BIOLOGIA MOLEKULARNA TECHNOLOGIA BIOMEDYCZNA, II ROK STOPIEŃ I

Samodzielna Pracownia Biologii Nowotworu

Instytut Biologii SGGW
Opracowanie instrukcji:
dr Paulina Kucharzewska-Siembieda,
mgr inż. Małgorzata Kubiak

WESTERN BLOT
ĆWICZENIE NR 2 i 3

ANALIZA EKSPRESJI BIAŁEK ZA POMOCĄ IMMUNODETEKCJI METODĄ WESTERN

BLOT

1. WPROWADZENIE

Ekspresja białek może być analizowana przy wykorzystaniu metod takich jak: immunodetekcja metodą
western blot, analiza in situ (test imunofluorescencji) i test immunoenzymatyczny (ELISA).
Immunodetekcja metodą western blot jest jedną z najpowszechniej stosowanych metod, która
umożliwia wykrywanie wybranych białek, występujących często w małych stężeniach w mieszaninie z
innymi białkami (w lizacie komórkowym). Technika ta znajduje szerokie zastosowanie przy badaniu
poziomu ekspresji białek, np. po transfekcji komórek cząsteczkami siRNA w celu wyciszenia ekspresji
genów lub transfekcji plazmidem w celu uzyskania nadekspresji wybranego białka.

Metoda western blot polega na przeniesieniu rozdzielonych przy pomocy elektroforezy białek z żelu na
specjalną membranę, a następnie wizualizacji interesującego nas białka przy zastosowaniu odpowiednio
dobranych przeciwciał. Przeniesienie białek na membranę jest w tej technice kluczowym etapem, gdyż
immunodetekcja białek w żelu nie byłaby możliwa.

Technika western blot składa się z trzech podstawowych etapów:

(1) elektroforezy jednokierunkowej w warunkach denaturujących (SDS-PAGE),
(2) elektrotransferu na membranę,
(3) immunodetekcji swoistych białek przy pomocy przeciwciał.

1.1. Elektroforeza jednokierunkowa w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)

Rozdzielenie mieszaniny białek przy pomocy elektroforezy stanowi punkt wyjściowy wielu analiz
laboratoryjnych, w tym metody western blot. W zależności od specyfiki stosowanej metody warunki
elektroforezy dobiera się w sposób umożliwiający rozdzielenie białek pod względem ich masy
molekularnej, ładunku lub aktywności biologicznej. Elektroforetyczny rozdział białek prowadzony jest
w żelu poliakrylamidowym, który w porównaniu z żelem agarozowym (stosowanym do rozdziału
kwasów nukleinowych), pozwala na lepszy rozdział molekuł. Poza tym żel poliakrylamidowy posiada
następujące zalety: jest bezbarwny, pozbawiony ładunków, odznacza się dużą wytrzymałością
mechaniczną, jest łatwy w przygotowaniu i formowaniu w odpowiednich naczyniach. Żel
poliakrylamidowy to łańcuchy akrylamidu połączone wiązaniami poprzecznymi za pomocą N,N’-
metyleno-bis-akrylamidu. W ten sposób tworzy się sieć, przez „oczka” której migrują rozdzielane
cząsteczki. Wielkość „oczek” sieci żelu zależy od stężenia akrylamidu oraz bisakrylamidu.
Polimeryzacja żelu odbywa się w obecności nadsiarczanu amonu (APS) oraz N,N,N’,N’-
tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).

Elektroforetyczny rozdział białek na żelu poliakrylamidowym może być prowadzony w warunkach

pozwalających na rozdzielenie tych biomolekuł w formie natywnej (zachowana pełna aktywność
biologiczna proteiny) lub zdenaturowanej (struktura badanej cząsteczki ulega nieodwracalnym
zmianom). Jeżeli – tak jak w przypadku metody western blot – celem eksperymentu nie jest
wyizolowanie aktywnego biologicznie białka, to wprowadzenie czynników denaturujących
pozwalających na rozwinięcie struktury białka znacznie poprawia możliwości rozdziału.

Elektroforeza białek w warunkach denaturujących określana skrótem SDS-PAGE (z ang. sodium

dodecyl sulfate-polyacrylamide gel protein electrophoresis) jest prowadzona się w obecności soli
sodowej siarczanu dodecylu (SDS), który jest detergentem jonowym. Odczynnik ten wpływa na
strukturę białka łącząc się z grupami hydrofobowymi aminokwasów, przez co nadaje całej cząsteczce
ładunek ujemny. Powoduje to nie tylko rozwinięcie cząsteczki proteiny poprzez rozerwanie wiązań
stabilizujących strukturę wyższych rzędów, ale również maskowanie pierwotnego ładunku białka.
Oznacza to, że wszystkie cząsteczki, niezależnie od ich oryginalnego ładunku wypadkowego
(dodatniego bądź ujemnego), po połączeniu z SDS otrzymują ładunek ujemny. Dzięki temu wszystkie
białka w żelu migrują w tym samym kierunku – od ujemnej katody do dodatniej anody (Ryc.1), a ich
rozdział następuje jedynie ze względu na ich masę molekularną (a nie pierwotny ładunek czy kształt) -
polipeptydy o niższej masie cząsteczkowej migrują szybciej, zaś większe wolniej.

Próbki zawierające
zdenaturowane białka

Katoda

Marker wielkości białek

Anoda

Ryc.1. Rozdział białek w warunkach denaturujących (pod kątem masy molekularnej proteiny).
Do rozdziału białek w żelach poliakrylamidowych, wykorzystuje się tzw. elektroforezę nieciągłą, która
umożliwia ich maksymalny rozdział. W technice tej żel składa się z dwóch warstw, które różnią się
wielkością porów: żelu zatężającego/wyrównującego (większe pory) i żelu rozwijającego/separującego
(mniejsze pory). Próbki nakładane na żel w pierwszym etapie przechodzą przez górną warstwę żelu,
gdzie zostają zagęszczone do wąskiego pasma. Dzięki zagęszczeniu próby na granicy obu żelów
separowane białka przechodzą równocześnie do żelu rozwijającego, co umożliwia lepszą rozdzielczość
(Ryc.2.). Następnie w części rozwijającej żelu mieszanina białek ulega rozdzieleniu na pojedyncze
prążki.

Żel zagęszczający

Żel rozwijający

Ryc.2. Przykład żelu do elektroforezy nieciągłej.

1.2. Elektrotransfer

Po zakończeniu elektroforezy białka z żelu muszą zostać przeniesione na specjalne membranę, która
charakteryzuje się zdolnością wiązania białek na swojej powierzchni. Istnieje kilka rodzajów membran
stosowanych w technice western blot, które różnią się właściwościami, rozmiarem porów oraz
wydajnością przyłączania się białek. Najczęściej stosowane to membrany nitrocelulozowe oraz
membrany z polifluorku winylidenu (PVDF, z ang. polivinylidene fluoride).

Transfer białek na membranę to kluczowy etap procedury western blot, ponieważ od jego przebiegu
zależy m.in. wydajność detekcji sygnału. Transfer prowadzony jest w polu elektrycznym – białka
przemieszczają się w kierunku elektrody dodatniej, gdyż po rozdziale elektroforetycznym w obecności
SDS białka są zdenaturowane i wszystkie posiadają ładunek ujemny proporcjonalny do ich masy.
Należy zatem tak ułożyć membranę względem żelu, by znalazła się ona na drodze migracji białek z żelu.
Wyróżniamy trzy typy transferu: transfer mokry, półsuchy i suchy.

Transfer mokry stanowi układ, w którym „kanapka” (z ang. sandwich) złożona z żelu, membrany,
papierów filtrujących i gąbek ułożona jest pionowo pomiędzy dwiema elektrodami (Ryc.3). Całość
umocowana jest w aparacie wypełnionym buforem. Transfer mokry jest zalecany w przypadku białek
dużych (>100 kDa), hydrofobowych lub trudno rozpuszczalnych ze względu na możliwość prowadzenia
go nawet przez 24 godziny, bez ryzyka wyparowania buforu. Przy transferach trwających dłużej niż
godzinę, trzeba jednak zapewnić chłodzenie, aby utrzymać temperaturę w granicach 10-30°C.

W przypadku transferu półsuchego „kanapka” ułożona jest poziomo i znajduje się między płaskimi
elektrodami. Żel i membrana umieszczone są pomiędzy bibułami nasączonymi buforem. Ponieważ cały
dostarczany prąd przechodzi przez membranę, transfer ten jest szybszy niż transfer mokry. Kolejną
zaletą tej metody jest niewielka ilość buforu potrzebna do przeprowadzenia transferu oraz brak
konieczności chłodzenia. Należy jednak pamiętać, że nie powinno się prowadzić transferu półsuchego
dłużej niż trzy godziny ze względu na możliwość wyparowania buforu.

Katoda
Gąbka
Kierunek transferu

Papier

Żel
Membrana

Papier

Gąbka
Anoda

Ryc.3. Schemat układu stosowanego do transferu mokrego i półsuchego (tzw. „kanapki”).

Transfer suchy jest najszybszym, ale jednocześnie najmniej wydajnym rodzajem transferu.
Wbudowany system zawierający elektrodę miedzianą i odpowiedni bufor katodowy i anodowy pozwala
na przeprowadzenie procesu bez udziału dodatkowych buforów. Przykładem jest technologia iBlot
(Thermo Fisher Scientific), która pozwala na przeniesienie białek na membranę PVDF lub
nitrocelulozową w czasie 7 minut.

1.3. Detekcja białek przy użyciu przeciwciał

Obecność białek w badanym lizacie komórkowym jest potwierdzana za pomocą swoistych przeciwciał
(monoklonalnych lub poliklonalnych). Zanim jednak membrana może być inkubowana
z przeciwciałami musi zostać „zablokowana” w roztworze innych białek (tzw. bloker), które łączą się
z miejscami, z którymi nie są związane białka z badanego materiału. W tym celu stosuje się najczęściej
roztwór odtłuszczonego mleka w proszku lub albuminy surowicy bydlęcej (BSA), zazwyczaj
z dodatkiem detergentu np. Tween20, który zmniejsza niespecyficzne łączenie się przeciwciał
z membraną. Wybór czynników blokujących zależy często od typu eksperymentu (np. jeżeli interesuje
nas analiza białek fosforylowanych to blokowanie mlekiem odpada ponieważ zawiera ono kazeinę,
która sama z siebie jest białkiem fosforylowanym i może być niespecyficznie wiązana przez
przeciwciała rozpoznające ten rodzaj modyfikacji).

W celu detekcji docelowego białka można stosować jeden rodzaj przeciwciał połączonych
ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwa rodzaje przeciwciał: pierwszorzędowe
niewyznakowane, skierowane swoiście przeciwko wykrywanemu białku oraz drugorzędowe
wyznakowane, skierowane swoiście przeciwko danemu izotypowi immunoglobuliny pierwszorzędowej
(metoda pośrednia) (Ryc. 4).
 Substrat

Wykrywalny
produkt
Substrat

Wykrywalny Drugorzędowe
produkt przeciwciało

Pierwszorzędowe przeciwciało

Rozpoznawane bialko
Bloker
Membrana

Metoda bezpośrednia Metoda pośrednia

Ryc. 4. Porównanie bezpośredniej i pośredniej metody detekcji białek na membranie.

Przeciwciała drugorzędowe są zwykle skoniugowane z enzymem np. peroksydazą chrzanową lub

fosfatazą alkaliczną, fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku przeciwciał
znakowanych enzymem detekcja opiera się na substratach dających barwny, nierozpuszczalny produkt
osadzający się na membranie lub wytwarzających światło (chemiluminescencja). Odczyt techniki
chemiluminescencji można dokonać na dwa sposoby, stosując urządzenie do odczytu
chemiluminescencji lub za pomocą kliszy fotograficznej.
 2. PRZEBIEG ĆWICZENIA

Cel: Przeprowadzenie analizy western blot w celu porównania ekspresji białka TfR1 w monocytach
oraz makrofagach z nich wyróżnicowanych (linia komórkowa THP-1).

2.1. Elektroforeza białek SDS-PAGE. Transfer białek na membranę nitrocelulozową.

Materiały:

• probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml,

• probówki o pojemności 15 ml i 50 ml,
• bufor do elektroforezy SDS-PAGE – NuPAGE MOPS SDS Running Buffer,
• żel poliakrylamidowy 10-dołkowy (NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, Mini Protein Gel),
• wzorzec białkowy (PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa),
• bufor do transferu – NuPAGE Transfer Buffer,
• metanol,
• membrana nitrocelulozowa,
• papier filtrujący (bibuła),
• podkłady z gąbki,
• bufor TBS-T (0,05% Tween-20, 50 mM Tris, 150 mM NaCl; pH 7,5),
• mleko odtłuszczone,
• przeciwciała pierwszorzędowe anty-TfR1 i anty-β-aktyna,
• skoniugowane z HRP przeciwciała drugorzędowe anty-królicze i anty-mysie,
• pęseta.

Sprzęt:

• pipety miarowe automatyczne: 1 – 10 μl, 10 – 100 μl, 20 – 200 μl, 100 – 1000 μl,
• wirówka na probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml (Eppendorf),
• worteks,
• roller,
• kołyska,
• urządzenie do odczytu chemiluminescencji.

Wykonanie:

Elektroforeza białek SDS-PAGE

1. Przygotowane tydzień wcześniej próbki lizatów inkubuj przez 10 minut w temperaturze 70°C.
2. Po skończonej inkubacji przenieś próbki na lód.
3. Przygotuj 500 ml buforu do elektroforezy SDS-PAGE mieszając 25 ml buforu NuPAGE MOPS
SDS Running Buffer (20x stężony) z 475 ml wody destylowanej.
4. Rozetnij torebkę i wyjmij kasetę z żelem.
5. Wyciągnij grzebień i przepłucz studzienki żelu buforem do elektroforezy za pomocą igły
i strzykawki.
6. Usuń białą taśmę zakrywająca szczelinę w dolnej części kasety.
 7. Umieść zacisk kasety w komorze zbiornika do elektroforezy, a następnie wypełnij komorę
zbiornika buforem do elektroforezy do poziomu katody.
8. Umieść kasetę z żelem w komorze studzienkami skierowanymi w Twoja stronę i zamknij
zacisk.
9. Wypełnij studzienki żelu buforem do elektroforezy, a następnie nałóż próbki (20 μl) i wzorzec
białkowy (4 μl).
10. Dolej do komory zbiornika do elektroforezy bufor do elektroforezy do poziomu linii
wypełnienia.
11. Umieść pokrywę na zbiorniku do elektroforezy. Pokrywa może być mocno osadzona tylko
wtedy, gdy wszystkie złącza są odpowiednio wyrównane
12. Przy wyłączonym zasilaniu podłącz przewody elektrod do zasilania, włącz zasilanie i prowadź
elektroforezę aż do całkowitego rozdziału białek, pod stałym napięciem 180-200 V.

Transfer białek na membranę nitrocelulozową

1. Przygotuj 500 ml buforu do transferu mieszając 25 ml buforu NuPAGE Transfer Buffer (20x
stężony) z 425 ml wody analitycznej i 50 ml metanolu.
2. Namocz w buforze do transferu 2 podkładki z gąbki i 2 sztuki papieru filtracyjnego (bibuły).
3. Umieść katodową część kasetki na płaskiej powierzchni i przenieś do kasety niewielką ilością
buforu do transferu (5-10 ml).
4. Następnie złóż „kanapkę” umieszczając w kasecie katodowej kolejno:
• zmoczony podkład z gąbki,
• zmoczony papier filtracyjny,
• żel z rozdzielonymi białkami (uprzednio wyciągnięty z kasetki i przepłukany buforem
do transferu)
• zmoczony papier filtracyjny,
• podkład z gąbki

i zamknij kasetkę drugą jej częścią (odpowiadającą anodzie) – należy to zrobić jednym
powolnym, zdecydowanym i nieprzerywanym ruchem.

UWAGA: Po złożeniu kasetki trzeba pilnować, żeby obie jej części się nie przemieszczały.

5. Włóż kasetkę z „kanapką” do zbiornika tak, aby katoda był skierowana do przodu, a zaciski
elektrod w kasetce były w kontakcie z prętem elektrody zbiornika do elektroforezy.
6. Dolej do komory zbiornika do elektroforezy bufor do transferu do poziomu katody.
7. Umieść pokrywę na zbiorniku do elektroforezy. Pokrywa może być mocno osadzona tylko
wtedy, gdy wszystkie złącza są odpowiednio wyrównane.
8. Przy wyłączonym zasilaniu podłącz przewody elektrod do zasilania, włącz zasilanie i prowadź
transfer przez 60 minut pod napięciem 10 V.
Immunodetekcja swoistych białek

1. Po skończonym transferze przenieś membranę do pojemnika.

2. W celu oceny wydajności transferu inkubuj membranę z 10 ml barwnika Ponceau S przez
chwilę na kołysce.
3. Nastepnie wypłucz dwukrotnie membranę wodą dejonizowaną i oceń barwienie białek na
membranie.
4. Usuń barwienie białek na membranie płucząc membranę trzykrotnie w buforze TBS-T (0,05%
Tween-20, 50 mM Tris, 150 mM NaCl; pH 7,5) (każde płukanie po 5 minut).
5. Inkubuj membranę w 20 ml 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze TBS-T przez
godzinę na kołysce w temperaturze pokojowej. Etap ten nazywany jest blokowaniem membrany
i jest on konieczny w celu zablokowania miejsc niespecyficznych na membranie, z którymi nie
są związane białka.
6. Inkubuj membranę z przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko białkom
TfR1 i β-aktynie, rozcieńczonymi 1:2000 w 5 ml 2,5% roztworu odtłuszczonego mleka w
buforze TBS-T. Inkubację prowadź przez noc w temperaturze 4°C.
7. Wypłucz membrany trzykrotnie w 20 ml buforu TBS-T (każde płukanie po 5 minut) na kołysce.
8. Inkubuj membranę z przeciwciałami drugorzędowymi skoniugowanymi z HRP,
rozcieńczonymi 1:2500 w 5 ml 2,5% roztworu odtłuszczonego mleka w TBST. Inkubację
prowadź przez 45-60 min w temperaturze pokojowej.
9. Wypłucz membranę trzykrotnie w 20 ml buforu TBST (każde płukanie po 5 minut).
10. Przygotuj roztwór luminolu (Pierce™ ECL Western Blotting Substrate) w probówce o
pojemności 15 ml poprzez zmieszanie dwóch odczynników w stosunku 1:1 (wymagana objętość
po zmieszaniu to 3-4ml na membranę).
11. Nanieś na membranę 2-3 ml roztworu luminolu i inkubuj przez 1 minutę.
12. Następnie osusz membranę z nadmiaru odczynnika przez dotknięcie kantem do papierowego
ręcznika. Tak przygotowaną membranę należy zamknąć w folii.
13. Dokonaj wizualizacji wyniku stosując urządzenie do odczytu chemiluminescencji.