PRÁCTICA FUNDAMENTO E REALIZACIÓN DE ELECTROFORESE

FUNDAMENTO
A electroforese en xel de agarosa utilízase comúnmente para separar
moléculas en función da carga, do tamaño e da forma. Trátase dun medio de
separación especialmente eficaz para biomoléculas cargadas como o ADN, o
ARN e as proteínas.
Factores como a carga, o tamaño e a forma das moléculas, así como as
características do tampón de electroforese, a concentración do xel e a
potencia eléctrica, teñen impacto sobre a movilidade das moléculas no xel.
Entre as moléculas de masa e forma molecular semellante, as máis cargadas
migran con maior rapidez.

OBXETIVO
Desenrolar unha compresión básica da teoría da electroforese e adquirir
práctica cos procesos de separación de diversas moléculas a través da
electroforese horizontal sobre xel.

REACTIVOS Y EQUIPOS
4 Colorantes diferentes
UltraSpec-Agarose™
Tampón de electroforesis (10x)
Solución de carga de colorante (glicerol)
Pipetas serológicas
Micropipetas de transferencia
Equipo de electroforesis horizontal
Fuente de corriente continua
Micropipetas automáticas con puntas
Balanza
Microondas, placa de calentamiento o estufa
Pro-pipeta
Matraces o vasos de precipitado de 250 ml
Guantes anticalor
Lentes protectoras y guantes de laboratorio desechables
Sistema de visualización (transiluminador de luz blanca)
Agua destilada o desionizada

PROCEDEMENTO

Exercicio 1
Localiza catro colorantes e busca si son colorantes básicos, ácidos ou
neutros.
Completa a táboa indicando si esperas

1 de 3
COLORANTE NOME TIPO (ácido, pH MIGRACIÓN ESPERADA
básico, neutro)
1 Tionina
2 Azul de metileno
3 Cristal violeta
4 Verde metilo

Numera 6 eppendorfs do 1-6

Vota nos primeiros 4 eppendorfs cada un dos colorantes.
No eppendorf 5 mestura a mesma cantidade de colorante 1 que de colorante
2.
No eppendorf 6 mestura a mesma cantidade de colorante 1 e de colorante 4.

Exercicio 2
Prepare o xel de agarosa ao 0,8%.

Para iso ten que calcular que volume de agarosa vai necesitar e iso vai
depender do tamaño da bandexa onde fagamos o xel.
Nesta táboa danche algunha pista do que tes que facer.

Terás que medir a túa bandexa e calcular o volume que fará falla para que
o xel teña uns 0,5cm de espesor.

Volume= área da base por altura

Cando teñas decidido que volume de agarosa necesitas, calcula canta

agarosa tes que pesar para que nese volume quede a agarosa ao 0,8% e
disolvea no buffer (TAE 1X ou TBE 1X)

Axúdate do microondas para que se disolva.

2 de 3
Enfría a agarosa entre 55-60ºV e vértea na bandexa.
Coloca o peine no medio e espere a que enfríe (tardará entre 15-20 min.).
Exercicio 3
Realice a electroforese
Retire as barreiras e o peine.
Coloque o xel no interior da cuba de electroforese e cargue as mostras.
Imos facelo de dúas maneiras, unha cubeta estará cuberta de buffer e
sumerxeremos a bandexa nel, de xeito que as mostras se cargan sumerxidas
no buffer.
Noutra cubeta non votaremos tanto buffer e cargaremos as mostras en seco.
Para cargar votaremos cada mostra dunha en unha en pocillos consecutivos.

Prepara as mostras: Antes de cargalas, collerás un anaco de Parafilm e

porás gotiñas de 3µL de gicerol, unha por cada mostra que se vai correr.
Logo, mestura 3µL de cada colorante cos 3µL de glicerol. Carga os 6µL no
pocillo.
Cerre a tapa e coloque o enchufe á fonte de alimentación.

Unha vez finalizada a electroforese, retire a bandexa con xel da cubeta.

Transfira o xel para a visualización. Como son colorantes non necesitan

ser tinguidos.
Analice e documente os resultados inmediatamente porque os colorantes
difundirán e a continuación desaparecerán do xel.

Exercicio 4
Conteste as seguintes preguntas:
1. En función de qué parámetros separa as moléculas a electroforese
mediante xel de agarosa?
2. Explique a migración en función da carga.
3. Que conclusións extraes dos resultados obtidos? Son os esperados
antes de facer o experimento?
4. Porqué engadimos glicerol ás solucións de mostra antes de depositalas
nos pocillos?

3 de 3