Teknikat elektroforetike pjese organike e kërkimit dhe përmirësimit te bimëve

Pak histori

• Njeriu ka realizuar seleksionimin dhe ka zhvilluar genotipe bimësh te dëshiruara qe me

lindjen e njerëzimit. Ai ka aplikuar principet baze te shkencës bimore gjate tere historisë
se tij. Sidoqoftë mundësitë e përmirësimit te bimëve morën hov vetëm ne shekullin XX-te
si rezultat i zbulimeve te Mendelit nëpërmjet tipareve trashëguese ne bizelen dhe
zbulimet pasuese te bazës gjenetike te trashëgimisë.
• Ne mes tyre kane luajtur një rol te rendesishem teoria kromozomike, shpjegimi i
mutacioneve si dhe zbulimi i strukturës se ADN-se dhe funksioneve te saj.
• Pasi u kuptua baza gjenetike e trashëgimisë, u zgjodhën bime me tipare te ndryshme te
dëshiruara dhe u kryqëzuan ne mënyre qe te prodhojnë varietete te reja, te cilat
kombinojne me mire karakteristikat e materialit dhurues.
• Cilësia e produkteve bujqësore është përmirësuar ne drejtime te ndryshme.
• Kërkesat e tregut kane bere qe te përshpejtohet procesi i përmirësimit dhe zhvillimit te
kultivarëve me rendiment te larte e te qëndrueshëm, superior ose cilësi te ndryshme.
• Dy metoda dhe kombinimet e tyre u shfaqen ne fund te shekullit XX
• Transformimi gjenetik
• Seleksionimi i bazuar ne markeret molekulare ndihmës.
• I pari ofron një metode te shpejte te kombinimit te materialeve gjenetike te specieve te
ndryshme, p.sh. transmetimi i një geni te një bakter qe përcakton tolerancën ndaj
herbicideve ne disa lloje bimësh.
• I dyti ka për qellim te përdorë informacionin mbi strukturën dhe funksionimin e
genomes se bimës ndaj materialit prindëror me efikas duke rritur shkallen e
seleksionimit te pasardhësve me te mire.

Pak teori

• Përpara se te flitet për elektroforezen, duhet te dimë se çfarë është ADN-ja

• ADN-ja dhe kodi gjenetik është biblioteka ku përmblidhet i gjithë informacioni i
nevojshëm për te krijuar dhe ruajtur një qelize dhe një organizëm te gjalle.
• Ky informacion nëpërmjet mekanizmave i jepet ARN-se dhe përfundon ne sintezën e nje
proteine, një enzime apo një koenzime dhe pastaj gjithçka rrjedh prej tyre
• Sikurse dihet polimorfizmi rrjedh nga greqishtja do te thotë shume forma dhe
përkufizohet si prezence ne te njëjtën popullate e dy ose me shume formave te
aleleve ne një lokus te dhëne.
• Speciet e gjalla ne përgjithësi janë nen presionin e dy fenomeneve te kundërta:
• --Ruajtjen e identitetit duke ndërtuar një njësi te riprodhimit qe lejon fluksin e një
variacioni gjenetik te kufizuar brenda llojit, por qe bllokon këmbimet gjenetike ndërmjet
llojeve.
• --Mbajtjen ne nivel te mjaftueshëm te polimorfizmit për te lejuar përshtatjen e
variacioneve te mjedisit
 • Megjithatë një specie nuk përben një bashkësi homogjene, por përbehet nga elementë
baze, popullata. Ky ndryshim ne brendësi te se njëjtës popullate është motori i
evolucionit.
• Ne qofte se polimorfizmi mund te kapet ne nivel fenotipik, ai nuk mund te pasqyroje
diferencat e mëdha midis individëve ne nivel genome.
• Modifikimet e materialit gjenetik janë modifikime qe transmetohen pasardhësve, disa nga
këto modifikime mund te ndodhen mbi kromozome te tera dhe mund te analizohen me
analizën kariotipike.
• Por ne përgjithësi mutacionet dallohen vetëm ne nivelin e shprehjes te tyre fenotipike
dhe ne tipare. Këto janë te dallueshme direkt , ose mund te dallohen ne nivelin molekular.
• Ndryshueshmëria e vërejtur ne bime si rezultat i mutacioneve apo ndryshimeve te geneve
strukturore te proteinave përcaktohet nga polimorfizmi i tyre proteinik.
• Analiza e polimorfizmit te një proteine, jep gjithashtu një pamje te polimorfizmit te
genit qe e kodon.

Çfarë janë markeret molekulare

• Markeret molekulare janë molekula qe mund te përdoren ne gjurmimin e geneve te

dëshiruara ne genotipet e studiuara paraprakisht.
• Ne fakt një pjese e ADN-se ose një proteine mund te përdoret si marker. Kërkimet me te
hershme qe kane te bëjnë me seleksionimin e tipareve specifike ishin te bazuar ne
vlerësimin e tipareve morfologjike, izozimave, proteinave rezerve p.sh. glutelinat, zeinat,
gliadinat, orzeinat
hordeinat etj.
• Megjithatë markeret e ADN-se duket se janë kandidatet me te mire për një vlerësim me
efikas ne seleksionim e materialit bimor.
• Ne ndryshim nga markeret proteinike ato te AND-se copëtohen si gene te thjeshte dhe
nuk janë te ndikuar nga mjedisi.
• ADN- veçohet lehte nga materialet bimore dhe analizat e saja janë me kosto përpunimi te
ulet.
• Me shume është pritur nga teknologjitë e ADN-se kur behet fjale për seleksionimin e
hibrideve. Deri tani testet pasardhëse kane qene metoda predominuese per identifikimin e
aftësisë kombinuese te genotipeve (qe është shume e rëndësishme për seleksionimin e
linjave prindërore).
• Kjo dukuri është e kushtueshme dhe konsumon shume kohe.
• Përcaktimi i distancave gjenetike ndërmjet prindërve pritet te parashikoje efektshmerine e
hibrideve ne te ardhmen.
• Janë bere disa studime për misrin, kolzen, orizin, grurin dhe prodhime te tjera qe
paraqesin se zbulimi thjeshte i distancave gjenetike relative nuk është i mjaftueshëm për
një qellim te tille.
• Janë vene ne harte disa gene qe kontrollojnë dobësimin e hibrideve ne oriz si dhe janë
përshkruar ne grurë gene te dëmshëm qe kane një bashkëveprim sinergjik, te cilët
zvogëlojnë përshtatjen e pasardhësve. Prezenca ose mungesa e tyre ne genotipe te
ndryshme mund te ndikoje edhe ne efekteshmerine e hibrideve.
• Kurdoherë qe pasardhësi është i vlefshëm, markeret molekulare mund te përdoren per te
ndihmuar seleksionimin e linjave me te mira.
 • Zbulimet e hershme te MAS (Seleksionim me Pjesëmarrjen e Markereve) jane kryer me
efektivitet ne seleksionimin e lokusve te shumte ne misër (p.sh.BERNARDO, 1998) duke
përdorur markeret molekulare patën rezultate shume premtuese.
• Është treguar deri tani qe seleksionimi per tiparet i koduar nga një gen i vetëm ne disa
specie duke përdorur sistemet e markerve,është shume efektiv veçanërisht kur vlerësimet
tradicionale janë te vështira, konsumojnë kohe ose kane një kosto te larte
• Seleksionimi me pjesëmarrjen e markerve gjithashtu mund te shpejtoje rigjenerimin e
genomes prindërore rikurente ne seleksionimin.

Zhvillimi i markerve molekulare

Ekzistojnë dy kategori kryesore te markerve molekulare

1. Markere qe ndajnë e përcaktojnë prezencën e një geni te vetëm dominat apo recesiv.
2. QTL (vendndodhja e tipareve sasiore) shoqëruese te markereve.

Është e e lehte dhe me e lire te zhvillosh markeret për një gen te vetëm qe trashëgon një tipar
se sa QTL.

Teknikat e markerve molekulare janë te shumta; përmendim disa:

• PCR- reaksionin zinxhir polimeraze

• RFLP- polimorfizmi i fragmenteve gjatësor te kufizuar
• RAPD-amplifikimi i restesishem polimorfik i ADN-se
• AFLP-amplifikimi gjatësor polimorfik i fragmeneteve
• SSR-mikrosatelitet: përsëritje e thjeshte sekuence.
• AFLPs- Amplifikim polimorfik i gjatësisë se fragmentit
• Këto metoda janë te kushtueshme dhe kërkojnë teknike dhe reagente speciale

Çfarë janë elektroforezat e proteinave

• Shume vite me pare kane filluar ne bote analizat ne nivelin molekular (elektroforezat) me
anën e te cilave është bere e mundur përcaktimi i sakte deri ne pastërtinë gjenetike te
specieve, llojeve dhe i varieteteve te ndryshme.
• Kjo teknike është përdorur ne fillim me analizat e fraksioneve te ndryshme te proteinave
ne gelin e amidonit. Me kalimin e viteve është përmirësuar me tej duke përdorur gele te
ndryshëm si poliakrilamid, agar, agaroze etj.
• Këto metoda u shfrytëzuan si për përcaktimet e polipeptideve ne fraksione te ndryshme te
proteinave te kokrrave te drithërave , ashtu dhe për proteinat e kloroplasteve, pjesëve te
tjera te tyre si dhe ne te gjitha përcaktimet e biokimisë molekulare tek kafshët dhe tek
njeriu
• Këto teknika sot janë përmirësuar dhe thelluar aq tepër sa duke përdorur elektroforezat dy
dimensionale bëjnë te mundur ndarjen e një vargu te vetëm polipeptid ne peptide te
veçante dhe pastaj studimin e tyre për probleme specifike
• Teknikat elektroforetike me te përdorshme i ndajnë proteinat ne funksion te peshës,
madhësisë, formës se tyre (PAGE) dhe te pikës izoelektrike (IEF)
 • Sikurse dihet, proteinat janë vargje te aminoacideve, renditja e te cilave kodohet nga
ADN-ja. Këto vargje mund te jene lineare apo te përdredhur ose ne forme lëmshesh dhe
kane madhësi te ndryshme.
• Duke i vendosur këto proteina ne një fushe elektrike dhe ne një site, ato do te ndalojnë
kur vrimat e kësaj site janë me te vogla se vete ato.
• Proteinat janë te ndërtuara nga aminoacide qe mund te jene acide, bazike apo neutrale.
Pra vete proteinat kane ngarkese elektrike.
• Duke i vendosur këto proteina ne një fushe elektrike specifike ne tension te larte dhe me
disa substanca qe kontrollojnë pH këto proteina ndalojnë levizeshmerine e tyre kur
ngarkesa behet 0. Ky tip elektroforeze quhet me fokusim izoelektrik ose IEF.

Teknikat elektroforetike te proteinave PAGE-SDS dhe PAGE-AC ( acide)

• Këto teknika lejojnë jo vetëm identifikimin e bandave te polipeptideve, por edhe

përcaktimin e peshës se tyre molekulare duke përdorur proteina standarde.
• Ekstraktimi i proteinës (proteine totale albumine, globuline,gluteline,)
• Denatyrimi dhe ndarja e polipeptideve
• Përgatitja e gelit poliakrilamid me koncentrim te përshtateshem
• Përgatitja e buferave për rezervuarët.
• Inserimi i proteines ne gele
• Aplikimi i fushës elektrike specifike për tipe te ndryshme proteinash
• Fiksimi dhe ngjyrimi i geleve me ngjyrues specifik
• Shpëlarja
• Leximi dhe interpretimi i rezultateve

Nje elektroforeze e proteines totale ne ne disa linja te misrit

Elektroforeze e zeines te dy popullatave PAGE-AC

 Elektroforeza 2 -D

Teknikat elektroforetike te proteinave me fokusim izoelektrik (IEF)

• Sikurse u theksua, me ketë metode mund te ndahen proteinat sipas ngarkesës se tyre
elektrike.
• Ne misër kjo metode përdoret për te ndare zeinen e cila është një proteine e tretshme ne
alkol dhe është proteine rezerve për ndërtimin e bimës se re
• Shembull: Përcaktimi i homogjeniteit te linjave dhe hibrideve te misrit
• Mielli i misrit ekstraktohet me 2-chloroethanol me disa kristale Pyronin G. Lihet
minimum 1 ore dhe centrifugohet ne 2000 rrot/min. Nga supernatanti merren 15-20 μl.
• Elektroforeza behet ne temperature te ulet 4oC
• Për 30 min. behet ne 800 V ne 34 mA (44 w) dhe pastaj 1200 V për 90 minuta.
• Fiksohen gelet për 30 min. ne solucionin fiksues.
• Ngjyrosja behet për 60 min. ne solucionin ngjyrues
• Shpëlarja behet gjate 30 min. me ujë te distiluar
• Interpretimi i rezultateve behet nëpërmjet një densitometri apo një sofware.
Analizat elektroforetike per polimorfizmin enzimatik

• Ne disa raste kjo metode jep rezultate me te mira se ajo e proteinave për përcaktimin e
variabilitetit gjenetik, përfshire misrin.
• Parimi: Një pjese e madhe e geneve koduese për proteinat janë polimorfe qe do te thotë
ekzistenca ne genome e dy ose me shume aleleve. Alelet e geneve koduese te proteinave
janë ne përgjithësi koodominant qe do te thotë mundësi shprehje te çdo aleli tek
heterozigotet. Pra nuk kemi te bëjmë me fenomenin pliotropi apo epistaze. Kjo krijon
premisën për studimin e karaktereve qe nuk janë nen efektin e bashkëveprimit fenotip x
mjedis.
• Dy alele te nje geni A dhe A’ ne heterozigotet do te ndeshin tre lloj individësh me
strukture :AA, A’A’, AA’. Ne qofte se aleli A kodon një proteine X aleli A’ kodon nje
proteine Y. Ne individe homozigote zimograma do te përfaqësoje një bande unike e cila
vendoset ne gel ne nje pozicion te caktuar sipas ngarkesës qe ka. Ne rastin e
heterozigoteve ne vartësi te karakteristikes te enzimes (proteines, monomerike apo
dimerike) ne gel do te kemi dy ose tre banda me te njëjtën levizmeshmeri elektroforetike
si tek heterozigotet AA dhe tjetra A’A’. Ne rastin e enzimes dimerike do te kemi tre
banda ku e mesmja është me intensive. Kur kemi te bëjmë jo me dy alele, por tre, katër
apo gjashte, numri i bandave dhe i rikombinimeve te tyre shtohet.

Etapat e analizës elektroforetike për polimorfizmin enzimatik

• Mbirja e farave temperature 25 0C.

• Prerja e indit realizohet ne pjesën e freskët pa e futur ne ambient te ftohet. (pjesa e
koleoptilit)
• Buferi i ekstraktimit: sakaroze 0.5 M, askorbat natriumi 0.4 M te cilat bashkohen ne një
pH 7.38. volumi i buferit 60 μ l për çdo prerje 12-15 mm koleoptil. Ruajtja realizohet ne -
20 oC.
• Copëtimi dhe centrifugimi. (një mase notuese te qarte dhe sasi për te realizuar 4-5 marrje)
E gjithë procedura realizohet sa me shpejt dhe ne kushtet e një temperature te ulet afro 0
o
C
• Buferi i gelit dhe i elektrodes sipas literaturës
 • Gelet: preferohet ai i amidonit 12.8 % .
• Migrimi
• Ne një gel te vetëm, duke e prere atë ne feta te holla dhe duke përdorur solucione
zbuluese për izozima te ndryshme, mund te zbulojmë deri 11 sisteme te ndryshme
enzimatike
• Leximi dhe konservimi

Disa metoda te markerve molekulare

PCR Polimeraze Chain Reaction (reaksioni zinxhir polimeraze)

• Përcaktimi: PCR është reaksioni i amplifikimit zinxhir in vitro i ADN-se me ane te se

cilës përftohen sasi te mëdha te sekuencave te ADN-se.
Elementet e realizimit:
• Praimerat (jane vargje nukleotidesh deri 20)
• Sekuenca shabllon te ADN (100-5000 nukleotide)
• ADN polimeraze ( taq polimeraza qe është termoduruese 90-95oC)
• 4 llojet e dezoksiribonukleotideve
Procedura
• Denatyrimi (temp. deri 95 Grade)
• Rinatyrimi (temp. deri 55 Grade)
• Sinteza (temp. deri 75 Grade)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

(polimorfizmi i fragmenteve gjatësor te kufizuar)

Objektivi dhe qëllimi i përdorimit

• RFLP është një metode qe ndjek kalimin e sekuencave te AND nga dhuruesi tek qelizat e
tjera. RFLPs përdoret ne funksion te qëllimeve te ndryshme përfshire dhe rastet e
kriminalitetit, gjendjen dhe shprehjen e sëmundjes dhe nder me te rëndësishmet
diferencat apo largësitë e lokuseve ne hartën gjenetike te qenieve te gjalla bimore apo
shtazore e cila matet me centiMorgan
• CentiMorgan (cM): Është njësia e distancës ne hartat gjenetike. Për distancat e shkurtra
ne qofte se dy gene janë 1 cM te ndara, atëherë ato do te rikombinohen mesatarisht ne 1
% te kohës
• Çdo organizëm trashëgon AND-ne e tij nga paraardhësi, prindërit. Kjo do te thotë se tek
pasardhësi ne çdo gjenerate kemi te njëjtat sekuenca te AND-se. Një RFLP është një
sekuence qe ka një sajte restriksioni me nje “target” sekuence ndërmjet. Nje “target”
sekuence është nje segment i AND se qe i korrespondon një “sonde” duke formuar çiftet
e bazave.
• Shembull: Le te ndjekim një RFLP te përcaktuar nga enzima e restriksionit EcoR I dhe
“target” i sekuencave jane 20 bazat GCATGCATGCATGCATGCAT. EcoR I këput ketë
zinxhir ne sekuencat qe njeh GAATTC duke e këputur ADN si me poshtë
Prodhohen tre fragmente restriksioni por vetëm njera përmban sekuencen “target”

SSR-mikrosatelitet. Përsëritje e thjeshte sekuence

• MILBOURNE et al. (1998) zbuloi qe SSRs-ja ne mënyre konsistente paraqet nivelin me

te larte te polimorfizmit (100% ne elb dhe 90.8% ne patate). AFLPs-ja paraqet nivelin me
te ulet te polimorfizmit nga te dhënat e deritanishme (46.8% ne elb dhe 41.7% ne patate).
RAPDs-ja është i ndërmjetëm (66.3% ne elb dhe 65.8% ne patate)
• Sistemet e mikrosateliteve përbehen nga një rajon i përsëritjes i ADN ne varg ne secilin
lokus. Vargjet e përsëritura janë zakonisht dinukleide te thjeshta (si TG) me secilin
dinukleotide dhe përsëriten dhjetëra here.
• Shkalla e tyre e larte e polimorfizmit ne numrin e përsëritjeve (n) lejon përdorimin e tij
ne pozicionim si marker ne hartimin e genomes. Gjatësia e çdo aleli përcaktohet
nëpërmjet PCR duke përdorur primer oligonukleotide specifike te cilët rrethojnë
sekuencen e përsëritur.
• Produktet e ADN bëhen te dukshëm mbas elektroforezes. PCR e bazuar ne tekniken e
mikrosateliteve lehtëson ndërtimin e hartave gjenetike ne shume specie
• P.sh. duke përdorur 19 mikrosatelite qe mbulojnë 10 kromozome ne linjat inbrede te
misrit, është arritur ne konkluzion se këto mund te shërbejnë si potenciale shume te
dobishme
• Numri i këtyre njësive mund te ndryshoje nga njeri individ tek tjetr
Variabiliteti gjenetik i disa popullatave te misrit per tolerance ndaj thatesires

• Nga 9 dagramat e përftuara dy prej tyre ku janë përdorur primerat bnlg 1209 dhe bnlg
1450 informacioni është i parëndësishëm. Mungojnë te dhënat për prezencën e shume
alleve ne secilën prej popullatave dhe grupeve te popullatave. Primerat e tjere SSR japin
një informacion te bollshëm mbi variabilitetin e madhe gjenetik ndërmjet grupeve te
popullatave dhe brenda vete grupit.
• Konstatojmë qe primerat SSRr, te përdorur ne funksion te identifikimit te geneve tolerant
ndaj thatësirës janë sintetizuar për tu përdorur kryesisht PR materiale homozigote sikurse
janë linjat inbrede te misrit. Ne rastin tone popullatat e analizuara nga pikëpamja
gjenetike paraqesin një përzierje gjenetike heterozigote, keshtu qe çdo gjurme (kampion
ADN-je) paraqet me tepër se një bande.

Sekuencimi automatik i ADN-se

• Duke përdorur ne vend te deoxynucleotideve (dNTPs), dideoxynucleotide (ddNTPs), te

cilat janë te ngjashme, por qe ndryshojnë nga mungesa e një grupi te karbonit 3’ mund te
realizojmë ne te njëjtën mënyre analizat me marker molekulare si PCR, SSR, AFLP etj.
• Por ne ketë rast çdo (ddNTPs) etiketohet me një fluorofore ( ngjyre) te ndryshme, duke
krijuar mundësinë qe te katër reaksionet te kryhen ne te njëjtën linje.
• Ndarja behet ne një gel poliakrilamidi i cili veçon fragmente qe ndryshojnë nga një
nukleotid i vetëm.
• Reaksionet e sekuencimit bëhen ne një orientim te vetëm , duke përdorur vetëm një
primer.
Disa shembuj te sekuencimit me ABI Prizma duke perdorur 4 fluorofore

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay.

(Provae lidhjes te enzimave imunosorbente)

• Parimi: Aftësia e antitrupave për tu lidhur me antigenin përkatës

• Qëllimi i metodës është përcaktimi i pranisë dhe sasisë te një proteine specifike ne një
kampion. Metoda ka dy variante baze: përcaktimi i sasisë se antitrupave ne kampion, apo
përcaktimi i sasisë te proteinës se lidhur me antitrupin.
• Procedura:
• Lidhja e kampionit qe dyshohet për përmbajtjen e një proteine specifike me një suport
(pllake mikrotiter plastike)
• Shtimi i antitrupit primar dhe lidhja e qëndrueshme e tij me kampionin ne suport (nqs
është proteina shenje e pranishme)
• Shtimi i antitrupit sekondar qe lidhet me antitrupin primar. Antitrupi sekondar është i
lidhur me një enzime te njohur qe shpreh një ngjyre te caktuar.
• Shpëlarjet dhe verifikimi i rezultatit.
• Metoda realizohet me 96 pjata mikrotiter plastike. Ndiqet e procedura e mësipërme.
Përgjigja negative apo pozitive përfshin te dhënat e pjatave nëpërmjet lexuesit, pajisje qe
vlerëson intensitetin e ngjyrës. (ngjyrat qe ato marrin pas përfundimit te procedurës).