定 Ａ 型肉毒毒素阳性。 ２　Ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ
Ｔａｂ．
１．３　双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ 方法的验证 ｍＬ）
浓度（Ｕ ／ Ａ４５０ Ｃｕｔ－
ｏｆｆ 值
１．３．１　特异性　以 Ａ 型肉毒类毒素为阳性对照， １００．
００ １．
１２８ ０．
１９４
其他型肉毒类毒素（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、破伤风类毒素和 ５０．
００ ０．
５６４ ０．
１９４
金黄色葡萄球菌肠毒素 Ｃ２ 为阴性对照，对所建立 ２５．
００ ０．
３３３ ０．
１９４
ＥＬＩＳＡ 法的特异性进行验证，上述各型类毒素和毒 １２．
５０ ０．
２０２ ０．
１９４
素的质量浓度均为 １ μｇ ／ ｍＬ。 ６．
２５ ０．
１３５ ０．
１９４
１．３．２　灵敏度（ 检出限） 　将 ２０１４０１０３ 批“ 衡力”
用 ＰＢＳ 稀释至 １００、５０、２５、１２． ２５ Ｕ ／
５ 和 ６． ｍＬ，进行 ２．３　双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ 方法的精密度验证　如表
ＥＬＩＳＡ 检测，对方法的灵敏度进行验证． ３ 所列，６ 批样品的批内 ＣＶ 值均低于 １０％，进一步
１．３．３　精密度　将 ３ 批“ 衡力” 用 ＰＢＳ 稀释至 １００ 计算 ３ 批样品的批间 ＣＶ 值为 ７．５３％，总 ＣＶ 值为
Ｕ／ｍＬ，每批平行检测 ８ 次，分别计算批内、批间和总 ７６％，可见所有样品的批内、批间和总 ＣＶ 值均低
７．
变异系数（ＣＶ），对方法的精密度进行验证。 于 １０％，表明该方法精密度良好。
１．３．４　耐用性　将 ３ 批“ 衡力” 用 ＰＢＳ 稀释至 １００
Ｕ／ｍＬ，在不同日期分别用 ＥＬＩＳＡ 法测定，共测定 ５ 表 ３　ＥＬＩＳＡ 方法的精密度验证
次，对方法的耐用性进行验证。 ３　Ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ
Ｔａｂ．
１．３．５　ＥＬＩＳＡ 法与动物中和法的比较　对获自中 次数 样品 １ 样品 ２ 样品 ３
国食品药品检定研究院的 １４ 批疑似注射用 Ａ 型肉 １ ０．
７６４ ０．
６７３ ０．
６８０
毒毒素样品包括 ３ 批动物试验结果为阴性的样品， ２ ０．
７０２ ０．
６５３ ０．
６４１

用 ＥＬＩＳＡ 与动物中和试验法进行比较。
３ ０．
６９６ ０．
５８６ ０．
６０６
４ ０．
７１７ ０．
６５０ ０．
６４９
２　结　果 ５ ０．
７３４ ０．
６１８ ０．
６３５
６ ０．
７３１ ０．
６２１ ０．
６１７
２．１　双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ 方法的特异性验证　如表 ７ ０．
７３０ ０．
６００ ０．
６２９
１ 所列，阳性对照呈强阳性反应，而其他各型阴性对 ８ ０．
７５４ ０．
６９５ ０．
７０９
照均无交叉反应。 ＣＶ（％） ３．
２２０ ５．
８４０ ５．
２４０
微生物学免疫学进展　２０１５ 年 ８ 月第 ４３ 卷第 ４ 期　Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ａｕｇ．２０１５， Ｖｏｌ．
４３ Ｎｏ．
４ ・３３・

２．４　双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ 方法的耐用性验证　如表

３　讨　论
４ 所列，在不同时间段的检测结果较为接近，所有样
品的检测结果均高于 Ｃｕｔ－ ｏｆｆ 值， 且 ＣＶ 值 均 小 于 近年来，注射用 Ａ 型肉毒毒素在医学美容等领
１０％，表明该方法有较好的耐用性。 域的应用日益增加。 目前在中国已上市的注射用 Ａ
型肉毒毒素只有爱尔兰 Ａｌｌｅｒｇａｎ 公司生产的 “ Ｂｏ－
表 ４　ＥＬＩＳＡ 方法的耐用性验证 ｔｏｘ”和兰州公司生产的“ 衡力” 两种产品。 无论是
４　Ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ
Ｔａｂ． 枟中国药典枠还是进口药品注册标准 ，对这两种 Ａ
［２］

次数 样品 １ 样品 ２ 样品 ３ Ｃｕｔ－
ｏｆｆ 值 型肉毒毒素制剂的鉴别试验均采用动物中和试验
１ ０．
７６４ ０．
６７３ ０．
６８０ ０．
１７９ 法，而动物法由于实验周期长，操作复杂等原因，给
２ ０．
７５３ ０．
７０１ ０．
７０４ ０．
１８１
产品的质量控制带来了诸多不便，建立简便有效的
替代方法，不仅能够节约实验成本，减少对动物的使
３ ０．
７５６ ０．
６７８ ０．
６９１ ０．
１７４
用，而且能更好的对产品的质量进行控制。
４ ０．
７７８ ０．
６５４ ０．
６７８ ０．
１９５
枟欧洲药典枠 规定可以采用免疫化学分析方法
５ ０．
８０９ ０．
７４３ ０．
７４９ ０．
２１０ 对注射用 Ａ 型肉毒毒素中的肉毒毒素成分进行鉴
ＣＶ（％） 别试验 。 ＥＬＩＳＡ 是一种常见的免疫分析方法，应
［４］
２．
９６０ ４．
９５０ ４．
１５０ ／
用已十分成熟。 用兰州公司制备的两种动物源性特
５　双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ 的适用性验证　对 １４ 批疑
２． 异性多克隆抗体，建立了针对 Ａ 型肉毒毒素的双抗
似注射用 Ａ 型肉毒毒素样品包括 ３ 批动物试验结 夹心 ＥＬＩＳＡ 方法，并经过初步的方法学验证，确认
果为阴性的样品，用 ＥＬＩＳＡ 与动物中和试验法的检 了该方法的可靠性和稳定性。 采用本实验方法对进
验结果完全一致，如表 ５ 所列，表明建立的 ＥＬＩＳＡ 口的“Ｂｏｔｏｘ” 及市场上一些无明确来源的疑似 Ａ 型
具有较好的适用性。 肉毒毒素制剂，同样能够检出 Ａ 型肉毒毒素成分，
实验用 ＥＬＩＳＡ 与动物中和试验法检验的初步结果
表 ５　ＥＬＩＳＡ 方法的适用性验证 完全一致，表明建立的 ＥＬＩＳＡ 法有较好的适用性。
５　Ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ
Ｔａｂ． 提示该方法可能有更广泛的应用前景，例如对未知
样品 Ａ４５０ Ｃｕｔ－
ｏｆｆ 值 动物试验结果 一致性 样品进行 Ａ 型肉毒毒素筛检等。
１ ０．
６４０ ０．
１０９ 阳性 符合 还需联合不同的实验室对所建立的 ＥＬＩＳＡ 法
作进一步验证和确认。 在获得更充分的数据后，有
２ ０．
８６８ ０．
１０９ 阳性 符合
望成为替代动物中和试验的可靠方法。
３ ０．
７０１ ０．
１０９ 阳性 符合

４ ０．
０３１ ０．
１０９ 阴性 符合
参考文献
５ ０．
５３４ ０．
１０９ 阳性 符合

６ ０．
１７７ ０．
１０９ 阳性 符合 ［１］ 　Ｂａｒａｓｈ ＪＲ， Ａｒｎｏｎ ＳＳ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｈａｔ
ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｙｐｅ Ｂ ａｎｄ ｔｙｐｅ Ｈ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎｓ ［ Ｊ］ ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，
７ ０．
０８１ ０．
１０９ 阴性 符合
２０１４，２０９（２） ：１８３－
１９１．
８ ０．
３５６ ０．
１０９ 阳性 符合 ［２］ 　国家药典委员会．中华人民共和国药典 （ 三部） ［ Ｓ］ ．北京：中
国医药科技出版社，２０１０：３１６－
３１７．
９ ０．
３１２ ０．
１０９ 阳性 符合
［３］ 　 Ｆｌｅｃｋｎｅｌｌ Ｐ ．Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ， ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ［ Ｊ］ ．ＡＬ－
１０ ０．
２４２ ０．
１０９ 阳性 符合 ＴＥＸ，２００２，１９（２） ：７３－
７８．
１１ ０．
０４０ ０．
１０９ 阴性 符合 ［４ ］ 　 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ
［ Ｓ ］ ．８．０．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ
１２ ０．
６１８ ０．
１０９ 阳性 符合
（ ＥＤＱＭ） ，２０１３：Ｐ１６８３－
１６８４．
１３ ０．
２７２ ０．
１０９ 阳性 符合

１４ ０．
３５３ ０．
１０９ 阳性 符合 收稿日期：２０１５－
０３－
０３　修回日期；２０１５－
０４－
１３　编辑：王棣