IL 6在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究

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硏究生姓名 
李翔 
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指导教师姓名 
杨惠林教授 
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专业名称 
外科学（骨科）
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研究方向＿
脊巧外科基袖与临床
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所在院部苏州大学附属第一
医院
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论文提交日期 
２０化年１２月 
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IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究中文摘要
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞
成骨分化障碍中的作用机制研究
中文摘要
随着老龄化社会的到来及社会环境的深刻改变，骨质疏松症已经成为最常见的骨
骼系统疾病之一。其主要表现为骨量减少、骨组织微结构改变、骨机械强度降低甚至
发生骨折。由于强大的免疫调节作用，糖皮质激素一直被广泛用于治疗各种炎症和自
身免疫性疾病。然而，治疗量的糖皮质激素也可能导致严重的临床并发症，骨质疏松症
就是其中重要的一种。糖皮质激素性骨质疏松症已经成为当今最常见的继发性骨质疏松
症。
除了疼痛，骨质疏松性骨折导致的活动障碍可进一步引起肺部感染、肌肉萎缩、
日常生活不能自理及社会孤立等一系列严重后果。骨质的形成及矿化是由源于骨髓基
质细胞（bone marrow stromal cells , BMSC）的成骨细胞定向分化的结果。很多文献
均发现骨质疏松症患者的 BMSC 成骨分化是有缺陷的，但其原因至今不明，在本研
究中我们试图从分子水平探讨其中的原因。
本实验首先构建糖皮质激素性骨质疏松小鼠动物模型（glucocorticoid induced
osteoporosis, GIO）：使用泼尼松缓释片皮下埋入 4 周，骨组织形态学分析、骨密度
及血清骨代谢指标检测等方法证实模型成功构建后，于造模成功的小鼠胸腰椎椎体分
离 BMSC 并体外传代培养，骨形态发生蛋白 2（BMP2）诱导其向成骨细胞定向分化。
Von Kossa 染色法计数成骨细胞克隆数（CFU-OB），MTT 法比较正常小鼠和骨质疏
松小鼠 BMSC 增殖率，定量 RT-PCR 比较两组 RANKL、OPGmRNA 表达情况，诱
导 1 周及 3 周后染色测定成骨分化情况，诱导 2 周时使用定量 RT-PCR 比较两组
Runx2、OPN、osteocalcin mRNA 表达情况。通过观察证实 GIO 的 BMSC 成骨分化
障碍。
再检测骨代谢相关的指标，发现白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）表达水平异
常增高，并进一步对细胞培养体系中加入 IL-6 中和抗体及慢病毒 shRNA 感染下调
IL-6 表达后，综合使用上述检测方法探讨 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍的分子
I
中文摘要 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
机制。最后使用 IL-6 中和抗体进行小鼠体内治疗，并检测相关成骨分化指标。

本实验验证了 GIO 小鼠椎体 BMSC 体外增殖减慢且伴成骨分化障碍，并得出以下
结论：
GIO 小鼠椎体 BMSC IL-6 过度分泌，
1、且该情况在使用 BMP2 诱导成骨时同样存在；
2、IL-6 过度分泌是导致 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍的重要原因；
3、IL-6 负性调节 Wnt/β-catenin 信号通路导致 GIO 小鼠椎体 BMSC 的成骨分化
障碍；
4、体内使用 IL-6 中和抗体可改善 GIO 小鼠的骨质疏松疾病表型
本实验加深了对 GIO 病理生理的认识，提出了在以后的 GIO 治疗研究中 IL-6 可
作为一个重要的治疗靶点的新观点，为进一步临床开发 GIO 药物提供了参考。
关键词：糖皮质激素骨质疏松症骨髓基质细胞白细胞介素-6 成骨分化
作者：李翔
指导老师：杨惠林教授
II
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究英文摘要
IL-6 Contributes to the Defective Osteogenesis of Bone

Marrow Stromal Cells from the Vertebral Body of the
Glucocorticoid-Induced Osteoporotic Mouse
Abstract
Osteoporosis is one of the most prevalent skeletal system diseases. It is characterized
by a decrease in bone mass and microarchitectural changes in bone tissue that lead to an
attenuation of bone resistance and susceptibility to fracture. Glucocorticoid（GC）are potent
immunomodulatory drugs that are commonly used to treat a variety of inflammatory
conditions and autoimmune disorders. However, therapeutic use of GC often leads to sever
clinical complications, such as bone loss and fracture risk. Glucocorticoid-induced
osteoporosis is the most common form of secondary osteoporosis.
Osteoporotic vertebral fracture (OVF) is by far the most prevalent osteoporotic
fracture. In addition to pain, osteoporotic vertebral fractures result in immobility that can
lead to chest infection, muscle loss, the inability to cope with daily activities, and social
isolation. In the musculoskeletal system, osteoblasts, originated from bone marrow stromal
cells (BMSC), are responsible for osteoid synthesis and mineralization. In osteoporosis,
BMSC osteogenic differentiation is defective. However, to date, what leads to the defective
BMSC osteogenesis in osteoporosis remains an open question. In the current study, we
made attempts to answer this question.
Fristly, a mouse model of glucocorticoid-induced osteoporosis (GIO) was established
by subcutaneous implantation of slow-release pellets containing prednisolone for 4 weeks.
At the time the mice were sacrificed, the thoracic and lumbar vertebrae (L1–L4) were
prepared for bone minal density (BMD) measurement and BMSC isolation; L5 was used
for histomorphometric analysis. Serum specimens were also taken for the measurement of
osteocalcin and C-telopeptide of type I collagen (CTX-I). The BMSCs were induced to
undergo osteogenesis by BMP2 in vitro for three weeks. The ALP and Alizarin Red
staining were made respectively. Total RNA was extracted and subjected to quantitative
RT-PCR to determine the expression of several osteogenic markers including Runx2,OPN,
and osteocalcin.
III
英文摘要 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
Secondly, the expression profiles of thirty-six factors, which play important roles in
bone metabolism were compared through antibody array between normal and osteoporotic
BMSC. Hence further comprehensive using the above methods and the Wnt/β-catenin
signaling pathway related factors (blocker and activtor) treatment, IL-6 neutralizing
antibodies, shRNA lentivirus infection to explore the molecular mechanism of GIO BMSC
osteogenesis disorder.
Lastly, in vivo administration of IL-6 neutralizing antibody was employed to observe
the curative effect to the osteoporotic mouse.
The experiments verified the phenomenon that GIO vertebral body BMSC
proliferated slowly and osteogenic differention was defective. We also obtain the following
conclusions:
1．IL-6 over-secretion was found in GIO vertebral body BMSC cultivation in vitro,
even using BMP2 to induce osteogenesis;
2. IL-6 over-secretion was one of the most important reasons of GIO vertebral body
BMSC defective osteogenic differentiation;
3. IL-6 acts upstream of Wnt/ β-catenin to negatively modulate β-catenin of
osteoporotic BMSC;
4. In vivo administration of IL-6 neutralizing antibody was found to be helpful to
rescue the osteoporotic phenotype of mouse vertebral body.
Our study provides a deeper insight into the pathophysiology of osteoporosis and
identifies IL-6 as a promising target for osteoporosis therapy.
Key Words: GC osteoporosis BMSC IL-6 osteogenesis
Written by: Li Xiang

Supervised by: Prof. Yang Huilin
IV
目录
第一章引言.................................................................................................................... 1
一、本文研究背景......................................................................................................... 1
1、骨质疏松症概述................................................................................................ 1
2、GIO 的发病机制概述 ....................................................................................... 1
3、BMSC 成骨分化的分子机制概述 ................................................................... 2
二、本研究的目的、内容、意义、方法及技术路线................................................. 4
1、研究目的............................................................................................................ 4
2、研究内容............................................................................................................ 4
3、研究意义............................................................................................................ 5
4、研究方法............................................................................................................ 5
5、技术路线............................................................................................................ 5
参考文献......................................................................................................................... 6
第二章 GIO 小鼠模型的构建与表征 ............................................................................. 11
一、材料与方法........................................................................................................... 11
1、材料与试剂...................................................................................................... 11
2、实验仪器.......................................................................................................... 12
3、实验方法.......................................................................................................... 12
二、实验结果............................................................................................................... 15
三、讨论....................................................................................................................... 16
参考文献....................................................................................................................... 18
第三章 GIO 小鼠椎体 BMSC 体外培养及异常骨代谢标志物的筛选 ........................ 19
一、材料与方法........................................................................................................... 19
1、实验材料与试剂.............................................................................................. 19
2、实验仪器.......................................................................................................... 20
3、实验方法.......................................................................................................... 20
二、实验结果............................................................................................................... 23
三、讨论....................................................................................................................... 28
参考文献....................................................................................................................... 29
第四章 IL-6 介导了 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍及其机制 ........................... 31
一、材料与方法........................................................................................................... 31
1、实验材料与试剂.............................................................................................. 31
2、实验仪器.......................................................................................................... 32
3、实验方法.......................................................................................................... 32
二、实验结果............................................................................................................... 34
三、讨论....................................................................................................................... 39
参考文献....................................................................................................................... 41
第五章 IL-6-/-小鼠 BMSC 的成骨分化 ........................................................................... 46
一、材料与方法........................................................................................................... 46
1、实验材料与试剂.............................................................................................. 46
2、实验仪器.......................................................................................................... 47
3、实验方法.......................................................................................................... 47
二、实验结果............................................................................................................... 48
三、讨论....................................................................................................................... 50
参考文献....................................................................................................................... 50
第六章 IL-6 中和抗体对小鼠 GIO 表型的挽救 ............................................................ 51
一、材料与方法........................................................................................................... 51
1、实验材料与试剂.............................................................................................. 51
2、实验仪器.......................................................................................................... 52
3、实验方法.......................................................................................................... 52
二、实验结果............................................................................................................... 53
三、讨论....................................................................................................................... 54
参考文献....................................................................................................................... 55
主要结论与展望.................................................................................................................. 57
综述肾上腺糖皮质激素性骨质疏松症发病的分子机制............................................ 58
参考文献....................................................................................................................... 61
中英文缩略词表.................................................................................................................. 67
攻读学位期间公开发表的论文.......................................................................................... 69
致谢.................................................................................................................................. 70
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究第一章引言
第一章引言
一、本文研究背景
1、骨质疏松症概述
骨质疏松症是一种以骨量明显降低、骨微观结构破坏、骨脆性增加、容易发生骨
折为特征的全身性骨病。随着我国进入老龄社会，骨质疏松症正成为严重影响人民生
活质量的常见疾病。骨质疏松症的诊断主要是以骨密度(BMD)降低为依据，目前国际
上通常用 T 值(T-core)表示，即 T 值≥-1.0 为正常，-2.5<T 值<-1.0 为骨量减少，T
值≤-2.5 为骨质疏松。根据发病机制不同，骨质疏松症可分为原发性和继发性骨质
疏松症两类[1]。原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症，既往
已得到广泛重视并已有大量基础及临床研究。而继发性骨质疏松症[2,3]是由于全身性
疾病、药物滥用、烟酒等不良嗜好及肢体废用等原因造成的骨量流失，由于该类患者
一般较年轻，往往容易被忽视，但其对社会家庭的影响实则更为严重。
在众多继发性骨质疏松症中，糖皮质激素性骨质疏松症(Glucoconicoid induced
osteopomsis，GIO)占所有病例的第一位，且在整个骨质疏松症临床病例数中其发病
仅次于绝经后骨质疏松症及老年性骨质疏松症，正得到越来越多的重视和研究[4]。由
于该病好发于中轴骨，自发性胸腰椎骨折在 GIO 很常见[5,6]，除了疼痛，骨质疏松性
骨折导致的活动障碍可进一步引起肺部感染、肌肉萎缩、日常生活不能自理及社会孤
立等一系列严重后果[7]。最新的美国风湿病学会糖皮质激素性骨质疏松诊治指南认为
[8]
糖皮质激素使用时并没有避免导致骨质疏松症的绝对安全剂量，骨密度与骨折的危
险性也不平行，故对于更年期后女性和 50 岁后男性它们推荐使用 2008 年国际骨质疏
松基金会(national osteoporosis foundation，NOF)推出的 FRAX 评估未来 l0 年骨
折绝对风险。
2、GIO 的发病机制概述
GIO 的发病机制很复杂，至今还没有完全清楚，研究较多的包括：①成骨细胞功
能受到抑制该作用较为持久，一直被认为是糖皮质激素致病的主要基病理基础。多
个研究提出 GC 通过抑制成骨细胞分化和骨形成过程的关键转录因子 Cbfa1 的表达[9]、
抑制 Wnt-β-catenin 通路[10,11]及增加此通路的抑制因子 DKK-1[12] 的表达、抑制 IGF，
1
第一章引言 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
BMP mRNA 等促进成骨的细胞因子表达[13,14]等多种途径抑制成骨细胞分化，并可能促进

成骨细胞及骨细胞凋亡。②破骨细胞功能活化此作用在 GIO 的发病机制相对次要，
但在早期可能具有更明显的效应。研究表明 GC 通过诱导 RANKL 和 M-CSF 的表达，下
调 OPG 的表达，增加破骨细胞重吸收活性[15,16]。③其他：GC 引起的四肢肌肉萎缩及肌
肉力量下降也是患者容易发生骨折的重要危险因素。
GIO 的病理机制中有一个重要特点即成骨细胞功能减弱[17]，但其具体的机制尚不
清楚。由于成骨细胞源于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSC)，因此，
对于 GIO 要阐明详细的病理生理机制及对其进行有效的治疗， BMSC 是一个极有希望
的治疗靶点。文献指出[18,19]GIO 中 BMSC 成骨分化是有障碍的，提高 BMSC 成骨分化能
力将有助于增加 GIO 骨量以治疗骨质疏松症，但迄今为止，BMSC 在 GIO 中成骨分化
障碍的具体机制并不明确。
3、BMSC 成骨分化的分子机制概述
骨骼系统是一个代谢活跃的复杂系统，骨髓是成分复杂的多细胞微环境，各种细
胞通过由自分泌、旁分泌和内分泌系统产生的多种细胞因子及细胞外基质成分发生密
切的交互作用[20,21]。BMSC 分化为成骨细胞通常需在合适的启动因素作用下活化谱系特
异性转录因子。当今的基础研究中，成骨信号通路主要包括 BMP- SMAD 通路及 Wnt/
β-catenin（经典及非经典）两类。
Bone morphogenic proteins (BMPs)是迄今公认的唯一具有异位成骨作用的细胞
因子，其家族包括 BMP-2,4,6,7,9。多个转基因小鼠的研究[22-24]发现 BMP 配体、受体
和抑制剂在成骨分化时的重要作用。BMP 信号通过细胞内 SMAD 蛋白（包括 SMAD1/5/8）
以及下游的有丝分裂原激活蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase (MAPK),
激活 RUNX2 和（或[25]）OSX 的转录。而 RUNX2(runt-related transcriptional factor
2)及其下游的 OSX 是两个被证实的具有激活骨钙素（osteocalcin）启动子的转录因
[26-29]
子，在成骨分化中发挥关键作用。BMP-2,4 或 SMAD1/5 基因敲除小鼠发生成骨缺
陷证明了 BMP 的重要作用[30]。值得注意的是 BMP-SMAD 通路其实是 BMSC 成骨成脂分化
[31-34]
的共同通路，GIO 特殊的骨髓微环境为成骨成脂分化的不平衡提供了必要的条
件，但迄今为止具体的分子机制尚不清楚，所以 BMP- SMAD-MAPK 通路是骨质疏松基
础研究领域的热点。
2
Wnt/β-catenin 是另一个被广泛研究的成骨分化信号通路。Wnt 包括 19 个骨髓

异质细胞群分泌的高度保守的糖蛋白，主要位于细胞质内，当其被激活后即转入细胞
核内发挥成骨作用。根据激活是否需要β-catenin 参与本信号通路可分为经典通路
及非经典通路。经典通路研究较多，FRIZZLED (FZD)受体和低密度脂蛋白受体相关蛋
白 5 或 6（the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 or 6 ，LRP5or
6) 共受体结合 Wnt 配体可阻止细胞质内β-catenin 降解，聚集的β-catenin 可转入
细胞核内与 TCF/LEF 家族蛋白相互作用从而激活成骨分化的目标基因[35,36]。而经典通
路的抑制剂 Dickkopf-related protein(Dkk1)则可阻断入核 [37] 。经典的 Wnt/β
-catenin 是 BMSC 成骨分化的重要通路，但是多个实验同时表明该通路在促进成骨分
化的同时又有抑制成脂分化的作用[38,39]。
非经典 Wnt 通路可通过多种方式，如细胞内 Ca 2+通路、PCP 信号通路及 GTPase Rac,
calcium/calmodulin-depenent kinase II (CAMKII) 或 c-Jun N-terminal kinase
(JNK)激活蛋白等多种途径发挥生物学作用[40-43]。由于非经典通路研究较少，这些途
径是单独还是协调发挥作用还有待于进一步阐明[44]。
BMSCs 成骨分化的分子调控还可能涉及[45-47]胰岛素生长因子-1（insulin-growth
factor-1，IGF-1）、成纤维细胞生长因子(fibroblast-growth factor，FGF)、活化
蛋白-1(activator-protein-1，AP-1)甲状旁腺素 PTH[48-50]等多种信号通路，这些通路
增加了成骨分化分子机制的研究难度。另外，BMSCs 成骨分化还有小 RNA (miRNAs)、
组蛋白（histone）及 DNA 甲基化（methylation）等后天性修饰调节需要进一步研
究。因此，阐明 GIO 异常的骨髓微环境有利于我们更清楚的认识 BMSC 成骨分化障碍
的深层次原因。
本研究中，我们尝试着去阐明 GIO 小鼠 BMSC 成骨分化障碍的分子机制。首先建
立了小鼠 GIO 模型并分离 BMSC，观察其成骨障碍情况，使用抗体芯片技术分析骨代
谢 36 个重要指标并与正常组比较，发现 IL-6 在 GIO 组中明显增高，且观察到β
-catenin 随之明显受到抑制，使用正反对比论证了 IL-6 过度分泌是 BMSC 成骨分化
障碍的重要原因，更重要的是发现体内使用 IL-6 中和抗体可以挽救 GIO 小鼠骨质疏
松病理表型。
3
二、本研究的目的、内容、意义、方法及技术路线
1、研究目的
构建糖皮质激素骨质疏松症（GIO）的小鼠模型，并观察其体外增殖及成骨分化
特点；寻找可能的骨生成障碍异常标志基因；多角度论证 IL-6 过度分泌是否参与了
GIO 小鼠椎体 BMSC 的成骨分化障碍及其分子机制；体内使用 IL-6 中和抗体对 GIO 小
鼠进行体内干预，为进一步临床开发治疗 GIO 的更加有效药物的进行有益探索。
2、研究内容
2.1 小鼠行波尼松龙缓释片皮下埋入术，测定实验前后的骨密度；4 周后取胸腰

椎分离 BMSC；取 L5 椎体做切片进行骨形态计量学分析；取全血制备血清，测定
Osteocalcin，CTX 含量。
2.2 分离及体外培养实验组及对照组 BMSC，流式细胞仪鉴定表型，实验组使用
BMP2 诱导成骨 3 周，Von Kossa 染色法计数成骨细胞克隆数（CFU-OB），MTT 法比较
两组增殖率，定量 RT-PCR 比较两组 RANKL 和 OPG mRNA 表达情况，诱导后染色观察其
成骨分化情况，诱导 2 周时使用定量 RT-PCR 比较两组 Runx2、OPN 和 osteocalcin mRNA
表达情况。
2.3 传代培养的 GIO 小鼠及正常对照组 BMSC 使用 BMP2 骨诱导后提取细胞总蛋
白，进行骨代谢标志基因的抗体芯片和 western blot 检测，并测定相关蛋白指标。
2.4 传代培养的 GIO 小鼠 BMSC 培养体系中分别加入 IL-6 中和抗体或使用 shRNA
下调 IL-6 表达后，分别使用染色法， RT-PCR 检测相关成骨细胞代谢指标。
2.5 ①传代培养的 GIO 小鼠 BMSC 培养体系中分别行骨诱导后 0,1,2,3 周，
western blot 及 RT-PCR 检测β-catenin 及其相关基因 cyclinD1、Axin2 和 Dkk1。
②分别使用 LiCl 激活β-catenin，IL-6 中和抗体及 STAT3 抑制剂 AG490, shRNAs 特
异性抑制 IL-6/ STAT3。 ③分别使用 IWR-1 抑制 Wnt/β-catenin 信号通路及 IL-6
作用后检测 IL-6/ STAT3 及β-catenin 相应变化。
2.6 小鼠随机分为 4 组：①安慰剂对照组 ②波尼松龙组 ③波尼松龙+IgG ④波
尼松龙+IL-6 中和抗体各组分别测定实验前后的骨密度，并于 4 周后使用椎体切片
染色及骨形态计量学分析；取小鼠全血制备血清，测定 Osteocalcin 和 CTX 含量。
4
3、研究意义
本研究分析了 GIO 模型 BMSC 体外增殖及成骨分化特点，寻找到成骨分化障碍异

常标志基因 IL-6，多角度论证了 IL-6 参与成骨分化障碍的调控及其分子机制，体内
使用 IL-6 中和抗体对 GIO 小鼠的进行治疗，为进一步临床开发 GIO 药物进行了有益
探索。
4、研究方法
动物模型构建、骨密度测定、组织染色、细胞培养、骨组织形态计量学分析、RT-PCR
及 real-time PCR、Western-blot、MTT、Antibody arrays、shRNA
5、技术路线
根据以上分析，本课题的技术路线制定如下：
5
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10
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究第二章
第二章 GIO 小鼠模型的构建与表征
为了后期的实验顺利进行，我们首先要建立合格的糖皮质激素骨质疏松症动物模
型。本次实验在构建小鼠糖皮质激素骨质疏松症的动物模型后，通过骨密度、骨形态
计量学分析及血清 Osteocalcin 和 CTX 含量检测综合评判模型构建的情况，为进一步
研究 GIO 提供实验基础。
一、材料与方法
1、材料与试剂
材料与试剂品牌
Swiss Webster 小鼠 Sino-British Sippr/BK
生理盐水 Amresco
波尼松龙缓释片 Innovative Research of America
安慰剂缓释片 Innovative Research of America
显微手术器械上海金粒医疗
盘尼西林湖北泽泰元化工有限公司
碘伏溶液江西泰馨康实业有限公司
水合氯醛上海实验试剂有限公司
15ml 和 50ml 离心管 Corning
1.5ml 离心管 Axygen
BCA 蛋白浓度测定试剂盒 PIERCE
96 孔板 Corning
CTX ELISA 试剂盒 Biomedical Technologies
Osteocalcin ELISA 试剂盒 Biomedical Technologies
多聚甲醛 Sigma
PBS 缓冲液上海源培
NaOH Sigma
甲基丙烯酸甲酯 Amresco
KOH Sigma
无水乙醇上海沪华
苦味酸 Sigma
品红 Sigma
11
第二章 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
2、实验仪器
实验仪器品牌实验仪器品牌
纯水器 Pall 涡旋振荡仪 IKA MS2
微量移液器 Eppendorf 摇床 TY-20
-80℃深低温冰箱 REVCO 骨密度测量仪 QDR-2000 Plus
-20℃冰箱 SANYO 台式冷冻离机 Eppendorf
电磁搅拌器 Stuart SM24 酶标仪 Bio-Tek
电子分析天平 Mettler Toledo 骨形态计量学软件 Bioquant
PH 计 Mettler Toledo 数据分析软件 SPSS
高压蒸汽消毒锅 Sanyo Lab 图表生成软件 Sigmaplot
3、实验方法
3.1 实验分组
在本研究中，20 只 Swiss Webster 小鼠（雄性，4 月龄）随机分为 2 组：
①波尼松龙给药组（10 只）：波尼松龙埋入皮下，4 周后取材；
②安慰剂对照组（10 只）：安慰剂埋入皮下，4 周后取材；
3.2 波尼松龙皮下埋入术
术前 1 天监测动物体重，根据体重计算麻醉剂量。小鼠颈部手术区用 10%硫化钠
溶液消毒。采用 10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射进行麻醉。将麻醉小鼠背侧颈部皮
肤轻轻拉起，切一个药片大小的切口，用镊子插入 2 厘米左右，将泼尼松龙（2.1
mg/kg/day，共释放 28 天）或安慰剂缓释片植入，缝合切口。术后连续 3 天肌注盘尼
西林（2 万单位），自由进食水，每日昼夜时间各 12 小时，术后不行任何固定，分笼
饲养，笼内活动空间自由。
3.3 骨密度
分别在泼尼松龙缓释片或安慰剂缓释片植入前后（0 周和 4 周）测量小鼠的全身
骨密度和脊柱骨密度。采用 10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射进行麻醉，运用 QDR-2000
Plus 双能 X 线骨密度仪对动物进行全身扫描，之后聚焦于脊柱进行扫描。
3.4 标本收取
泼尼松龙缓释片或安慰剂缓释片植入小鼠颈部皮下 4 周之后，将小鼠断颈处死。
12
取胸椎和 L1-L4 腰椎分离骨髓基质细胞；取第 5 腰椎（L5）进行骨形态计量学分析；

取小鼠全血制备血清。
3.5 血清制备与 ELISA
动物断颈处死后，用 1ml 注射器从心脏取血 1ml，置于 1.5ml 离心管中（不含抗凝
剂）
，室温静置 30min，室温 1500g 离心 10min，取上层血清存于-80℃冰箱。
总蛋白浓度采用 BCA 法测定。将 A 液与 B 液按 50：1 比例混合，然后取出 200μ
l 与 25μl 总蛋白样品混匀，37℃孵育 30min，酶标仪 562nm 波长下读取 OD 值。
用 ELISA 试剂盒自带的 EIA 缓冲液(EIA buffer：含 1％BSA，0．05％Tween20 in
PBS)统一调蛋白浓度为 2μg/μl。建立标准曲线，设标准孔 7 孔，采用倍比稀释法，
将事先配好的标准品从高到低稀释成 7 个浓度。加样处理及检测步骤如下表所示：
Reagents Test sample Standard Test sample (blank) Reagent blank

Diluted standard EIA buffer
Test sample EIA buffer
(Tube 1~7) (Tube 1~7)
100μl 100μl
100μl 100μl
4℃过夜孵育
第二天，清洗 7 次
Labeled
100μl 100μl 100μl 100μl
antibody
4℃孵育 1h
清洗 9 次
Chromogen 100μl 100μl 100μl 100μl
室温避光孵育 30min
Stop solution 100μl 100μl 100μl 100μl
酶标仪 450nm 读数
结果计算：所有 OD 值都应减除空白值；以标准品之 OD 值做出标准曲线；输入待

测蛋白样品 OD 值计算相应浓度。
3.6 骨形态计量学分析
① 固定液（4%多聚甲醛）配制
配制 PBS 溶液 1L。将 40g 多聚甲醛溶于 PBS，搅拌至完全溶解，搅拌过程中逐渐
加入氢氧化钠；酸度计指示下逐滴加入盐酸调整 PH 值至 7.2-7.4 即可。
② 甲基丙烯酸甲酯的配制
首先使用 1200ml 三蒸馏水缓慢溶解 60g 氢氧化钾（KOH）；400ml 甲基丙烯酸甲
酯与 400mlKOH 溶液混合，震荡 3min，静置分层后弃下层液体；再加入 400mlKOH 溶
13
液混合，震荡 3min，静置分层后弃下层液体，如此重复 2 次；最后加入 400ml 去离

子水混合，震荡 3min，静置 10min，弃下层液体；如此重复 2 次；将 MMA 溶液置于烧
杯，加入 50g 无水 Cu2SO4；存于 4℃冰箱；1 天后取出进行过滤；所得溶液即为单体
溶液。
③ 标本固定
4%多聚甲醛固定骨组织标本，流水冲洗 24 小时。
④ 标本梯度脱水
70%乙醇，24 小时；75%乙醇，24 小时；80%乙醇，24 小时；85%乙醇，24 小时；
90%乙醇，24 小时；95%乙醇，24 小时；100%乙醇，24 小时。
⑤ 过滤及包埋
透明后的标本置于单体 I 溶液浸泡 18 小时；单体 II 溶液浸泡 24 小时；单体 III
溶液浸泡 24 小时。然后更换为新的单体 III 溶液。容器内加入合适大小的纯单体块；
置于负压器内，设置抽吸强度为 2×104 帕斯卡，时间 4 小时；抽真空之后盖上容器
盖子，并在盖子上设置换气孔，置于 4℃冰箱 5 天；然后室温下继续聚合直至固化；
后期可置于 40℃烤箱内加速标本的完全硬化。
⑥ 切片及磨片
包埋块固定于切片机，使刀片方向与标本长轴垂直，即矢状面切割，厚度约 150
µm。超声清洗切片 10sec，去离子水冲洗 2min，室温晾干，将切片粘在有机玻璃载玻
片上，5kg 砝码压片 1 天。
先将切片置于磨沙玻璃上打磨，然后依次用 P300、P800 和 P1200 砂纸进行打磨，
将切片打磨至 50 µm；最后采用精抛光氧化铝粉和去离子水混合后进行抛光；最终厚
度为 30-40 µm。
⑦ 染色方法（苦味酸品红染色）
切片超声清洗 30sec，然后去离子水清洗 2min；0.1％甲酸溶液 3min；流水冲洗
2min；20％甲醇溶液 2hr；流水冲洗 2min；切片置于 60℃恒温水浴，使用 Stevenol
蓝染色 8min；60℃去离子水洗片 2min；室温下，苦味酸品红染色 2min；最后 100％
乙醇液清洗 2 次。
⑧ 骨形态计量学分析
在小鼠 L5 腰椎硬组织切片上，以生长板中点为起点，向近端延伸 0.5mm，选取
14
2.8mm2 区域为目标区域，借助 Bioquant 骨形态计量学分析软件，测量 Bone

area/tissue area (%)、Trabecular thickness (μm)、Trabecular spacing (μm)、
Trabecular number (mm-1)、ObS/BS (%)和 OcS/BS (%)等指标。
3.7 统计分析
SPSS 软件分析实验数据，计量数据采用算术平均值±标准差（mean±SD）表示，
采用双侧检验。两组比较使用 t 检验分析，多组比较使用单因素方差分析，如有显
著性差异，采用 Tukey 检验进行统计分析；P<0.05 表示具有统计学意义。
二、实验结果
1、造模前后骨密度检测发现实验组较对照组小鼠的全身及脊柱骨密度变化率明
显降低，血清 Osteocalcin 浓度检测发现实验组较对照组明显降低而 CTX 水平却相反
（表 1）；
2、造模前后骨组织形态计量学分析发现实验组骨小梁数，宽度，成骨细胞数均
较对照组有明显降低而骨小梁间隙却明显增宽，破骨细胞数增多（表 2）；
3、造模前后成骨细胞克隆数比较发现实验组明显减少（图 1）。
15
表 1. 骨密度及血清骨代谢指标检测结果
参数对照组模型组
全身 BMD (% 变化率) -3.2±1.6 -7.8±2.1 *
腰椎局部 BMD (% 变化率) -4.3±2.2 -9.1±3.7 *
Osteocalcin (mg/L) 82.7±8.6 43.2±6.5 **
CTX-I (ng/mL) 8.4±1.5 11.2±1.4*
结果使用均数±标准差表示*P<0.05 vs. placebo; **P<0.01 vs. placebo.
表 2. 骨组织形态计量学分析结果
组织形态参数对照组模型组
骨面积/组织面积(%) 14.5±2.1 4.9±1.4**

骨小梁宽度(mm) 41.6±2.6 28.3±4.2**
骨小梁间隙 (mm) 454±71 597±42*
骨小梁数(per mm) 1.82±0.36 1.32±0.22*
成骨细胞数/骨细胞数(%) 37.23±6.35 25.73±5.17*
破骨细胞数/骨细胞数 (%) 2.25±0.47 4.59±0.72*
结果使用均数±标准差表示. *P<0.05 vs. 对照组; **P<0.01 vs. 对照组.
图 1 成骨细胞克隆数
(实验组椎体 BMSC 培养 4 周 CFU-OB 检测，结果使用均数±标准差表示**P<0.01)
三、讨论
选择合适的动物模型是实验首先需要考虑的问题，本实验中选择的是 4 月龄雄性
16
Swiss Webster 小鼠，考虑此骨龄小鼠骨重建趋于平衡，各种体内生长因子对实验干

扰较小且为避免雌激素影响选择雄性小鼠。小鼠价格便宜，饲养简单，尤其适合后期
需要做基因敲除对骨代谢影响的实验[1]。本实验使用泼尼松缓释片颈部皮下埋入可控
制药物剂量，防止体内激素过量造成动物死亡，结果证明此方法能获得稳定快速的动
物模型。
作为目前诊断骨质疏松症的金标准，双能 X 线吸收法(dual energy X- ray
absorptiometry，DXA) 检测骨密度发现造模前后两组全身及脊柱骨密度变化有明显
差异，由于我们没有查询到小鼠骨质疏松症的诊断标准，由于条件限制也没有使用
micro CT 进行检查，但我们认为使用实验前后的骨密度变化率来协助诊断实验鼠的
骨质疏松情况是相对准确的方法。而骨形态计量学测量可以观察到骨组织细胞及骨小
梁数量与形态的变化，推测骨质疏松症的破骨和成骨情况 [3]，检测发现两组骨面积、
骨小梁厚度、间隙及骨小梁数、成骨细胞克隆数、成骨及破骨细胞比例均有明显差异，
说明造模成功；而血清骨代谢指标 Osteocalcin 和 CTX-I 两组亦显示出明显差异，尤
其是成骨指标实验组 Osteocalcin 下降了约 50%，而破骨指标 CTX-I 升高了 30%，也
印证了糖皮质激素造成的骨质疏松症主要表现为成骨障碍[4,5]，虽然也有破骨细胞活
动较多的作用。
综上所述，本次实验已成功构建了糖皮质激素骨质疏松小鼠模型，为进一步的研
究奠定了实验动物基础。
17
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18
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究第三章
第三章 GIO 小鼠椎体 BMSC 体外培养及异常骨代谢标

志物的筛选
骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSC）是来源于骨髓

的多能干细胞，在适当条件下，能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌
细胞等中胚层细胞。因此，对于 GIO 要阐明详细的病理生理机制及进行有效治疗，
BMSC 是一个潜在靶点。文献指出[1,2]GIO 中 BMSC 成骨分化是有障碍的，提高 BMSC 成
骨分化能力将有助于增加 GIO 骨量以治疗骨质疏松，但至今 BMSC 在 GIO 具体的成骨
障碍机制尚不清楚。本节拟观察 BMSC 体外增殖与成骨分化特点，而异常的骨髓微环
境是骨重建异常的重要原因，本节亦将寻找可能的 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍
异常代谢标志基因为进一步研究打下基础。
1、实验材料与试剂
材料与试剂品牌材料与试剂品牌
硝酸银 Sigma 定量 PCR 试剂盒 Takara
亚硫酸钠 Sigma 引物合成酶上海生工
番红 O Sigma PCR 用 96 孔板 Axygen
无水乙醇上海沪华 α-MEM 培养基 Gibco
上海金粒医疗有限
显微器械细胞培养耗材康宁
公司
抗坏血酸 Sigma 胰蛋白酶 Hyclone
β-甘油磷酸钠 Sigma DMSO Sigma
双抗 Gibco MTT 试剂盒 Merck Millipore
15ml 和 50ml 离心管 Corning ALP 染色试剂盒上海前尘生物
1.5ml 离心管 Axygen Trizol Invitrogen
茜素红上海生工氯仿 Amresco
96 孔板 Corning 异丙醇 Amresco
流式抗体 BD 乙醇上海沪华
BMP-2 R&D DEPC Amresco
多聚甲醛 Sigma 逆转录试剂盒 Invitrogen
19
第三章 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
PBS 缓冲液上海源培胎牛血清 Hyclone

上海生工生物工程
蛋白电泳缓冲液蛋白酶抑制剂 Roche
股份有限公司
蛋白预制胶 Bio-rad BCA 试剂盒 Pierce
Cell signaling
PVDF 膜 Whatman Anti-STAT3
technology
Cell signaling
转膜缓冲液上海生工 Anti-β-actin
technology
脱脂奶粉上海生工 Cytokine Array RayBiotech
Cell signaling
Anti-IL-6 TBST 上海生工
technology
Cell signaling
Anti-p-STAT3 ECL Pierce
technology
Cell signaling
RIPA loading buffer 上海生工
technology
2、实验仪器
纯水器 Pall 酶标仪 Bio-Tek
微量移液器 Eppendorf 细胞计数仪 Beckman
-80℃深低温冰箱 REVCO 超净台 Thermo
-20℃冰箱 SANYO 数据分析软件 SPSS
电磁搅拌器 Stuart SM24 图表生成软件 Sigmaplot
电子分析天平 Mettler Toledo 分光光度计 Nanodrop
PH 计 Mettler Toledo 普通 PCR 仪 Bio-rad
高压蒸汽消毒锅 Sanyo Lab 定量 PCR 仪 ABI7500
涡旋振荡仪 IKA MS2 细胞培养箱 Thermo
摇床 TY-20 倒置显微镜 Olympus
流式细胞仪 BD Calibur 台式冷冻离心机 Eppendorf
转膜仪 Bio-rad
3、实验方法
3.1 椎体 BMSC 分离、流式鉴定、体外培养与体外诱导成骨分化

动物处死后，75%酒精消毒 10min，取其胸椎和第 1-4 腰椎（L1-L4），尽量将肌
肉等软组织剔除，剥离椎间盘，然后用小剪刀将椎体剪碎，用含有 10%胎牛血清的α
-MEM 培养基反复冲洗骨粒，然后将培养基和骨组织接种到培养瓶中，37℃孵箱（5%
CO2）中培养。每 2 天半量换液，第 8 天时将骨粒和没有贴壁的细胞弃去，瓶底贴壁
20
的细胞即为骨髓基质细胞。
贴壁细胞融合后加入 0.25%胰酶消化 2-3min，加入含有血清的培养基血清中止消
化反应，充分吹打混匀，收集于离心管中，300g 离心 5min，弃上清，加入培养基，
吹打均匀接种于培养瓶中进行传代培养。
细胞融合达 80%-90%，0.25%胰酶消化 2-3min，加入含有血清的培养基血清中止
消化反应，充分吹打混匀，收集于离心管中，300g 离心 5min，弃上清，用 PBS 清洗
2 次，最后用 PBS 重悬细胞，台盼蓝法细胞计数。加入荧光标记的抗体
anti-mouseFITC-CD90、FITC-CD105 和 FITC-CD45，37℃下避光反应 20min。最后加
入 500μl PBS 重悬细胞，上机检测。
为了诱导细胞成骨分化，细胞培养至融合后，加入含有 100 ng/ml BMP2 的α-MEM
培养基，每 3 天换液 1 次，共诱导 21 天。提取细胞总蛋白，进行抗体芯片和 western
blot 检测。
3.2 CFU-Osteoblast 测定
骨髓基质细胞以 l×l06/孔的密度接种于 6 孔板，加入成骨诱导液（90% α-MEM、
10%FBS、100 μM 维生素 C 和 10 mM β-甘油磷酸钠），3 天换液 1 次，
24 天后对 CFU-OB
进行计数。
Von Kossa 染色：弃培养液，室温过夜干燥；中性甲醛溶液室温固定 15min，去
离子水清洗 3 次，室温过夜干燥；加入 5%硝酸银溶液，紫外照射 60min，去离子水清
洗 3 次；加入 5%亚硫酸钠溶液褪色，去离子水清洗 3 次；加入 0.05%番红 O 复染 4 min，
去离子水清洗，室温干燥；对黑色矿化结节进行计数拍照。
3.3 MTT
用胰酶消化处于对数期的细胞，终止反应后离心，弃上清，用培养基重悬细胞，
细胞计数后用培养基调整细胞密度为 5-10×104/ml。96 孔板每孔加入 100μl 上述细
胞悬液；将接种好的细胞置于培养箱中培养至细胞汇合；之后每孔加入 10μl
MTT(5mg/ml)，继续培养 4hr；小心弃上清，注意勿将 Formazan 结晶吸弃；然后每孔
加入 150μlDMSO，室温低速振荡混匀 10min，待结晶充分溶解，用酶标仪测定波长
490nm 下各孔的 OD 值。
3.4 细胞总 RNA 提取和定量 RT-PCR
贴壁细胞融合后加入 0.25%胰酶消化 2-3min，加入含有血清的培养基血清中止消
21
化反应，充分吹打混匀，收集于离心管中，300g 离心 5min，弃上清。加入 1ml Trizol

试剂，用移液器反复吹打至细胞完全裂解。室温静置 5mins，每 1ml Trizol 加入氯
仿 0.2ml，剧烈晃动 15secs，室温静置 2~3mins，4℃12000g 离心 15mins。取最上层
的水相。每 1ml Trizol 加入 0.5ml 异丙醇，混匀，室温静置 10mins，4℃12000g 离
心 10mins，弃上清，每 1ml Trizol 加入 1ml 75%乙醇清洗 RNA 沉淀，4℃7500g 离心
5mins。弃上清，空气干燥 5mins~10mins，加入 DEPC 处理过的 ddH2O，55℃~60℃孵
育 10mins。分光光度计测定总 RNA 浓度和纯度，并进行琼脂糖电泳。
RNA 反转录反应的体系和程序如下： 0.5 μ g~5 μ g RNA+1 μ l 500 μ g/ml
Oligo-dT+ddH2O=10μl，70℃ 5mins，置于冰上，加入 4μl 5×RT Buffer+5μl 2.5mM
dNTP，37℃ 5mins，置于冰上，加入 1μl 逆转录酶，42℃ 60mins，70℃ 5mins。
Real-time PCR 采用 SYBR 嵌入法。反应体系如下：4.5μl ddH2O+0.1μl20mM 正
义引物+0.1μl20mM 反义引物+0.1μl cDNA+0.2μl RoxII+5μl SYBR Premix；反应
程序如下：94℃ 10secs+（94℃ 10secs，60℃ 30secs）×40 循环+融解曲线程序。
引物序列如下：
Gene Primer sequences (5’-3’) Product length (bp)

RANKL CGAGCGCAGATGGATCCTAA (F) 247
CCACATCCAACCATGAGCCT (R)
OPG ACAGTTTGCCTGGGACCAAA (F) 160
TCACAGAGGTCAATGTCTTGGA (R)
Runx2 TTCAACGATCTGAGATTTGTGGG (F) 221
GGATGAGGAATGCGCCCTA (R)
OPN CTGGCAGCTCAGAGGAGAAG (F) 106
TTCTGTGGCGCAAGGAGATT (R)
OC GCTACCTTGGAGCCTCAGTC (F) 71
AGGGTTAAGCTCACACTGCT (R)
β-actin GGCTGTATTCCCCTCCATCG (F) 154
CCAGTTGGTAACAATGCCATGT (R)
3.5 碱性磷酸酶染色
吸弃培养基，PBS 清洗 2 次，加入固定液室温固定 30sec，吸弃固定液，PBS 清
22
洗 2 次，然后加入染色液，37℃下染色 45mins，吸弃染色液，PBS 清洗 2 次，扫描仪

和显微镜对细胞进行大体和显微观察。
3.6 茜素红染色
中性甲醛溶液固定细胞，PBS 清洗 2 次，然后加入 40 mM 茜素红染液，37℃孵育
30 min，PBS 清洗 2 次，扫描仪和显微镜对细胞进行大体和显微观察。
3.7 骨代谢标志物的抗体芯片
借助 Raybiotech 公司的 Cytokine Array L-Series 芯片检测 36 种骨代谢标志基
因的表达，具体实验操作由上海拓然生物科技有限公司协助完成。
3.8 细胞总蛋白提取和 Western blot
弃培养基，冰预冷的 PBS 溶液清洗 2 次，将细胞用细胞刮刮入冰预冷的 PBS 中，
4℃ 300g 离心 5mins 收集细胞，弃上清，加入 RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂（10μg/ml
leupeptin，10μg/ml pepstatin A 和 10μg/ml aprotinin）。反复吹打至细胞裂解，
冰上孵育 30mins。4℃ 12000g 离心 30mins，将上清液转移备用。
总蛋白浓度采用 BCA 法测定。将 A 液与 B 液按 50：1 混合，取出 200μl 与 25μ
l 待测样品混合，37℃孵育 30mins，562nm 测定 OD 值。
向蛋白样品中加入同体积 2×上样缓冲液，95℃加热 10mins。然后在 SDS-PAGE
凝胶中每孔上样 30μg。电泳时先 80V 恒压 30mins，之后 120V 恒压 2-3hr。之后将
凝胶、PVDF 膜和滤纸叠好，4℃恒流 300mA 转膜 3hr，之后将膜 5%脱脂奶粉溶液中室
温封闭 1hr，一抗 4℃过夜孵育。第二天 TBST 室温清洗膜 4 次，每次 15min。辣根过
氧化物酶标记的二抗室温孵育 1hr，TBST 室温清洗 PVDF 膜 15mins×4 次，运用 ECL
将 PVDF 膜对 X 光片进行曝光。
3.9 统计分析
同第二章所述方法。
二、实验结果
1，流式细胞检测结果发现所检测的 CD90,CD105 等干细胞表面标志阳性而血细胞
标志 CD45 阴性（图 2）；
2，实验组 MTT 检测发现体外培养的 BMSC 增殖率较低（图 3）；定量 PCR 检测发
现实验组的破骨细胞代谢指标 OPG mRNA 两组虽无明显差异，但是 RANKL 表达却较高，
23
（图 4）；
3，实验组使用 BMP2 诱导后 ALP 及茜素红染色时实验组均淡染（图 5）；成骨细
胞代谢的相关指标 Runx2，OPN，osteocalcin mRNA 亦发现实验组表达较低（图 6），
两组比较有统计学意义。
4，在所检测的 36 个骨代谢标志蛋白中(表 3)，实验组 IL-6 及其下游的活化信号
转导及转录激活子 3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）明
显上调(图 7,8)，且该情况在使用 BMP2 继续诱导成骨的 3 周内同样存在(图 9)。由于
p-STAT3 也可能由 BMSC 分泌的 G-CSF、leptin、oncostatin M 和 IL-11 激活，为排
除其他相关因素可能的影响，我们检测了上述几个因子的表达水平，结果发现除了
G-CSF 在骨质疏松症模型组轻度下降外，其他因子的表达均无异常( 补充图 1)。
图 2 培养细胞表型流式细胞仪鉴定
图 3 BMSCs 体外增殖情况
24
图 4 破骨细胞代谢指标
图 5 碱性磷酸酶 (ALP)及茜素红（Alizarin Red）染色
图 6 成骨细胞功能检测
25
(定量 RT-PCR 检测成骨指标 Runx2、OPN 及 OC ，β-actin 作内参，结果使用

相对于对照组倍增率表示。*: p<0.05. **: p<0.01)
表 3 所检测的 36 骨代谢指标(结果发现 IL-6 明显增高)
图 7 IL-6 荧光强度明显增强
26
图 8 模型组 IL-6 及 STAT3 表达情况
图 9 骨诱导后 IL-6 及 STAT3 检测

(β-actin 做内参照. **: p<0.01,模型组 vs. 对照组. )
补充图 1 G-CSF, leptin, oncostatin M 及 IL-11 表达情况
27
三、讨论
自 1999 年 BMSC 被发现后，这种功能强大的神奇细胞一直是大家研究的热点。由
于 BMSC 只占骨髓中有核细胞的 0.01%-0.0001% [3,4]，因此如想对其进行研究，首先必
须在所获得的骨髓细胞中对其进行分离纯化。目前常用的分离方法有贴壁法、密度梯
度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法。由于贴壁法对细胞损伤小，费用较低，
简单易行，经过 2-3 代传代培养后通常能够满足实验要求，故最为常用，而其他几种
方法较复杂，设备要求较高并未得到广泛使用。目前鉴定 BMSC 主要通过细胞膜表面
的特异性抗原，干细胞表面比较肯定存在的是[5,6]：CD90、CD105、CD29 和 CD44 等，
而 CD45 和 CD14 等造血细胞表面抗原一般为阴性。本实验中，实验组及对照组均分离
培养出 CD90 和 CD105 阳性，CD45 阴性细胞，加之后续可被 BMP2 诱导成骨定向分化，
故可以确定所得的细胞即为 BMSC。
本实验发现实验组细胞较对照组细胞体外增殖活力明显减弱，且实验组再使用
BMP2 诱导后 ALP 及茜素红染色结果也可以表明实验组细胞成骨分化潜能较对照组
明显减弱，成骨分化指标 Runx2、OPN 和 osteocalcin mRNA 表达水平较对照组减
低，两组比较有统计学意义。上述结果说明糖皮质激素性骨质疏松 BMSC 增殖减慢
以及成骨分化障碍，虽然在 BMP2 这样的强成骨诱导因素存在情况下，成骨活性会
稍有增高，但仍明显低于正常组。
OPG（骨保护素）又叫破骨细胞抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory
factor），是一种生长因子受体，属于肿瘤坏死因子（TNF）受体家族。OPG 是 RANKL
（破骨细胞分化因子）的竞争性受体，通过与 RANKL 的结合减少破骨细胞的产生。实
验组发现 RANKL 表达上调，而 OPG mRNA 两组无明显差异。说明在糖皮质激素性
骨质疏松症时，破骨细胞功能变化较小，成骨破骨偶联出现异常。当然，也有文献报
道骨质疏松时 BMSC 成脂分化增强[7-10]，成脂成骨功能失平衡也是造成骨质疏松症恶性
循环的重要原因。
为了探讨 GIO 异常的骨髓微环境，本次实验中，使用抗体芯片技术发现在所检测
的 36 个骨代谢标志蛋白中，IL-6 及其下游的 p-STAT3 明显上调，而可能造成混淆的
G-CSF, leptin, oncostatin M 及 IL-11 无明显改变，提示我们 IL-6 在 GIO 小鼠椎体
BMSC 成骨分化过程中明显增高，该现象很可能与 BMSC 的成骨分化障碍有关系。
自从 30 年前被发现以来，Interleukin-6(IL-6)被证明可出现在许多老年性疾病中。
28
表现为破骨细胞过度活化的老年性及绝经后骨质疏松症可发现明显增高的 IL-6[11,12]，
临床上也发现过多的 IL-6 与骨质疏松症有关[13,14]。近期还有报道：增高的 IL-6 可溶
性受体是预测髋部骨折的可靠指标[15]，血清 IL-6 浓度和 C 反应蛋白及骨密度有明显
相关[16] 。然而，GIO 椎体骨折中 IL-6 所扮演的角色及内在的分子机制尚不清楚。
GIO 小鼠椎体 BMSC 体外培养发现 IL-6 明显增高，且该情况在使用 BMP2 诱导成
骨时同样存在。下一步我们将继续探讨过多的 IL-6 是否参与了 GIO 小鼠椎体 BMSC
的成骨分化功能障碍。
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30
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究第四章
第四章 IL-6 介导了 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍

及其机制
上一章节通过实验发现 GIO 小鼠椎体 BMSC 分化时 IL-6 过度分泌，本章节实验

我们拟研究增高的 IL-6 是否与 GIO 小鼠 BMSC 成骨分化障碍有关。作为成骨分化中
经典的信号通路，我们设想过度分泌的 IL-6 导致的 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍
是否与 Wnt/β-catenin 通路信号有关？所以，本节将通过实验探讨在成骨分化障碍
的分子调节机制中，IL-6 是否与 Wnt/β-catenin 信号通路有关。
双抗 Gibco IL-6 RNAi 慢病毒载体 Genecopoeia
15ml 和 50ml
Corning 慢病毒包装试剂盒 Genecopoeia
离心管
离心管 Axygen 慢病毒滴度测定试剂盒 Clontech
96 孔板 Corning Trizol Invitrogen
BMP-2 R&D 氯仿 Amresco
PBS 缓冲液上海源培异丙醇 Amresco
FBS Hyclone 无水乙醇上海沪华有限公司
α-MEM 培养基 Gibco DEPC Amresco
细胞培养瓶/皿/板 Corning RNA 逆转录试剂盒 Invitrogen
胰蛋白酶 Hyclone 定量 PCR 试剂盒 Takara
Cell signaling
RIPA 引物合成上海生工
technology
蛋白酶抑制剂 Roche PCR 用 96 孔板 Axygen
BCA 试剂盒 Pierce Anti-p-STAT3 Cell signaling technology
loading buffer 上海生工 Anti-STAT3 Cell signaling technology
蛋白电泳缓冲液上海生工 Anti-β-actin Cell signaling technology
蛋白预制胶 Bio-rad TBST 上海生工
PVDF 膜 Whatman ECL Pierce
转膜缓冲液上海生工茜素红上海生工
31
第四章 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
脱脂奶粉上海生工 ALP 染色试剂盒上海前尘生物

IL-6 neutralization
Peprotech IWR-1 Sigma
antibody
LiCl Sigma G490 Sigma
Anti-non-phospho Cell signaling
β-catenin technology
2、实验仪器
纯水器 Pall 转膜仪 Bio-rad
微量移液器 Eppendorf 数据分析软件 SPSS
-80℃深低温冰箱 REVCO 图表生成软件 Sigmaplot
-20℃冰箱 SANYO 细胞培养箱 Thermo
电磁搅拌器 Stuart SM24 普通 PCR 仪 Bio-rad
电子分析天平 Mettler Toledo 定量 PCR 仪 ABI7500
PH 计 Mettler Toledo 分光光度计 Nanodrop
高压蒸汽消毒锅 Sanyo Lab 倒置显微镜 Olympus
涡旋振荡仪 IKA MS2 细胞计数仪 Beckman
摇床 TY-20 超净台 Thermo
台式冷冻离心机 Eppendorf 蛋白电泳仪 Bio-rad
酶标仪 Bio-Tek
3、实验方法
3.1 IL-6 中和抗体实验

IL-6 中和抗体（0.8 μg/ml）被用来阻断骨髓基质细胞 IL-6 的活性。IL-6 中和
抗体加入细胞培养基后，1 天后提取细胞总蛋白，采用 western blot 对目标蛋白表
达量进行分析。
BMP2 诱导骨髓基质细胞成骨分化，其中加入 IL-6 中和抗体（0.8 μg/ml）。1
周后对细胞进行 AKP 染色和定量分析，3 周后对细胞进行茜素红染色和定量分析，2
周后提取细胞总 RNA 进行实时定量 PCR 分析。
同上次实验相关内容（见第三章 3.8 节）。
3.3 碱性磷酸酶染色与定量
AKP 染色方法同上次实验相关内容（见第三章 3.5 节）。
32
采用 pNPP 法进行定量。吸弃细胞培养基，用冰预冷的 PBS 溶液清洗 2 次，然后

将细胞用细胞刮刮入 PBS 中，300g 室温离心 5min，弃上清，加入用 300-500μl 去离
子水重悬细胞。然后-80℃冰箱静置 0.5hr，37℃水浴 5min，如此反复冻融 3 次。之
后 4℃12000g 离心 30mins，转移上清备用。将 50μl pNPP 储备液、100μl DEA 和
50μl 待测蛋白样品混合，37℃水浴 30mins，最后加入 200μl NaOH（3M），从中取
出 200μl 置于 96 孔板中，酶标仪波长 405nm 下测定 OD 值。
蛋白浓度测定方法同前（见第三章 3.8 节）。
3.4 茜素红染色与定量
中性甲醛溶液固定细胞，PBS 清洗 2 次，然后加入 40 mM 茜素红染液，37℃孵育
30 min，PBS 清洗 2 次，扫描仪和显微镜对细胞进行大体和显微观察。之后加入 0.1M
HCl，4℃过夜孵育，最后借助分光光度计读取 OD610 的数值。
细胞总 RNA 提取、总 RNA 逆转录、实时定量 PCR 方法同上（见第三章 3.4 节）。
Real-time PCR 引物序列如下：

IL-6 GCCTTCTTGGGACTGATGCT (F) 475
TGGAAATTGGGGTAGGAAGGAC (R)
Runx2 TTCAACGATCTGAGATTTGTGGG (F) 221
GGATGAGGAATGCGCCCTA (R)
OPN CTGGCAGCTCAGAGGAGAAG (F) 106
TTCTGTGGCGCAAGGAGATT (R)
OC GCTACCTTGGAGCCTCAGTC (F) 71
AGGGTTAAGCTCACACTGCT (R)
33

Cyclin D1 TCAAGTGTGACCCGGACTG (F) 175
ATGTCCACATCTCGCACGTC (R)
Axin2 AGGTCCTGGCAACTCAGTAAC (F) 164
TCTCTTAAGTCAGCAGGGGC (R)
Dkk1 TCTCTATGAGGGCGGGAACA (F) 156
TTTCGGCAAGCCAGACAGAT (R)
3.6 RNAi
293T 细胞生长至 70%-80%时将慢病毒包装复合物加入到培养基中。48hr 后收集
上清，里面即含有病毒颗粒。测定病毒滴度，将慢病毒以 MOI=25 感染骨髓基质细胞，
通过 RT-PCR 和 Western blot 检测 IL-6 的核酸和蛋白表达水平，计算干扰效率。
3.7 椎体来源骨髓基质细胞的体外给药
LiCl（20 mM）和 IWR-1（10−6 M）分别用来激活和阻断 Wnt/β-catenin 信号通路
活性，AG490 (50 μM)用来阻断 STAT3 的活性。
3.8 统计分析
二、实验结果
1，GIO 小鼠 BMSC 经 IL-6 中和抗体处理（图 10-12）或使用 shRNA（图 13-15）
下调了 IL-6 表达后，p-STAT3 水平相应下调，而处理组 ALP 及茜素红染色较深，ALP
和钙沉积以及 Runx2、OPN 和 OC 等相关成骨细胞代谢标志物的 mRNA 表达水平均
较对照组高，且该情况在使用 BMP2 诱导成骨 3 周内同样存在。
34
图 10 磷酸化 STAT3 表达情况

(模型组 BMSCs 体系 IL-6 作用后再使用 IL-6 中和抗体作用，IgG 作为对照)
图 11 使用 IL-6 中和抗体作用后检测 ALP 及钙沉积情况
图 12 使用 IL-6 中和抗体作用后检测 Runx2、OPN 及 OC 表达情况

(使用相对于对照组倍增率表示， *: p<0.05， IL-6 中和抗体 vs 对照组. )
35
图 13 IL-6 RNAi 作用后检测 IL-6 及 STAT3 表达情况
图 14 IL-6 RNAi 作用后检测 ALP 及钙沉积情况
图 15 IL-6 RNAi 作用后检测 Runx2 、 OPN 及 OC 表达情况

2，骨诱导后 0、1、2 和 3 周实验组活化 β-catenin 及其目的基因 cyclinD1 和
Axin2 较对照组明显下调而抑制基因 Dkk1 较对照组上调。（图 16,17）
36
3，骨质疏松小鼠 BMSC 用 LiCl 激活 β-catenin 后，IL-6/STAT3 并无明显变化；

而 IL-6 中和抗体及 STAT3 抑制剂 AG490，shRNAs 特异性抑制 IL-6/ STAT3 作用
后 β-catenin 均明显增高。（图 18-20）
4，正常小鼠 BMSC 分别使用 IWR-1 抑制 Wnt/β-catenin 信号通路及 IL-6 作用
后检测 IL-6/STAT3 及 β-catenin 发现两者间存在负性调节关系。（图 21,22）
图 16 模型组使用 BMP2 骨诱导后 β-catenin 表达情况
图 17 模型组使用 BMP2 骨诱导后 cyclin D1、Axin2 及 Dkk1 表达情况

(使用相对于对照组倍增率表示.)
37
图 18 使用 LiCl 作用后 IL-6 及 STAT3 表达情况
图 19 使用 AG490 及 IL-6 中和抗体作用后 β-catenin 表达情况
图 20 RNAi 作用后 STAT3 及 β-catenin 表达情况
38
图 21 使用 IWR-1 作用后 β-catenin、IL-6 及 STAT3 表达情况
图 22 使用 IL-6 作用后 β-catenin 表达情况

(β-actin 作为内参照 *: p<0.05, 模型组 vs. 对照组)
三、讨论
在本次实验中，我们分别使用 IL-6 中和抗体和 shRNA 下调 IL-6 表达来探讨过度
分泌的 IL-6 是否参与了 GIO 小鼠椎体 BMSC 的成骨分化障碍。实验发现：成骨代谢
相关标志基因及 mRNA 水平均由于 IL-6 的下调而明显增高。因此我们认为，IL-6 确
实参与了成骨细胞分化过程中的抑制调节作用，且在其中作用较为明显。实验中，我
们使用 β-catenin 的经典激活剂 LiCl 及抑制剂 IWR-1 作用后检测 β-catenin、IL-6 及
STAT3 表达的情况，而由于实验条件限制，没有深入检测其下游的 GSK-3β 及 TCF4
表达水平，但有多篇报道了 LiCl 及 IWR-1 对 β-catenin 的确定性作用。
39
从肝细胞激活到 B 淋巴细胞激活，IL-6 一直被认为是具有多种生物学作用的细

胞因子，其在免疫系统、中枢神经系统及骨的多种生物学活动中发挥重要的作用[1-3]。
增高的 IL-6 在类风湿性关节炎时的致病作用[4]及 IL-6 受体的单克隆抗体 Tocilizumab
可以通过抑制类风湿关节炎时骨吸收正性调节骨平衡[5,6]已被证实。而近期的研究认
为 IL-6 是基质/成骨细胞分泌并通过加强成骨破骨细胞相互作用而促进破骨细胞形成
的[7]。相对于在骨吸收中的作用，IL-6 在骨形成中的作用很少被研究，且各个研究结
果间差异较大。
在本次研究中，我们发现了 IL-6 负性调节 BMSC 成骨作用，这与许多文献相同。
例如，IL-6 敲除鼠中观察到皮质骨结构异常及骨折愈合困难[8,9]，尽管有基本正常的
骨密度[10,11]。而 IL-6 过表达的转基因鼠中发现骨量减少伴钙化障碍，同时有成熟的
成骨细胞活动明显减少[12]。Kaneshiro 等在体外实验时发现 IL-6 是通过 SHP2/MEK2
和 SHP2/Akt2 信号通路负性调节成骨细胞分化的[13]。Poli 等报道 IL-6 缺陷鼠可以
抵抗雌激素缺失造成的骨量减少[11]。Bian 报道骨肉瘤细胞分泌的 IL-6 可以抑制 BMSC
向成骨细胞分化[14]。有些药物可以通过抑制 IL-6 的表达来减少骨吸收[15-19]。但也有
部分研究认为 IL-6 可促进成骨分化。如 Huh 等认为[20] IL-6 是由脂肪源的基质细胞
分泌且可促进成骨即与我们的研究不同，其原因可能是由于两种细胞来源（骨髓，脂
肪组织）不同。由于成骨细胞主要源于骨髓基质细胞，所以我们认为本实验研究中对
骨髓基质细胞的成骨作用研究更能真实的反应 GIO 的成骨分化障碍情况。
迄今为止，关于 IL-6 调节 BMSC 成骨分化的具体分子机制的报道较少。曾有研究
IL-6 通过 SHP2/MEK2 及 SHP2/Akt2 信号通路负性调节 BMSC 成骨分化[21]。而本实验使
用 LiCl 活化β-catenin 及 IWR-1 抑制β-catenin 时，IL-6 及 STAT3 水平并未改变；
而在使用 IL-6 中和抗体及 STAT3 抑制剂 AG490 时，β-catenin 明显升高。因此，我
们认为成骨分化通路中，β-catenin 位于 IL-6 的下游。由于 AG490 并不是 STAT3 特
异性抑制剂，所以我们继续使用 shRNAs 技术沉默 IL-6 进而特异性阻滞 IL-6-STAT3
通路，结果同样证明了 IL-6-STAT3 位于β-catenin 上游且二者间呈负性调节关系。
最后我们使用 IL-6 作用，进一步证明了 IL-6 位于成骨信号调节通路的上游负性调节
β-catenin。由于β-catenin 在 BMSC 成骨分化时具有重要作用，我们认为 wnt/β
-catenin 信号通路在 IL-6 介导的 BMSC 成骨障碍中具有重要的作用。据我们所知，
这是首次报道 IL-6 通过抑制β-catenin 负性调节 BMSC 成骨分化。
40
BMP- SMAD-MAPK 通路及 Wnt/β-catenin（经典及非经典）是当今研究较多的成

骨信号通路。BMP 信号通过细胞内 SMAD 蛋白（包括 SMAD1/5/8）以及下游的有丝分裂
原激活蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase (MAPK),激活 RUNX2 和（或[22]）
OSX 的转录。而 RUNX2 (runt-related transcriptional factor 2)及其下游的 OSX（成骨相
关转录因子抗体）是两个被证实的具有激活 osteocalcin（骨钙素）启动子的转录因子
[23-26]
，在成骨分化中具有关键作用。
Wnt/β-catenin 是另一个被广泛研究的成骨分化通路。Wnt 包括 19 个骨髓异质
细胞群分泌的高度保守的糖蛋白，主要位于细胞质内，当激活后即转入细胞核内发挥
成骨作用。根据激活是否有β-catenin 参与分为经典通路及非经典通路。经典通路
研究较多，
FRIZZLED (FZD)受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白 5 或 6（the low-density
lipoprotein receptor-related protein 5 or 6 ，LRP5or 6)共受体结合 Wnt 配体
可阻止细胞质内β-catenin 降解，聚集的β-catenin 可转入细胞核内与 TCF/LEF 家
族蛋白相互作用从而激活成骨反应的目标基因 [27,28] 。而经典通路的抑制剂
Dickkopf-related protein (Dkk1)则可阻断入核[29]。经典的 Wnt/β-catenin 是 BMSC
成骨分化的重要通路，但是多个实验同时表明该通路在促进成骨的同时又有抑制成脂
分化的作用[30,31]。非经典 Wnt 通路可通过多种方式，如细胞内 Ca 2+通路,PCP 信号通路
及 GTPase Raccalcium/calmodulin-depenent kinase II (CAMKII) 或 c-Jun
N-terminal kinase (JNK)激活蛋白等多种途径发挥生物学作用[32-35]。由于非经典通
路研究较少，这些途径是单独还是协同发挥作用还有待于进一步阐明[36]。
曾有报道指出 IL-6 可激活人脂肪干细胞成骨分化，非经典 WNT 通路中的酪氨酸
激酶样孤儿受体 2(receptortyrosine kinase-like orphan receptor2，ROR2)的 mRNA
转录增加，而成骨分化经典 WNT 通路的β-catenin 却无明显变化[37]。究其原因我们
认为,当 IL-6 激活经典 WNT 通路时抑制成骨分化，而激活非经典 WNT 通路时则会促进
成骨分化。
参考文献
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IL-6-accelerated calcification byinduction of ROR2 in human adipose tissue-derived

mesenchymal stem cells is STAT3 dependent.Rheumatology. 2014; 53(7):1282–90
45
第五章 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
第五章 IL-6-/-小鼠 BMSC 的成骨分化
本次实验我们拟探讨 IL-6-/-小鼠椎体 BMSC 的成骨分化特点，进一步明确 IL-6

对 Wnt/β-catenin 信号通路的调控作用。
双抗 Gibco Trizol Invitrogen
15ml 和 50ml 离心管 Corning 氯仿 Amresco
1.5ml 离心管 Axygen 异丙醇 Amresco
96 孔板 Corning 乙醇上海沪华
BMP-2 R&D DEPC Amresco
PBS 缓冲液上海源培逆转录试剂盒 Invitrogen
胎牛血清 Hyclone 定量 PCR 试剂盒 Takara
α-MEM 培养基 Gibco 引物合成上海生工
细胞培养瓶/皿/板 Corning PCR 用 96 孔板 Axygen
胰蛋白酶 Hyclone ALP 染色试剂盒上海前尘生物
Cell signaling
RIPA 茜素红上海生工
technology
Anti-non-phospho Cell signaling
蛋白酶抑制剂 Roche
β-catenin technology
Cell signaling
BCA 试剂盒 Pierce Anti-p-STAT3
technology
Cell signaling
蛋白 loading buffer 上海生工 Anti-β-actin
technology
蛋白电泳缓冲液上海生工 TBST 上海生工
蛋白预制胶 Bio-rad ECL Pierce
PVDF 膜 Whatman 脱脂奶粉上海生工
转膜缓冲液上海生工
46
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究第五章
2、实验仪器
纯水器 Pall 蛋白电泳仪 Bio-rad
微量移液器 Eppendorf 转膜仪 Bio-rad
-80℃深低温冰箱 REVCO 数据分析软件 SPSS
-20℃冰箱 SANYO 图表生成软件 Sigmaplot
电磁搅拌器 Stuart SM24 细胞培养箱 Thermo
电子分析天平 Mettler Toledo 普通 PCR 仪 Bio-rad
PH 计 Mettler Toledo 定量 PCR 仪 ABI7500
高压蒸汽消毒锅 Sanyo Lab 分光光度计 Nanodrop
涡旋振荡仪 IKA MS2 倒置显微镜 Olympus
摇床 TY-20 细胞计数仪 Beckman
台式冷冻离心机 Eppendorf 超净台 Thermo
酶标仪 Bio-Tek
3、实验方法
3.1 IL-6-/-小鼠基因型鉴定
10 周大 IL-6-/-鼠(B6.129S2-Ⅰl6 tm1Kopf
/J, Jackson Lab)10 只为实验组，同窝
出生的鼠（C57BL/6J）10 只作为对照组，饲养情况完全相同。剪鼠尾 3-5mm；加入
30μl 消化液（含蛋白酶 K），60℃消化 5h，期间不停混匀，直至组织已经碎软；加
300μl 无菌水，95℃ 10min；离心，取 1μl 做 PCR 鉴定。引物序列如下：
Common: 5’-TTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3’;
Wild type reverse: 5’-TTCTCATTTCCACGATTTCCCAG-3’;
Mutant reverse: 5’-CCGGAGAACCTGCGTGCAATCC-3’。循环程序：94℃ 3min，
（94℃
30 sec，62℃1min，72℃ 1 min）×35，72℃ 2 min。PCR 产物进行琼脂糖电泳。
3.2 椎体骨髓基质细胞分离、体外培养与成骨分化
同第三章 3.1 节
47
3.5 碱性磷酸酶染色与定量
3.6 茜素红染色与定量
3.7 统计分析
二、实验结果
1．IL-6-/-小鼠椎体 BMSC 培养后检测发现其未表达 IL-6，且β-catenin 及其目
的基因 cyclinD1 和 Axin2 较对照组明显上调。（如图 23,24）
2．使用 BMP2 骨诱导后实验组 ALP 及茜素红染色较深，ALP 定量和钙浓度检
测、Runx2、OPN 和 OC 等相关成骨细胞代谢标志物的 mRNA 定量检测均较对照组
上调。
（图 25,26）
图 23 IL-6 -/-小鼠 IL-6 及 β-catenin 的表达情况
48
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究第五章
.
图 24 IL-6 -/-小鼠 cyclin D1 及 Axin2 的表达情况
图 25 IL-6 -/-小鼠 ALP 染色和钙沉积情况
图 26 IL-6 -/-小鼠骨诱导后 Runx2、OPN 及 OC 的表达情况

(β-actin 作为内参照，结果用相对于未诱导的正常小鼠 BMSCs 倍增率使用均数±
标准差表示， *: p<0.05 ，**: p<0.01, IL-6 -/- vs 对照组.)
49
三、讨论
为排除前期实验中可能有的实验误差，进一步验证实验结论，本实验使用了更有
特异性的 IL-6 基因敲除小鼠重复前述实验步骤并检测相关指标。在本次实验中，我
们首先对 IL-6-/-小鼠基因型进行了确认。接着后续实验发现实验组和对照组小鼠椎体
BMSC 分泌的 β-catenin 及其目的基因[2-4]cyclinD1 和 Axin2 的表达存在明显差异；使
用 BMP2 骨诱导后 IL-6-/-小鼠 ALP 及茜素红染色较深、ALP 定量和细胞钙沉积度检
测指标均较高；而 Runx2、OPN 和 OC 等相关成骨细胞代谢标志物的 mRNA 表达水
平也较对照组明显上调，从而再次证明了 IL-6 确实对 Wnt/β-catenin 信号通路有负性
调控作用，并由此影响 BMSC 成骨分化功能。该结果使我们有信心进行下一步的体
内实验。
参考文献
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50
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究第六章
第六章 IL-6 中和抗体对小鼠 GIO 表型的挽救
前期实验观察了 GIO 小鼠模型 BMSC 体外增殖及成骨分化特点，找到成骨分化障

碍异常标志基因 IL-6，多角度论证了 IL-6 参与成骨分化障碍的调控及其分子机制。
由此我们设想能否在体内使用针对 IL-6 的特异性药物对 GIO 进行更有效的治疗？本
次实验拟体内使用 IL-6 中和抗体对 GIO 小鼠进行治疗，为进一步临床开发 GIO 药物
进行探索。
材料与试剂品牌
Swiss Webster 小鼠 Sino-British Sippr/BK
生理盐水 Amresco
波尼松龙缓释片 Innovative Research of America
安慰剂缓释片 Innovative Research of America
显微手术器械上海金粒医疗
盘尼西林湖北泽泰元化工有限公司
碘伏溶液江西泰馨康实业有限公司
水合氯醛上海实验试剂有限公司
15ml 和 50ml 离心管 Corning
1.5ml 离心管 Axygen
BCA 蛋白浓度测定试剂盒 PIERCE
96 孔板 Corning
CTX ELISA 试剂盒 Biomedical Technologies
Osteocalcin ELISA 试剂盒 Biomedical Technologies
多聚甲醛 Sigma
PBS 缓冲液上海源培
NaOH Sigma
甲基丙烯酸甲酯 Amresco
KOH Sigma
无水乙醇上海沪华
苦味酸 Sigma
品红 Sigma
Hematoxylin Sigma
Orange G Sigma
51
第六章 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
2、实验仪器
纯水器 Pall 高压蒸汽消毒锅 Sanyo Lab
微量移液器 Eppendorf 涡旋振荡仪 IKA MS2
-80℃深低温冰箱 REVCO 摇床 TY-20
-20℃冰箱 SANYO 骨密度测量仪 QDR-2000 Plus
电磁搅拌器 Stuart SM24 台式冷冻离心机 Eppendorf
电子分析天平 Mettler Toledo 酶标仪 Bio-Tek
PH 计 Mettler Toledo 骨形态计量学分析软件 Bioquant
图表生成软件 Sigmaplot 数据分析软件 SPSS
正置显微镜 Leica
3、实验方法
3.1 实验分组
本研究将 40 只 4 月龄雄性 Swiss Webster 小鼠随机分为 4 组，每组 10 只小鼠，
分组情况如下：
①安慰剂对照组：安慰剂缓释片皮下埋入术，4 周后取材；
②波尼松龙组：波尼松龙缓释片皮下埋入术，4 周后取材；
③波尼松龙+IgG：波尼松龙缓释片皮下埋入术，分别于术后第 4、11、18 和 25
天腹腔注射 IgG（500μg）；
④波尼松龙+IL-6 中和抗体：波尼松龙缓释片皮下埋入术，分别于术后第 4、11、
18 和 25 天腹腔注射 IL-6 中和抗体（500μg）。
3.2 波尼松龙皮下埋入术
同第二章相应内容（见第二章 3.2 节）。
3.3 骨密度
3.4 标本收取
3.5 血清制备与 ELISA
52
3.6 骨形态计量学分析
3.7 石蜡切片制备与 hematoxylin & orange G 染色
将标本依次浸入二甲苯 I 5 min，二甲苯 II 5 min，100%酒精 I 5 min，100%酒
精 II 3 min，95%酒精 3 min，85%酒精 3 min，75%酒精 3 min，然后自来水冲洗；1%
Acid alcohol 中 30 s，沥干；室温置于 Hematoxylin 中 30min；去离子水充分清洗；
0.5% ammonia 中 15 s；去离子水充分清洗；95%乙醇中 1min，沥干；置于 Orange G
中 1.5min；95%乙醇清洗 3 次；脱水，透明，封片。
3.8 统计分析
二、实验结果
波尼松龙+IL-6 中和抗体组全身及脊柱骨密度变化率，Osteocalcin 均较波尼松
龙+ IgG 组明显增高，而 CTX 含量轻度减少；波尼松龙+IL-6 中和抗体组染色显示更
多量的松质骨面积，且与波尼松龙+IgG 组骨小梁数、间隙、宽度和成骨细胞数等各
指标间均有显著性差异，而两组间破骨细胞数无明显差异。（图 27，表 4,5）
表 4. IL-6 中和抗体作用后 BMD 及血清骨代谢指标
泼尼松泼尼松
参数安慰剂泼尼松 + +
IgG IL-6 nAb
全身骨密度变化率
-2.2±1.1 -7.1±2.3* -6.8±1.5* -4.6±1.5*
(%)
脊柱局部骨密度变
-4.5±1.5 -9.9±2.3* -8.1±1.3* -5.8±1.9*
化率(%)
血清骨钙素 (mg/L) 73.7±7.6 49.2±4.6** 53.2±6.6* 63.5±7.5*
CTX-I (ng/mL) 7.2±1.5 10.5±1.8* 11.8±2.2* 9.1±2.0*
(结果使用均数 ±标准差表示，*P<0.05, **P<0.01 泼尼松 vs.安慰剂, 泼尼松+IgG vs.

安慰剂及泼尼松+IL-6 nAb vs. 安慰剂+IgG.)
53
图 27 IL-6 中和抗体作用后椎体松质骨染色情况
( hematoxylin and orange G staining )
表 5. IL-6 中和抗体作用后椎体松质骨组织形态计量学分析
泼尼松泼尼松 e
组织计量学参数安慰剂泼尼松 + +
IgG IL-6 nAb
骨面积/组织面积
19.7±4.3 5.9±1.1** 6.7±2.3* 12.9±3.4*
(%)
骨小梁宽度 (mm) 35.6±4.6 22.4±3.5** 25.7±3.1 29.3±4.8*
骨小梁间隙 (mm) 484±51 579±35* 597±26* 514±35*
皮质骨数 (mm-1) 1.99±0.23 1.24±0.24* 1.06±0.19* 1.78±0.36*
成骨细胞/骨细胞(%) 35.72±5.97 27.38±3.95* 25.94±5.22* 33.25±4.62*
破骨细胞/骨细胞(%) 3.23±0.52 5.49±0.78* 5.74±0.66* 5.25±0.57*
(结果使用均数 ±标准差表示，*P<0.05,泼尼松 vs. 安慰剂, 泼尼松+IL-6 nAb vs. 泼
尼松+IgG.)
三、讨论
本次实验中，我们综合前期实验的结果，设想既然 IL-6 是导致 GIO 成骨分化障
碍的重要原因，能否使用 IL-6 中和抗体去治疗 GIO？而现今的治疗骨质疏松症药物
中，主要还是抗破骨细胞功能的药物，对于以成骨细胞功能障碍为主的 GIO 及老年
性骨质疏松症并不合适。使用血清骨代谢指标、骨密度、组织学及骨组织计量学等多
种检测后，我们首次发现体内使用 IL-6 中和抗体确实可以改善小鼠骨质疏松疾病病
理表型，特别是成骨分化障碍为主要致病机制的 GIO。
IL-6 在多种疾病发病过程中的重要作用已经被阐明[1]。如 IL-6 可促进 B 细胞恶
性肿瘤及多发性骨髓瘤细胞的增生并抑制细胞凋亡 [2-4] ；由于能够刺激 BMSC 生成
54
RANKL[5]，激活破骨细胞和诱导骨吸收，IL-6 被认为是绝经后骨质疏松症的一个关键
因素[6]；类风湿性关节炎患者关节滑液中 IL-6/可溶性 IL-6 受体(sIL-6R)复合物的高
表达已被证实可诱导破骨细胞的形成,导致关节破坏[7]。因此，对于某些与 IL-6 分泌
异常有关的疾病，通过药物特异性抑制 IL-6 是一种很有前途的治疗方法。多个临床
试验也已经证实在多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病
中，人源性 IL-6 受体(sIL-6R)抗体有良好的治疗效果[8-11]。本实验通过体内使用 IL-6
中和抗体，发现可改善 GIO 小鼠的成骨细胞功能，对破骨细胞功能无明显作用，可为
进一步临床开发 GIO 药物提供参考。
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56
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究主要结论与展望
主要结论与展望
本实验验证了 GIO 小鼠椎体 BMSC 体外增殖减慢且伴成骨分化障碍，并得出以下

结论：
1、GIO 小鼠椎体 BMSC IL-6 过度分泌，且该情况在使用 BMP2 诱导成骨时同样存在；
2、IL-6 过度分泌是导致 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍的重要原因；
3、IL-6 负性调节 Wnt/β-catenin 信号通路导致 GIO 小鼠椎体 BMSC 的成骨分化
障碍；
4、体内使用 IL-6 中和抗体可改善 GIO 小鼠的骨质疏松疾病表型
本实验加深了对 GIO 病理生理的认识，提出了在以后的 GIO 治疗研究中 IL-6 可
作为一个重要的治疗靶点的新观点。为进一步临床开发 GIO 药物提供了参考。
57
综述 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
综述
肾上腺糖皮质激素性骨质疏松症发病的分子机制
李翔综述杨惠林陈建权审校

肾上腺糖皮质激素（glucocorticoid，GC）广泛使用在风湿类风湿，肾脏病，多发
性硬化等免疫性疾病的治疗中，而皮质激素诱导的骨质疏松(glucocorticoid induced
osteoporosis，GIO)是 GC 最常见的不良反应之一。即使小剂量激素（≤7.5 mg 泼尼松
等效剂量）也可导致骨量迅速丢失，椎体及髋部骨折风险明显增高。
GIO 的特点包括：①GC 使用初期即可发生 GIO[1]：GC 的使用时间是其对骨密度
影响的重要原因[2]。GIO 病程一般分为两个阶段[3,4]即第一年的骨量快速丢失期，约丢
失骨量 3-5%和骨量持续慢速丢失期，约每年丢失骨量 0.5-1%。其中骨小梁受累最显
著。②GC 剂量越大，骨量丢失越多，有剂量依赖性，尤其是脊柱骨折风险可能较髋
部及桡骨远端等处骨折增大约 2~5 倍；相对于激素使用的累积剂量与骨折的风险，每
日使用的剂量风险相关性可能更高[5]。③GC 使用也并没有安全阈值：研究表明多部
位骨量丢失甚至可能是由于长期小剂量使用 GC 吸入治疗导致[6]。④骨折与骨密度不
平行[7]：GIO 患者未出现严重骨密度下降时即可发生骨折，同时伴有骨质量下降[8,9]。
GIO 重在早期治疗与预防，但目前世界范围内 GIO 尚未受到医患双方的重视，患者依
从性差，防治往往不积极。
GIO 的发病机制很复杂，本文主要从细胞外机制，细胞机制及易感性等三方面进
行总结。
一、细胞外机制
曾被认为是 GIO 主要致病机制。受到广泛研究的是 GC 对钙稳态的影响。GC 可
通过抑制胃肠道对钙、磷离子的吸收并增加肾脏尿钙排泄对钙代谢造成明显影响。这
主要是由于 GC 增加了对钙吸收有重要作用的活性维生素 D 的分解[10-13]及增加脂肪含
量使脂溶性的维生素 D 活性降低[14]。而由于钙减少引起的继发性甲状旁腺功能亢进，
也可活化破骨细胞导致骨丢失。过多的外源性 GC 也可抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质
轴[15, 16]及生长素-胰岛素样生长因子 1( growth hormone-insulin-like growthfactor 1，
GH–IGF1)[17, 18]，从而减少了肾上腺源的性激素[19]。GC 也可直接抑制成骨细胞中 IGF-I
58
IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究综述
的转录[20]而抑制成骨分化。
二、细胞层面
现在认为在 GIO 致病机制中扮演更重要的角色[21]。长期使用 GC 可短暂刺激破骨
细胞活化、接着较长期持久的抑制Ⅰ型胶原的合成及成骨细胞增殖，促进骨细胞和成
骨细胞的凋亡。
1、成骨细胞功能变化
由于多种研究表明 GIO 时成骨细胞功能明显缺陷，我们首先对成骨细胞功能变化
进行总结。研究较多的成骨信号通路主要是 BMP- SMAD 通路及 Wnt/ β-catenin（经典
及非经典）两类。在此，主要对 Wnt/ β-catenin 予以阐述。
（ 1 ）经典 Wnt/β-catenin 信号通路 GIO 一个明显的特点是由于抑制了
Wnt/β-catenin 信号通路导致成骨分化缺陷以及激活了 caspase 3 [22, 23]导致成骨细胞凋
亡增加，其总体效果表现为成骨活动减少。骨髓基质细胞可因为不同的条件向成骨或
成脂方向分化，GIO 时由于骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）
减少及过氧化物酶增生活化受体 PPARγ2，CAAT 增强绑定蛋白增多可致 runt 相关蛋白
2(Runx2)受抑制[24, 25]，进而使成脂活性增加成骨活性减少。
Wnt/β-catenin 信号通路是骨生成最为重要的信号通路，研究发现[26-29]GC 通过
增加 wnt 拮抗剂 dickkopf-1 (Dkk-1)和骨硬化蛋白 sclerostin 的表达而造成成骨细胞功
能障碍。Wnt 是包括 19 个骨髓异质细胞群分泌的高度保守的糖蛋白，主要位于细胞
质内，当激活后即转入细胞核内发挥成骨作用。根据激活是否有 β-catenin 参与分为
经典通路及非经典通路。经典通路研究较多，FRIZZLED (FZD)受体和低密度脂蛋白受
体相关蛋白 5 或 6（the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 or 6 ，LRP5or
6) 共受体结合 Wnt 配体可阻止细胞质内 β-catenin 降解，聚集的 β-catenin 可转入细
胞核内与 TCF/LEF 家族蛋白相互作用从而激活成骨反应的目标基因[30,31]。而经典通
路的抑制剂 Dickkopf-related protein (Dkk1)则可阻断入核[32]。经典的 Wnt/ β-catenin
是 BMSC 成骨分化的重要通路，有趣的是多个实验表明该通路在促进成骨的同时又
有抑制成脂分化的作用[33,34]。
（2）非经典 Wnt 通路可通过多种方式，如 PCP 信号通路, 细胞内 Ca 2+通路及
GTPase Rac, calcium/calmodulin-depenent kinase Ⅱ (CAMK Ⅱ) 或 c-Jun N-terminal
59
kinase (JNK)激活蛋白等多种途径发挥生物学作用[35-38]。研究表明，GIO 时活性氧增多

可激活 ROS/ PKC_/p66shc/JNK 通路[39-41]。由于非经典通路研究较少，GIO 时这些途径
是单独还是协调发挥作用还有待于进一步阐明[42]。
（ 3 ） BMSCs 成骨分化的分子调节还可能涉及 [43-45] 胰岛素生长因子 -1
（insulin-growth factor-1，IGF-1）,成纤维细胞生长因子 (fibroblast-growth factor， FGF),
活化蛋白-1(activator-protein-1 ，AP-1) 甲状旁腺素 PTH 等多种信号通路，这些通路增
加了成骨分化分子机制的研究难度。另外，BMSCs 成骨分化还有小 RNA (miRNAs),组
蛋白（histone）及 DNA 甲基化（methylation）等后天性修饰调节需要进一步研究。
2、骨细胞及破骨细胞功能变化
GIO 时，多种细胞凋亡通路的共同下游信号 caspase 3[22, 23]活化可促进骨细胞凋亡
增加 [46]。由于骨细胞作为骨表面信息感受器，其数量减少及功能缺陷使骨微损伤修
复功能障碍[46, 47]。此外，GC 也可导致血管内皮细胞生长因子减少进而骨血管生成减

少[48]，这也部分解释了很多 GIO 临床表现骨密度并没有较大改变但骨强度已明显降
低而发生骨折。
与对成骨功能影响不同，破骨细胞功能在 GIO 时却有较多活化。这是由于破骨活
化通路中的 M-CSF 和 RANKL 增加，而 RANKL 的竞争性抑制剂骨保护素
OPG(osteoprotegerin)在基质细胞及破骨细胞中减少[49, 50]。GC 也可增加具有破骨促进
作用的 IL-6(interleukin-6)及减少破骨抑制作用的干扰素 β（interferon-β）[51, 52]。GC 还
可增加特异性的基质金属蛋白酶 MMP (matrixmetalloproteinases)的表达，随之在中性
pH 环境中减少Ⅰ型胶原的表达导致骨质量下降[53, 54]。
三、易感性
GIO 的重要特点是 GC 的使用量和临床结果并不一致，其机制并不完全清楚。个
体易感性可能是其中的重要原因。GC 在体内的吸收分布及代谢，GC 受体的数量，亲
和性及细胞核共受体的因素造成发病率个体差异明显[55,56]。临床及体外研究表明 GC
受体多态性是调节 BMD 的重要原因[57]。近十年来，其分子机制研究进展集中在 11β
羟化类固醇脱氢酶(11β-HSD)，它可通过非活性的皮质酮及活性的皮质醇间相互转化
而进行受体前调节[58]。11β-HSD 是局部组织调节 GC 水平的关键酶，它分为Ⅰ型和Ⅱ
型。Ⅰ型 11β-HSD 表现为 GC 受体激活剂，在成骨细胞中可促使其表面的 GC 受体活
化并促进其下游目的基因的表达，进而影响成骨细胞的增生分化。而此通路也可由于
60
炎症因子，外源性 GC 及年龄等影响发生变化[59]。而在肝脏及脂肪等Ⅱ型 11β-HSD 丰

富的组织中其主要表现为 GC 受体抑制，可将皮质醇转化为非活性的皮质酮。GIO 可
减少骨血管体积和降低外周循环与腔隙小管的溶质转运，对成骨细胞凋亡和破骨细胞
激活、骨形成率、骨微结构、结晶度、脉管系统体积、孔隙流体和骨强度等造成负面
影响。
GIO 发病机制还没有完全清楚，除了上述机制，GC 引起的肌萎缩及肌力下降也
是导致患者骨折的危险因素。当今的热点集中在硬骨素抗体等作用于成骨细胞功能的
研究上，可能会为将来特异性治疗 GIO 做出贡献。
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IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究中英文缩略词表
中英文缩略词表
英文缩写英文全称中文全称
BMSCbone marrowstromal cells 骨髓基质细胞
RT-PCR reverse transcription-polymerase 逆转录-聚合酶链式反应 chain reaction
FBSfetal bovine serum 胎牛血清
PBS phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液
IL-6 interleukin-6 白细胞介素 6
BMP2bone morphogenetic protein2 骨形态发生蛋白 2
SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠
GIO glucocorticoid-induced osteoporosis 糖皮质激素性骨质疏松症
OVF osteoporoticvertebralfracture 骨质疏松性椎体骨折
CTX-IC-telopeptide of type I collagenI 型胶原 C 端肽
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应
qRT-PCRQuantitativereal-time 实时荧光定量 PCRpolymerase chain reaction
RANKL receptor activator of NF-κB ligand 核因子κB 受体活化因子配基
WT Wild type 野生型
OPG osteoprotegrin 骨保护素
KO Knockout 敲除
cDNA Complimentary deoxyribonucleic acid 互补 DNA
OCN Osteocalcin 骨钙素
RNAiRNA interferenceRNA 干扰
RUNX2 runt-related gene 2 Runt 相关因 2
DMEM Dulbeccos modified Eagles medium Dulbecco 改良必需培养基
mRNA Messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸
ALP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶
MTT3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl3-(4,5-二甲基噻
tetrazolium bromide 唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐
67
中英文缩略词表 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
OB osteoblasts 成骨细胞
OC osteoclasts 破骨细胞
OPN osteopontin 骨桥蛋白
FITCfluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素
pNPPp-nitrophenyl phosphate 对硝基磷酸苯酯
CFUColony forming unit 细胞集落形成单位
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IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究攻读学位期间公开发表的论文
攻读学位期间公开发表的论文
1 Li X, Zhou ZY, Zhang YY, Yang HL.IL-6 Contributes to the DefectiveOsteogenesis

of Bone Marrow Stromal Cellsfrom the Vertebral Body of theGlucocorticoid-Induced
Osteoporotic Mouse. PLoS One. 2016 Apr 29;11(4):e0154677. doi:
10.1371/journal.pone.0154677.（If 3.057 第一作者）
2 Zongyu Zhou, Chunshan Luo, Xiang Li, Yuanyuan Zhang, Huilin Yang ,Yue Xie,
Guotai Zhu. Single-stage surgical treatment of complex cervicalspondylosis by combined
anterior and posteriorapproach: an observational study. Int J Clin Exp Med
2016;9(6):9397-9403 ISSN:1940-5901/IJCEM0016361（If 1.075 通讯作者）
3 Zhao ZX1, Li X,Liu WD, Liu XZ, Wu SJ, Hu XH. Inhibition of Growth and
Metastasis of Tumor in Nude Mice after Intraperitoneal Injection of Bevacizumab. Orthop
Surg. 2016 May;8(2):234-40. doi: 10.1111/os.12236（If 0.65 共同第一作者）
4 李翔，赵则雪，张媛媛，杨惠林.单侧 PVP 结合小关节囊封闭术治疗高龄骨质
疏松性胸腰椎骨折的早期疗效观察.中国骨与关节损伤杂志，2016,31(7):746-747.（第
一作者）
5 李翔，赵则雪，张媛媛. 腰椎间盘突出症术后早期再手术临床分析. 临床误诊
误治杂志，2016,31(8):52-56.（第一作者）
承担科研项目
使用等几何建模对驾驶员颈椎病随访分析及早期预警淮安市科技局
HASZ2014006 (主持)
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致谢 IL-6 在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究
致谢
在即将结束博士阶段学习之际，多少往事涌上心头。衷心感谢导师杨惠林教授，
每当在我学习科研遇到困难挫折彷徨苦闷之际，总会想起他经常说的舍得观，成败论。
杨老师严谨求实的治学精神、广博精湛的理论高度和实践经验以及永不知疲倦的工作
作风都给我留下了深刻的印象。我的人生已被杨老师深深的植入了奋斗的基因。
衷心感谢苏大骨科研究所的陈建权教授在实验，论文写作方面提供的热情指导。
同时感谢苏大一附院各位主任及护士们对我的指导和帮助。
感谢上海交通大学附属上海市第一人民医院骨科曹雷博士，吴剑宏博士，王建东
主任，伍凯主任在课题研究及临床培训中的帮助。
感谢淮安第一人民医院各位领导同事们给予我的帮助和支持。
感谢苏州大学医学院、研究生部的各位领导和老师们四年来对我的关心和支持！
衷心感谢我的妻子、妹妹、父母和岳母在我读书期间给予的默默支持和无私奉献！
谨以此文献给所有关心我的人！
李翔谨致
2016 年 08 月 30 日
70
苏州大学
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IL 6在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究

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IL 6在糖皮质激素性骨质疏松小鼠椎体骨髓基质细胞成骨分化障碍中的作用机制研究

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、 —

机制。最后使用 IL-6 中和抗体进行小鼠体内治疗，并检测相关成骨分化指标。

IL-6 Contributes to the Defective Osteogenesis of Bone

Written by: Li Xiang

BMP mRNA 等促进成骨的细胞因子表达[13,14]等多种途径抑制成骨细胞分化，并可能促进

Wnt/β-catenin 是另一个被广泛研究的成骨分化信号通路。Wnt 包括 19 个骨髓

2.1 小鼠行波尼松龙缓释片皮下埋入术，测定实验前后的骨密度；4 周后取胸腰

本研究分析了 GIO 模型 BMSC 体外增殖及成骨分化特点，寻找到成骨分化障碍异

components,mechanisms, and diseases. Developmental cell 2009，17, 9-26

protein 6. Genes & development 2008，22, 2968-2979

第二章 GIO 小鼠模型的构建与表征

取胸椎和 L1-L4 腰椎分离骨髓基质细胞；取第 5 腰椎（L5）进行骨形态计量学分析；

Reagents Test sample Standard Test sample (blank) Reagent blank

结果计算：所有 OD 值都应减除空白值；以标准品之 OD 值做出标准曲线；输入待

液混合，震荡 3min，静置分层后弃下层液体，如此重复 2 次；最后加入 400ml 去离

2.8mm2 区 域 为 目 标 区 域 ， 借 助 Bioquant 骨 形 态 计 量 学 分 析 软 件 ， 测 量 Bone

结果使用均数±标准差表示*P<0.05 vs. placebo; **P<0.01 vs. placebo.

骨面积/组织面积(%) 14.5±2.1 4.9±1.4**

结果使用均数±标准差表示. *P<0.05 vs. 对照组; **P<0.01 vs. 对照组.

Swiss Webster 小鼠，考虑此骨龄小鼠骨重建趋于平衡，各种体内生长因子对实验干

第三章 GIO 小鼠椎体 BMSC 体外培养及异常骨代谢标

骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSC）是来源于骨髓

PBS 缓冲液 上海源培 胎牛血清 Hyclone

3.1 椎体 BMSC 分离、流式鉴定、体外培养与体外诱导成骨分化

化反应，充分吹打混匀，收集于离心管中，300g 离心 5min，弃上清。加入 1ml Trizol

Gene Primer sequences (5’-3’) Product length (bp)

洗 2 次，然后加入染色液，37℃下染色 45mins，吸弃染色液，PBS 清洗 2 次，扫描仪

图 5 碱性磷酸酶 (ALP)及茜素红（Alizarin Red）染色

(定量 RT-PCR 检测成骨指标 Runx2、OPN 及 OC ，β-actin 作内参 ，结果使用

表 3 所检测的 36 骨代谢指标(结果发现 IL-6 明显增高)

图 8 模型组 IL-6 及 STAT3 表达情况

图 9 骨诱导后 IL-6 及 STAT3 检测

补充图 1 G-CSF, leptin, oncostatin M 及 IL-11 表达情况

of cellular biochemistry. 1999; 75(3):414–23

第四章 IL-6 介导了 GIO 小鼠椎体 BMSC 成骨分化障碍

上一章节通过实验发现 GIO 小鼠椎体 BMSC 分化时 IL-6 过度分泌，本章节实验

脱脂奶粉 上海生工 ALP 染色试剂盒 上海前尘生物

3.1 IL-6 中和抗体实验

采用 pNPP 法进行定量。吸弃细胞培养基，用冰预冷的 PBS 溶液清洗 2 次，然后

Gene Primer sequences (5’-3’) Product length (bp)

Gene Primer sequences (5’-3’) Product length (bp)

图 10 磷酸化 STAT3 表达情况

图 11 使用 IL-6 中和抗体作用后检测 ALP 及钙沉积情况

图 12 使用 IL-6 中和抗体作用后检测 Runx2、OPN 及 OC 表达情况

图 13 IL-6 RNAi 作用后检测 IL-6 及 STAT3 表达情况

图 14 IL-6 RNAi 作用后检测 ALP 及钙沉积情况

图 15 IL-6 RNAi 作用后检测 Runx2 、 OPN 及 OC 表达情况

3，骨质疏松小鼠 BMSC 用 LiCl 激活 β-catenin 后，IL-6/STAT3 并无明显变化；

图 16 模型组使用 BMP2 骨诱导后 β-catenin 表达情况

图 17 模型组使用 BMP2 骨诱导后 cyclin D1、Axin2 及 Dkk1 表达情况

图 18 使用 LiCl 作用后 IL-6 及 STAT3 表达情况

图 19 使用 AG490 及 IL-6 中和抗体作用后 β-catenin 表达情况

图 20 RNAi 作用后 STAT3 及 β-catenin 表达情况

图 21 使用 IWR-1 作用后 β-catenin、IL-6 及 STAT3 表达情况

图 22 使用 IL-6 作用后 β-catenin 表达情况

从肝细胞激活到 B 淋巴细胞激活，IL-6 一直被认为是具有多种生物学作用的细

BMP- SMAD-MAPK 通路及 Wnt/β-catenin（经典及非经典）是当今研究较多的成

23 Ducy, P. & Karsenty, G. Two distinct osteoblast-specific cis-acting elements control

IL-6-accelerated calcification byinduction of ROR2 in human adipose tissue-derived

第五章 IL-6-/-小鼠 BMSC 的成骨分化

本次实验我们拟探讨 IL-6-/-小鼠椎体 BMSC 的成骨分化特点，进一步明确 IL-6

3.4 细胞总 RNA 提取和定量 RT-PCR

图 23 IL-6 -/-小鼠 IL-6 及 β-catenin 的表达情况

2.8mm2 区域为目标区域，借助 Bioquant 骨形态计量学分析软件，测量 Bone

PBS 缓冲液上海源培胎牛血清 Hyclone

(定量 RT-PCR 检测成骨指标 Runx2、OPN 及 OC ，β-actin 作内参，结果使用

脱脂奶粉上海生工 ALP 染色试剂盒上海前尘生物

李翔综述杨惠林陈建权审校