ЕтапиДНК-діагностики або ПЛР. Переваги, модифікації ПЛР.

Електрофорез
фрагментів ДНК. Ідентифікація фрагментів ДНК і РНК методами
гібридизації. ДНК-зонди
Поняття про полімеразну ланцюгову реакцію

ПЛР - це процес отримання великої кількості копій необхідних ділянок ДНК in vitro (в
пробірці) внаслідок ампліфікації.
Необхідна умова для проведення ПЛР - знання нуклеотидної послідовності ділянки, копії
якої необхідно отримати. Ділянку досліджуваної ДНК гібридизують (сполучають) з двома штучно
синтезованими праймерами - олігодезоксирибонуклеотидами завдовжки від 15 до ЗО пар
нуклеотидів, які комплементарні певним ділянкам на обох ланцюгах ДНК. Тобто праймери ніби
окреслюють ту ділянку ДНК, копії якої необхідно отримати. Метод не вимагає великих кількостей
досліджуваної ДНК - достатньо навіть однієї молекули, що міститься в одному волосі на голові,
одній краплі крові чи іншого біологічного матеріалу.
Реакційна суміш для ПЛР містить досліджувану ДНК, субстрати реакції - чотири типи де-
зоксирибонуклеотидтрифосфатів, 2 праймера, термостабільну ДНК-полімеразу.
Один цикл полімеризації включає 3 етапи:
• плавлення: на цій стадії реакційну суміш нагрівають до температури 90-97°С. Досліджувана
двохланцюгова ДНК денатурує;
• гібридизація ДНК з праймерами. В результаті зниження температури до 50-60°С відбувається
комплементарне сполучення праймерів з ланцюгами матричної ДНК і утворення
двохланцюгової ділянки на кожній з ниток ДНК;
• елонгація - подовження ниток ДНК за участю термостабільної ДНК-полімерази. Потім все
повторюється.
Описану процедуру ампліфікації ДНК проводять в автоматичному режимі в приладі —
циклізаторі. Такий прилад дозволяє задавати потрібну кількість циклів і вибирати оптимальні
часові
і температурні параметри. За 25-30 циклів число синтезованих копій ДНК досягає декількох
мільйонів. Для встановлення проходження ПЛР проводять дослідження вмісту ДНК до і після
циклізації. Якщо вміст ДНК після циклізації збільшився, то це означає що пройшла ІІЛР.
Метод широко використовується для діагностики інфекційних захворювань (туберкульозу,
хламідіозу, цитомегаловірусної інфекції, СНІДу і ін.). ПЛР дозволяє виявити збудника в
біологічному матеріалі навіть тоді, коли інші методи виявляються неефективні.

Другий напрям використання ПЛР — генетичне тестування (виявлення мутацій в генах

діагностика спадковоїпатології).

Третій напрямок - судово-медична експертиза з приводу встановлення батьківства,

особистості та ін.

Модифікації(види ПЛР):
Їх існує близько 10, основними є:
1. PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism, ПЛР-ПДРФ – поліморфізм довжин
рестрикційних фрагментів). Спочатку проводять ПЛР, а потім – рестрикцію отриманого ПЛР-
продукту.
2. Real-time PCR (ПЛР у реальному часі). Спостерігають за реакцією в реальному часі,
безпосередньо вимірюючи накопичення продукту ПЛР в кожному циклі. Принциповою
особливістю методу ПЛР в режимі реального часу, на відміну від класичної ПЛР, є можливість
кількісного визначення ДНК/РНК в досліджуваному матеріалі, відсутність стадії електрофорезу,
менш суворі вимоги до організації ПЛР-лабораторії та автоматична реєстрація та інтерпретація
отриманих результатів.

3. RT-PCR (Reverse Transcription PCR – ПЛР з використанням зворотної транскрипції). Вихідним

продуктом є РНК, на якій за допомогою ферменту зворотної транскриптази отримують ДНК, з
якою вже і проводять ПЛР. Це зручно, наприклад, для того, щоб виявити, які саме гени в даній
клітині експресуються. Та інші.

ЕЛЕктрофорез фрагментів ДНК

Гель-електрофорез — аналітичний метод хімії і молекулярної біології для розділення
різних видів молекул. Суміш молекул пропускається через гель, який являє собою
молекулярне сито, яке легше пропускає дрібніші молекули, аніж великі. Рушійну силу
задає електричне поле, тому молекули мають бути заряджені.

Метод використовується в молекулярній біології для розділення фрагментів

дезоксирибонуклеїнової, рибонуклеїнової кислоти або білків, використовуючи електричне
поле, що створюється в гелевій матриці. Метод зазвичай застосовується для аналітичних
цілей, але може також використовуватися як попередня стадія таких методів як мас-
спектрометрія, поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ), полімеразна
ланцюгова реакція (ПЛР), молекулярне клонування, секвенування ДНК, саузерн-блот,
вестерн блот що застосовуються для аналізу послідовностей молекул або визначення
певних білків.
Досліджуваний препарат (суміш речовин, розчин білка, ДНК або РНК) вносять в лунку,
розміщену в гелі — середовищі з сітчасто-просторовою структурою. Зазвичай для гель-
електрофорезу використовують тонкі пластини гелю. Знаходячись в буферному розчині
макромолекули володіють певним сумарним електричним зарядом, і коли через гель
проходить електричний струм, вони переміщаються в електричному полі.[1]

Молекули однакового розміру (однакового заряду) рухаються єдиним фронтом,

створюючи в гелі дискретні невидимі смуги. Чим менший розмір молекул або більший
їхній заряд, тим швидше вони рухаються. Поступово вихідний препарат, що складається з
різних макромолекул, розділяється на зони, розподілені на довжині пластинки.

За ходом електрофорезу слідкують за переміщенням в гелі барвника — електрично

зарядженої низькомолекулярної речовини, яку вносять в кожну лунку перед початком
електрофорезу. Коли барвник досягає кінця пластини, електрофорез зупиняють. Якщо
зразок являє собою дискретний набір макромолекул різного розміру, то після
електрофорезу виходить набір чітких смуг, розміщених одна під одною. Якщо ж
розміщення молекул за розміром більш-менш безперервне, то виходить розмита картина.
За інтенсивністю забарвлення смуг можна судити про концентрацію макромолекул в
зразку.
Для електрофорезного розділення нуклеїнових кислот середнього розміру зазвичай
використовують агарозні гелі. Агароза — це чиста фракція, яку одержують з агару або
безпосередньо з агароутворюючих морських водоростей. В 1% агарозному гелі можна
розділити молекули розміром від 600 до 20 000 п.н. Для фракціонування більших молекул
ДНК (мільйони пар основ), денатурованої ДНК і РНК використовують спеціальні системи
електрофорезу. Деколи для вирішення спеціальних завдань для розділення ДНК
використовують поліакриламідні гелі. В 20% поліакриламідному гелі можна розділити
фрагменти ДНК, які складаються всього з шести основ і які відрізняються лише одним
нуклеотидом.
Ідентифікація ДНК
Для аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК використовують різні методи(наприклад
гібридизації). Гібридизація-це повна або часткове схрещування двох різнорідних ділянок
ДНК.Певну послідовність нуклеотидів, що складає генетичну інформацію можна
ідентифікувати з абсолютною специфічностю шляхом гибридизації з комплементарною
копією, використовуючи як зонд нуклеїнову кислоту, позначену радіоактивною міткою або
кон’юговану іншим способом. Зондами називають РНК і ДНК, за допомогою яких у
досліджуваному матеріалі виявляють комплементарні нитки. Для одержання зонду
можна використовувати нуклеїнову кислоту, виділену з віріонів, або РНК, одержані
шляхом транскрипції in vitro. Розвиток технології виробництва рекомбінантних ДНК і
методів хімічного синтезу нуклеїнових кислот дав змогу одержувати зонди будь якої
специфічності. За допомогою методу стало за молжливе виявити РНК і ДНК збудника
інфекції в клінічному матеріалі (кров, виділення з носової частини глотки, слина, кал,
матеріал, одержаний під час біопсії тощо). Цей метод незамінний для ідентифікації
вірусів, що не культивуються в лабораторних умовах, для персистуючих вірусів, для
виявлення провірусу (вірусспецтфічної інфекційної послідовності в клітинному геномі). За
допомогою молекулярної гібризизації було виявлено кищкові аденовіруси (типи 40, 41) у
калі, віруси папіломи в клітинах пухлин (рак шийки матки) та інши збудники інфекцій,
визначено типи і варіанти їх.

Принцип методу полягає в слідуючому. Молекула клітинної ДНК складається з двох

ланцюгів, зв’язаних водневими зв’язками.Під час нагрівання при температурі 100оС або
обробки лугом водного розчину ДНК водневі зв’язки руйнуються, і подвійна спираль
дисоціює на два окреми ланцюжки.Цей процес називається денатурацією ДНК. Проте у
разі тривалої експозиції при температурі 65оС одноланцюжкові ДНК можуль легко
утворити дволанцюжкову спираль, ідентичну вихідній; такий процес називається
ренатурацією або гібридизацією. Реакція гібридизації може відбуватися між будь-якими
двома одноланцюжковими нуклеїновими кислотами (ДНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-РНК) за
умови, якщо вони мають комплементарні нуклеїнові послідовності.
Один з ланцюжків можна позначити маркером, і за допомогою цього ланцюжка виявляти
в досліджуваному матеріалі комплементарні йому послідовності.