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密级： Ｙ３８２９５９５ 论文编号：

◎中国兢血群童ｒｏ
学位论文

蜱源副流感病毒５型的分离鉴定及致病性分析

硕士研究生：马云云

学 号：８２１０ｌｌ观４３７

指 导 教 师：曲连东研究员

申请学位类别：农学硕士

专 业：预防兽医学

研 究 方向：动物疫苗与分子免疫学

培养 单位：哈尔滨兽医研究所

研究生院

２０２１年６月

万方数据
 密级： 论文编号：

糊妇辩誊彭
学位论文

蜱源副流感病毒５型的分离鉴定及致病性分析

硕士研究生：马云云

学 号：８２１０１１８２４３７

指 导 教 师：曲连东研究员

申请学位类别：农学硕士
专 业：预防兽医学

研究 方向：动物疫苗与分子免疫学
培养 单位：哈尔滨兽医研究所

研究生院

２０２１年６月

万方数据
 Ｓｅｃｒｅｃｙ： Ｎ０．

Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ

Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ

Ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙ’ｐｅ ５

Ｃａｎｄｉｄａｔｅ：ＭＡ Ｙｕｎｙｕｎ

Ｓｔｕｄｅｎｔ ＩＤ：８２１０１１８２４３７

Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ ＱＵ Ｌｉａｎｄｏｎｇ

Ｄｅｇｒｅｅ Ｔｙｐｅ：Ｍａｓｔｅｒ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ

Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ

Ｍａｊｏｒ：Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｉｅｌｄ：Ａｎｉｍａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ

Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ

Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ

Ｊｕｎｅ ２０２１

万方数据
 中国农业科学院
硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表
论文题目 蟀源副流感病毒５型的分离鉴定及致病性分析

动物疫苗与分子免
论文作者 马云云 专业／领域 预防兽医学 研究方向
疫学

指导教师 曲连东 培养单位 哈尔滨兽医研究所

‘＼
硕（博）导 …
姓名 职称 单 位 专业 签名

评 硕导口
李广兴 教授 东北农业大学 基础兽医学
博导团
阅

人 姜骞 副研究员
硕导团
博导口
哈尔滨兽医
研究所
预防兽医学 ‘＼＼
答

老一陪
辩 硕导口
李一经 教授 东北农业大学 预防兽医学
手 博导团
席

硕导口
唐丽杰 教授
博导团
东北农业大学 预防兽医学
砖ｋ专，
贾洪林 研究员
硕导团
博导口
哈尔滨兽医
研究所
预防兽医学 么劲Ｌ Ｖ
锻
硕导口 哈尔滨兽医
；●

辩
刘明 研究员
博导团 研究所
预防兽医学
训孵
硕导团 哈尔滨兽医

委
刘家森 副研究员
博导口 研究所
预防兽医学
勾家禾‘
硕导口
博导口
员
硕导口
博导口

硕导口
博导口

会议记录（秘书）． 杨鸣发

论文答辩时间地点 ２０２１年５月２０日综合楼７００４室

万方数据
 独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成
果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发

表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证
书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了
明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：乌云云 时间： 矽２，Ｊ年Ｚ，Ｅｌ∑日

关于论文使用授权的声明
本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科
学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩
印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不
同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

研究生签名：马云云 时间：ｗ≯７年钿２日

时间：加叫年占月２日
导师躲＼切
万方数据
 摘要

蜱作为多种人兽共患病的传播媒介，严重影响人类健康和畜牧业持续稳定发展，在世界范围
内造成畜牧业经济损失日益增加。随着人类活动和动物贸易的增加，蜱的传播范围进一步扩大，
造成较大范围蜱传疾病的发生和流行。因此，为了保障人类生命安全和畜牧业健康稳定发展，进
行蜱携带病原的高通量分析，明确己知和未知病原体；进行重要病原体分离鉴定，遗传变异及致
病性研究十分必要。副流感病毒５型（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５，ＰＩＶ５）最初从猴子肾细胞中分离，
随着时间的推移越来越多数据表明ＰＩＶ５对多种动物存在致病性，感染宿主范围逐渐增多；感染

宿主谱系逐渐从家养经济动物到野生动物，再到畜牧经济动物，逐渐引起人们的重视。目前还没
有关于媒介生物蜱携带ＰＩＶ５的报道。ＰＩＶ５主要经呼吸道途径传播，目前已知ＰＩＶ５在临床上可
导致病犬发生急性支气管炎，并可引起继发感染等症状。此外，也发现该病毒还可引发犊牛肺部
呼吸困难和间质性肺炎等呼吸道疾病，感染ＰＩＶ５也能引起牛非化脓性脑炎和神经症状，最终导
致患病动物死亡。随着ＰＩＶ５引起越来越严重的临床症状，该病原受到广泛的关注和重视。

病毒宏基因组学（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）是用于分析不同来源样本中直接富集病毒核酸混合物的一
种新方法，该方法不需要在组织培养物中进行体外扩增和培养就可以完成测序和功能注释，准确
性和灵敏度高且成本低。作为一种新的方法，在病原临床症状不明显的情况下，识别并发现病原，
最大程度地挖掘疑似样本中的潜在病原体，为病原的发现和分离鉴定提供技术支撑。
本研究对黑龙江省大兴安岭、黑河和伊春地区采集的全沟硬蜱进行病毒宏基因组学高通量测
序分析。首先应用人工布旗法采集蜱类样本，经形态学初步鉴定，选取全沟硬蜱进行液氮研磨处
理，加入ＰＢＳ进行稀释后，通过高速离心和滤膜过滤除去杂质成分，利用核酸酶消化后，提取病
毒核酸利用随机引物进行扩增、浓缩和纯化后，将产物进行高通量测序分析。通过对原始数据中

质量低的序列进行筛查和过滤，将获得的高质量序列进行拼接组装，共获得３９０，４５５，８３０个读长，

然后用ａｄａｐｔｏｒ和ｑｕａｌｉｔｙ分析程序对它们进行了修剪，高质量序列为３８５，９６５，５８８个，进一步比
较和组装后发现，其中３，６４２，６５３个序列与注释病毒开放阅读框（ＯＲＦｓ）的序列一致。主要包括
的病毒序列对应到布尼亚病毒科、副粘病毒科、痘病毒科、杆状病毒科、疱疹病毒科、呼肠孤病

毒科、轮状病毒科等。为进一步验证病毒宏基因组测序结果，应用细胞分离培养、ＰＣＲ检测、电
镜观察形态、免疫荧光鉴定和病毒全长基因扩增等方法对病毒进行系统的分离鉴定和遗传进化分
析。首先将蜱处理液接种Ｖｅｒｏ细胞，第５ ｄ出现了明显的病变，细胞出现拉丝、变圆脱落、细胞
聚集等现象。取病变细胞上清液和蜱样本处理液提取核酸进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果可扩增出大小
约２１３ ｂｐ的片段，与预期结果相符。细胞培养物经反复冻融，继续盲传３代后收获病毒且取接种

第四代Ｖｅｒｏ细胞的病毒液利用Ｒｅｅｄ．Ｍｕｅｎｅｈ方法计算该分离株ＴＣＩＤｓｏ为１×１０”ＴＣＩＤｓｄｍｌ。电
镜下观察到的病毒粒子直径在５０～６０ ｎｍ，完整的病毒粒子呈球形，有囊膜，符合ＰＩＶ５的病毒粒
子电镜特征，且经免疫荧光鉴定能够看到特异性荧光，Ｒ：Ｉ’．ＰＣＲ扩增该分离株的全长基因组序列
进行测序分析，证明媒介生物蜱中存在ＰＩＶ５，命名为Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９，登录号为ＭＷ０５１７７６。通
过对病毒全长基因序列进行遗传进化分析表明，Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９分离株与国内小熊猫ＺＪＱ．２２１分
离株、东北虎ＳＲ和ＨＭＺ分离株、穿山甲ＧＤｌ８和ＣＡＮ分离株以及韩国犬源１１６８．１分离株处
于同一进化分支，亲缘关系较近，而与其他猪源、牛源、猕猴肾细胞源、人源、马源等ＰＩＶ５参

万方数据
 考株不同，提示该病毒可能在野生动物之问跨物种传播。鼻腔接种Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９毒株的雪貂动
物模型出现严重的呼吸窘迫，并伴有肺炎和神经组织损伤性炎症。这些结果证实了媒介生物蜱中
存在ＰＩＶ５，并表明这种节肢动物可能是ＰＩＶ５的一个天然储藏者。进一步监测媒介生物蜱中ＰＩＶ５
的循环传播，为有效控制Ｐ１Ｖ５在我国的发生和流行及疫苗研发提供了数据支撑。

本研究利用病毒宏基因组学高通量测序分析技术对全沟硬蜱携带的病毒群落进行研究，并对
提示的重要病原ＰＩＶ５进行分离鉴定，遗传进化和致病性分析，以充分了解疾病的传播情况，并

制定有效的控制策略，为评估其对动物和人类健康的潜在风险奠定基础。

关键词：副流感病毒５型，全沟硬蜱，病毒宏基因组学，遗传进化分析

万方数据
 Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ａｓ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｚｏｏｎｏｓｅｓ，ｔｉｃｋｓ ｈａｖｅ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ

ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｈｕｓｂａｎｄｒｙ，ｃａｕｓｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｌｏｓｓｅｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｈｕｓｂａｎｄｒｙ

ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｔｒａｄｅ，ｔｈｅ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ｔｉｃｋｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｆｕｒｔｈｅｒ

ｅｘｐａｎｄｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｌｅａｄ ｔｏ ｔｈｅ ＯＣＣＵｌＴｅｒｌｃ庀ａｎｄ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．

Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｆｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｉｍａｌ

ｈｕｓｂａｎｄｒｙ，ｉｔ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｍａｓｔｅｒ ｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｖｉｒｅｓ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ ｔｉｃｋｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｋｎｏｗｎ ａｎｄ

ｕｎｋｎｏｗｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ，ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ

ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５（ＰＩＶ５）ｗａｓ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ

ｃｅｌｌｓ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ｔｉｍｅ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｄａｔａ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ＰＩＶ５ ｒｅｐｏｒｔｓ ｏｆｆ ａｎｉｍａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｅｃｏｎｏｍｉｃ

ａｎｉｍａｌｓ ｔｏ ｗｉｌｄ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ｅｃｏｎｏｍｙ，ｆｏｒｃｉｎｇ ｗｅ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｂｅｇａｎ ｔｏ ｐａｙ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ

ｉｔ．Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｒｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｎｏ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ＰＩＶ５ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｃｋｓ．ＰＩＶ５ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂｙ

ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｒｏｕｔｅ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｎｏｗ ｋｎｏｗｎ ｔｈａｔ ＰＩＶ５ ｃａｎ ｌｅａｄ ｔｏ ａｃｕｔｅ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｉｎ ｓｉｃｋ ｄｏｇｓ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ，ａｎｄ

ｃａｕｓｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｙｍｐｔｏｍｓ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ＰＩＶ５ ｈａｓ ａｌｓｏ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｃａｕｓｅ

ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｙｓｐｎｅａ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ ｃａｌｖｅｓ，ａｎｄ ＰＩＶ５ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ

ｃａｎ ａｌｓｏ ｃａｕｓｅ ｎＯｎ—ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｄｅａｔｈ ｏｆｔｈｅ

ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ．Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｐａｉｄ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｕｓｉｎｇ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｓｅｒｉｏｕｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ

ｓｙｍｐｔｏｍｓ．

Ｖｉｒａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ，ａｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｖｉｒｕｓｅｓ，ｃａｎ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ

ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｆｌｕｘ，ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ

ａｎｄ ｌｏｗ ｃｏｓｔ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，Ｃａｌｌ ｂｅ ｄｏｎｅ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ

ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ａｎｄ ｄｏ ｎｏｔ ｎｅｅｄ ｔｏ ｂｅ ｄｏｎｅ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ．Ａｓ ａ ｎｅｗ

ｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｒｅ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓ，ｉｔ ｃａｎ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ，

ｅｘｃａｖａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｅｘｔｅｎｔ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ

ｓｕｐｐｏａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ．

Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｗｉｔｈ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ

ｖｉｒｏｍｅｓ ｏｆ＆ｏｄｅｓ ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ．Ｆｉｒｓｔｉｙ，ｔｈｅ ｔｉｃｋｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｋｈｉｎｇａｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｈｅｉｈｅ

ａｎｄ Ｙｉｃｈｕｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆＨｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗｅｒｅ ｓａｍｐｌｅｄ ｂｙ ｆｌａｇ ｍｅｔｈｏｄ，ｗｉｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｔｉｃｋｓ ｗｅｒｅ ｇｒｉｎｄｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｄｉｌｕｔｅｄ ｉｎ ＰＢＳ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｉｇｈ—ｓｐｅｅｄ

ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ａｆｔｅｒ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ｌｏｗ－ｑｕａｌｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｄａｔａ

ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｈｉｇｈ・ｑｕａｌｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ３９０，４５５，

８３０ ｒｅａｄｓ ｒｅｍａｉｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｄａｐｔｏｒ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｔｒｉｍｍｅｄ ｔｈｅｍ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｒｅａｄｓ ｗｅｒｅ ３８５，９６５，

５８８．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ３，６４２，６５３ ｒｅａｄｓ ｓｈｏｗｅｄ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｔｏ ａｎｎｏｔａｔｅｄ

ｖｉｒａｌ ＯＲＦｓ．Ｉｔ ｍａｉｎｌｙ ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａ。Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ，

万方数据
 Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ，Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｎｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ，Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ，Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ，

Ｐａｎｏｒａｖｉｒｕｓ，Ｒｅｏｖ西＿ｉｄａｅ，Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｏｒｔｅｒｖｉｒａｌｅｓ ａｎｄ ＳＯ ｏｎ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ

ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｂｙ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ，

ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｉｌ・ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｅ

ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｆｉｒｓｔ，ｔｈｅ ｔｉｃｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｗａｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎ ｔｈｅ ５ｔｈ ｄａｙ，ｔｈｅｒｅ Ｗｅｒｅ

ｏｂｖｉｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｄｒａｗｉｎｇ，ｂｅｃｏｍｉｎｇ ｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｓｈｅｄｄｉｎｇ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｅｒａ

ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｕｐｅｍａｔａｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｃｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ

ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｚｅ ｏｆ２ １ ３ ｂｐ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ

ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｗａｓ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ａｎｄ ｂｌｉｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ３

ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ａｆｔｅｒ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒｔｈ
７
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ．ｔｈｅ ＴＣＩＤｓｏ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ａｓ ｌ×１ ０５ ＴＣＩＤｓｄｍＬ ｂｙ Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ

ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗａｓ ５０－６０ ｎｍ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ

ｖｉｒｉｏｎｓ ｗｔ目１．ｅ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｗｉｔｈ ｃａｐｓｕｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｎ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆＰＩＶ５ ｖｉｒｉｏｎｓ

ｕｎｄｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｆｕｌｌ・ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｏｒ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ＰＩＶ５ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｔｉｃｋ．Ｉｔ ｗａｓ ｎａｍｅｄ Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０ １９

ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｇｉｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ＭＷ０５ １ ７７６．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ

ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＴｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９ｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｉｎｔｈｅ ｓａｎｌｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｂｒａｎｃｈｗｉｔｈｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅ ｒｅｄｐａｎｄａ

ＺＪＱ－２２１ ｉｓｏｌａｔｅｓ，ｔｈｅ ｓｉｂｅｒｉａｎ ｔｉｇｅｒ ＳＲ ａｎｄ ＨＭＺ ｉｓｏｌａｔｅｓ，ｔｈｅ ｐａｎｇｏｌｉｎ ＧＤｌ８ ａｎｄ Ｃａｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ

Ｋｏｒｅａｎ ｄｏｇ １１６８・ｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ．ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｃｌｏｓｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ Ｐ１Ｖ５

ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇｓ，ｃａｔｔｌｅ，ｍａｃａｑｕｅ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ，ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｈｏｒｓｅ，ｉｔ ｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ

ｍａｙ ｂｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ａｍｏｎｇ ｗｉｌｄ ａｎｉｍａｌｓ．Ｆｅｒｒｅｔ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ

Ｔｉｃｋ／ＨＵ／２０１９ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｓｅｖｅｒｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｗｉｔｈ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ａｎｄ

ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｄａｍａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＩＶ５ ｉｎ ｔｉｃｋ

ａｎｄ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔＩＩｉｓ ａｒｔｈｒｏｐｏｄ ａｓ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ

ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＩＶ５ ｉｎ ｔｉｃｋｓ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｔｉｃｋ・ｂｏｒｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．

Ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ

ｖｉｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｉｘｏｄｅｓ ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ＰＩＶ５ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｆｕｌｌｙ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ｔｈｅ

ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ ｍａｋｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ，ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｉｓｋ ｔｏ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ
ａｎｄ ｈａｍａｎ ｈｅａｌｔｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐａｒａｉｎｆｉｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５，ｌｘｏｄｅｓｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ，Ｖｉｒａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ

万方数据
 目录
第一章绪论………………………………………………………………………………．１

１．１副流感病毒５型……………………………………………………………………．１

１．１．１ ＰＩＶ５基因组结构………………………………………………………………．．１

１．１．２ ＰＩＶ５形态及生物学特性………………………………………………………。ｌ

１．Ｉ．３ ＰＩＶ５的蛋白功能………………………………………………………………一２

１．１．４ ＰＩＶ５流行情况……………………………………………………………………２

１．１．５ ＰＩＶ５的临床症状及诊断………………………………………………………一３

１．１．６ ＰＩＶ５的防控……………………………………………………………………～４

１．２病毒宏基因组学……………………………………………………………………．４

１．３研究目的及意义……………………………………………………………………．５

第二章媒介生物蟀携带病毒的宏基因组学分析………………………………………．６

２．１实验材料……………………………………………………………………………．６

２．１．１蜱样本采集……………………………………………………………………．．６

２．１．２主要试剂………………………………………………………………………．．６

２．１．３仪器设备………………………………………………………………………～６

２．２实验方法……………………………………………………………………………．６

２．２．１样本预处理……………………………………………………………………。６

２．２．２蜱处理液总ＲＮＡ的提取………………………………………………………６

２．２．３病毒宏基因组学测序…………………………………………………………一７

２．３实验结果……………………………………………………………………………．８

２．３．１病毒宏基因组测序结果…………………………………………………………８

２．４讨论……………………………………………………………………………………………………………．．９

第三章蜱源副流感病毒５型的分离鉴定………………………………………………１１

３．１实验材料……………………………………………………………………………１１

万方数据
 ３．１．１实验样品………………………………………………………………………ｌ １

３．１．２实验试剂………………………………………………………………………ｌ １

３．１．３实验仪器………………………………………………………………………ｌｌ

３．２实验方法……………………………………………………………………………ｌｌ

３．２．１分离培养………………………………………………………………………ｌ １

３．２．２分子生物学检测………………………………………………………………１ ２

３．２．３病毒含量的测定………………………………………………………………１２

３．２．４间接免疫荧光试验……………………………………………………………１２

３．２．５电镜观察………………………………………………………………………１ ３

３．２．６病毒全长基因序列分析………………………………………………………１３

３．３结果…………………………………………………………………………………１ ５

３．３．１病毒分离鉴定…………………………………………………………………１５

３．３．２ ＰＩＶ５全长基因遗传进化分析…………………………………………………１７

３．４讨论……………………………………………………………………………………………………………１ ８

第四章ＰＩＶ５分离毒株的致病性分析…………………………………………………．．２０

４．１实验材料……………………………………………………………………………２０

４．１．Ｉ实验动物与毒株………………………………………………………………２０

４．１．２主要试剂………………………………………………………………………２０

４．１．３实验设备………………………………………………………………………２０

４．２实验方法……………………………………………………………………………２０

４．２．１实验分组及攻毒………………………………………………………………２０

４．２．２临床症状观察…………………………………………………………………２０

４．２．３样品采集及病毒载量测定……………………………………………………２０

４．２．４血液学分析……………………………………………………………………２ｌ

４．２．５细胞因子和趋化因子ｍＲＮＡ转录水平的检测………………………………２ｌ

４．３实验结果……………………………………………………………………………２２

万方数据
 ４．３．１雪貂存活率及体重体温变化…………………………………………………２２

４．３．２病理解剖及病理组织学评价…………………………………………………２３

４．３．３不同组织病毒载量的测定……………………………………………………２４

４－３．４细胞因子和趋化因子ｍＲＮＡ表达动力学及血液学测定……………………２５

４．４讨论……………………………………………………………………………………………………………２６

第五章全文结论…………………………………………………………………………２９

参考文献…………………………………………………………………………………．３０

致 谢……………………………………………………………………………………………………………．．３７

作者简介…………………………………………………………………………………．３８

万方数据
 主要符号对照表

Ｖ¨Ｉ

万方数据
 中国农业科学院颈士学位论文 第一章绪论

第一章绪论
帚一旱瑁比

１．１副流感病毒５型

副流感病毒５型（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５，Ｐ１Ｖ５）是引起犬呼吸道疾病的重要病原体之一，感

染犬以后表现急性支气管炎，也可引起继发感染，对犬的影响严重，因此也称其为犬副流感病毒

（Ｃａｎｉｎｅｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ，ＣＰＩＶ）（ＣＨＥＮ ｅｔａｌ．，２０１２）。最初从猴子肾细胞中分离，随着时间的
推移越来越多数据表明ＰＩＶ５对多种动物存在致病性，感染宿主范围逐渐增多；感染宿主谱系逐
渐从家养经济动物到野生动物，再到畜牧经济动物，逐渐引起人们的重视。ＰＩＶ５呈世界性分布，
可经呼吸道途径传播。目前已知Ｐ１Ｖ５在临床上可导致病犬发生“犬窝咳”，此外，２０１３年刘晔等

在吉林白城地区肉牛养殖场中发现该病毒还可引发犊牛肺部呼吸困难和间质性肺炎等呼吸道疾
病，也能引起牛非化脓性脑炎和神经症状，最终导致患病动物死亡。随着Ｐ１Ｖ５引起的临床症状
越来越严重，该病原受到更加广泛的关注和重视。目前，对ＰＩＶ５的分子生物学特性，流行病学
特征及临床症状有了较为详细的了解，直接用于临床的快速诊断方法还需要进一步改进和完善，
未来对ＰＩＶ５感染的病理生理学及免疫发病机制的深入研究，必将推动对ＰＩＶ５的治疗和疫苗研制
的发展。

１．１．１ ＰＩＶ５基因组结构

ＰＩＶ５是副粘病毒科腮腺炎病毒属中的成员，其基因组是副粘病毒科中最小的，此外人副流感
病毒１￣４型、腮腺炎病毒、新城疫病毒、仙台病毒等都是腮腺炎病毒属成员（ＳＡＥＬＡＯｅｔａｌ．。２０２１），
为单股负链不分节段的ＲＮＡ病毒，基因组大小为１５２４６ ｎｔ，从３’端到５’端生成７种常见结构蛋

白，分别是核衣壳蛋白（Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＰ）、磷蛋白（Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ）、基质蛋白（Ｍａｔｒｉｘ
ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍ）、融合蛋白（Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｆ）、血凝素－丰中经氨酸酶蛋白（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｉ－ＩＮ）、聚

合酶蛋白（ＬａＮｅｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌ）以及小疏水蛋白（Ｓｍａｌｌｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＨ）（殷震等，１９８５；
ＲＩＭＡＢ Ｋｅｔａｌ．，２０１４），其中ＳＨ蛋白存在于Ｆ蛋白与ＨＮ蛋白之间，是腮腺炎病毒成员所特有
的一个小疏水蛋白（师新川，２０１２）。该病毒基因组遵循“六碱基原则”（高菽蔓等，２０１６），副粘
病毒科成员中如新城疫病毒（ＬＩｕ ｅｔａｌ．，２０１９）和仙台病毒（ＢＡＪＩＭＡＹＡｅｔａｌ．，２０１７）都遵循这个
原则，而副粘病毒科中的小反刍兽疫病毒的复制并不遵循此原则（ＭＵＮＩＲＡＪＵ ｅｔａｌ．。２０１５）。

１．１．２ ＰＩＶ５形态及生物学特性

ＰＩＶ５病毒粒子形态多样，电镜下观察到完整的病毒粒子呈球形或椭圆形，直径大小为５０－２００
ｎｍ（ＴＥＲＲＩＥＲｅｔａｌ．，２００９），外围囊膜由脂蛋白和糖类构成，血凝素．神经氨酸酶蛋白（ＨＮ）和Ｆ
蛋白是纤突的主要组成部分（方喜业，１９９５）。该病毒能在多种动物的原代肾细胞及Ｖｅｒｏ细胞上
增殖，因其复制周期不存在ＤＮＡ阶段，故几乎不产生细胞病变（ＴＯＭＰＫＩＮＳ ｅｔａｉ．，２００７）。ＰＩＶ５

病毒对热不稳定（李长磊，２０１３），不耐酸，不耐醚，在低ＰＨ值条件下和乙醚存在时容易失活，

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论

可在低温条件下长期保存。４＂Ｃ条件下可以凝集多种动物如豚鼠、鸡和猴等的红细胞，但是随着病
毒的不断传代，凝集红细胞的特性也会发生改变（ＥＲＬＥＳ ｅｔ ａ１．，２００４；姚月琴，２００６）。

１．１．３ ＰＩＶ５的蛋白功能

ＰＩＶ５病毒编码ＮＰ、Ｖ／Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、ＨＮ、Ｌ共７种蛋白，ＮＰ蛋白为ＰＩＶ５的核蛋白，是
ＰＩＶ５核衣壳的主要组成部分，被Ｍ蛋白所包裹，含有５１０个氨基酸，该蛋白与病毒ＲＮＡ相结合

后通过病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ＲＮＡ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲｐ）

的作用启动病毒的转录与复制（ＤＯＣＨＯＷ ｅｔ ａ１．，２０１２ ｏ Ｐ蛋白为高度磷酸化蛋白，以同源四聚

体形式存在（ＫＡＴＯ ｅｔ ａ１．，２００６），包含Ｎ端和Ｃ端两部分，其中Ｎ端可与游离的ＮＰ蛋白结合，

可使ＮＰ蛋白以可溶性单体形式存在，这是ＲＮＡ复制过程中核衣壳的形成所必需的（ＫＳｎＺＥＫ
ｅｔ ａ１．，２００３；ＦＡＮＧ ｅｔ ａ１．，２０１０）。Ｐ蛋白的Ｃ端可与Ｌ蛋白结合，进一步介导与核衣壳的结合。Ｌ
蛋白是副粘病毒科中分子量最大的蛋白，含有２２５６个氨基酸，该蛋白能够与Ｐ蛋白结合形成具
有ＲＮＡ聚合酶作用的复合物（ＳＬＥＡＴ ｅｔａｌ．，１９９３）。ＨＮ蛋白存在于病毒表面，具有血凝素一神经
氨酸酶活性。故ＰＩＶ５能够凝集多种动物的红细胞，经研究发现，Ｉ－ＩＮ蛋白与神经氨酸酶受体结合

会引起ＨＮ蛋白空间构象改变，使其得以释放，从而有助于ＨＮ蛋白颈部残基与Ｆ蛋白相结合
（ＷＥＬＣＨ ｅｔ ａ１．，２０１３）。Ｆ蛋白在病毒出芽时获得，能够介导病毒与宿主细胞膜表面脂蛋白融合，
含有２２５６个氨基酸（ＳＴＯＰＥ ｅｔ ａ１．，２００１），Ｆ蛋白和ＨＮ蛋白之间含有一个富含疏水残基的免疫

球蛋白样结构域（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．１ｉｋｅ（Ｉｇ．１ｉｋｅ）ｄｏｍａｍ），该结构域可能能够介导Ｆ．ＨＮ蛋白相互
作用（ＢＯＳＥ ｅｔ ａ１．，２０１３）。Ｍ蛋白是含量最高的蛋白，是病毒包膜的组成成分，可维持病毒完整
的结构。该蛋白在病毒装配、出芽和释放过程中发挥重要作用（ＴＡＫｎ订ＯＴ０ｅｔａｌ．，２００４；ＳＣＨＭＩＴＴ
ｅｔａｌ．，２００５），Ｍ蛋白还可以在ＨＮ蛋白和Ｆ蛋白的结合中维持其结构的稳定，从而对病毒成功入
侵宿主细胞奠定基础（ＴＥＮＧ ｅｔａｌ．，１９９８）。有些ＰＩＶ５不含有ＳＨ蛋白，经研究发现，ＳＶ５（含ＳＨ
基因）缺失ＳＨ基因后的重组病毒（ｒＳＶ５ＡＳＨ）对动物的致病力减弱和致细胞病变效应明显，但

对病毒的复制并未产生影响，这与ＳＨ蛋白能够抑制ＴＮＦ．旺介导的细胞凋亡有关（ＬＩＮ ｅｔａｌ．，２００３；

ＷＩＬＳＯＮ ｅｔ ａ１．，２００６）。Ｖ蛋白并不是副粘病毒所特有的蛋白，如人源的副流感１型病毒（ＨＰＩｖ．
１），呼吸道合胞体病毒（ＲＳＶ），新城疫病毒等不存在Ｖ蛋白，研究发现Ｖ蛋白能够与泛素连接
酶结合发生蛋白泛素化和降解（ＭＯＴＺ ｅｔ ａ１．，２０１３；ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ ｅｔ ａ１．，２０１４）。ＰＩＶ５感染细胞后
在细胞内大量增殖并被释放到细胞外环境，Ｖ蛋白能够延迟细胞的凋亡和复制周期，不会造成细
胞的大量崩解死亡（ＬＩＮ ｅｔ ａ１．，２０００；ＳＵＮ ｅｔ ａ１．，２００４；ＹＡＮＧ ｅｔ ａ１．，２０１５）。而在ＨＰＩＶ－２、３中除了
Ｖ蛋白还存在一种非结构蛋白Ｃ蛋白，该蛋白似乎能起到调控病毒的转录作用（ＭＡＬＵＲ ｅｔ ａ１．，

２００４）。

１．１．４ ＰｌＶ５流行情况

科学家们于１９５６年首次在猴子肾细胞中分离出ＰＩＶ５病毒，并将其命名为猿猴病毒５型
（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５，ＳＶ５）（ＨＵＬＬ ｅｔ ａ１．，１９５６），随后该病毒在不同宿主犬、猫、仓鼠、豚鼠、猪、
人等均有感染报道，但多不发病，临床上呈隐性经过（ＣＨＡＴＺ队ＮＤＲＥＯＵ ｅｔ ａ１．，２００４；ＬＥＥ ｅｔ ａ１．，

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 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论

２０１３）。ＰＩＶ５对犬的危害较大，主要通过侵害犬的呼吸道引起急性支气管炎，也存在引发机会菌
感染的风险，引发“犬窝咳”（ＭＣＣＡＮＤＬＩＳＨｅｔａｌ．，１９７８），因此通常将其称为犬副流感病毒（Ｃａｎｉｎｅ

ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ，ＣＰＩＶ）（ＣＨＥＮｅｔａｌ．，２０１２）。从最初只可以感染犬、豚鼠、小鼠、仓鼠，人，
随着时间推移ＰＩＶ５感染宿主范围逐渐扩大，１９９８年德国科学家在感染猪繁殖与呼吸综合征
（Ｐｏｒｃｉｎｅ ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＳｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）的母猪肺中分离到一株ＰＩＶ５病毒命名ＳＥＲ株、随
后２０１ １年韩国ＫＮＵ．１株、２０１７年韩国Ｃａｒｉｎａ、Ｍ２９３和Ｒｉｇｅｌ株相继在猪体内分离，该病毒波

及范围广泛，在我国呈流行趋势。２００３年孙贺廷等研究发现未经疫苗免疫的虎血清中ＰＩＶ５的
ＨＩＡＢ抗体阳性率达６５．７９％（孙贺廷等，２００４）。

１．１．５ ＰＩＶ５的临床症状及诊断

ＰＩＶ５感染后动物表现为咳嗽、体温升高、流鼻涕等，严重时可引起继发感染，导致神经机能

出现异常、脑组织水肿甚至发生死亡（王凤雪等，２０１６）。１９８０年Ｅｖｅｒｍａｎｎｄｅｎｇ等从犬脑脊液
中成功的分离到一株犬源ＰＩＶ５，该病犬行为表现为后肢麻痹、运动失调。后续研究进一步证实
ＰＩＶ５还可引起犬急性脑脊髓炎症和脑内积水，严重病犬最终导致后躯麻痹和瘫痪或死亡。２０１７
年罗满林和他的团队分别从动物园死亡的东北虎（ＳＲ株）、华南虎源（ＨＭＺ株）、穿山甲（ＧＤｌ８

株）和（ＣＡＮ株）、小熊猫（ＺＪＱ－２２１株）中鉴定分离到ＰＩＶ５；其中病死小熊猫肺组织存在小叶
性肺炎。患病虎表现出食欲减退、体温升高、呼吸困难、喘气、咳嗽、流涕等临床症状；特征性
病理变化为肺部表面有针尖状出血点（ＺＨＡＩ ｅｔａｌ．。２０１７）。２０１５年扈荣良等（ＨＵ ｅｔａｌ．，２０１５）从

病死牛中分离到一株牛源ＰＩＶ５命名ＢＣｌ４株，病牛最初的ｌ临床表征为分泌鼻粘液、厌食、鼻塞
和体重减轻、肺部呼吸困难和间质性肺炎可能是导致病牛死亡的主要原因。２０２０年Ｍｅｌａｎｉｅ等人

发现感染ＰＩＶ５能引起牛非化脓性脑炎和神经症状，病牛最终死亡（ＭＥＬＡＮＩＥ ｅｔａｌ．，２０２０）。一般
情况下ＰＩＶ５单独感染的情况不多见，常与其他致病原混合感染引起临床症状。
目前经典的诊断ＰＩＶ５病毒感染的方法仍然是病毒的分离鉴定，主要通过细胞分离培养、血
吸附试验、血凝试验、电镜观察病毒颗粒来检测抗原。由于ＰＩＶ５是一种隐性感染的病毒，感染
动物后很少观察到明显的临床症状，因此在采集样本的时间点上很难把握，此外还由于传统的病

毒分离和鉴定过程耗费时间，操作繁琐，临床诊断条件有限等缺点，无法实现病毒的早期快速诊
断和分子流行病学调查的需要。血清学诊断方法病毒特异性抗体很难获得，并且与其它副粘病毒
科的成员之间存在交叉反应，结果较难判定。ＰＣＲ方法检测病毒核酸是一种既灵敏又特异的病毒
感染早期诊断手段，应用该方法研究ＰＩＶ５流行病学情况，克服了目前常规方法的某些缺点，特
异性良好，可以检测动物组织样品、生物制品及常用传代细胞具有常规方法不可替代的优势，是
一种既简便快速又准确可靠的诊断方法。但是常规ＰＣＲ方法的灵敏度可能无法适应现在临床诊
断的要求，而后续发展起来的实时荧光定量ＰＣＲ方法能够实现该病毒的快速检测和诊断，与常
规ＰＣＲ方法相比较，通过检测荧光信号实时监测模板的扩增，具有更高的敏感性和特异性，操作
也更简便，已成为病原检测的重要方法（冯育芳等，２０１３）。

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 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论

１．１．６ ＰＩＶ５的防控

ＰＩＶ５属于负链ＲＮＡ病毒，与正链ＲＮＡ相比，其基因组结构更加稳定，此外，该病毒虽然

能感染多种动物，但是其毒力比较弱，不在人类中引起疾病，安全性好，是作为疫苗开发的理想
病毒载体，通过鼻腔接种动物，能够刺激机体产生有效的体液免疫和细胞免疫。含有ＰＩＶ５的活

疫苗如四联苗、五联苗、六联苗等已经广泛应用于“犬窝咳”的治疗（ＣＨＥＮｅｔａｌ．，２０１２）。ＰＩＶ５
载体已经广泛应用于重组流感病毒疫苗（ＴｏＭＰＫＩＮＳ ｅｔ ａ１．，２００７）、重组痘病毒疫苗（ＣＬＡＲＫ ｅｔ
ａ１．，２０１１）、重组狂犬病疫苗（Ｃ脏Ｎｅｔａｌ．，２０１５）、呼吸道合胞体病毒疫苗（ＰＨＡＮｅｔａｌ．，２０１４）的
研制，具有广泛的应用价值，为防控这些病原提供了一个良好的应用前景。

１．２病毒宏基因组学

宏基因组学分析技术的出现推动了微生物研究领域的发展，该技术最初只应用于细菌和真菌
的研究，２００２年Ｂｒｅｉｔｂａｎ Ｍ等将该技术用于研究海水中的病毒群落并首次发现海水中病毒组成

以噬菌体为主（ＢＲＥＩＴＢＡＲＴｅｔａｌ．，２００２）。直到２００５年，ＥｄｗａｒｄｓＲＡ等第一次提出病毒宏基因
组学这一概念（ＥＤＷＵ①Ｓ ｅｔ ａ１．，２００５），截止目前，该技术己广泛应用于多种环境样本包括淡
水、土壤、动物的肠道等的研究（砌Ｍ ｅｔ ａ１．，２０１３）。长期以来，动物和人类的病毒发现一直集
中在病原性感染和能够在细胞中易于培养且能引起明显的细胞病变效应的病毒上。病毒宏基因组

学（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）是近年来发展起来的用来分析从各种来源直接富集病毒核酸混合物的一种新
方法，而不需要在组织培养物中进行扩增。病毒宏基因组学表征了从环境或生物样品中富集的病
毒颗粒的遗传组成，应用生物技术将样本中的病毒遗传物质进行分离与富集并对提取的核酸进行
高通量测序，将测序得到的结果与病毒数据库进行序列比对分析，最后借助于软件分析得到样本
中的病毒群落信息。由于低病毒核酸浓度，遗传表征首先需要非特异性核酸扩增，然后进行ＤＮＡ

测序测序可以通过克隆质粒和Ｓａｎｇｅｒ测序或使用高度大规模平行测序技术进行，也称为下一代
测序（ＡＬＬＡＮＤＥＲｅｔａｌ．，２００１）。病毒宏基因组学或来自富集病毒颗粒制剂的核酸测序已经常用
于病毒发现（ＣＨｎＪ，２０１３），也可用于检测生物产品如人和动物疫苗中的污染病毒，还可以通过
下一代测序技术来跟踪减毒疫苗病毒的突变谱和遗传稳定性（ＢＩＤｚＨＩＥｖＡｅｔａｌ．，２０１４）。病毒宏
基因组学方法可以对环境中的病毒直接进行表征，再结合病例对照提供与复杂传染病相关的候选
病原体，有效缩小研究范围。运用病毒宏基因组学技术挖掘环境和生物体中更多具有重要意义的
病毒，一方面丰富了病毒种类，另一方面扩张了病毒的宿主范围，对进一步病毒分离，溯源及流
行病学调查研究意义重大（曾茂芹等，２０２０）。
高通量测序技术目前正在给基因组学领域带来革命性的变化，并为病毒的检测和表征提供了
新的方法。利用宏基因组测序直接从临床样本中阐明病毒，尤其是测序ＲＮＡ病毒的基因组序列
有以下优点。首先，宏基因组学使人们能够在事先不知道病原临床症状的情况下。将意想不到的
病毒或甚至是新病毒作为主要病原体或共同感染者进行鉴定和基因组表征（ＰＡＲＫＥＲ ｅｔ ａ１．。２０１６；

ＫＡＦＥＴＺＯＰＯＵＬＯＵ ｅｔ ａ１．，２０１８；ｎｔＥＲ ｅｔ ａ１．，２０１８；ＷＡＭＡＩＴＨＡ ｅｔ ａ１．，２０１８），其次不需要对快

速进化或高度多样化的ＲＮＡ病毒的引物和或探针进行持续优化（ＡＮＤＥＲＳＥＮ ｅｔ ａ１．，２０１５），最
后有助于常规监测和及早发现有别于当前流行毒株的新病毒株的暴发（ＦＩＬＬＯＵＸ ｅｔ ａ１．．２０１８）。

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 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论

通过高通量测序技术可以对微生物核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）基因的特定区域进行靶向测序（Ｔａｒｇｅｔｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），普查群落的具体组成结构，掌握其多样性变化规律，并揭示其中的优势物种；在此
基础上，还可以进一步开展宏基因组学和宏转录组学（Ｍｅｔａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）研究，利用鸟枪法测
序技术（Ｓｈｏｔｇｕｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）和全微生物组关联分析（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ＷｉｄｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ，ＭＷＡＳ）
相结合，分别从ＤＮＡ和ＲＮＡ水平全面展示微生物群落的功能和活性，进而从原理上阐明微生物
群落在生态系统中发挥作用的根本机制。

１．３研究目的及意义

自１９５６年在猴子肾细胞中首次发现ＰＩＶ５的流行，之后随着时间的推移越来越多数据表明
ＰＩＶ５在不同宿主犬、猫、仓鼠、豚鼠、猪、人等均有感染报道，感染宿主谱系逐渐从家养经济动
物到野生动物，再到畜牧经济动物，迫使我们逐渐开始重视。目前还没有关于媒介生物蜱感染ＰＩＶ５

的报道。蜱作为多种人兽共患病的传播媒介，严重影响人类健康和畜牧业持续稳定发展，目前针
对蜱携带病原的本底情况知之甚少，因此本研究以黑龙江省边境地区媒介生物蜱为切入点，利用
病毒宏基因组学分析技术，旨在掌握该地区蜱携带的动物病毒群落，明确已知和未知病原体，并
对提示的重要病原体进行分离鉴定，遗传变异及致病性研究，为评估其对动物和人类健康的致病、
传播和流行风险奠定基础，也为疾病的研究和防控提供科学依据。

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第二章媒介生物蜱携带病毒的宏基因组学分析

第二章媒介生物蜱携带病毒的宏基因组学分析

２．１实验材料

２．１．１蜱样本采集

本研究于２０１９年３～６月通过人工布旗法采集黑龙江省大兴安岭，伊春和黑河地区蜱类样本
１８５６份。根据蜱种类、采集时间和地点的不同按照每批ｌＯ～５０只装于冻存管中，置于一８０。Ｃ保存。

２．１．２主要试剂

ｇＮａｓｅ．Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ、Ｍ－ＭＬＶ反转录酶、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅＡ等均购白Ｔａｋａｒａ公司；ＡｘｙＰｒｅｐ

ＭｕｋｉｓｏｕｒｃｅＴｏｔａｌＲＮＡ小量制备试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司。

２．１．３仪器设备

高速离心机（上海力申有限公司）；核酸电泳槽（Ｂｉｏ・Ｒａｄ，ＵＳＡ）；凝胶成像分析仪（１ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司）；４＂Ｃ台式离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，德国）；电热恒温水槽（上海一维科技有限公司）；－８０＂Ｃ超低
温冰箱（海尔公司）；组织研磨仪（北京吴诺斯科技有限公司）；超微量核酸分析仪（杭州奥盛仪
器有限公司）。

２．２实验方法

２．２．１样本预处理

２０１９年３－６月在黑龙江省大兴安岭，伊春和黑河地区，应用人工布旗法共采集蜱类样本１８５６
份，采集到的蜱样本通过形态学观察其假基头、盾板和气门板等部位进行初步分类（邓国藩等，
１９９１）。根据蜱种类、采集时间和地点的不同按照每批１０～５０只装于冻存管中，置于．８０℃保存。
选取相同蜱种各１５只左右分为一组，置于１．５ ｍＬ无ＲＮａｓｅ的离心管中，先用ＲＮａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ
冲洗三次减少污染。将处理过的蜱样本放入高温灭菌过的研钵，加入液氮进行研磨直至组织研碎。
加入２ｍＬ的高压灭菌的研磨液（无菌ＰＢＳ，１００Ｕ／ｍＬ青霉素，１００ ｇｇ／ｍＬ链霉素），悬浮组织，
收集于２ ｍＬ无ＲＮａ．ｓｅ的离心管中，将研磨后样品４℃、１００００ｘｇ离心２０ ｍｉｎ，收集沉淀与上清，

将上清再一次４＂Ｃ、１００００×ｇ离心３０ ｍｉｎ后进行收集，并先后通过Ｏ．４５岬和Ｏ．２２岬孔径的滤
膜过滤后暂放．８０＂Ｃ冰箱保存。全基因组鸟枪法（ＷｈｏｌｅＧｅｎｏｍｅ Ｓｈｏｔｇｕｎ，ＷＧＳ）分析的上清液与
适量的ＤＮａｓｅ Ｉ和ＲＮａｓｅＡ混合，３７℃孵育１ ｈ，以清除宿主基因组ＤＮＡ和其他游离核酸。剩余
上清液体用于病毒分离。

２．２．２蜱处理液总ＲＮＡ的提取

取出．８０。Ｃ冰箱暂存的蜱处理液，根据ＡｘｙＰｒｅｐ Ｍｕｌｔｉｓｏｕｒｃｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ试剂盒提

供的步骤提取其总ＲＮＡ，具体步骤如下：

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第二章媒介生物蜱携带病毒的宏基因组学分析

（１）取２００ＩｘＬ２．２．１中蜱组织处理液，加入４００ｌａＬＢｕｆｆｅｒＲ．Ｉ，转入试剂盒中备好的１．５ｍＬ
无菌离心管中。
（２）加入５００止Ｂｕｆｆｅｒ Ｒ－ＩＩ，漩涡振荡１５－３０ ｓ，４。Ｃ、１２０００×ｇ离心５ ｍｉｎ。

（３）提取的上清加入１．５ ｍＬ无菌离心管中，再滴加２５０此异丙醇，使其均匀混合。
（４）将上述步骤中的混合液加入２ ｍＬ离心管中的制备管，在４。Ｃ条件下、５０００×ｇ离心１
ｍｉｎ。

（５）倒掉上一步离－ｔ３后的废液，再在其中加入６００止ＢｕｆｆｅｒＷＩＡ，在４＂Ｃ条件下、１１０００ｘｇ
离心１ ｍｉｎ。

（６）弃去废液，制备管重新置于２ ｍＬ离心管中，再加入７００ ｇＬ Ｂｕｆｆｅｒ Ｗ２，在４。Ｃ条件下、

１１０００×ｇ离心１ ｍｉｎ；再按照相同的离心条件重复此步骤一次。
（７）弃去废液，在４＂Ｃ条件下、１ １０００×ｇ离心１ ｍｉｎ。

（８）将上述制备管放入另一个干净的试剂盒中备好的１．５ ｍＬ离心管中，在膜的中央加５０～１００
ｕＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＴＥ（ＤＮａｓｅ＆ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）或ＲＮａｓｅ．ｆｒｅｅ水。

（９）在室温下静置３ ｍｉｎ后，４＂Ｃ条件下、ｌ １０００ｘｇ离心ｌ ｍｉｎ，最后获得ＲＮＡ暂放。８０＂Ｃ保

存备用。

２．２．３病毒宏基因组学测序

选取全沟硬蜱组处理液进行病毒宏基因组学测序，取２．２．２中提取的总ＲＮＡ利用Ｍ．ＭＬＶ反
转录试剂盒说明书进行模板的制备，反应体系如下：
（１）反应混合液的制各

试剂 体积（止）
ＲＮＡ ５

Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ｌ

ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｍＯ ６

（２）用枪轻轻混匀上述预混液，在７０。Ｃ恒温水浴锅中反应１０ ｍｉｎ后置于冰上急冷５ ｍｉｎ，

瞬离数秒使管壁上的液体沉入底部。
（３）反转录体系的配制

试剂 体积（乩）

上述反应液 １２

５ｘＭＬＶ Ｂｕｆｆｅｒ ４

ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １

ＲＮｒｉｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．２５

ＲＴａｓｅ Ｍ—ＭＬＶ ０．２５

ＲＮｒｉｓｅ—ｆｒｅｅ Ｈ２０ ２．５

（４）先于３０＂Ｃ恒温水浴锅保温１０ ｍｉｎ，然后再升温至４２＂Ｃ反应１ ｈ，最后在７０＂Ｃ作用１５

ｍｉｎ，立即置于冰上延伸１０ ｍｉｎ，瞬离后通过乙醇沉淀法纯化制各的ｅＤＮＡ并利用微量分光光度
计测定其浓度后送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行病毒宏基因组学分析，利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第ｊ：章媒介生物蜱携带病毒的宏基因组学分析

ＨｉＳｅｑ高通量测序平台，将制备好的总ＤＮＡ进行质量验证，合格的ＤＮＡ经随机打断形成短片
段，构建文库进行测序分析，将测序的结果通过质量筛选获得高质量数据集（Ｃｌｅａｎ ｄａｔａ），进行
病毒宏基因组学高通量测序分析（刘永相，２０１５）。利用ＮＣＢＩ核酸序列数据库（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｄａｔａｂａｓｅ，ＮＴ）和非冗余蛋白库（Ｎｏｎ—ｒｅｄｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅ，ＮＲ）比对拼接序列，经
过滤和筛选后进行生物信息学分析。

２．３实验结果

２．３．１病毒宏基因组测序结果

本实验利用Ｕｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ高通量测序平台，对黑龙江省大兴安岭，伊春和黑河地区蜱携带

病毒进行基因预测，对原始数据中质量低的序列进行筛查和过滤，将获得的高质量序列进行拼接

组装，共获得３９０，４５５，８３０个读长（Ｒｅａｄｓ），然后用ａｄａｐｔｏｒ和ｑｕａｌｉｔｙ分析程序对它们进行了修
剪。高质量序列为３８５，９６５，５８８，进一步比较和组装后发现，其中３，６４２，６５３（０．９４％）个序列与
注释病毒开放阅读框（ＯＲＦｓ）的序列一致。根据序列的相似性将病毒划分为１８个病毒科，包括

Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａ， Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ，Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ，Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ，Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ，

Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ， Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ， Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ， Ｎｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ，

Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ，Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ，Ｐａｎｏｒａｖｉｒｕｓ，Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｏｒｔｅｒｖｉｒａｌｅｓ和一小部分未知病
毒（图２．１）。本研究我们挑选注释量中等的副粘病毒，对其进行病毒分离鉴定，遗传进化和致病
性分折。
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图２．１病毒宏基因组分析结果

Ｆｉｇ！一ｌ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第二章媒介生物蜱携带病毒的宏基因组学分析

２．４讨论

病毒宏基因组学（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｅｓ）是用于分析不同来源样本中直接富集病毒核酸混合物的一
种新方法，该方法具有高准确性、高通量、高灵敏度和低成本等突出优点，可以同时完成传统基
因组学研究如测序和注释，且不需要在组织培养物中进行体外扩增和培养。作为一种新的方法，
在病原临床症状不明显的情况下，识别并发现病原，最大程度地挖掘疑似样本中的潜在病原体，

为病原的发现和分离鉴定提供技术支撑（ＫＩＭｅｔａｌ．，２０１３；曾茂芹，２０２０）。该技术己广泛应用于
多种环境样本包括淡水、土壤、大气、噬菌体及人类和脊椎动物等的病毒群落的研究，逐渐成为

人们获取未知病毒的有效工具。２００７年，Ｂｅｎｃｈ等利用病毒宏基因组学方法对切萨皮克湾的浮游
病毒分析发现该地区存在大量未知病毒序列（ＢＥＮＣＨ ｅｔ ａ１．，２００７），２００９年，Ｎｇ等在佛罗里达
绿海龟纤维乳头瘤组织中发现了一株新型的单链ＤＮＡ病毒（ＮＧ ｅｔａｌ．，２００９），２０１５年，汪俭基
于该技术探究我国北黄海海洋病毒群落特征，发现肌尾病毒科的注释量最高（汪俭，２０１５），２０１６

年，夏骏等利用该技术分析我国渤海的海洋病毒群落组成，也是肌尾病毒科的注释量最高（夏骏
等，２０１６），表明病毒宏基因组技术能直接从样本中发现已知病毒和新型病毒，对进一步研究病
毒的遗传进化及对人类和动物致病性提供了技术手段。利用下一代测序技术充分获得样本内的病
毒核酸序列，进一步分析生物体和生态环境中的已知病毒和未知新型病毒并对其进行快速鉴定，
以便更好地了解它们的遗传及进化规律。长期以来，对于病毒的研究一直局限于传统的病毒分离，
因其操作繁琐，耗费时间，因此需要建立一种新的研究病毒的方法，病毒宏基因组学分析技术能
够对样本中的病毒核酸直接进行测序，快速鉴定样本中的病毒群落，逐渐成为了研究病毒的有效
工具。

蜱作为广泛分布的媒介生物之一，所携带病原种类较多，包括病毒，细菌和原虫等多种病原
体。大多数蜱传病为人兽共患传染病，主要通过吸血方式传播给易感宿主，给人类健康和畜牧业

稳定发展带来严重影响。随着人类和动物接触到蜱虫的机会增加，蜱传疾病的流行范围逐年扩大，
促使人们更多的关注蜱和蜱传疾病。研究媒介生物蜱携带病原的分布和流行情况，评估蜱传疾病
对公共卫生安全和健康养殖的影响，进行蜱携带病原的风险评估，可为媒介生物蜱携带病原的防
控提供科学依据，对预防和控制蜱传疾病有重要的意义。
本研究应用人工布旗法共采集蜱类样本１８５６份，经形态学初步鉴定，选取全沟硬蜱进行病

毒宏基因组学分析，首先对蜱样本进行液氮研磨处理，加入ＰＢＳ进行稀释后，通过高速离心和滤
膜过滤，再加入适量的ＤＮａｓｅ Ｉ和ＲＮａｓｅ Ａ混合以清除宿主基因组ＤＮＡ和其他游离核酸等杂质

成分，利用核酸酶消化后，提取病毒核酸利用随机引物进行扩增、浓缩和纯化，达到病毒宏基因
组学高通量测序的质量要求后，将产物进行高通量测序分析。基于Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ高通量测序平
台，通过对原始数据中质量低的序列进行筛查和过滤，将获得的高质量序列进行拼接组装，共获

得３９０，４５５，８３０个读长，然后用ａｄａｐｔｏｒ和ｑｕａｌｉ哆分析程序对它们进行了修剪，高质量序列为３８５，
９６５，５８８个，进一步比较和组装后发现，其中３，６４２，６５３个序列与注释病毒开放阅读框（ＯＲＦｓ）
的序列一致。主要包括的病毒序列对应到布尼亚病毒科、副粘病毒科、痘病毒科、杆状病毒科、
疱疹病毒科、呼肠孤病毒科、轮状病毒科等。通过病毒宏基因组学分析结果显示，大部分序列与
注释病毒开放阅读框（ＯＩｔＦｓ）的序列一致，但是这些序列一部分因测序深度不够，对应的序列长
度较短，可信度不高，所对应的病毒并不一定都存在于蟀样本中，因此需要更进一步检测和验证

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第二章媒介生物蜱携带病毒的宏基因组学分析

病毒的存在。在与数据库进行序列比对过程中发现还有一部分序列为未知序列，一方面可能是因
为建立的数据库信息不够全面，另一方面可能是存在新型病原，至今尚未被发现，这无疑为新型
病原的发现奠定了基础，还有一部分序列对应到了植物病毒，细菌和噬菌体，这可能是媒介生物
蜱本来在森林覆盖率高的自然环境下生存，接触的环境复杂多样，主要靠吸食宿主血液生存，故

蜱携带的病原种类繁多，不仅包括病毒，还有细菌，原虫和噬菌体等，测序到这些序列可能和蜱
样本去除杂质成分不彻底有关。总之，病毒宏基因组学分析方法发展迅速，已经广泛应用于各种
样本中病毒群落的研究。通过病毒宏基因组分析获得更多的生物媒介蜱携带的病原种类，明确己
知和未知病原体，并对提示的重要病原体进行分离鉴定，遗传变异及致病性研究，为评估其对动
物和人类健康的致病、传播和流行风险奠定基础，也为疾病的研究和防控提供了一定的指导意义，
使人们对新发与再发及突发疾病能够更好的预警。

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第三章蜱源副流感病毒５型的分离鉴定

第三章蜱源副流感病毒５型的分离鉴定

３．１实验材料

３．１．１实验样品

２．２．１中处理过的蜱类样本上清液于．８０４Ｃ保存，非洲绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ）由哈尔滨兽医研究所
自然疫源性人兽共患病创新团队提供，ＰＩＶ５阳性血清由本实验室制备并保存于．２０℃。

３．１．２实验试剂

Ｅｘｒａｑ高保真酶、ｐＭＤ．１８Ｔ载体、ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＤＬ５００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ反
转录酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司；兔抗貂ＩｇＧ．ＦＩＴＣ（Ｓｏｌａｂｌｅ，北京，中国）；Ａｂｃｏｍ
Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒、ＡｘｙＰｒｅｐ Ｍｕｌｔｉｓｏｕｒｃｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ小量制备试剂盒、ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲ清洁试
剂盒及胶回收试剂盒等购自康宁生命科学（吴江）有限公司；质粒小量提取试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公
司；核酸染料购自哈尔滨擎科公司：ＤＭＥＭ培养基购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；ＦＢＳ胎牛血清购自Ｇｉｂｃｏ
公司；所有引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成。

３．１．３实验仪器

高速离心机（上海力申有限公司）；称量天平（Ｄｅｎｖｅｒ，ＵＳＡ）；４＂Ｃ台式离心机（湖南湘仪有

限公司）；核酸电泳槽（Ｂｉｏ－Ｐａｄ，ＵＳＡ）；凝胶成像分析仪（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；电热恒温水浴槽（上
海一维科技有限公司）；生物安全柜，３ＴＣ细菌培养箱（哈尔滨东联仪器制造有限公司）；．８０＂Ｃ超

低温冰箱（海尔公司）；常温离心机（ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ，６４１８）；透射电镜（Ｈｉｔａｃｈｉ），荧光显微镜（ＡＭＧ
ＥＶＯＳ ｆｌ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ公司，ＵＳＡ）。

３．２实验方法

３．２．１分离培养

将２．２．１中处理过的上清液取５０止接种长满单层的Ｖｅｒｏ细胞，于３７℃培养箱内培养观察细
胞病变（ＣＰＥ），直至观察一周，将出现明显ＣＰＥ的培养物经冻融３次，盲传３代仍有病变的细
胞培养物４＂１２，ｌ ０００×ｇ离心１０ ｍｉｎ后收获病毒。取第四代适应细胞的病毒进行病毒蚀斑纯化，
具体步骤如下：
（１）于６孔板中培养Ｖｅｒｏ细胞，选取形成单层平铺满细胞的孔用作试验。

（２）取病毒液１００ｌａＬ加入１．５ｍＬ离心管中，再取９００止ＤＭＥＭ加入离心管中漩涡震荡混
匀，此为１０Ｊ梯度，从ｌＯｏ梯度离心管中取１００ ｌａＬ加入另一个离心管中，加入９００ ｌａＬＤＭＥＭ漩
涡震荡混匀，此为ｌＯ七梯度，以此类推，稀释至１０４梯度并保存于４＂１２。（注：每稀释一个样品都
应放在冰上）
（３）接种前弃去细胞培养液，用５ｍＬＩｘＰＢＳ缓冲液冲洗单层细胞，然后弃去冲洗液，再加

１１

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第三章蜱源副流感病毒５型的分离鉴定

Ｉ－２ ｍＬ ＤＭＥＭ，放置一旁备用。
（４）取５个梯度的病毒液各５０¨Ｌ加入６孑Ｌ板的各孔中，并设阴性对照（只加５０ｕＬＤＭＥＭ），
置于３７℃温箱吸附２ ｈ（加入病毒液每１５ ｍｉｎ摇动一次，以便病毒均匀分布）。
准备：２％低熔点琼脂糖不需要高压，在外面称量好２ ｇ加入１００ ｍＬ无菌ＰＢＳ或双蒸水中，
微拧开管盖，在微波炉中加热灭菌１５ ｍｉｎ，取出后置于４０－－－４５℃水浴锅中备用。
（５）将３７＂Ｃ温箱孵育后的含病毒培养基吸出，加ＤＭＥＭ冲洗一遍（目的是吸取未吸附的病
毒）；将４２℃水浴锅中的琼脂糖和２ｘＤＭＥＭ维持液取出．１：ｌ混合后，加入培养板各孔，每孔１．５
ｍＬ，置于室温下３０ ｍｉｎ左右使其冷却凝固。

（６）把培养板倒置，在３７℃温箱继续培养４８－－７２ｈ。肉眼观察蚀斑情况。
（７）挑取区分明显的单个蚀斑溶于２００止ＤＭＥＭ振荡，－８０。Ｃ冻融一次，接种到预先准备
的培养单层细胞的２４孔板或４８孔板，观察ＣＰＥ的形成。收集有ＣＰＥ形成的细胞培养上清。重
复以上蚀斑３次得到纯化的病毒。

３．２．２分子生物学检测

取上述收获于细胞培养物的病毒上清液，按照２．２．２方法提取病毒液总ＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ，
根据病毒宏基因测序结果提示参考哺乳动物腮腺炎病毒Ｍ２９３（ＭＫ４２３２４１）设计引物（Ｆ：
ＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＴ，Ｒ：ＣＴＣＴＧＡＴ ＣｒｒＧＣＡＧＴｌ℃兀’ＧＡ）进行ＰＣＲ扩增，在反

应体系中依次加入ｄＮＴＰ２皿，，１０ｘＢｕｆｆｅｒ ５“Ｌ，上下游引物各１．５此，ｃＤＮＡ模板５此，Ｅｘ ７的
酶０．５止，用无ＲＮａｓｅ水补足至５０曲总体积，于ＰＣＲ仪上进行模板链的预变性，变性，退火和
延伸反应，最后用１．５％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，并将ＰＣＲ产物送吉林省库美生物
科技有限公司进行序列测定。

３．２．３病毒含量的测定

取３．２．１纯化好的病毒液进行ｌＯ倍系列稀释，待Ｖｃｒｏ细胞铺满９６孔培养板，加入稀释好的
病毒液每孔１００止，每个稀释度做８个重复，同时设立阴性对照组，置于３７。Ｃ培养箱使其吸附作
用２ ｈ，弃掉病毒上清，ＰＢＳ清洗一次，加入２％的ＤＩＶｌＥＭ细胞维持液继续培养，每天观察，记

录每个稀释度出现ＣＰＥ的孔数，并按照Ｒ∞ｄ－Ｍｕｅｎｃｈ方法计算ＴＣＩＤ５０。

３．２．４间接免疫荧光试验

待９６孔板中的Ｖｅｒｏ细胞贴壁５ ｈ后，接种倍比稀释的病毒液，７２ ｈ弃去９６孔板中的培养

液，用１００ｕＬＰＢＳＴ清洗２次，每次５ ｍｉｎ；－２０℃预冷的甲醇进行４＂Ｃ过夜固定，然后用ＰＢＳＴ洗
三次，每次５ ｍｉｎ；各加入１００ｕＬ稀释度为ｌ：１００的阳性血清作为一抗，用ＰＢＳＴ稀释，４＂Ｃ过夜
或室温１ ｈ封闭；用ＰＢＳＴ清洗三次，５ ｍｉｎ／次；再加入荧光二抗，１：１０００，用ＰＢＳＴ稀释，室温

避光作用１ ｈ；用ＰＢＳＴ清洗三次，５ ｍｉｎ／次；置于荧光显微镜下观察结果。

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第三章蜱源副流感病毒５型的分离鉴定

３．２．５电镜观察

取一８０。Ｃ保存的纯化好的病毒上清液，４＂Ｃ，１３２０００ｘｇ离心３０ｍｉｎ，弃部分上清，留１００ｕＬ悬
浮沉淀，吸取１５ ｕＬ悬液滴加至电镜铜网，室温条件下使其吸附１０ ｍｉｎ，用５ ｕＬ ２％的磷钨酸进
行染色并于透射电镜下观察，另将纯化的病毒液接种于Ｖｅｒｏ细胞，待病变达到４０％～５０％左右收
集细胞上清并浓缩，将浓缩的病毒液先进行柠檬酸铅染色１０ ｍｉｎ，双蒸水清洗３次，再用醋酸铀
染色３０ ｍｉｎ，双蒸水清洗３次，待干燥后，于透射电镜下观察病毒粒子的形态。

３．２．６病毒全长基因序列分析

３．２．６．１引物设计

参照ＧｅｎＢａｎｋ中哺乳动物腮腺炎病毒Ｍ２９３（ＭＫ４２３２４１）序列，设计覆盖病毒基因组全长
的１３对引物（见表３－１）。

表３．１ Ｍ２９３病毒基因组序列ＰＣＲ扩增引物

Ｔａｂｌｅ ３－ｌ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＭ２９３ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ

万方数据
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■ＩＩ—■■■■●—■■■■●■●■●■—■■■■■■●■—■——■■●■—●————■—■■■■●———■■■■■■■■■■■■——●■■■■■●

表３．１（续）

３．２．６．２ ＰＣＲ扩增病毒全基因组

将提取的病毒基因组ＲＮＡ先反转录为ｃＤＮＡ，操作同２．２．５模板的制备，对其进行ＰＣＲ扩
增，５０ ｕＬ扩增体系和程序如下所示：

体积（ｕＬ）

ｃＤＮＡ ，

１０）（ＢＵ腩ｒ ，

ｄＮｌｌＰ ：

Ｆ（１０ＵＭ） ●

Ｒ（１０ｕＭ） ●

ＥｘＴａｑ 蛇，
ｄｄＨ２０ 弧”

ＰＣＲ反应程序如下所示：
９４℃ ，ｍＩｎ

９４℃ ４５ ｓ ］

５２℃ ４５ ｓ ３０ ｃｙｃｌｅｓ

７２℃ Ｉ ｍｉｎ ．Ｊ

７２℃ ５ ｍｉｎ

３．２．６．３纯化ＰＣＲ产物

将上述ＰＣＲ产物加入浓度为１％的琼脂糖凝胶上进行核酸电泳，并对其大小合适的目的条带
进行胶回收，具体步骤如下：

（１）在紫外灯下将含有目的条带的凝胶切下后用无尘纸吸尽凝胶表面液体并切碎。置于天
秤上测量凝胶重量作为一个凝胶体积。
（２）加入体积为凝胶３倍的ＢｕｆｆｅｒＤＥ．Ａ，于７５＂Ｃ条件下加热混合液，每２－３ ｍｉｎ取出震荡
混匀一下，直至凝胶完全融于其中（约６￣８ ｍｉｎ）。

（３）加入上述混合液一半体积的Ｂｕｆｆｅｒ ＤＥ．Ｂ，旋涡震荡混匀后可见混合液颜色变为黄色。
（４）转移黄色液体置２ ｍＬ离心管的ＤＮＡ制备管中，ｌ １０００×ｇ离心ｌ ｍｉｎ，弃掉上层滤液。

（５）滴加５００ｕＬＢｕｆｆｅｒＷｌ于ＤＮＡ制备管中，１１０００。ｇ离心３０ ｓ，弃掉上层滤液。

１４

万方数据
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（６）再加入７５０ ｕＬＢｕｆｆｅｒ Ｗ２，１１０００×ｇ离心３０ ｓ，弃掉上层滤液。以同样的离心条件再次

加入７００ ｕＬＢｕｆｆｅｒ Ｗ２，ｌ １００００９离心ｌ ｍｉｎ。

（７）将制备管置回２ ｍＬ离心管中，１１０００×ｇ空离ｌ ｍｉｎ。

（８）将ＤＮＡ制备管放回另一干净的１．５ ｍＬ无菌离心管中，在膜中央滴加２０ ｕＬ预热的洗

脱液，在室温下静置２ ｒａｉｎ，Ｉ １０００“ｇ离心１ ｍｉｎ后收获ＤＮＡ。

３．２．６．４克隆测序

ＰＣＲ产物利用ＰＣＲ清洁试剂盒进行纯化后，将目的条带连接至ｐＭＤｌ８－Ｔ载体，转入细菌细
胞ＤＨ５ｕ中培养。经菌液ＰＣＲ鉴定后将阳性质粒送吉林省库美生物科技有限公司序列测定，具

体步骤如下：
（１）连接体系

试剂 体积（ｕＬ）

ｐＭＤｌ８－Ｔ ０．５

Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ ５

ｃＤＮＡ ２

ｄｄＨ２０ ２．５

将上述共ｌＯ ｕＬ连接样置于１６℃连接仪过夜连接。
（２）转化步骤
首先将１０ ｌｌＬ连接样加入５０ ｕＬ ＤＨ５ａ感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上作用３０ ｍｉｎ，再
转入４２℃水浴锅中热击９０ ｓ，再冰浴３ ｍｉｎ，加入８００ ｕＬ无抗性的ＬＢ培养基，于３７℃恒温摇床
培养５０ ｍｉｎ，取出４０００ｘｇ，离心３ ｍｉｎ后弃去７００ ｕＬ上清，剩余液体悬浮菌体沉淀，取１００ ｕＬ

均匀涂于氨苄抗性的琼脂平板，待其干燥后倒置于３７＂（２温箱培养过夜。
挑取单个菌落溶于１０ ｕＬ ｄｄＨ２０中，各取５ ｕＬ液体进行菌液ＰＣＲ鉴定，经鉴定为阳性结果
的菌液继续扩大培养于氨苄抗性的ＬＢ培养基中，３７℃摇床过夜培养后送库美生物公司进行测序
并对测序结果进行剪切拼接得到病毒全长基因序列。

３．３结果

３．３．１病毒分离鉴定

根据病毒宏基因组学分析结果提示，将２．２．１中蜱样本处理液接种长满单层的Ｖｅｒｏ细胞，置
３７＂Ｃ培养，第５ ｄ出现了明显的病变，细胞出现拉丝、变圆脱落、细胞聚集等现象（图３．ＩＡ）。
取病变细胞上清液和蜱样本处理液提取核酸进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果可扩增出大小约２ １ ３ ｂｐ的片
段（图３．ＩＢ），与预期结果相符。将细胞培养物通过反复冻融，继续盲传３代后收获病毒。取接
种第四代Ｖｅｒｏ细胞的病毒液利用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ方法计算该分离株ＴＣＩＤ５０为１×１０＂ＴＣＩＤ５０／ｍｌ。
间接免疫荧光试验结果显示感染了该病毒的实验组可见特异性荧光，对照组未见荧光（图３．ＩＣ）。
电镜下观察到完整的病毒粒子呈球形，带囊膜，直径５０－－６０ ｎｌｎ，与ＰＩＶ５的病毒粒子形态及大小
基本一致，进一步验证分离株为ＰｌＶ５（图３－ＩＤ）。根据设计的引物扩增ＰＩＶ５的全长序列，凝胶

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电泳显示出了与预期结果相符的阳性条带（图３．ＩＥ）。ＰＣＲ产物利用ＰＣＲ清洁试剂盒进行纯化，

将测序正确的目的条带连接至ｐＭＤｌ８一Ｔ载体，转入细菌细胞ＤＨ５０ｔ中培养。经ＰＣＲ鉴定为阳性
结果的质粒进行测序分析，每个质粒序列测定重复３次，确定无误后利用ＤＮＡＳＴＡＲ软件将序列
进行拼接，大小约为１５２４６ ｂｐ，并登录ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ进行比对分析，发现与ＰＩＶ５的同源性最高，
证明分离的病毒是ＰＩＶ５，命名为Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９，登录号为ＭＷ０５１７７６，进一步验证了病毒宏基
因组学分析结果。
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图３—１ ＰＩＶ５分离与鉴定。Ａ：分离株Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９造成的Ｖｅｒｏ细胞病变（标尺＝２００ ａｍ；ａ．Ｖｅｒｏ引起的细胞病

变；ｂ．阴性对照）；Ｂ：ＲＴ－ＰＣＲ检测（Ｍ１．ＤＬ５００ ＤＮＡ相对分子质量标准；１．全沟硬蜱上清液；ＮＣ．阴性对

照；Ｍ２．ＤＬ２０００ ＤＮＡ相对分子质量标准；２．细胞上清液；ＮＣ．阴性对照）；Ｃ：Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株感染Ｖｅｍ细

胞的间接免疫荧光（标尺＝２００ ｎｍ；ａ．未感染组无荧光信号；ｂ．感染组显示绿色荧光）；Ｄ：ＰＩＶ５电镜观察（ａ．

细胞培养上清负染。观察到包膜副粘病毒样颗粒，具有双层衣壳结构。标尺＝２００ ｎｍ；ｂ．感染Ｖｅｒｏ细胞的超薄

切片显示典型的富含对比度的病毒颗粒，标尺＝５００ ｎｍ）；Ｅ：ＰＩＶ５全基因组扩增电泳图（Ｍ．ＤＬ２０００ ＤＮＡ相对

分子质量标准；卜１３．各个片段的ＲＴ－ＰＣＲ产物；ＮＣ．阴性对照）

Ｆｉｇ．３－１ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＰＩＶ５．Ａ：ＣＰＥ ｏｆＶｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｔｉｃｌ（／ＨＬＪ／２０１９ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ｆｂａｒ

＝２００ ｎｍ；ａ．ＣＰＥ ｃａｕｓｅｄ ｏｆＶｅｒｏ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ；ｂ．Ｎｏｎ—ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ＣＰＥ）；Ｂ：ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｍ１．

ＤＬ５００ ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．ＲＴ－ＰＣＴ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆＩｘｏｄｅｓｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ；ＮＣ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ２．ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；２．

ＲＴ－ＰＣＴ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ；ＮＣ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒ０１）；Ｃ：Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩＶ５ ｉｎ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ

ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒａｉｎ Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０ Ｉ ９．ｆｂａｒ＝２００ ｎｍ；ａ．Ｎｏｎ—ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ；ｂ．

１ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０ １ ９ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）；Ｄ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ

ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩＶ５（ａ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ．Ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒａｌ—ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ

ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒｅｄ ｃａｐｓｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ｂａｒ＝２００ ｎｍ；ｂ．Ｕｌｔｒａ—ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ

ｔｙｐｉｃａｌ ｃｏｎｔｒａｓｔ—ｒｉｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ｂａｒ＝５００ ｎｍ）；Ｅ：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＰＩＶ５ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍ．ＤＬ２０００

ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１—１３．ＲＴ－ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆｓｅｇｍｅｎｔｓ；ＮＣ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒ０１）

１６

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３．３．２ ＰⅣ５全长基因遗传进化分析

为了追溯Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株的起源和进化，从ＮＣＢＩ核酸数据库中检索了ＰＩＶ５参考株的所有
基因组序列，与来自不同宿主的ＰＩＶ５参考株相比，进化树显示ＰＩＶ５株分为Ｇ１和Ｇ２两组，５个

分支。对该分离株Ｔｉｃｌ（／ＨＵ／２０１９的基因组序列进行系统发育分析，结果表明该毒株属于Ｇ２组。
序列分析表明，Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株与Ｇ２组分离株的同源性为９６．９４～９９．８５％，与Ｇ１组分离株的同
源性仅为９７．４４～９７．９７％。核苷酸序列分析结果表明，Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株与犬源１ １６８．１株，东北虎

源ＨＭＺ，ＳＲ株，猪源ＳＨ／２０１５株，小熊猫源ＺＪＱ．２２１株，穿山甲源ＧＤｌ８和ＣＡＮ株处于同一
进化分支，具有相同的遗传起源，亲缘关系相近，而与我国分离的马源ＸＪ０３３株、犬源ＣＰＩＶ－

ＨＥＮ０７１８株、牛源ＢＣ．１４株和犬源ＣＣ．１４株遗传差异较大。此外，有限的数据表明，在中国鉴
定的ＰＩＶ５毒株表现出密切的亲缘关系，特别是在野生动物第５支系（图３－２Ａ）。对新分离株的Ｆ
基因进行序列比对，核苷酸同源性９６．３２～９９．８８％。通过核苷酸序列比对发现，Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９的

Ｎ、Ｖ伊（Ｖ）、Ｍ、ＳＨ、ＨＮ和Ｌ蛋白的核苷酸序列相似性分别为９６．８６－－９９．８７％、９６．７１～９９．７０％、
９６．２１～１００％、８５．３８～１００％、９７．０６－－９９．９４％和９８．０８～９９．９１％，与来自不同宿主的其他ＰＩＶ５参考株
的核苷酸序列相似（图３－２Ｂ）。

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１７

万方数据
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图３・２基于ＰＩＶ５全基因组序列的系统进化分析。Ａ－Ｂ：利用ＭｅｇＡｌｉｇｎ软件比较Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株（用红色三角

表示）与其它２９株ＰＩＶ５参考株的核酸序列。系统发育树采用ＭＥＧＡ７．０软件和邻域连接法，ｂｏｏｔｓｔｒａｐ重复１０００

次。

Ｆｉｇ．３－２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆＰＩＶ５．Ａ・Ｂ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆｔｈｅ

Ｔｉｃｋ／ＨＬｌ／２０１９ ｓｔｒａｉｎ ｔｈｅ ｆｏｎｔ ｍａｒｋｅｄ ｉｎ ｒｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ｔｒｉａｎｇｌｅ ａｎｄ ２９ ｏｔｈｅｒ ＰＩＶ５ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ Ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ

ｕｓｉｎｇ ＭｅｇＡｌｉｇｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ Ｗｉｔｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ＭＥＧＡ ７．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｉ曲ｂｏｕｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ

ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｌ ０００ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．

３．４讨论

科学家们于１９５６年首次在猴肾细胞中分离出ＰＩＶ５，１９６７年Ｂｉｎｎ研究团队首次用犬肾和猴
’肾细胞从患犬呼吸道分离出ＰＩＶ５（ＢＩＮＮ ｅｔ ａ１．，１９６７）。然而１９７２年，Ｈｓｉｕｎｇ等科学家们发现，
野生猴子的体内中并没有抗该病毒的抗体，而且当与人接触后，反而它们能被感染上这种病毒，
人类在自然条件下也能被这种病毒感染（ＨＳＩＵＮＧ，１９７２）。ＰＩＶ５是犬重要的病原体之一，感染犬

以后表现急性支气管炎，也可引起继发感染，对犬的影响严重，因此也称其为犬副流感病毒（Ｃａｎｉｎｅ

ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＣＰＩＶ）（ＣＨＥＮ ｅｔ ａ１．，２０１２）。２０１１年韩国ＫＮＵ．１株、２０１７年韩国Ｃａｒｉｎａ、

Ｍ２９３和Ｒｉｇｅｌ株相继在猪体内分离，ＰＩＶ５在感染猪后多数表现为神经系统和呼吸系统疾病．部
分病死猪诊断为间质性肺炎和脑炎同时伴随着细菌继发感染。２０１７年，罗满林和他的团队分别从
动物园死亡的东北虎（ＳＲ株）、华南虎（ＨＭＺ株）、穿山甲（ＧＤｌ８株）和（ＣＡＮ株）、小熊猫

（ＺＪＱ．２２１株）中分离鉴定到ＰＩＶ５（ＬＵＯ ｅｔａｌ．，２０１７）。２０１８年姜宁等在我国１８个省收集１３７头
病死和腹泻猪样本，在这些猪小肠中分离到５株ＰＩＶ５（Ｊ队ＮＧ ｅｔ ａ１．，２０１８）。随着时间的推移越
来越多数据表明ＰＩＶ５对动物的致病性和感染宿主范围报道逐渐增多，感染宿主谱系逐渐变广，
从家养经济动物到野生动物，再到畜牧经济动物，因此及时有效地掌握ＰＩＶ５的遗传变异情况，

为防控ＰＩＶ５提供科学依据。
本研究从全沟硬蜱中分离得到一株蜱源Ｐ１Ｖ５并对其进行了系统的分离鉴定和遗传进化分析，
包括常规ＰＣＲ检测、细胞分离培养、电镜观察形态、免疫荧光鉴定和病毒全长基因扩增。将蜱处
理液接种Ｖｅｒｏ细胞，引起明显的细胞病变效应，细胞培养物经反复冻融，继续盲传３代后收获病
毒且取接种第四代Ｖｅｒｏ细胞的病毒液利用Ｒｅｅｄ．Ｍｕｅｎｃｈ方法计算该分离株ＴＣＩＤ５０为１×ｌＯｓ。７
ＴＣＩＤｓｄｍｌ。电镜下观察到的病毒粒子直径在５０～６０ ｎｍ，完整的病毒粒子呈球形，有囊膜，符合
ＰＩＶ５的病毒粒子电镜特征，且经免疫荧光鉴定能够看到特异性荧光，ＲＴ－ＰＣＲ扩增该分离株的全
长基因组序列进行测序分析，进一步验证了病毒宏基因组分析结果，证明媒介生物蜱中存在ＰＩＶ５，
命名为Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９，登录号为ＭＷ０５１７７６。通过对病毒全长基因序列进行遗传进化分析表明，
Ｔｉｃｋ／ＩＩＬＪ／２０１９分离株与国内小熊猫ＺＪＯ．２２１分离株、东北虎ＳＲ和ＨＭＺ分离株、穿山甲ＧＤｌ８
和ＣＡＮ分离株以及韩国犬源１１６８．１分离株处于同一进化分支，亲缘关系较近，而与其他猪源、
牛源、猕猴肾细胞源、人源、马源等ＰＩＶ５参考株不同。我们推测可能通过蜱虫叮咬吸血途径将
ＰＩＶ５传播给各种野生动物并在其中跨物种传播。蜱叮咬是一种潜在的疾病传播途径，这可能是因
为蜱虫叮咬可能被忽视，或者其他途径起了作用，宿主暴露在病原体中，然后成为病原体携带者。
该病毒首次在我国黑龙江省全沟硬蜱中分离获得，且在不同的物种尤其是野生动物之问循环传播，

万方数据
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因此蜱类被认为是ＰＩＶ５对人和动物致病的重要宿主和传播媒介，同时也提示该病毒在我国的分
布可能不仅仅局限于目前所知的区域。蜱是传播多种病原的重要生物媒介之一，随着气候变暖和
人类活动的影响，蜱的繁衍也不再仅仅局限于特定的地区间，大量潜在传播媒介的存在可为病原
传播提供有利条件，可能造成较大范围的流行（李楠等，２０２０）。截止目前，关于ＰＩＶ５的报道
相对较少，但仍在不断传播。中国的黑龙江、吉林、内蒙古、新疆和广东等省都发生了ＰＩＶ５病
例。表明ＰＩＶ５在中国可能有较高的患病率和广泛的地理分布。

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第四章ＰＩＶ５分离毒株的致病性分析

第四章ＰＩＶ５分离毒株的致病性分析

４．１实验材料

４．１．１实验动物与毒株

１２只雪貂均购自丹麦，于哈尔滨兽医研究所生物安全三级实验室负压隔离器中饲养３天左右
使其适应生活环境，总共隔离饲养１４天，每天测量体重和体温。ＰＩＶ５病毒液来自３．３．１分离纯化
得到的病毒。

４．１．２主要试剂

ＴＢ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ荧光染料、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ反转录酶、Ｔｎｚｏｌ等

均购自Ｔａｋａｒａ公司；病毒ＲＮＡ基因提取试剂盒购自ＡＸＹＧＥＮ公司。

４．１．３实验设备

高速离心机（上海力申有限公司）；称量天平（Ｄｅｎｖｅｒ，ＵＳＡ）：４ ０Ｃ台式离心机（湖南湘仪有
限公司）；电热恒温水浴槽（上海一维科技有限公司）；．８０。Ｃ超低温冰箱（海尔公司）；组织研磨

仪（北京吴诺斯科技有限公司）。手术刀，剪刀，镊子均高压灭菌，酒精棉球，无菌注射器。

４－２实验方法

４．２．１实验分组及攻毒

为研究ＰＩＶ５分离株对雪貂的致病性，本实验将１２只雪貂随机分为两组，分别为感染组和对
照组，每组各６只雪貂，为了避免交叉感染，感染组和对照组分别在不同的负压隔离器中饲养，
感染组通过鼻腔接种蚀斑纯化后的第十代病毒液各ｌ×１０５，ＴＣＩＤｓｏ／ｍｌ，对照组以相同途径接种对
应剂量的ＤＭＥＭ细胞培养基。

４．２．２临床症状观察

每天观察并记录感染组和对照组动物的食欲、精神状况、粪便及眼睑，结膜等部位的变化，

根据Ｖａｎｇｅｅｌ等的方法对临床症状进行打分（Ｖａｎｇｅｅｌｅｔａｌ．，２００７），各项临床症状指标的打分范围
在０－３分（未出现任何临床症状记为０，出现精神沉郁、厌食、流鼻涕、挤在一起、呼吸困难、
活动量低、咳嗽、发热、流泪、粪便变软等临床症状各记为ｌ，／＞３分代表动物发病），并绘制体
温体重变化曲线。

４．２．３样品采集及病毒载量测定

在感染的第０天起，攻毒组和对照组各取６只雪貂，尾部静脉采集全血５００ ＩｌＬ／只，每隔三
天采一次血，用于检测血清中的病毒载量。动物攻毒后，若出现死亡，及时进行尸检。收集鼻甲

２０

万方数据
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骨、扁桃体、气管、肺、肝、小肠、肾、胰腺、脾脏、大脑等组织于－８０℃保存。并将肉眼观察到
病变明显的组织如肺脏、大脑、脾脏等用１０％的甲醛溶液４。Ｃ过夜固定，然后石蜡包埋处理，每
个标本获得４ ｕｍ切片，进行ＨＥ染色，用于常规的病理组织学观察。
采用实时荧光定量ＰＣＲ方法，取出．８０℃保存的肺脏，大脑，脾脏，气管和小肠等病变明显
的组织，用无菌剪刀剪取０．１ ｇ组织，加入３００ ｇＬ的ＰＢＳ，用组织研磨仪处理至匀浆，在．２０℃中

反复冻融３次，８０００×ｇ离心３ ｒａｉｎ，取上清，ＲＮＡ提取步骤同２．２．３操作并进行反转录后用于测
定其病毒载量。

４．２．４血液学分析

在感染的第０天起，攻毒组和对照组各取６只雪貂，尾部静脉采集全血５００ ｕＬ／只，每隔三
天采一次血，用于血常规的检测。

４．２．５细胞因子和趋化因子ｍＲＮＡ转录水平的检测

根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中提供的雪貂ｌＬ－１ｐ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＦＮ吖、ＴＮＦ－ｄ、ＧＡＰＤＨ
的核酸序列，选取保守性高的序列发计特异性荧光定量引物（如表４．１所示），按照ＴＢ Ｇｒｅｅｎ试
剂盒说明书进行反应体系的配置，如下所示：

试剂 体积（ｕＬ）

ＴＢＧｔｅｅｎ ＩＩ（２×） ｌＯ

Ｆ（ｕｍ） ０．８

Ｒ（ｕｍ） ０．８

ＰｏｘＤｖｅ ＩＩ ０．４

ｄｄＨ２０ ６

ｃＤＮＡ ２

反应程序

９５℃ ３０ Ｓ

９５℃ ５ Ｓ
］
６０℃ ３０ ｓ ４０ ｃｙｃｌｅｓ

９５℃ １５ ｓ Ｊ
６０℃ ｌ ｍｉｎ

９５℃ １５ Ｓ

表４．１雪貂细胞因子和趋化因子的引物序列

Ｔａｂｌｅ ４－１ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｅｒｒｅｔｓ ｅｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ

万方数据
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表４一ｌ（续）

４．３实验结果

４．３．１雪貂存活率及体重体温变化

本实验将１２只雪貂随机分为感染组和对照组，每组６只，在相同条件的隔离器中单独饲养，
进行为期１４天的观察。在实验期间，为评价Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株的致病性，每天观察雪貂的临床体

征。感染组和对照组的存活率均为１００％（图４—１Ａ）。感染组主要表现为抑郁、厌食、流鼻涕、挤

在一起、呼吸困难、活动量低、咳嗽，且感染组临床平均评分明显高于对照组（ｐ＜０．０１），相比之
下，对照组雪貂在感染后ｏ￣１４天没有任何临床症状（图４．１Ｂ）。动物在感染后第４天开始持续高

烧（＞３９＂Ｃ），直到第８天，平均体温在感染后第６天达到最高，对照组雪貂在整个实验过程中体
温正常（图４—１Ｃ）。如图４．１Ｄ所示，感染Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株的动物体重显著低于对照组。
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万方数据
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图４．１ ＰＩＶ５感染雪貂的临床评价。Ａ．Ｄ：每组六只雪貂接种病毒液１００ ｕＬ。评估生存率（Ａ）、临床评分（Ｂ）、

体温（Ｃ）和体重（Ｄ）。体温超过３９。Ｃ（＞３９℃）定义为发热。

Ｆｉｇ．４－ｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｅｒｒｅｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰＩＶ５．Ａ－Ｄ：Ｓｉｘ ｆｅｒｒｅｔｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ

ｗｉｔｈ ｌ ００ ｕＬ ｖｉｒｕｓ．Ａ：Ｓｕｒｖｉｖａｌ；Ｂ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅｓ；Ｃ：Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｄ：Ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｓｓｅｄ ａｎｄ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ．Ｂｏｄｙ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ａｂｏｖｅ ３９℃（＞３９℃）ｗｅｒｅ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ ｆｅｖｅｒ．

４．３．２病理解剖及病理组织学评价

雪貂接种Ｔｉｃｋ／ＨＵ／２０１９株后，各个脏器组织出现了不同程度的病变，解剖发现与阴性对照
组相比，感染组雪貂的肺脏表面可见严重的间质水肿和弥漫性出血，感染肺实质较对照组更坚硬、
更重（图４—２Ａ）。死亡的雪貂可见大脑充血和肿大（图４—２Ｂ）。感染的雪貂脾脏表现为严重肿胀、

出血和坏死（图４．２Ｃ）。在尸检时从对照动物收集的组织中没有观察到肉眼可见的损伤（图４—２
（Ｄ—Ｆ））。

组织病理学检查结果显示，对照组肺组织有轻微充血现象，肺泡结构正常，无明显的炎症反

应，感染组肺组织结构破坏，出现广泛性淤血，部分可见含铁血黄素沉积，肺泡上皮细胞增生及
炎性细胞浸润导致肺泡膈中等程度增宽（图４－２Ｇ）。大脑组织胶质细胞增生，部分神经元细胞变
性坏死，小血管周围可见胶质细胞围管性浸润（图４—２Ｈ）。脾脏中红髓部分可见含铁血黄素沉积，
幼稚性红细胞增生（图４．２Ｉ），对照组没有观察到肉眼可见的明显病变（图４．２（Ｊ．Ｌ））。

ｉ
．
，

图４．２ ＰＩＶ５感染后雪貂的眼观病变及病理组织学变化。Ａ：严重的肺间质水肿和弥漫性出血；Ｂ：脑部充血和肿

大；Ｃ：脾脏严重肿大易碎出血坏死；Ｄ．Ｆ：对照组；Ｇ：广泛充血，含铁血黄素沉积、肺泡上皮细胞增生和炎

症细胞浸润导致肺泡隔增宽（苏木精伊红染色，ｂａｒ＝１００ ｕｍ）；Ｈ：脑组织ｄ、ｉｌｎ管周围可见胶质细胞增生和血管

２３

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第四章ＰＩＶ５分离毒株的致病性分析

周围浸润（苏木精．伊红染色，ｂａｒ＝１００¨ｍ）；Ｉ：红髓中有少量含铁血黄素沉积，脾脏有幼稚性红细胞增多（苏

木精．伊红染色，ｂａｒ＝１００肛ｍ）；Ｊ－Ｌ：阴性对照（健康雪貂组织学变化，苏木精．伊红染色，ｂａｒ＝１００ ｐ．ｍ）。

Ｆｉｇ．４－２ Ｇｒｏｓｓ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｆｅｒｒｅｔｓ ｗｉｔｈ ＰＩＶ５．Ａ：Ｓｅｖｅｒｅ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ

ｏｅｄｅｍａ ａｎｄ ｄｉｆｆｕｓｅ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｏｆｔｈｅ ｌｕｎｇ；Ｂ：Ｈｙｐｅｒｅｍｉａ ａｎｄ ｅｎｌａｒｇｅｄ ｏｆｔｈｅ ｂｒａｉｎ；Ｃ：Ｓｅｖｅｒｅ，ｅｎｌａｒｇｅｄ，ｆｒｉａｂｌｅ．

ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ ａｎｄ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ；Ｄ—Ｆ：Ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｌｕｎｇ，ｂｒａｉｎ，ｓｐｌｅｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；Ｇ：Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ

ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｓｉｄｅｒｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｌｖｅｏｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ

ｗｉｄｅｎｉｎｇ ｏｆａｌｖｅｏｌａｒ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｏｆｌｕｎｇｓ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｂａｒ＝１００肛ｍ）；Ｈ：Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ

ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｃａｒｌ ｂｅ ｓｅｅｎ ａｒｏｕｎｄ ｓｍａｌｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ

ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｂａｒ＝１ ００“ｍ）：Ｉ：Ｒｅｄ ｐｕｌｐ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｓｍａｌｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆｈｅｍｏｓｉｄｅｒｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｓｐｌｅｅｎ

（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｂａｒ＝１００ ｌａｍ）；Ｊ—Ｌ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｆｅｒｒｅｔ，ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ

ａｎｄ ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｂａｒ＝１００“ｍ）．

４．３．３不同组织病毒载量的测定

为了检测感染ＰＩＶ５雪貂的组织嗜性，我们分别收集感染后第３天，第６天和第１４天雪貂的
鼻甲骨、气管、肺、肝、小肠、肾、胰腺、脾脏、大脑等组织和血清样本进行病毒载量的测定。
根据以往的研究报道，ＰＩＶ５主要损害动物的呼吸器官和神经器官。为了进一步研究Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９
株在雪貂的呼吸道和大脑中是否复制，我们在第３天对两只雪貂分别实施安乐死，测定各个组织
中的病毒ＲＮＡ。第３天时肺脏中的病毒ＲＮＡ水平较高，其他组织中的病毒ＲＮＡ水平较低（图
４．３Ａ）。在第６天时感染组中２只雪貂陆续出现发热和食欲不振的症状，为了研究这些症状是否
由病毒引起，我们对两只雪貂实施了安乐死，收集各个组织器官用于病毒ＲＮＡ检测。病毒ＲＮＡ
在大脑组织和血清中含量相对较低，然而病毒ＲＮＡ在肺和脾脏中显著升高（图４—３Ｂ）。所有的雪

貂在第１４天全部安乐死，除了在感染组的雪貂肺部检测到较高的拷贝数（１０４－２ｃｏｐｉｅｓ／ｕＬ），在脾
脏、大脑和血清中的病毒ＲＮＡ也有所升高，其他任何组织或器官均未检测到病毒ＲＮＡ（图４－３Ｃ

和图４－３Ｄ）。感染后的第６天和第１４天均在感染雪貂的肺中检测到较高的病毒ＲＮＡ。肺是ＰＩＶ５
最敏感的器官，在第１４天时病毒载量最高。这些结果表明，Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株可以在雪貂上呼吸
道和大脑中复制长达１４天，动物不会发生死亡。结果显示ＰＩＶ５主要在肺脏和大脑组织复制。这
与之前的病理解剖和组织切片观察结果相符合。

Ａ ｌ感染组 Ｂ
Ｉ感染组
＋。・对照组 Ｉ对照组
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３ ６ １４ ３ ６ １４

感染天数（ｄ１ 感染天数（ｄ）

２４

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ｌ嚣。一ｑ繇氐颦《ｚ篮据必
０
６ １４
６ １４

感染天数《ｄ Ｊ 感染天数《ｄＪ

图４．３ ＰＩＶ５感染雪貂各组织的病毒载量。Ａ．Ｄ：感染后第３，６，１４天，制备各器官组织匀浆，利用ｑＰＣＲ检测

病毒ＲＮＡ。图中黑色虚线代表检测限。

Ｆｉｇ．４－３ Ｌｏａｄ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｃｏｐｉｅｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆＰｌＶ５－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｆｅｒｒｅｔｓ．Ａ・Ｄ：Ｏｎ ３．６ ａｎｄ １４ ｄｐｉ．Ｅａｃｈ ｏｒｇａｎ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ

ａｎｄ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｑＰＣＲ．Ｔｈｅ ｄａｓｈｅｄ ｂｌａｃｋ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｐａｎｅｌｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

４．３．４细胞因子和趋化因子ｍＲＮＡ表达动力学及血液学测定

血液学参数是其主要临床诊断指标之一，如果被感染或储存病毒的蜱通过叮咬和吸血将Ｐ１Ｖ５
病毒传播给家畜和野生动物，这将是疾病传播的重要来源。我们收集了Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株感染雪
貂的血液，比较了它们的动态平衡因子。结果显示感染雪貂的红细胞计数（ＲＢＣ）、血红蛋白浓度
（ＨＧＢ）、中性粒细胞（ＮＥＵ）、嗜酸性粒细胞（ＥＯＳ）和嗜碱性粒细胞（ＢＡＳＯ）参数均正常（图
４－４（Ａ．Ｅ））。与对照组相比，感染雪貂的白细胞（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）、淋巴细胞（ＬＹＭ）和
单核细胞（ＭＯＮＯ）指标均出现异常。单核细胞参数在感染第６天下降到基线，在第１４天恢复
到正常范围（图４．４Ｆ）。在感染的第３～６天，雪貂的淋巴细胞参数持续下降，低于正常范围，然

后在第１４天迅速增加（图４。４Ｇ）。另外，在白细胞计数参数中也发现了类似的结果（图４－４Ｈ）。
与对照组相比，感染第３～１４天试验组雪貂的血小板计数仍低于正常范围（图４．４Ｉ）。为探讨

Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９株的发病机制和免疫应答，利用ｑＰＣＲ检测细胞因子和趋化因子在ｍＲＮＡ水平的
表达。结果表明，与对照组相比，感染组雪貂细胞因子和趋化因子的表达有不同程度的增加。全

血ＰＢＭＣ中ＩＬ．４、ＩＬ一６、ＩＬ一８、ＩＦＮ。１３和ＴＮＦ．０【的表达均上调，而ＩＬ．１０与对照无显著差异（图
４．４Ｊ）。提示Ｔｉｃｌ（／ＨＬＪ／２０１９感染组可能诱导炎症反应，细胞因子和趋化因子如ＩＬ一４、ＩＬ．６、ＩＬ．８、

ＩＬ．１０、ＩＦＮ．１３和ＩＦＮ一０【可能与疾病的严重程度有关。

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 中国农业科学院硕士学位论文 第四章ＰＩＶ５分离毒抹的致病性分析

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Ｉ ＩＬ．４ ＩＬ．ｎ ｌＬ．８ ＩＬ．１（） ＩＦＮ．ｎ ＴＮＦ．“

图４．４ ＰＩＶ５感染雪貂的血液生化分析和ＰＢＭＣｓ免疫相关基因ｍＲＮＡ表达水平。Ａ—Ｉ：采集第３，６。１４天的雪

貂的血液，使用Ｃｅｌｌｔａｃ血液分析仪进行血液学检查。每项实验重复３次。Ｊ：第３、６、１４天感染组和对照组雪

貂ＰＢＭＣｓ中的相关细胞因子和趋化因子ｍＲＮＡ水平。采用实时定量ＲＴ－ＰＣＲ检测各组细胞因子和趋化因子基

因ｍＲＮＡ水平。并与雪貂ＧＡＰＤＨ的ｍＲＮＡ水平进行比较。采用２。△ｃｔ法进行ｍＲＮＡ的相对定量（ＲＱ）和各

基因的相对倍数变化（Ｙ轴）。

Ｆｉｇ．４－４ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ Ｉｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ＰＢＭＣｓ ｏｆ ＰＩＶ５－

ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｆｅｒｒｅｔｓ．Ａ—Ｉ：Ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｆｅｒｒｅｔｓ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ

ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｅｌｌｔａｃ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ ａｔ ３，６，１４ ｄ．ｐ．ｉ．Ｅａｃｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ

ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｅａｔｓ．Ｊ：Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ＰＢＭＣｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｆｅｒｒｅｔｓ ｏｒ ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ

ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｏｒ ３，６，ａｎｄ １４ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｏｆｅａｃｈ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－

ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｅｒｒｅｔ ＧＡＰＤＨ．Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ（ＲＱ）ｏｆｍＲＮＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ

ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２。６６。’ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｅａｃｈ ｇｅｎｅ ｆｙ－ａｘｉｓ）．

４．４讨论

１９５６年科学家首次在在恒河猴和食蟹猴肾细胞（Ｒｈｅｓｕｓ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ—ｃｅｌｌ）

中成功分离出了ＳＶ５，认为该病原的天然宿主是猴子（ＨＵＬＬｅｔａｌ．，１９５６），然而１９７２年，Ｈｓｉｕｎｇ

２６

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第四章ＰｌＹ５分离霉株的致病性分析

等科学家们发现，人类在自然条件下也能被这种病毒感染（ＨＳｒＬ小Ｇ，１９７２），随后不同宿主感染
ＰＩＶ５的病例时有报道，从家养经济动物再到野生动物感染（ＣＨＡＴｚＩＡＮＤＲＥＯｕ ｅｔ ａ１．，２００４；刘

永相，２０１５），地区及物种不断增多（ＣＨＵＡｅｔ ａ１．。２０００；ＮＡＧＡＯ ｅｔａｌ．，２０１２：ＣＰ。ＴＲＥ．ＳＯＳＳＡＨ

ｅｔ ａ１．，２０１６：高菽蔓等，２０１６），主要侵袭宿主的神经系统和呼吸系统（ＢＡＵＭＧＡＲＴＮＥＲ ｅｔ ａ１．，

１９８２；ＬＩＵｅｔａｌ．，２０１５）。１９８０年Ｅｖｅｒｒｎａｒｍ等从犬脑脊液中成功分离到一株犬源ＰＩＶ５，该患犬行
为表现为后肢麻痹、运动失调（ＥＶＥＲＭＡＮＮ ｅｔ ａ１．，１９８１）。后续研究进一步证实ＰＩＶ５还可引起
犬急性脑脊髓炎症和脑内积水，严重患犬最终导致后躯麻痹和瘫痪或死亡（ＣＨＥＮ ｅｔ ａ１．，２０１２）。

１９９８年在感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，

ＰＲＲＳＶ）的配种母猪的肺中发现了ＳＥＲ分离株（ＨＥＩＮＥＮｅｔａｌ．。１９９８）。２０１５年扈荣良等（ＨＵ ｅｔ
ａ１．，２０１５）从病死牛中分离到一株命名为ＢＣｌ４牛源ＰＷ５，肺部呼吸困难和间质性肺炎可能是导
致病牛死亡的主要原因，提示ＰＩＶ５与呼吸道感染有潜在的关联。虽然目前还没有关于ＰＩＶ５引起

腹泻症状的相关报道。但是已有研究人员从我国各直辖市受腹泻影响的仔猪中分离到５株Ｐ１Ｖ５
毒株（ＬＥＥ ｅｔ ａ１．，２０１３）。２０１９年谢金鑫等（Ｘｍ ｅｔ ａ１．，２０２０）首次在马的粪便样品中分离到一株
马源ＰＩＶ５命名ＸＪ０３３，在３４４份样品中，阳性样本数２ｌ份感染率６．１％，这些阳性样品中大部分
都来自同一马术俱乐部的马种，提示ＰＩＶ５可能在马中循环传播，系统发育分析表明，马源ＰＩＶ５
与人源ＡＧＳ分离株处于同一个单一的分支，但与其他动物源的ＰＩＶ５株的谱系存在较大差异。表
明这可能是一种人源病毒。然而，ＰＩＶ５与人类疾病的联系仍然存在争议，还没有达成明确的共识。
ＰＩＶ５的疾病症状从急性到慢性病各不相同，健康的病毒携带者没有症状。同一宿主中不同Ｐ１Ｖ５

的毒力在不同分离株问可能存在差异。近年来世界各国养犬业不断发展，尤其是家养伴侣宠物数
量的不断增加，ＰＩＶ５越来越引起人们的重视。因此，控制ＰＩＶ５的感染不仅对畜牧业生产有重要
意义，对公共生物安全意义更重大，ＰＩＶ５可能在未来的某一天将是人类面临的主要公共卫生问题
之一。

截止目前，还不清楚是否ＰＩＶ５入侵中国并导致了这些毒株的流行。据我们所知，目前还没
有关于蜱类中ＰＩＶ５的报道，它也可能起源于蜱类。所以我们利用雪貂进行了动物致病性实验。
本研究的目的是评价Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９分离株对实验感染雪貂的临床症状、各脏器的病毒载量和病
理组织学变化。通过鼻腔接种剂量为１×１０５一ＴＣＩＤ５０／ｍｌ的病毒液，于感染后第３天进行体征评
估和血清及脏器病毒载量的检测。我们记录了所有的微观和宏观损伤，通过病毒载量来分析ＰＩＶ５
感染雪貂的组织嗜性。动物试验研究表明，Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９分离株在雪貂呼吸道和神经组织广泛复
制。感染Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９的雪貂在接种后３－６天开始出现轻微临床症状，包括发热、流鼻涕、蜷
缩在一起，随着时间的推移，症状逐渐显现，与健康对照组相比，感染Ｔｉｅｋ／ＨＬＪ／２０１９株的雪貂
体重明显下降。与对照组相比，感染组主要的组织病理学表现为肺组织结构破坏，出现广泛性淤
血，部分可见含铁血黄素沉积，肺泡上皮细胞增生及炎性细胞浸润导致肺泡膈中等程度增宽。大
脑组织胶质细胞增生，部分神经元细胞变性坏死，小血管周围可见胶质细胞围管性浸润。脾脏中
红髓部分可见含铁血黄素沉积，幼稚性红细胞增生，表明ＰＩＶ５在雪貂身上引起非常慢性的疾病
且未造成动物死亡；此外，感染前期在肺脏组织中观察到较高的病毒载量，说明该病毒可通过上
呼吸道向外排毒，这对了解ＰＩＶ５传播途径有很大的意义，感染后期脾脏和大脑组织中病毒含量
较高。这些特征与ＰＩＶ５感染其他动物如牛、犬、小熊猫等引起的临床症状及病理组织学变化相
似（ＬＩＵ ｅｔ ａ１．，２０１７；ＺＨＡＩ ｅｔ ａ１．，２０１７；ＭＥＬＡＮＩＥ ｅｔ ａ１．，２０２０）。感染Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９毒株的雪貂

２７

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第四章ＰｌＹ５分离毒株的致病性分析

出现严重的白细胞、血小板、淋巴细胞减少，并诱导Ｂ．干扰素（ＩＦＮ．１３）和促炎性细胞因子产生。
因此，雪貂动物模型感染实验进行血液学分析对于ＰＩＶ５的诊断是必不可少的。我们推测如果被
感染或储存病毒的蜱能够通过叮咬和吸血将ＰＩＶ５传播给家畜和野生动物，这将是疾病传播的重
要来源。综上所述，这些结果表明，ＰｌＶ５在野生动物之间的跨物种传播是可能的。为了更好地了
解新的ＰＩＶ５的流行病学特点和进化特征，需要对不同物种的ＰＩＶ５进行进一步的监测。需要分离
和分析更多不同来源的病毒，以充分了解疾病的传播情况，并制定有效的控制策略。

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 第五章全文结论

第五章全文结论

１．本研究以黑龙江省大兴安岭、黑河和伊春地区媒介生物蜱为研究对象，对其携带的病毒进行宏
基因组分析，获得了该地区全沟硬蜱携带病毒的本底情况，发现该地区全沟硬蜱样本中布尼亚病
毒科、副粘病毒科和肠道病毒科的注释量较高。
２．首次从全沟硬蜱中成功分离得到一株ＰＩＶ５，命名为Ｔｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９。病毒全长基因遗传进化分
析表明，Ｔｉｅｋ／ＨＬＪ／２０１９分离株与国内野生动物源ＰＩＶ５亲缘关系较近，而与其他家畜分离的ＰＩＶ５
参考株处于不同的进化分支。

３．动物试验研究表明，接种Ｙｉｃｋ／ＨＬＪ／２０１９毒株的雪貂动物模型出现严重的呼吸窘迫，并伴有肺
炎和神经组织损伤性炎症，且在呼吸器官和神经器官广泛性复制。

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 参考文献

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ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ＤＮａｓｅ ｔｒｅａａｎｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｔｗｏ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｓｐｅｃｋｓ．

Ｐｒｏｅ Ｎａｔｌ Ａｅａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８（２０）：ｌ １６０９－１４．ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２１ １４２４６９８．

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ＧⅡ也Ｓ ｌ（’Ｐ脏ＬＡＮ Ｅ，ＴＡＲＪＹＡＬ Ｒ，ＴＥ、州ＥＹ Ｒ，ＯＭＯＮＩＷＡ Ｏ，ＦＵＬＬＡＨ Ｍ，ＦＯＮＮＩＥ １Ｌ ＦＯＮＮＩＥ

Ｍ，ＫＡＮＮＥＨ Ｌ，ＪＡＬＬＯＨ Ｓ，ＧＢＡＫＩＥ Ｍ，ＳＡＦＦＡ Ｓ，ＫＡＲＢＯ ｌ（，ＧＬＡＤＤＥＮ Ａ Ｄ，ＱＵ Ｊ，ＳＴＲＥＭＬＡＵ

Ｍ，ＮＥＫＯＵＩ Ｍ，ＦＩＮＵＣＡＮＥ Ｈ Ｋ，ＴＡＢＲＩＺＩ Ｓ，ＶＩＴＴＩ Ｊ Ｊ，ＢＩＲＲＥＮ Ｂ，ＦＩＴＺＧＥＲＡＬＤ Ｍ，ＭＣＣＯＷＡＮ

Ｃ，ＩＲＥＬＡＮＤ Ａ，ＢＥＲＬＩＮ Ａ Ｍ，ＢＯＣＨＩｃＣＨＩＯ Ｊ，１：ｆ坦ＯＮ・ＶＥＧＡ Ｂ，ＬＥＮＮＯＮ Ｎ Ｊ’ＲＹＡＮ Ｅ Ｍ，

ＢＪＯＲＮＳＯＮ ｚ，ＭＩＬＮＥＲ Ｄ Ａ，ＬＵＫＥＮＳ Ａ Ｋ ＢＲＯＯＤＩＥ Ｎ，ＲＯＷＬＡＮＤ Ｍ，ＨＥ州砌ＣＨ Ｍ，ＡＫＤＡＧ

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 参考文献

Ｍ，ＳＣＨＩＥＦＦＥ乙Ⅱ呵Ｊ Ｓ，ＬＥＶＹ Ｄ，ＡＫＰＡＮ Ｈ，ＢＡＵＳＣＨ Ｄ Ｇ，ＲＵＢＩＮＳ Ｋ，ＭＣＣＯＲＭｌＣＫ Ｊ Ｂ，

ＬＡＮＤＥＲ Ｅ Ｓ，ＧＵＮＴＨＥＲ Ｓ，ＨＥＮＳＬＥＹ Ｌ，０ＫＯＧＢＥＮＩＮ Ｓ，２０１５．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｎｃｏｖｅｒｓ

Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆＬａＳｓａ Ｖｉｒｕｓ．Ｃｅｌｌ，１６２（４）：７３８－５０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０７．０２０．

ＢＡＪＩＭＡＹＡ Ｓ，ＨＡＹＡＳＨＩ Ｔ’ＴＡⅪＭＯＴＯ Ｔ＇２０】７．Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆＳｅｎｄａｉ ＶｉｍＳ ｆｒｏｍ ＣＩｏｎｅｄ ｃＤＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ

Ｍｏｌ Ｂｉ０１．１６０２：１０３・１１０．ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－１－４９３９－６９６４－７－７．

ＢＡＵＭＧＭ≈ＴＮＥＲ Ｗ Ｋ，ＫＲＡＫＯＷＫＡ Ｓ，ＫＯＥＳＴＮＥＲ Ａ，ＥＶＥＲＭＡＮＮ Ｊ，１９８２．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ

ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｉｎ ｄｏｇｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ．Ｖｅｔ

Ｐａｔｈｏｌ，１９（３）：３０５—１４．ＤＯＩ：１０．１１７７／０３００９８５８８２０１９００３０８．

ＢＥＮＣＨ Ｓ Ｒ，ＨＡＮＳＯＮ Ｔ Ｅ，ＷＩＬＬＩＡＭＳＯＮ Ｋ Ｅ，ＧＨＯＳＨ Ｄ，ＲＡＤＯＳＯＶｌＣＨ Ｍ，、张ＮＧ Ｋ，

ＷＯＮｎＩ＾ＣＫ Ｋ Ｅ．２００７．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ Ｂａｙ ｖｉｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎ．Ａｐｐｌ

Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．７３（２３）：７６２９－４１．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．００９３８—０７．
ＢⅢＺＨⅢ、德＆ＺＡＧＯＲＯＤＮＹＡＹＡ Ｔ’ ＫＡＩｔＡＧ认ＮＮＩＳ Ｋ， ＳＩＭＯＮＹＡＮ ｖ’ＬＡＡＳＳＲＩ Ｍ，

ＣＨＵＭＡＫＯＶ Ｋ．２０１４．Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．

ＪⅦｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９：６８・７５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２０１３．１２．０１８．
ＢＩＮＮ Ｌ Ｎ，ＥＤＤＹ Ｇ Ａ，ＬＡＺＡＲ Ｅ Ｃ，ＨＥＬＭＳ Ｊ，ＭＵＲＮＡＮＥ Ｔ，１ ９６７．Ｖｉｒｕｓｅｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ

ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，１２６（１）：１４０—５．ＤＯＩ：１０．３１８Ｉ／００３７９７２７－１２６－

３２３８６．

ＢＯＳＥ Ｓ，既ＡＴＨＣＭ，ＳＨＡＨＰＡ，ＡＬＡＹＹＯＵＢＩＭ，ＪＡＲＤＥＴＺＫＹＴ Ｓ，ＬＡＭＢＲＡ，２０１３．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ

ｉｎ ｔｈｅ ｐａｍｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｖｅａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｎｄ

ｍｅｔａｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｖｉｒ０１．８７（２４）：１３５２０－３１．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２１２３－１３．
ＢＲＥＩＴＢＡＲＴ Ｍ，ＳＡＬＡＭＯＮ Ｐ，ＡＮＤＲＥＳＥＮ Ｂ，ＭＡＨＡＦＦＹ Ｊ Ｍ，ＳＥＧＡＬＬ Ａ Ｍ，Ｍ匣ＡＤ Ｄ，ＡＺＡＭ Ｆ，

ＲＯＨＷＥＲ Ｆ，２００２．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，

９９（２２）：１４２５０－５．ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２０２４８８３９９．
ＣＩ！ＴＲＥ－ＳＯＳＳＡＨ Ｃ，ＫＷＩＡＴＥＫ Ｏ，ＦＡＨＡＲＯＵＤＩＮＥ Ａ，ＳＯＵＬＥ Ｍ，ＭＯＵＴＲＯＩＦＩ Ｙ Ｏ，ＶＩ砸Ｌ Ｍ Ａ，

ＳＡＬＡＭＩ Ｈ，ＲＡＳＳＯＵＬ Ｓ，ＡＳＮＡＯＵＩ Ｍ，ＭＯＩＮＤＪＩＥ Ｙ ＡＬＢＩＮＡ Ｅ，ＬＩＢＥＡＵ Ｇ，ＣＡＲＤＩＮＡＬＥ Ｅ，

２０ １ ６．Ｉｍｐａｃｔ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｃｕｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｐｒｅａｄ ｏｆ Ｐｅｓｔｅ ｄｅｓ Ｐｅｔｉｔｓ

Ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｍｏｒｏｓ Ａｒｃｈｉｐｅｌａｇｏ：Ａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｔｈｒｅａｔ ｔｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｉｓｌａｎｄｓ．Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ

Ｅｍｅｒｇ Ｄｉｓ，６３（４）：４５２－９．ＤＯＩ：１０．１ｌ ｌ １／ｔｂｅｄ．１２２９６．

ＣＨ√＾ＴＺＩＡＮＤＲＥＯＵ Ｎ，Ｓ１ＤＣＫ Ｎ，ＹＯＵＮＧ Ｄ，ＡＮＤＲＥＪＥＶＡ Ｊ，ＨＡＧⅣ【ＡＩＥＲ Ｋ，ＭＣＧＥＯＣＨ Ｄ Ｊ，

Ｒ ＡＮＤＡＩ Ｌ Ｒ Ｅ，２００４．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｏｆｈｕｍａｎ，ｃａｎｉｎｅ，ｓｉｍｉａｎ ａｎｄ ｐｏｒｃＩｎｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ

ｓｉｌＩｌｉａｌｌ ｖｉｒｕｓ ５（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５）．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，８５（１０）：３００７－３０１６．ＤＯＩ：１０．１０９９／ｖｉｒ．Ｏ．８０２００－０．

ＣＨＥＮ Ｚ，ＸＵ Ｐ，ＳＡＬＹＡＲＤＳ Ｇ Ｗｊ ＨＡＩＷＥＹ Ｓ Ｂ，ＲＡＤＡ Ｂ，ＦＵ Ｚ Ｆ，ＨＥ Ｂ，２０１２．Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａ

ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５－ｂ硒ｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ａ ｈｏｓｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅ—ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５．

ＰＬｏＳ ＯＮＥ，７（１ １）：ｅ５０１４４．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ，ｐｏｎｅ．００５０１４４．

Ｃ瑚：ＮＺ，ＺＨＯＵＭ，ＧＡＯＸ，ＺＨＡＮＧＧ，ＲＥＮＧ，ＧＮＡＮＡＤＵＲＡＩＣ ｗ，ＦＵＺ Ｆ，ＨＥＢ，２０１５．Ａｎｏｖｅｌ
ｒａｂｉｅｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，

８７（６）：２９８６－９３．ＤＯＩ：１０．１ １２８／ＪＶＩ．０２８８６－１２．
ＣＨＩＵ Ｃ Ｙ＇２０１３．Ⅶａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６（４）：４６８－４７８．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｉｂ．

３１

万方数据
 中国农业科学院硬士学位论文 参考文献

２０１３．０５．００１．

ＣｍＪＡ Ｋ Ｂ。ＢＥＬＬＩＮＩ Ｗ Ｊ，ＲＯＴＡ Ｐ Ａ，ＨＡＲＣＯＵＲＴ Ｂ Ｈ，ＴＡＭＩＮ Ａ，Ｌ舢ⅥＳ Ｋ，ＫＳ衄Ｋ Ｔ Ｇ，

ＲＯＬＬＩＮ Ｐ Ｅ，ＺＡＫＩ Ｓ Ｒ。ＳＨＩＥＨ彤ＧＯＬＤＳＭＩＴＨ Ｃ Ｓ，ＧＵＢＬＥＲ Ｄ Ｊ，ＲＯＥＨＲＩＧ Ｊ￡ＥＡＴＯＮ Ｂ，

ＧＯＵＬＤ Ａ凡ＯＬＳＯＮ Ｊ，ＨＥＬＤ Ｈ，ＤＡＮｌＥＬＳ Ｐ，ＬＩＮＧ Ａ Ｅ，ＰＥＴＥＲＳ Ｃ Ｊ，ＡＮＤＥＲＳＯＮ Ｌ Ｊ，ＭＡＨＹ Ｂ

Ｗ：２０００．Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ：ａ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｅｍｅｒｇｅｎｔ ｄｅａｄｌｙ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８（５４７０）：１４３２－５．

ＤＯＩ：ｌＯ．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２８８．５４７０．１４３２．

ＣＩ。ＡＲＫ Ｋ Ｍ，ＪＯＨＮＳＯＮ Ｊ Ｂ，ＫＯＣＫ Ｎ Ｄ，ＭＩＺＥＬ Ｓ Ｂ，ＰＡＲＫＳ Ｇ Ｄ，２０１ １．Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５－ｂａｓｅｄ

ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ（ＶＡＣＶ）ａｎｔｉｇｅｎｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｌｌ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ

ｌｅｔｈａｌ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ＶＡＣＶ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４１９（２）：９％１０６．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒ０１．２０１ １．０８．００５．

ＤＯＣＨＯＷ Ｍ，ＫＲＵＭＭ Ｓ Ａ，ＣＲＯＷＥ Ｊ Ｅ，ＭＯＯＲＥ Ｍ Ｌ，ＰＬＥＭＰＥＲ Ｒ Ｋ，２０１２．Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａＩ

ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８７（９）：６８７８・９ １．ＤＯＩ：１ ０．１０７４０ｂｃ．Ｍ ｌｌ １．

３２５２５８．

ＥＤＷＡＲＤＳ Ｒ Ａ，ＲＯＨＷＥＲ Ｆ＇２００５．Ｖｉｒａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３（６）：５０４・１０．ＤＯＩ：

１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏｌｌ６３．

ＥＲＬＥＳ Ｋ，ＤＵＢＯＶＩ Ｅ Ｊ，ＢＲ００ＫＳ Ｈ Ｗ，ＢＲＯＷＮＬＩＥ Ｊ，２００４．Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆｖｉｒｕｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ

Ｗｉｔｈ ｃａｎｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４２（１０）：４５２４－９．ＩＸ）Ｉ：１０．１ １２８／ＪＣＭ．４２．１０．

４５２４－４５２９．２００４．

ＥＶＥＲＭＡＮＮ Ｊ Ｅ ＬＩＮＣＯＬＮ Ｊ Ｄ，ＭＣＫＩＥＲＮＡＮ Ａ Ｊ，１９８１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ

ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ

ｃｅｒｅｂｍｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ａ ｄｏｇ ｗｉｔｈ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐａｒｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ

Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１７“１１）：１１３２－１１３４．

ＦＡＮＧ Ｙ，ＳＮＩＪＤＥＲ Ｅ Ｊ，２０１０，Ｔｈｅ ＰＲＲＳＶ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ：ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇ

ｓｅｔ ｏｆｎｏｎｓｎ＇ｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，１５４（１－２）：６１－７６．ＤＯＩ：１０．１０１６巧．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２０１０．０７．０３０．

ＦＩＬＬＯＵＸ Ｄ，ＦＥＲＮＡＮＤＥＺ Ｅ，ＬＯ瓜Ｅ Ｅ，ＣＬＡＵＤＥ Ｌ，ＧＡＬＺＩ Ｓ，ＣＡＮＤＲＥＳＳＥ Ｔ，Ｗ瞰ＴＥＲ Ｓ，ＪＥＥ、，Ａ

Ｍ Ｌ＇ＭＡＫＥＳＨＫＵＭＡＲ Ｌ ＭＡＲＴＩＮ Ｄ Ｐ’ＲＯＵＭＡＧＮＡＣ Ｂ ２０ １ ８．Ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｙａｍ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，８（１）：１７８７９．ＤＯＩ：１０．１０３８，Ｓ４１５９８－０１８－３６０４２・７．

ＨＥＩＮＥＮ Ｅ，ＨＥＲＢＳＴ Ｗｊ ＳＣＨＭＥＥＲ Ｎ，１ ９９８．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆａ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｃａｓｅ ｏｆｐｏｒｃｉｎｅ

ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＲＲＳ）ａｎｄ ｉｔｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．

ＡｒｃｈＶｉｒ０１．１４３（１１）：２２３３－９．ＤＯＩ：１０．１００７，娴７０５００５０４５４．
ＨＩＥＲＷＥＧＥＲ Ｍ Ｍ。ＷＥＲＤＥＲ Ｓ，ＳＥＵＢＥＲＬＩＣＨ Ｔ’２０２０．Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ５ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ

Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｏｆＣａｔｔｌｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２１（２）．ＤＯＩ：１０．３３９０／Ｕｍｓ ２１０２０４９８．

ＨＳｌＵＮＧ Ｇ Ｄ．１９７２．Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ－５ ｖｉｒｕｓ．Ｉｎｆｆｃｔｉｏｎ ｏｆｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ．Ｐｒｏｇ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，１４：２４１・７４．

ＨＵＬＬ Ｒ Ｎ，ＭＩＮＮＥＲ Ｊ Ｒ，ＳＭＩＴＨ Ｊ Ｗ，１ ９５６．Ｎｅｗ ｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆｍｏｎｋｅｙ

ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ．Ｉ．Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ Ｓ．Ｖ．Ｉ，Ｓ．Ｖ．２，Ｓ．Ｖ．４，Ｓ．Ｖ．５，Ｓ．Ｖ．６，Ｓ．Ｖ．Ｉ ｌ，

ｓ．Ｖ．１２ ａｎｄ ｓ．Ｖ．１５．Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ，６３（２）：２０４－２１５．ＤＯＩ：ｚｌＯ．１０９３／ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．面ｅ．ａｌ １９８０４．

ＪＩＡＮＧ Ｎ，ＷＡＮＧ Ｅ，ＧＵＯ Ｄ，ＷＡＮＧ Ｘ，ＳＵ Ｍ，ＫＯＮＧ Ｆ，ＹＵＡＮ Ｄ，ＺＨＡＩ Ｊ，ＳＵＮ Ｄ，２０１８．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ

ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５ ｉｎ ｄｉａｒｒｈｅａ－ａｆｆｅｃｔｅｄ ｐｉｇｌｅｔｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ

Ｓｃｉ，８０（４１：５９０．５９３．１３０１：１０．１２９２／ｊｖｍｓ．１７－０５８１．
ＫＡＦＥＴｚＯＰＯＵＬｏＵ Ｌ Ｅ，ＥＦＴＨＹＭ认ＤＩＳ ｌ（，ＬＥＷＡＮＤＯＷＳⅪＫ，ＣＲ００Ｋ Ａ，ＣＡＲＴＥＲ Ｄ，

３２

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 参考文献

ＯＳＢＯＲＮＥ Ｊ，ＡＡ．ＲＯＮＳ Ｅ，ＨＥＷＳＯＮ Ｒ，ＨＩＳＣＯＸ Ｊ Ａ，ＣＡＲＲＯＬＬ Ｍ Ｗ，ＶＩＰＯＮＤ Ｒ，ＰＵＬＬＡＮ Ｓ Ｔ，

２０１８．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｎｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．３（５０）．ＤｏＩ：
１０．２８０７／１５６０．７９１７．ＥＳ．２０１８．２３．５０．１８００２２８．

ＫＡＴ０ Ｈ，ＴＡｌ（ＥＵＣＨｌ ０，ＳＡＴｏ Ｓ，ＹＯＮＥＹＡＭＡ Ｍ，ＹＡＭＡＭＯＴｏ Ｍ，Ⅶ盯ＳＵＩ Ｋ，ＵＥＭＡＴＳＵ Ｓ，

ＪＵＮＧ Ａ，ＫＡＷＡＩ Ｔ，ＩＳＨＩＩ Ｋ Ｊ，ＹＡＭＡＧＵＣＨｌ Ｏ，０ＴＳＵ Ｋ，ＴＳＵＪＩＭＵＲ Ａ Ｔ，ＫＯＨ Ｃ Ｓ，ＲＥＩＳ Ｅ ＳＯＵＳＡ

Ｃ，～硝ＴＳＵＵＲＡ Ｙ，ＦＵＪｌＴＡ Ｔ＇ＡＫＩＲＡ Ｓ，２００６．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ～Ⅱ）Ａ５ ａｎｄ ＲＩＧ．Ｉ ｈｅｌｉｃａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ

ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆＲＮＡｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４４１（７０８９）：１０１－５．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０４７３４．

ＫＩＭ Ｍ Ｓ，ＷＨＯＮ Ｔ ｗ，ＢＡＥ Ｊ Ｗ，２０ ｌ ３．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ

ｆｒｏｍ Ｋｏｒｅａ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｉｎｆｏｍｌ，１１（３）：１２１．１２８．ＤＯＩ：１０．５８０８／ＧＩ．２０１３．１１．３．１２１．

ＫＳＩＡＺＥＫ Ｔ Ｇ，ＥＲＤＭＡＮ Ｄ，ＧＯＬＤＳＭｌＴＨ Ｃ Ｓ，ＺＡＫｌ Ｓ Ｒ，ＰＥＲＥＴ Ｔ’ＥＭＥＲＹ Ｓ，ＴＯＮＧ Ｓ，ＵＲＢＡＮＩ

Ｃ，ＣＯＭＥＲ Ｊ Ａ，ＬＩＭ Ｗ，ＲＯＬＬＩＮ Ｐ Ｅ，ＤＯＷＥＬＬ Ｓ Ｆ，ＬＩＮＧ Ａ Ｅ，ＨＵＭＰＨＲＥＹ Ｃ Ｄ，ＳＨＩＥＨ Ｗ Ｊ，

ＧＵＡＲＮＥＲ Ｊ，ＰＡＤＤＯＣＫ Ｃ Ｄ，ＲＯＴＡ Ｐ，ＦＩＥＬＤＳ Ｂ，ＤＥＲＩＳＩ Ｊ，ＹＡＮＧ Ｊ Ｙ，ＣＯＸ Ｎ，ＨＵＧＨＥＳ Ｊ Ｍ，

ＬＥＤＵＣ Ｊ Ｗ ＢＥＬＬＩＮＩ Ｗ Ｊ，ＡＮＤＥＲＳＯＮ Ｌ Ｊ，２００３．Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ

ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４８（２０）：１９５３－６６．ＤＯＩ：１０．１０５６仆７ＥＪＭｏａ ０３０７８ １．

ＬＥＥ Ｙ Ｎ，ＬＥＥ Ｃ，２０１ ３．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５ ｉｓｏｌａｔｅ ｉｎ

Ｋｏｒｅａ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，１５８（８）：１７６５．７２．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００７０５－０１３．１７７０．ｚ．

ＬＩＮ Ｇ Ｙ，ＬＡＭＢ Ｒ Ａ，２０００．Ｔｈｅ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｍｓ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５ Ｖ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｌｏｗｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ

ｃｙｃｌｅ．Ｊ Ｖｉｒ０１．７４（１９）：９１５２－６６．ＤＯＩ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７４．１９．９１５２－９１６６．２０００．
ＬＩＮ Ｙ ＢＲＩＧＨＴＡ Ｃ，ＲＯＴＨＥＲＭＥＬ ＴＡ，ＨＥ Ｂ，２００３．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｓｉｍｉａｎ

ｖｉｒｕｓ ５ ｌａｃｋｉｎｇ ａ ｓｍａｌｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７７（６）：３３７１・８３．ＤＯＩ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７７．６．３３７１・３３８３．

２００３．

ＬＩＵＣ，ＬＩＸ，ＺＨＡＮＧ Ｊ，ＹＡＮＧ Ｌ，ＬＩ Ｆ，ＤＥＮＧ Ｊ，ＴＡＮ Ｆ’ＳＵＮＭ，ＬＩＵＹＴＩＡＮＫ，２０１７．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ

ｇｅｎｏｍｉｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ａｒｃｈ Ｖｉｍｌ’１ ６２（８）：

２３３７．２３４４．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００７０５．０１７．３３８７．０．

ＬⅡＪ Ｈ，ＷＡＮＧ Ｊ，ＧＥ Ｓ，ＬＶ Ｙ，ＬＩ Ｙ，ＺＨＥＮＧ Ｄ，ＺＨＡ０ Ｙ，ＣＡＳＴＥＬＬＡＮ Ｄ，ＷｒＡＮＧ Ｚ，２０１９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｅｍｅ唱ｉｎｇ ｓｕｂ—ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｖ１］ｈ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｖｉｍｓ Ｇｅｎｅｓ，

５５（３）：３１４－３２１．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１２６２－０１９－０１６５１－５．
ＬｎＪ Ｙ ＬＩ Ｎ，ＺＨＡＮＧ Ｓ，ＺＨＡＮＧ Ｆ’ＬＩＡＮ Ｈ，ＨＵ Ｒ，２０１５．Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ５ ａｓ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｃａｕｓｅ ｏｆ

Ｓｅｖｅｒｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃａｌｖｅｓ，Ｃｈｉｎａ．Ｅｍｅ曙ｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２ １（１２）：２２４２－４．ＤＯｈ １ ０．３２０ １／ｅｉｄ

２１１２．１４１１１１．

ＬＩＵＹ ｚＨＡＮＧ Ｈ Ｐ＇ＺＨＡＮＧ Ｓ Ｆ，、）ｉ，ＡＮＧ ＪＸ，ＺＨＯＵ ＨＮ，ＺＨＡＮＧ Ｆ，ＷＡＮＧ Ｙ Ｍ，ＭＡＬ，ＬＩ Ｎ，ＨＵ

Ｒ Ｌ．２０ １ ５．Ｒａｂｉｅｓ Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｏｍｅｓｔｉｃ Ｃａｍｅｌｓ ａｎｄ Ｃａｔｔｌｅ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ．ＰＬｏＳ

Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ，１０（９）：ｅ０００４８９０．ＤＯＩ：１０．１３７Ｉ／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００４８９０．

ＭＡＬＵＲ Ａ Ｇ，ＨＯＦＦＭＡＮ Ｍ Ａ，ＢＡＮＥＰＯＥＥ Ａ Ｋ，２００４．１１１ｅ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３（ＨＰＩＶ

３）Ｃｐｒｏｔｅｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｖｉｒａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ，９９（２）：１９９－２０４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２００３．１１．００９．
ＭＣＣＡＮＤＬｌＳＨ Ｉ Ａ，１７－ＩＯＭＰＳＯＮ Ｈ，ＷⅪＧＨＴ Ｎ Ｇ，１９７８．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｉｎｅ ｂｏｒｄｅｔｅｌｌｏｓｉｓ：

ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔａｃｔｃｈａｌｌｅｎｇｅ．ＶｅｔＲｅｃ，１０２（２２）：４７９—８３．ＤＯＩ：１０．１１３６／ｙｒ．１０２．２２．４７９．

３３

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 参考文献

ＭＥＬＡＮＩＥ Ｍ Ｈ，ＳＩＭＥＡ Ｗｊ ＴＯＲＳＴＥＮ Ｓ，２０２０．Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ５ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ

ａｎｄ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｏｆＣａｔｔｌｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２ｌ（２）：４９８．ＤＯＩ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２１０２０４９８．

ＭＯＴＺ Ｃ，ＳＣＨＵＨＭＡＮＮ Ｋ Ｍ，ＫｌＲＣＨＨＯＦＥＲ Ａ，ＭＯＬＤＴ Ｍ，、）ｌ，Ｉ＿ｍ Ｇ，ＣＯＮＺＥＬＭＡＮＮ Ｋ Ｋ，

ＨＯＰＦＮＥＲ Ｋ Ｐ－２０１３．Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ Ｖ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｓｒｕｐｔ ｔｈｅ ｆｏｌｄ ｏｆｔｈｅ ＲＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ＭＤＡ５ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ

ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３．３３９（６１２０）：６９０－３．ＤＯＩ：１０．１ １２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３０９４９．

ＭＵＮＩＲＡＪＵ Ｍ，ＭＡＨＡＰＡＴＲＡ Ｍ，ＢＵＣＺＫＯＷＳＫＩ Ｈ，ＢＡＴＴＥＮ Ｃ，ＢＡＮⅥ～Ｉ①ＡＣ，队ＲＩＤＡ Ｓ，２０ １ ５．

Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｐｅｓｔｅ ｄｅｓ ｐｅｔｉｔｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ：Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ

ｓｔａｎｄａｒｄ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ，３３（３）：４６５・７１．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１４．１０．０５０．
ＮＡＧＡＯ Ｙ，ＮｌＳＨｌＯ Ｖ ＳＨＩＯＭＯＤＡ Ｈ，１’ＡＭＡＲＵ Ｓ，ＳＨＩＭｏＪＩＭＡ Ｍ，Ｇｏ，ｒＯ Ｍ，ＵＮＥ Ｙ，ＳＡｌ℃Ａ，

ＩＫＥＢＥ Ｙ’ＭＡＥＤＡ Ｋ，２０１２．Ａｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｉｇｅｒｓ（Ｐａｎｔｈｅｒａ ｔｉｇｒｉｓ）：ｐｏｓｓｉｂｌｅ

ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｆｒｏｍｗｉｌｄ ａｎｉｍａｌｓｔｏ ＺＯＯ ａｎｉｍａｌｓ．ＪＶｅｔＭｅｄＳｃｉ，７４（６）：６９９・７０５．ＤＯＩ：１０．１２９２／ｊｖｍｓ．１ｌ－
０５０９．

ＮＧ Ｔ Ｆ，ＭＡＮＩＲＥ Ｃ，ＢＯＩ∞ＷＭＡＮ Ｋ，ＬＡＮＧＥＲ Ｔ＇ＥＨＲＨＡＲＴ Ｌ，ＢＲＥＩＴＢＡＲＴ Ｍ，２００９．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ

ｏｆａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｅａ ｔｕｒｔｌｅ ｆｉｂｒｏｐａｐｉｌｌｏｍａ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｊ

ＶｉｒｏＩ，８３（６）：２５００－９．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪⅥ．０１９４６－０８．
ＰＡＲＫＥＲ Ｊ，ＣＨＥＮ Ｊ，２０ １ ７．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖｉｒａｌ

ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ ＣｌｉｎⅥｒ０１．８６：２０－２６．ＤＯＩ：１０．１０１６０．ｊｃｖ．２０１６．１ １．０１０．

ＰＨＡＮ ＳＩ，ＣＨＥＮＺ，ＸＵ Ｐ，ＬＩＺ，ＧＡＯＸ，ＦＯＳＴＥＲＳ Ｌ，ＴＥＮＧＭＮ，ＴＲＩＰＰＲＡ，ＳＡＫＡＭＯＴＯＫ，ＨＥ

Ｂ，２０１４．Ａ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５（ＰＩＶ５）．Ｖａｃｃｉｎｅ，

３２（２５）：３０５０－７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１４．０３．０４９．
ＲＩＭＡＢＫ，ＧＡＴＨＥＲＥＲＤ，ＹＯＵＮＧＤ Ｆ’ＮＯＲＳ肛ＤＨ，ＲＡＮＤＡＬＬＲＥ，ＤＡＶＩＳＯＮＡＪ，２０１４．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆｔｈｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｓｔＳ

ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐａｓｓａｇｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．ＪⅥｒｏｌ，８８（７）：３８２６－３６．ＤＯＩ：ｌＯ．１１２８／ＪⅥ．０３３５１－１３．

ＲｏＤＲＩＧＵＥＺ Ｋ Ｒ，ＨＯＲＶＡＴＨ Ｃ Ｍ，２０１４．Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ Ｖ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｅｎｓｏｒ

ＬＧＰ２ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ＭＤＡ５ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ＬＧＰ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＬＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ

ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒ０１．８８（１４）：８１８０－８．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００７３７－１４．
ＳＡＥＬＡＯ Ｐ，ＷＡＮ０ Ｙ＇ＣＨＡＮＴＨＡＶＩＸＡＹ Ｇ，ＹＵ Ｖ ＧＡＬＩ．ＡＲＤＯ Ｒ Ａ，ＤＥⅪ江ＲＳ Ｊ Ｃ Ｍ，ＬＡＭＯＮＴ

Ｓ Ｊ，ｌ（ＥＬＬＹ Ｔ，ＺＨｏＵ Ｈ，２０２ １．Ｄｉａｉｎｃｔ ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔｏｍｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ

ｄｕｒｉｎｇｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｔｒａｃｈｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｉｓｓｕｅ．ＳｃｉＲｅｐ，１１（１）：７４５０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８—０２ｌ一

８６７９５．ｘ．

ＳＣＨＭＩＴＴ Ａ Ｐ，ＬＥＳＥＲ Ｇ Ｐ＇ＭＯＲＩＴＡ Ｅ，ＳＵＮＤＱＵＩＳＴ Ｗ Ｉ，ＬＡＭＢ Ｒ Ａ，２００５．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｖｉｒａｌ

ｌａｔｅ－ｄｏｍａｉｎ ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＦＰＩ、‘ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｂｕｄｄｉｎｇ ｏｆ ａ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７９（５）：２９８８－９７．

Ｄ０ｌ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７９．５．２９８８－２９９７．

ＳＣＨＵＬＺＥ Ｔ Ｌ，ＪＯＲＤＡＮ Ｒ Ａ，ＳＣＨＵＬＺＥ Ｃ Ｊ，２００５．Ｈｏｓｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｘｏｄｅｓ ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ（Ａｃａｒｉ：

Ｉｘｏｄｉｄａｅ）ｉｎ ｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｓｅｔｔｉｎｇｓ ｉｎ ａ Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ—ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａ ｉｎ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ．Ｊ Ｍｅｄ

Ｅｎｔｏｍｏｌ，４２（６）：９６６－７３．ＩＸ）ｌ：１０．１０９３／ｊｍｅｄｅｎｔ／４２．６．９６６．
ＳＬＥＡＴ Ｄ Ｅ，ＢＡＮＥＲＪＥＥ Ａ Ｋ，１９９３．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，６７（３）：１３３４－９．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．６７．３．１３３４・１３３９．

３４

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 参考文献

ＳＴＯＰＥ Ｍ Ｂ，ＫＡＲＧＥＲ Ａ，ＳＣＨＭＩＤＴ Ｕ，ＢＵＣＨＨＯＬＺ Ｕ Ｊ，２００１．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ

ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｉｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３

ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｖｉｒ０１．７５（１９）：９３６７—７７，ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶｌ．７５．１９．

９３６７—９３７７．

ＳＵＮ Ｍ，ＲＯＴＨＥＩｔⅣ正Ｌ Ｔ Ａ，ＳＨＵＭｂ～Ｎ Ｌ，ＡＬＩＧＯ Ｊ Ａ，ＸＵ Ｓ，Ｌｎ、『Ｙ，ＬＡＭＢ Ｒ Ａ，ＨＥ Ｂ，２００４．

Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５ Ｖ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ

ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｖｉｒ０１．７８（１０）：５０６８—７８．ＤＯＩ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７８．１０．５０６８—５０７８．２００４．

ＴＡＫＩＭ０１＇ｏ Ｔ，ＰＯＲＴＮＥＲＡ，２００４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｂｕｄｄｉｎｇ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ，１０６（２）：

１３３４５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２００４．０８．０１０．
ＴＥＮＧ Ｍ Ｎ，ＣＯＬＬＩＮＳ Ｐ Ｌ，１ ９９８．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ

ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＪⅥｍｌ，７２（７）：５７０７－Ｉ ６．ＤＯＩ：１ ０．１ １ ２８／

ＪＶＩ．７２．７．５７０７—５７１６．１９９８．

ＴＥＲＲＩＥＲ ０，ＩｍＬＬＡＮＤ Ｊ Ｐ，ＲＯＳＡ・ＣＡＬＡＴＲ Ｊ气、，Ａ Ｍ，ＬＩＮＡ Ｂ，ＴＨＯＭＡＳ Ｄ，ＭＯＵＬＥＳ Ｖ：２００９．

Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５（ＰＩＶ－５）ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｃｒｙｏ・ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，４２（１—

２１：２００－３．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２００８．１２．０１７．
ＴＯＭＰＫＩＮＳ Ｓ Ｍ，ＬＩＮ Ｙ ＬＥＳＥＲ Ｇ Ｐ，ＫＲＡＭ匣Ｒ Ｋ Ａ，ＨＡＡＳ Ｄ Ｌ，ＨＯＷＥＲＴＨ Ｅ Ｗ：ＸＵ Ｊ，ＫＥＮＮＥＴＴ

Ｍ Ｊ，ＤＵＲＢＩＮ Ｒ Ｋ，ＤＵＲＢＩＮ Ｊ Ｅ，ＴＲⅢＰ Ｒ，ＬＡＭＢ Ｒ Ａ，髓Ｂ，２００７．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ

５（ＰＩＶ５）ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ

ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６２（１１：１３９－５０．ＤＯＩ：１０，１０１６／ｊ．ｖｉｒ０１．２００６．１２．００５．
ＴＹＬＥＲ Ａ Ｄ，ＭＡＴＡ ＳＥＪＥ Ｌ，ＵＲＦＡＮ０ Ｃ Ｊ，ＳＣＨＭＩＤＴ Ｌ，ＡＮＴＯＮＡＴＩＯＮ Ｋ Ｓ，ＭＵｌⅣＥＹ Ｍ Ｒ，

ＣＯＲＢＥＴＴ Ｃ艮２０１８．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ’Ｓ ＭＩｎｉＯＮ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ

Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，８（１）：１０９３１．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８・０１８－２９３３４－５．

ＶＡＮＧＥＥＬ Ｉ，ＡＮＴＯＮＩＳ Ａ Ｆ，ＦＬＵＥＳＳ Ｍ，ＲＩＥＧＬＥＲ Ｌ，ＰＥＴＥＲＳ ＡＲ，ＨＡＲＭＥＹＥＲ Ｓ Ｓ，２００７．Ｅｆｆｉｃａｃｙ

ｏｆ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｖｅ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ３－ｗｅｅｋ・ｏｌｄ ｃａｌｖｅｓ

ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ ＢＲＳＶ．Ｖｅｔ Ｊ，１７４（３）：６２７－３５．ＤＯＩ：１０．｜０１６／ｊ．ｔｖｊｌ．２００６．１０．０１３．

ＷＡＭＡＩＴＨＡ Ｍ Ｊ，ＮＩＧＡＭ Ｄ，ＭＡＩＮＡ Ｓ，ＳＴＯＭ哐Ｏ Ｆ，ＷＡＮＧＡＩ Ａ，ＮＪＵＧＵＮＡ Ｊ Ｎ，ＨＯＬＴｏＮ Ｔ Ａ，

ＷＡＮＪＡＬＡ Ｂ Ｗ，Ⅵ０～ＭＡＬＷＡ Ｍ，ＬＵＣＡＳ Ｔ，ＤＪＩＫＥＮＧ Ａ，ＧＡＲＣＩＡ－ＲＵｌＺ Ｈ，２０１ ８．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ

ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｖｉｒｕｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｉｚｅ ｌｅｔｈａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｉｎ Ｋｅｎｙａ．ｖｉｒｏｌ Ｊ，１ ５（１）：９０．ＤＯＩ：１０．１１８６／

Ｓ１２９８５．０１８－０９９９．２．

Ｗ．ＥＬＣＨ Ｂ Ｄ，ＹＵＡＮ Ｐ，ＢＯＳＥ Ｓ，ＫＯＲＳ Ｃ Ａ，ＬＡＭＢ Ｒ Ａ，ＪＡＲＤＥＴＺＫＹ Ｔ Ｓ，２０１３．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ

ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５（ＰＩＶ５）ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＨＮ）ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，９（８）：

ｅ１００３５３４．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００３５３４．
ＷｌＬＳＯＮ Ｒ Ｌ，ＦＵＥＮＴＥＳ Ｓ Ｍ，ＷＡＮＧ Ｐ，１：ｆ～ＤＤＥ０ Ｅ Ｃ，ＫＬＡ订Ａ，ＨＥＮＤＥＲＳｏＮ Ａ Ｊ，ＨＥ Ｂ，２００６．

Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８０（４）：１７００－９．ＤＯＩ：１０．１ １２８／

ⅣＩ，８０．４．１ ７００．１ ７０９，

ＸＩＥ Ｊ，ＴＯＮＧ Ｐ，ＺＨＡＮＧ Ａ，ＺＨＡＮＧ Ｌ，ＳＯＮＧ Ｘ，ＫＵＡＮＧ Ｌ，２０２０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｅｑｕｉｎｅ ＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓ ５．ｖｉｒｏｌ Ｓｉｎ，３５（２）：２４５—２４７．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１２２５０—０１９—００１８５—

２．

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 参考文献

Ⅵ≮ＮＧ Ｙ＇ＺＥＮＧＥＬ Ｊ，ＳＵＮ Ｍ，ＳＬＥＥＭＡＮ Ｋ，ＴＩＭＡＮＩ Ｋ Ａ，ＡＬＩＧＯ Ｊ，Ｒ０１’Ａ只ＷＵ Ｊ，ＨＥ Ｂ，２０１５．

ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＶｉｒａｌＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｔｈｅＶＰｒｏｔｅｉｎ ｏｆＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓ ５．ＪＶｉｒｏｌ，８９（２３）：１１８４５・５７．

ＤＯＩ：１０，１１２８，ＪＶＩ．０１８３２－１５．

ＺＨＡＩ Ｊ Ｑ，ＺＨＡＩ Ｓ Ｌ，ＬＩＮ Ｔ＇ＬＩＵ Ｊ Ｋ，ⅥｒＡＮＧ Ｈ Ｘ，Ｌｌ Ｂ，ＺＨＡＮＧ Ｈ，ＺＯＵ Ｓ ｚ，ＺＨＯＵ ｘ，ＷＵ Ｍ Ｆ，

ＣＨＥＮ Ｗ：ＬＵＯ Ｍ Ｌ，２０１７．Ｆｉｒｓｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ

ｌｅｓｓｅｒ ｐａｎｄａ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，１６２（５）：１４１３．１４１８．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００７０５－０１７－３２４５—０．

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 致谢

致 谢

光阴如箭，岁月如梭，三年时光转瞬即逝，回想起三年前，拖着行李箱，怀着心中的梦想，
初到“东方小巴黎”哈尔滨，在这座美丽的冰城，我开启了三年的硕士求学生涯。在这段短暂的
旅途中，我经历了实验出结果的喜悦，也感受了课题不顺的沮丧，也有为写论文彻夜未眠的焦虑，
幸运的是，有一群可敬可亲的老师和志同道合的好友陪伴着我，让我有了勇气去面对实验和生活
中遇到的挫折和困难，过关斩将，为我未来的人生之路积攒了宝贵经验。
三年的时光如此之短，在此论文完成之际，倍感交集，我首先要感谢我的导师曲连东研究员，

在论文选题，实验设计，中期考核和论文撰写过程中给予我耐心指导和督促，曲老师严谨的治学
态度和一丝不苟的科研精神无时无刻不在感染着我，激励着我，让我终身受益，非常感谢您对我
学习过程中的谆谆教诲。
感谢我的实验指导老师杨鸣发博士，在我每次实验进展不下去的时候，是您帮我重新整理思
路，并及时指出实验过程中的不足，教我分析总结实验失败的原因，在您的精心指导下，我得到

了很大的进步，能够独立去分析实验数据。在生活中，您更像一个师兄，虽然我们也曾为交流不
畅而争吵过，但是您教我的为人处世的态度使我受益匪浅。
衷心感谢自然疫源性人兽共患病创新团队提供的良好平台，感谢边境地区家养动物外来动物疫
情监测溯源技术研究项目（２０１７ＹＦＤ０５０１８０１）和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
（Ｙ２０１９ＹＪ０７．０４）的资助，感谢刘家森老师，田进老师，姜骞老师，刘明老师，康洪涛老师，李
志杰老师，郭冬春老师给予我实验上的指导和生活中的关心。
感谢５０１１实验室的张继凯师兄，陈思师姐，薛雨佳师姐，刘晓晓师姐，左智敏师兄，于志亚
师妹，刘迪师妹，李茵师妹，潘玉迪师妹等在实验上的帮助和生活上的陪伴，也感谢我的舍友唐
棉依同学三年来的陪伴，相互激励，互诉心情，感谢你对我生活习惯的包容。

最后，我特别要感谢我的家人，感谢你们的理解和支持，是你们默默地付出和无私的爱，让
我可以没有后顾之忧的享受学生生活的快乐时光，感谢冯海鹏同学六年来的陪伴，让我在追梦的
道路上不在孤单，不忘初心，未来可期。

３７

万方数据
 中国农业科学院硕士学位论文 作者简介

作者简介

马云云，女，汉族，１９９４年９月出生于甘肃省平凉市。２０１４年９月考入甘肃农业大学动物
医学院，攻读动物医学（兽医公共卫生）专业，２０１８年６月获农学学士学位；２０１８年９月进入
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所攻读预防兽医学硕士学位，研究方向为动物疫苗与分子免疫学，
主要从事媒介生物蜱携带疫情监测溯源技术研究。

攻读硕士学位期问发表的学术论文：
马云云，于志亚，刘家森，康洪涛，姜骞，杨鸣发，曲连东，２０２１．大兴安岭全沟硬蜱携带哺乳

动物腮腺炎病毒５型的分离鉴定．中国预防兽医学报（已录用）．
ＹＡＮＧ Ｍ弋ＭＡ Ｙ＃，ＳＯＮＧ Ｍ，ＷＵ Ｈ，ＪＩＡＮＧ Ｑ，ＬＩＵ Ｊ，ＱｔＪ Ｌ，２０２０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｉｇａ ｔｉｃｋ ｌｘｏｄｅｓ ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ．Ｔｉｃｋｓ

Ｔｉｃｋ Ｂｏｒｎｅ Ｄｉｓ．１２（１）：１０１５５４．ＤＯＩ：１０．１０１６巧．ｔｔｂｄｉｓ．２０２０．１０１５５４．

获奖情况：
荣获中国农业科学院研究生院２０１８级硕士研究生中期考核优秀奖。

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