Вежба бр.

4
Ензими: Поделба и функција во организмот. Испитување на
нивните општи својства

1. Теоретски дел
1.1. Вовед

Биохемиските реакции кои се одвиваат во живите организми, на пример

разложувањето на сложените органски соединенија на попрости (катаболизам),
синтезата на разни сложени органски соединенија од попрости (анаболизам),
како и претворбата на едни соединенија во други, со заедничко име се
означуваат како метаболизам.

Мали
молекули Голема
молекула

Слика 1. Метаболички процеси

Во живите организми овие реакции се одвиваат во релативно благи

услови, на пример кај човекот на температура од 37°С. Глукозата надвор од
организмот при нормални услови останува долго непроменета и за нејзино
разложување до CO2 и H2O потребна е температура од 300°С. Наспроти ова,
во организмот на човекот таа се разложува до CO2 и H2O при нормална
телесна температура и нормален притисок, а ослободената енергија
организмот ја употребува за одржување на животните процеси.
Одвивањето на оваа реакција, како и на низа други реакции во живите
организми е овозможено од присуството на посебни супстанци кои имаат улога
на биокатализатори и кои се познати под името ферменти или ензими.
Ензимите се едни од најважните компоненти на клетките кои дејствуваат во
интрацелуларната и екстрацелуларната средина, овозможувајќи го текот и
одвивањето на биохемиските реакции.
Науката која ги изучува особините и дејството на ензимите се нарекува
ензимологија.

стр. 1
 1.2. Особини и хемиски состав на ензимите
Речиси сите досега познати ензими се протеини кои имаат каталитичка
функција.
По својата хемиска природа ензимите се разликуваат од неорганските
катализатори, но имаат и низа заеднички својства како на пример:
➢ Ензимите делуваат во мали количества.
➢ Во текот на хемиската реакција ензимите физички се менуваат, но после
завршувањето на реакцијата тие се враќаат во првобитната состојба.
➢ Ензимите не ја менуваат положбата на хемиската рамнотежа на
реакцијата, туку само ја забрзуваат реакцијата.
➢ Ензимите имаат својство да ја зголемуваат брзината на хемиските
реакции, но само на оние реакции кои реално можат да се случат и без
нивното присуство. Ензимите не предизвикуваат реакции кои се
термодинамички невозможни.
Ензимите се карактеризираат и со некои специфични својства по кои се
разликуваат од неорганските катализатори:
➢ Ензимите се прости или сложени протеини.
➢ Ефективноста на ензимите е многу поголема во споредба со онаа на
неорганските катализатори. Имено, брзината на една биохемиска
реакција катализирана од ензим е многу поголема од онаа катализирана
од неоргански катализатор.

Слика 2. Неензимска и ензимска катализа

Ензимите ги имаат истите физичко-хемиски својства како и протеините.

Спаѓаат во групата на глобуларни протеини. Тие се амфолити и на површината
од својата молекула содржат позитивни и негативни електрични полнежи.
Најлесно се таложат при нивната изоелектрична точка. При промени во
структурата или при денатурација доаѓа до губење на ензимската активност.
Постојат повеќе фактори кои влијаат врз стабилноста и активноста на ензимот
како: рН на средината, температурата, присуството на други супстанци кои
можат да делуваат како активатори или инхинитори и.т.н.
Некои ензими се изградени само од протеински дел и се наречени
еднокомпонентни ензими (протеин-ензими).
Оние ензими кои освен протеински дел (апоензим) содржат и непротеински
дел се двокомпонентни ензими (протеид-ензими). Непротеинската компонента
се нарекува кофактор, а целата молекула се означува како холоензим.
Кофакторот, во зависност од јачината на силите со кои се поврзува за

стр. 2
протеинскиот дел, може да биде простетична група, доколку е цврсто врзан за
протеинскиот дел, или коензим, кој со дисоцијација лесно се одделува од
протеинскиот дел.

апоензим + кофактор = холоензим

Апоензимот и кофакторот се поврзуваат со јонски врски, водородни врски и

хидрофобни интеракции, а поретко и со ковалентни врски.

Каталитичкото дејство на ензимот врз некој супстрат се овозможува преку

контакт помеѓу ензимот и супстратот при што се образува ензимо-супстратен
комплекс. Местото во протеинскиот дел на ензимот каде доаѓа до сврзување на
супстратот се нарекува активен центар. Активниот центар на ензимот е
изграден од страничните радикали на аминокиселините од кои е составен. Во
составот на активните центри на ензимите најчесто влегуваат
аминокиселинските остатоци на: серин, хистидин, цистеин, глутамин, аспарагин
и.т.н, како и некои метални јони кај металоензимите. Во овие аминокиселински
остатоци се наоѓаат различни реактивни групи како на пример: -ОН, -СООН,
=NH и други кои учествуваат во ензимската катализа.
Класичниот модел за начинот на поврзување на ензимот со супстратот
за прв пат бил промовиран од страна на Emil Fischer во 1890 година, кој вели
дека активниот центар на ензимот и соодветниот супстрат се структурно
комплементарни, односно дека си одговараат како „клуч и клучалка“.

Слика 3. Хипотеза на класичниот модел „клуч и клучалка“

стр. 3
Наспроти овој класичен модел, во 1958 година од страна на Koshland бил
промовиран втор модел за начинот на поврзување, најправин како хипотеза, а
денес веќе и како општоприфатен модел на т.н „индуцирано прилагодување“.
Според овој модел супстратот е тој кој при врзувањето со ензимот ги индуцира
конформационите промени во активниот центар на ензимот.

Слика 4. Хипотеза на моделот „индуцирано прилагодување“

1.3. Специфичност на ензимската катализа

За разлика од неорганските катализатори кои катализираат повеќе видови

реакции, ензимите се одликуваат со специфичност.
Специфичноста може да биде изразена кон видот на реакцијата која ја
катализираат или кон супстратот што го активираат, па се разликува:
➢ Специфичност на дејство и
➢ Супстратна специфичност.
Под терминот Специфичност на дејство се подразбира способноста на
еден ензим да катализира само еден вид хемиска реакција (на пример
хидролази катализираат само реакции на хидролиза, оксидоредуктази само
оксидоредукциски реакции и.т.н).
Под терминот Супстратна специфичност се подразбира способноста
на ензимот да активира само еден супстрат или повеќе супстрати со слична
структура. Така, постои апсолутна специфичност, кога ензимот активира само
еден супстрат (пример, ензимот уреаза делува само на уреата и го катализира
нејзиното разложување до NH3и CO2) и групна специфичност, кога ензимот
активира повеќе супстрати со слична структура.

1.4. Номенклатура на ензимите

Имињата на некои ензими се добиени според името на супстратотврз кој

делува ензимот и тоа на тој начин што на името на супстратот се додава
наставката -аза (пример: уреа – уреаза; сахароза – сахараза и.т.н).
Во 1961 година Меѓународната унија за биохемија препорачала
класификација според која сите ензими се поделени во шест големи класи:

стр. 4
Оксидоредуктази ги катализираат оксидо-редукционите реакции;
Трансферази ги катализираат реакциите на пренесување на различни
функционални групи, а тоа пренесување може да биде
интрамолекуларно или помеѓу молекулите;
Хидролази ги катализираат реакциите на хидролиза;
Лиази ги катализираат реакциите на откинување на одделни
групи од некои соединенија како слободни молекули (на
пример јаглерод диоксид) без учество на вода;
Изомерази ги катализираат реакциите на изомеризација;
Лигази катализираат реакциите на биосинтеза

Според оваа класификација секоја класа се дели на повеќе групи, зависно од

супстратот на кого дејствува ензимот.
Секоја група понатаму се дели на повеќе подгрупи според кофакторот кој
учествува во реакцијата.
И на крај, секој ензим си има свој реден број.
Со оваа класификација секој ензим си добил свој единствен
класификационен број кој еднозначно го определува и кој се користи кога е
потребна точна идентификација на ензимот.
На пример, класификациониот број на ензимот алкохол дехидрогеназа е
E.C.1.1.1.1. Првата единица означува дека овој ензим припаѓа на првата класа
ензими, а тоа се оксидоредуктазите. Втората единица означува дека тој ензим
припаѓа на првата група на оксидоредуктази, а тоа се оние кои делуваат врз
алкохолната група. Третата единица означува дека во алкохол
дехидрогеназата како акцептор на водородот се јавува кофакторот
никотинамид аденин динуклеотид и четвртата единица означува дека алкохол
дехидрогеназата е првиот ензим од оваа подгрупа.

1.5. Механизам и кинетика на ензимските реакции

Една едноставна ензимска рекација според општо прифатената теорија на
Michaelis-Menten може да се подели во две фази.
Во првата фаза ензимот се соединува со супстратот и се создава едно
интермедиерно соединение т.е ензим-супстратен комплекс. При тоа доаѓа до
активирање на супстратот, односно неговата структура се менува преку
раскинување на некои интрамолеклуларни врски, а самиот ензим-супстратен
комплекс станува несатбилен.
Во втората фаза доаѓа до моментално распаѓање на нестабилниот
комплекс до продукти на реакцијата и настанува ослободување на ензимот.
Ослободениот ензим стапува во реакција со други молекули на супстрат, па
затоа мали количества на ензим можат да катализираат трансформација на
голми количества на супстрат.
Фаза 1 Е + S ⇄ ES ⇄ ES’
Фаза 2 ES’⇄EP ⇄Е + P

S го означува супстратот; E го означува ензимот;ES го означува првиот

комплекс кој се формира помеѓу ензимот и супстратот; ЕS’ е нестабилниот
(активиран) ензимо-супстратен комплекс; EP ензим-продукт комплекс и P го
означува продуктот.

стр. 5
 1.6. Механизам на ензимските реакции
За разбирање на процесот на катализа, најпрвин мора да се направи разлика
помеѓу хемиска рамнотежа и брзина на реакцијата. Функцијата на
катализаторот е да ја зголеми брзината на реакцијата, но тој не влијае на
хемиската рамнотежа. Која било реакција S ⇄ P може да се претстави со еден
реакционен координатен дијаграм (слика 5) на кој е претставена промената на
енергијата за време на реакцијата.

Слика 5. Реакционен координатен дијаграм за реакцијата S ⇄ P

На дијаграмот на слика 5 е претставена вредноста на слободната

енергија (G) на системот во текот на реакцијата. Почетната точка на
директната и повратната реакција се наречени основни состојби. Прикажани се
енергиите на активација (ΔG‡) за двете реакции S→P и P→S. Слободната
енергија во основната состојба на P е пониска од онаа на S така што ΔG’°
(вкупната промена на стандардната слободна енергија) е негативна и
рамнотежата е поместена кон добивање на P. Положбата и насоката на
рамнотежата не зависат од ниеден катализатор. Поволна хемиска
рамнотежа не значи дека претворбата S→P ќе се одвива со поголема
брзина.
Брзината на реакцијата зависи од еден друг параметар. Помеѓу S и P
постои енергетска бариера т.е енергија потребна за ориентирање на групите

стр. 6
кои реагираат, раскинување, преуредување на врските и други трансформации
потребни за одвивање на самата реакција. Оваа енергија е прикажана на слика
5 и слика 6 со енергетското „брдо“.

Слика 6. Споредба на реакционите дијаграми на неензимски и ензимски

катализирана реакција

За одвивање на некоја реакција молекулите мора да ја совладат оваа

енергетска бариера. Точката на самиот врв на енергетското брдо е наречена
преодна состојба. Преодната состојба претставува краткотрајна молекуларна
состојба во која се случуваат процесите на раскинување на врска, создавање
на врска и појава на полнеж. Енергијата потребна за совладување на
енергетската бариера е наречена енергија на активација. Енергијата на
активација всушност е разликата помеѓу енергетските нивоа на основната
состојба и преодната состојба на реакцијата. Брзината на реакцијата зависи од
оваа енергија на активација - повисока енергија на активација резултира со
побавна реакција.
Брзината на реакцијата може да се зголеми со зголемување на
температурата или притисокот, со што се зголемува бројот на молекулите со
доволна енергија за совладување на енергетската бариера.
Енергијата на активација поинаку може да се намали со додавање на
катализатори како што може да се види на слика 6, каде интермедиерите ES и
EP се наоѓаат на минимумот на кривата од енергетскиот профил на ензимски
катализираната реакција. Ензимите ја зголемуваат брзината на
ензимските реакции со намлување на енергиите на ективација.

1.7. Кинетика на ензимските реакции

Брзината на хемиските реакции, нивниот тек и механизам на дејство се

предмет на изучување на хемиската кинетика. Ензимската кинетика е дел од
хемиската кинетика во која се изучува зависноста на брзината на ензимските
реакции од влијанието на различни фактори како што се: температурата, рН
средината, концентрацијата на ензимот, концентрацијата на супстратот,
влијанието на ефекторитеи.т.н.

стр. 7
1.7.1 Влијание на температурата врз брзината на ензимската реакција

Познато е од неорганска хемија дека брзината на хемиските реакции се

зголемува од 2-4 пати при секое зголемување на температурата за 10°С. Оваа
зависност е забележана и кај ензимските реакции, меѓутоа во определени
температурни граници. Температурата на која брзината на ензимската реакција
е најголема се вика оптимална температура на ензимот (слика 7).
За повеќето ензими оптималната температура е температурата на
клетките во кои се наоѓаат, околу 40-45°С. Ова особено важи за анималните
ензими. Растителните ензими имаат оптимална температура помеѓу 60-70°С,
но постојат и ензими кои се термостабилни. На пример, ензимите на
термофилните бактерии, адаптирани да растат и се развиваат во природните
геотермални топли извори имаат оптимална температура од околу 85°С.

Слика 7. Влијание на температурата врз ензимската активност

Секое покачување на температурата над оптималната температура

предизвикува намалување на активноста на ензимите, како што може да се
забележи на графикот претставен на слика 7. Причина за ова претставува
денатурурањето на протеинската молеклула на ензимот со што се намалува

стр. 8
ефективната концентрација на ензимот и се намалува брзината на ензимската
реакција.
При намалување на температурата каталитичката активност се
намалува, но не настануваат некои позначајни структурни промени во
структурата на ензимите.

1.7.2 Влијание на рН врз брзината на ензимската реакција

Ензимите се активни во релативно широк рН интервал, но активноста на

ензимот не е константа во целиот тој интервал. Концентрацијата на
водородните јони при која ензимот покажува највисока активност се нарекува
оптимална рНили рН оптимум.
Треба да се нагласи дека максималната активност на ензимот при
определена рН вредност не е секогаш „оптимална“. Пример за ова е ензимот
аргиназа, кој оптимално дејствува при рН 7-8 во подолг временски интервал
(околу 60 минути), а максималната активност му е на рН 10, но во краток
временски интервал, бидејќи се денатурира и инактивира.
На слика 8 се претставени рН оптималните вредности за некои ензими.

Слика 8. Зависност на ензимската активност од рН

Ефектот на водородните и хидроксилните јони врз ензимите е различен.

Во екстремно кисела и алкална средина тие имаат денатурирачко дејство, при
што самиот ензим иреверзибилно се инактивира. Од друга страна пак
водородните и хидроксилните јони реверзибилно влијаат врз стабилноста на
ензимот, супстратот и ензимо-супстратниот комлекс. Кај поголем дел од
контактните и каталитичките аминокиселини кои се наоѓаат во активниот
центар на ензимот процесот на јонизацијата и взаемното дејство со супстратот
зависи од степенот на дисоцијација, кој директно зависи од рН средината.

стр. 9
1.7.3 Влијание на концентрацијата на ензимот врз брзината на ензимската
реакција

Експерименталните испитувања покажале дека, во присуство на доволно

количество супстрат, на почетокот на реакцијата, брзината на ензимската
реакција зависи од концентрацијата на ензимот.
Така, ако концентрацијата на ензимот се зголеми два пати и брзината на
реакцијата ќе се зголеми двапати и.т.н. Тоа значи дека на почетокот на
реакцијата, брзината на ензимската реакцијата е правопропорционална со
концентрацијата на ензимот.
На слика 9 е даден графички приказ за влијанието на концентрацијата на
ензимот врз концентрацијата на продуктот кој се создава во текот на
реакцијата во услови на доволно количество супстрат.

Слика 9. Влијание на концентрацијата на ензимот врз ензимската активност

1.7.4 Влијание на концентрацијата на супстратот врз брзината на

ензимската реакција

Зависноста на брзината на ензимската реакција од концентрацијата на

супстратот се испитува при константна концентрација на ензимот и константни
вредности за температурата и рН.

стр. 10
 Слика 10. Влијание на концентрацијата на супстратот врз брзината на
ензимската активност
Зависноста на брзината на ензимската реакција од концентрацијата на
супстратот графички е претставена на слика 10. При ниски концентрации на
супстратот, брзината на ензимската реакција се зголемува
правопропорционално со зголемувањето на концентрацијата на супстратот. Со
понатамошно зголемување на концентрацијата на супстратот брзината на
реакцијата се зголемува и понатаму, но сега во помала мерка, односно
непропорционално со покачувањето на концентрацијата на супстратот.
При повисоки концентрации на супстратот, брзината на ензимската
реакција асимптотски се приближува кон нејзината максимална вредност (Vmax),
и се постигнува заситување на ензимот со супстрат. Секое понатамошно
зголемување на концентрацијата на супстратот не доведува до зголемување на
брзината на ензимската реакција, бидејќи нема повеќе слободни молекули на
ензимот во реакционата смеса. Во такви услови, брзината на ензимската
реакција зависи од концентрацијата на ензимот. Утврдено е дека сите ензими
го покажуваат овој ефект на заситување.
Значајно е дека самите ензими помеѓу себе се разликуваат по
концентрацијата на супстратот при која настанува заситувањето.
Концентрацијата на супстратот при која се постигнува половината од
максималната брзина на реакцијата се нарекува Michaelis-ова константа (Кm).
Michaelis-овата константа ја претставува состојбата кога ензимот е
полузаситен, односно кога половината од количеството ензим е врзан во ES
комплексот, а половината е во слободна форма. Кm има карактеристична
вредност за секоја ензимска реакција. Така, кај ензимите кои имаат повеќе
супстрати, секој супстрат има своја карактеристична вредност за Кm.

стр. 11
2. Експериментален дел

2.1. Потребни лабораторискиапарати и прибор

• Пипети
• Чаша
• Епрувети
• Водена бања

2.2. Потребни реагенси

• Дестилирана вода
• Квасочна суспензија
• Раствор на сахароза
• Раствор на скроб
• Фелингов реагенс
• Луголов раствор

2.3. Испитување на општите особини на ензимите

Ензимите како специфични катализатори имаат повеќе заеднички особини:

специфичност на дејство, супстратна специфичност, зависност на брзината на
ензимската реакција од температурата и рН средината, влијанието на
присуството на одредени инхибитори или активатори врз каталитичката
активност на ензимот и.т.н.
Со цел да се постигне оптимално дејствување на ензимот, системот за
катализа освен ензим и супстрат, потребно е да содржи и пуфер кој ќе
обезбеди оптимална рН, активатор доколку е потребно, присуство на кофактор,
но и одржување на одредена температура во текот на инкубацијата.

2.3.1. Каталитичко дејство на ензимот сахараза врз сахарозата

• Принцип на методата:

Сахаразата е ензим од групата на хидролази и врши хидролитичко

разложување на сахарозата до глукоза и фруктоза. Присуството на овие
моносахариди се докажува со Фелингова реакција.

• Реагенси и прибор:

1. Квасочна суспензија, содржи сахараза;

2. Ацетатен пуфер, рН 4.6;
3. Раствор на сахароза (γ=10 g/L) ;
4. Фелингов реагенс;
5. Епрувети, пипети, термостат

стр. 12
 • Постапка:

Во една епрувета се става 1 mL квасочна суспензија, 0,5 mL ацетатен пуфер и

1 mL раствор на сахароза.
Во друга епрувета се става 1 дестилирана вода, 0,5 mL ацетатен пуфер
и 1 mL раствор на сахароза.
Двете епрувети се инкубираат во термостат на 37°С, 10 минути. Потоа со
содржината на двете епрувети одделно се изведува Фелинговата реакција.
Фелинговата реакција е позитивна во првата епрувета во која поради
присуството на ензимот сахараза дошло до хидролитичко разложување на
сахарозата.

*Fehling-ова проба
Принцип
Се состои во редукција на Cu2+ јонот Cu+ јон.
Постапка
Во епрувета се става по 1 mL раствор на Фелинг I и Фелинг II, а
содржината се меша.
Во друга епрувета се става 2 mL раствор на глукоза.
Двете епрувети истовремено се загреваат до вриење. Потоа, содржината
од епруветата со Фелинговиот реагенс се префрла во епруветата со
растворот на глукоза. Се забележува промена на бојата од сина, преку
зелена до црвено-керамидеста боја на талог од Cu2O.

2.3.2. Испитување на супстратната специфичност на ензимите сахараза

и амилаза

• Принцип
Специфичноста на ензимите кон супстратот е условена од просторниот
распоред на групите кои го врзуваат супстратотво активниот центар.
Супстратната специфичност може да биде апсолутна (ензимот
сахаразакаталитички дејствува само врз сахарозата) или групна специфичност
(ензимот амилаза каталитички дејствува врз соединенија со слична структура:
скроб и гликоген). Продуктите на хидролиза на сахарозата (супстрат на
сахаразата) се докажуваат со позитивна Фелингова реакција, а разложувањето
на скробот (супстрат на амилазата) се утврдува со негативна Луголова проба.

• Реагенси и прибор
1. Квасочна суспензија, содржи сахараза;
2. Разредена плунка, содржи амилаза;
3. Раствор на сахароза (γ=10 g/L);
4. Раствор на скроб (γ=10 g/L);
5. Фелингов реагенс;
6. Луголов раствор;
7. Епрувети, пипети, термостат.

стр. 13
 • Постапка
Се работи во 4 епрувети според следнава шема:

Епрувета бр. Супстрат Ензим

1 1 mL р-р на скроб 1 mL разредена плунка
2 1 mLр-р на скроб 1 mLквасочна суспензија
3 1 mLр-р на сахароза 1 mL разредена плунка
4 1 mLр-р на сахароза 1 mLквасочна суспензија

Приготвените епрувети се инкубираат на 37°С, 15 минути. После

инкубирањето со содржината на сите 4 епрувети одделно се изведува
Фелингова и Луголова проба. Фелинговата проба е позитивна во епруветите 1
и 4, а Луголовата проба е позитивна само во присуство на неразграден скроб,
односно во епрувета број 2.

3. Влијание на активатори и инхибитори врз ензимската активност на

амилазата од плунката

• Принцип
Активноста на многу ензими може да се зголеми или намали во
присуство на некои јони или други хемиски соединенија.
Супстанците кои ја зголемуваат активноста на ензимите, односно
брзината на ензимската реакција се нарекуваат активатори. Таква улога
најчесто ја имаат катјоните: Mg2+, Fe2+, Ca2+, Zn2+и K+, а поретко анјоните како:
Cl-, Br-и NO3-.
Супстанци кои ја намалуваат активноста на ензимите, односно ја
намалуваат брзината на ензимската реакција се нарекуваат инхибитори. Таква
улога имаат катјоните: Ag+, Pb2+, Hg2+и.т.н. кои ги инхибираат речиси сите
ензими.
Натриум хлорид, NaCl е специфичен активатор на ензимот амилаза од
плунката. Во присуство на овој активатор брзината на ензимската реакција се
зголемува неколку пати. Во овој случај активатор на амилазата е всушност
хлоридниот анјон, Cl-.
Амилазата неповратно се инхибира под дејство на јоните на бакар, Cu2+
oд бакар(II) сулфаткој го денатурира ензимот.

• Реагенси и прибор
1. Раствор на скроб (γ=10 g/L);
2. Разредена плунка, содржи амилаза;
3. Натриум хлорид, NaCl (γ=10 g/L) ;
4. Раствор на бакар(II)сулфат, CuSO4 (γ=10 g/L)
6. Луголов раствор;
7. Епрувети, пипети, термостат.

• Постапка
Во три епрувети се става по 1 mL раствор на скроб и 1 mL разредена
плунка. Во првата епрувета се става 3-4 капки дестилирана вода, во втората 3-
4 капки раствор од натриум хлорид и во третата 3-4 капки раствор од
бакар(II)сулфат. Сите епрувети се инкубираат на 37°С, 10 минути. По

стр. 14
завршувањето на инкубацијата се изведува Луголова проба. Пробата е
позитивна само во третата епрувета, бидејќи разложувањето на скробот е
спречено. Реакцијата на разградба на скробот најбрзо се одвива во епруветата
со натриум хлорид, а побавно во епруветата со дестилирана вода.

4. Влијание на температурата врз активноста на ензимот глукозо-6-фосфат

дехидрогеназа

• Принцип
Глукозо-6-фосфат дехидрогеназа (ЕС 1.1.1.49) претставува ензим од
класата оксидоредуктази.Овој ензим ја катализира реакцијата на оксидација на
глукозата на првиот јаглероден атом.Одземениот водород предизвикува
редукција на акцепторот метиленско сино при што интензитетот на сината боја
се намалува. При различна температура на инкубација на ензимот со
супстратната смеса (глукоза и метиленско сино), обезбојувањето ќе биде со
различен интензитет.

• Реагенси и прибор
1. Квасочна суспензија, содржи глукозо-6-фосфат дехидрогеназа;
2. Раствор на метиленско сино (γ=1g/L);
3. Раствор на глукоза (γ= 5 g/L);
4. Епрувети, пипети, чаша, термостат.

• Постапка
Во три епрувети се ставаат по 1mLквасочна суспензија.
Во други три епрувети се става по 1 mLсупстратна смеса.
Супстратната смеса се подготвува на следниов начин: Во чаша се става
1 mLр-р на метиленско сино и 10 mL раствор од глукоза.
Потоа се групираат две по две епрувети, една со квасочна суспензија и
друга од супстратната смеса и се поставуваат на различни
температури.Едниот пар од епрувети се остава на собна температура, другиот
на 37ºС, а третиот пар на 100ºС околу 15 минути. Потоа супстратната смеса од
епруветата се додава во епруветата со квасочна суспензија и сите епрувети се
чуваат на соодветната температура уште 15 минути.
По истекот на времето се забележува дека најголемо обезбојување има
во епруветата која се инкубирала на температура од 37ºС, послабо
обезбојување во онаа на собна температура, а поради настаната денатурација
на ензимот на температура од 100ºС во третата епрувета не се забележува
обезбојување на метиленското сино.

стр. 15
Резултати од изведената вежба

Каталитичко дејство на ензимот сахараза врз сахароза

Реакција Позитивна Неагативна

Испитување на супстратната специфичност на ензимите сахараза и амилаза

Фелингова проба Луголова проба

Позитивна Негативна Позитивна Неагативна

1 mL р-р 1 mL
на скроб разредена
плунка

1 mLр-р 1 mLквасочна
на скроб суспензија
1 mLр-р 1 mL
на разредена
сахароза плунка

Влијание на активатори и инхибитори врз ензимската активност на амилазата

од плунката
Со дестилирана вода Луголова проба
Позитивна Негативна

Натриум Хлорид
Бакар II сулфат

Влијание на температурата врз активноста на ензимотглукозо-6-фосфат

дехидрогеназа
На собна температура
На 37 0С
На 1000С

Изработил (студент):
Проверил (асистент):

стр. 16
стр. 17