PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR-ja ose reaksioni i amplifikimit zinxhir in vitro të ADN-së është një

proçedurë efektive me anë të së cilës mund të fitohen sasi të mëdha të një
sekuence ADN-je në kushte laboratorike.

• Lëndët e nevojshme për reaksionin e PCR-së janë:

(1) dy oligonukleotide sintetike (20 nukleotide) që luajnë rolin e primerëve duke

qënë komplementarë me zonat e përkundrejta që rrethojnë zonën e ADN-së që
kërkohet të amplifikohet;

(2) një sekuencë shabllon e përfshirë midis sekuencës që njohin primerët e që

mund të ketë madhësi nga 100 deri në 5.000 çifte bazash;

(3) një ADN-polimerazë e qëndrueshme termikisht që të përballojë temperaturat e

nevojshme për denatyrimin e ADN-së (rreth 90-95°C);

(4) katër llojet e dezoksiribonukleotideve.

• Çdo cikël përbëhet nga tri etapa kryesore.

a) Denatyrimi. Kryhet denatyrimi i ADN- së me anë të temperaturës së lartë deri

në 95°C. Në mjedisin e reaksionit, përveç ADN-së shenjë shtohen primerët në
sasi të majftueshme. ADN-polimeraza e qëndrueshme ndaj temperaturës së
lartë dhe katër dezoksiribonukleotidet. Kjo fazë e ciklit zgjat jo më shumë se 1
minutë.

b) Rinatyrimi. Temperatura ulet ngadalë deri në rreth 55°C. Gjatë kësaj faze
primerët gjejnë sekuencat komplementare me to në ADN-në shenjë.

c) Sinteza. Në sajë të rritjes së temperaturës deri në rreth 75°C, temperatura

optimale për funksionimin e Taq-polimerazës, kryhet sinteza e ADN-së në çdo
skaj 3’-OH të secilit primer.
• Aparaturë të programueshme të quajtura makina të PCR-së, termociklues ose
amplifikues.

• Ato përmbajnë një bazament ku temperatura mund të ndryshohet sipas

dëshirës dhe ku vendosen epruvetat e reaksionit të amplifikimit zinxhir.

• Gjatë ciklit të parë të amplifikimit, zinxhirët e rinj që formohen zgjaten përtej

zonës komplementare me primerët.

• Këta zinxhirë janë ata që formojnë segmentet e gjatë e që do përdoren gjatë

ciklit të dytë.

• Gjatë ciklit të dytë zinxhirët origjinorë të ADN-së shenjë dhe ata të gjatë të
formuar gjatë ciklit të parë, denatyrohen dhe hibridizohen përsëri me
sekuencat primere.

• Një raund i dytë sinteze ndodh dhe si pasojë formohen molekula të reja të
gjata dhe të shkurtëra.
Paraqitje skematike e proçesit
të PCR-së
• Gjatë ciklit të tretë, segmentet e shkurtra, të gjata dhe origjinale dyfishohen
përsëri me të njëjtin kompleks enzimash.

• Gjatë këtij cikli dhe në ato që ndjekin rriten në mënyrë të ndjeshme segmentet e
shkurtra në raport me ato të gjatat.

• P.sh. pas ciklit të trembëdhjetë, të shkurtrit kanë përqëndrim rreth 1 milion herë
më të lartë se të gjatët.
• Në sajë të ndjeshmërisë së lartë që ajo ka po përdoret për detektimin e sasive të
vogla të ADN-së në kampione nga më të pazakonshmet, si flokët, kocka
shumë të vjetra, pjesë indesh të degjeneruar, etj.

• Përdoret në diagnostikimin e sëmundjeve për të përcaktuar nëse një infeksion,

p.sh., shkaktohet nga viruse ose baktere.

• Ka gjetur zbatim në drejtime të tilla si p.sh. atë të diagnostikimit të sëmundjeve

gjenetike (beta-talasemive, fibrozë cistike, distrofisë muskulare të Duchenne,
koresë së Huntingtonit, tumoreve të ndryshme, etj.)

• Identifikimin dhe analizimin e ADN-së edhe nga burime që e përmbajnë atë në

sasi shumë të ulët e në gjendje cilësore jo të mirë, Mjekësi Ligjore.

• PCR-ja bën të mundur gjithashtu analizimin e ADN-së nga burime shumë të

vjetra ose mbetje materialesh biologjike të ruajtura për një kohë të gjatë
(fosilet, kockat, indet tek mumjet).
Kjo teknikë ka dhënë kontribut të madh

• në sqarimin e strukturës së hollë të gjenomës eukariote si në sekuencimin e

saj,
• identifikimin e mutacioneve pikëzore dhe delecioneve,
• indentifikimin e zonave të përsëritura e pa kuptim të ADN-së,
• përcaktimin e seksit,
• për analizimin e ADN-së së mikrodisektuar për sqarimin e disa
mekanizmave molekularë që qëndrojnë në bazë të proçeseve fiziologjike e
të zhvillimit të organizmave.

• Me futjen e kësaj teknike u bë gjithashtu i mundur detektimi i shpejtë i

baktereve ose viruseve që zhvillohen shumë ngadalë si mykobakteret, virusi
HIV dhe tipizimi i shpejtë i sistemeve të tjera si p.sh., ai antigjenik HLA,
etj.
 Antitrupat monoklonalë

• Gjitarët kanë zhvilluar një sistem qelizor mbrojtës shumë efikas ndaj lëndëve
toksike ose mikroorganizmave që konsiderohen të huaj për një organizëm.

• Pjesë e kësja përgjigje imunitare janë qelizat e sistemit limfatik ose

limfocidet.

• Si pasojë e një nxitësi (antigjen) këto qeliza fillojnë të prodhojnë proteina

specifike (antitrupa) të cilat lidhen me lëndën ose organizmin e huaj dhe me
ndihmën e qelizave të tjera dhe sistemit të komplementit asgjësojnë pasojat e
tyre biologjike.

• Në përgjigje të një “thirrje për mbrojtje”, çdo qelizë prodhuese e antitrupave

shumohet dhe prodhon në sasi të rritur një antitrup specifik.
• Shpesh herë “trupat ose lëndët e huaja” për një organizëm përmbajnë shumë
epitope (zona me veti antigjenike).

• Si pasojë nxiten për shumim shumë lloje qelizash prodhuese të antitrupave

ku çdo lloj (linjë ose klon qelizor) prodhon një lloj të caktuar antitrup për çdo
epitope ose determinant antigjenik.

• Kjo tërësi antitrupash që prodhohen si përgjigje ndaj një antigjeni quhen

antitrupa poliklonalë, term që i referohet faktit që prodhohen nga lloje të
ndryshme klonesh limfocitare.

• Qelizat shtazore, përfshirë edhe ato të njeriut, mund të kultivohen në terrene

ushqyese të përshtatshme, kanë disa kufizime.

• Për të bërë të mundur rritjen në mënyrë të izoluar edhe të qelizave shtazore,

përdoret metoda e hibridomave dhe që solli më pas prodhimin e
antitrupave monoklonalë.
• U synua fitimi i antitrupave me veti specifike maksimale, pra e linjave
qelizore të veçuara, ku secila prodhon vetëm llojin karakteristik të antitrupave.

• Këto quhen antitrupa monoklonalë pra që prodhohen nga një klon i vetëm
qelizor e që si pasojë përbëhen nga një lloj i vetëm.

• Për të shkrirë fillimisht qeliza të meliomës së miut me qeliza normale të

shpretkës të marra nga një mi i imunizuar ndaj një antigjeni të dhënë.

• Këto të fundit janë qeliza që prodhojnë antitrupin ndaj antigjenit specifik, por
nuk kanë aftësi të rriten në mënyrë të shpejtë.

• Nga shkrirja e mësipërme u fituan me anë të përzgjedhjes, qelizat hibride

somatike (hibridomat) ku ishin kombinuar cilësitë pozitive të të dyja qelizave:
aftësia për të prodhuar antitrupin në fjalë dhe për t’u shumuar pafundësisht.
• Përsa i përket seleksionimit për markatorin HGPRT (hipoksantinë-guaninë-
fosforibozil-transferazë) përzgjedhja e qelizave hibride bëhet duke i rritur ato
në terren HAT (hipoksantinë-aminopterinë-timidinë).

• Në këtë terren mund të mbijetojnë dhe të shumohen vetëm hibridët qeliza të

shpretkës (që mund të prodhojnë antitrupa që kanë një enzimë HGPRT
funksionale)- qeliza të meliomës (që i japin aftësinë hibridit për t’u shumuar
në mënyrë të pakufizuar në terren artificial).

• Nga pikpamja teknike priten 10-14 ditë për të ndjekur hibridët që kanë
mbijetuar dhe janë shumuar.

• Këto kombinime qelizore janë ato midis qelizave të shpretkës me qeliza të

meliomës, ndodhen ata hibridë që prodhojnë antitrupin e dëshiruar
Si mund të indentifikohen dhe të ndahen pikërisht hibridët e
dëshiruar?

• Detektimit të antitrupave të çliruara nga qelizat prodhuese.

• Antitrupat vihen në kontakt me antigjenin me të cilin është inokuluar kafsha nga

janë nxjerrë qelizat fillestare.

• Lidhja antigjen- antitrup është e qëndrueshme dhe pas lidhjes me një antitrup
vihet në dukje prania e antitrupave të dëshiruar.

• Vënia në dukje e këtyre të fundit bëhet në sajë të lidhjes së antitrupit sekondar

me një enzimë që mund të shndërrojë një substrat pa ngjyrë në një substrat të
ngjyrosur.

• Ato klone qelizore që japin përgjigje pozitive, pra ku shfaqet substrati i

ngjyrosur, janë linjat hibride antitrup-prodhues të dëshiruara.
Shkrirja dhe përzgjedhja e hibridëve
për prodhimin e antitrupave
monoklonalë
• Qelizat dhe klonet pozitive transferohen në terren të freskët dhe rikalohen në
terren të ngurtë për të marrë në formën e kloneve të veçuara qelizat prodhuese
të antitrupave.

• Këto të fundit i nënështrohen një testimi sekondar për prodhimin e antitrupave

me anë të metodës imunologjike të përshkruar më sipër.

• Nëse me këtë rrugë izolohen më shumë se një klon ato testohen nga fakti nëse
prodhojnë antitrupa kundër të njëjtit epitope ose determinant antigjenik.

• Nëse janë klone të ndryshme ato mbahen në mënyrë të izoluar dhe mbahen
funksionalë me anë të kalimeve të vazhdueshme në terren të freskët ose me
anë të ngrirjes në azot të lëngët për t’i ruajtur për një kohë më të gjatë.
 Përdorimet

1. Përdoren për ndarjen dhe fitimin në gjendje të pastër të lëndëve të ndryshme

Interferoni i njeriut p.sh., është fituar në kulturë qelizore në përqëndrime rreth
30 000 njësi/ml kulturë.

• Antitrupi monoklonal specifik për interferonin lidhet kimikisht me një suport të

ngurtë të vendosur në një kolonë përmes së cilës kalohet kultura që përmban
interferonin, nga e cila janë larguar paraprakisht qelizat me anë të filtrimit.

• Molekulat e interferonit lidhen (kapen) nga antitrupat ndërsa të gjitha lëndët e

tjera që nuk njihen, ridalin nga kolona. Më pas kolona shpëlahet me solucione
që bëjnë të mundur shkëputjen e antigjen - antitrup.

• Në këtë mënyrë mund të imunizohet një organizëm me një përzierje antigjenesh

të ndryshëm dhe me anë të hibridomave mund të fitohen antitrupa në gjendje të
pastër.
2. Përdorimi i antitrupave monoklonalë për tipizimin qelizor

• Nuk kërkon paraprakisht izolimin në gjendje të pastër të një antigjeni

sipërfaqësor për prodhimin e tij.

• T-limfocitet u klasifikuan në disa lloje praktikisht në bazë të antigjenëve të

tyre sipërfaqësorë.

• E rëndësishme kur bëhet fjalë për transplantimin e organeve ku antigjenë të

caktuar përcaktojnë flakjen e organit.

• Antitrupat monoklonalë përbëjnë mjete shumë specifike për identifikimin e

antigjenëve specifikë tumoralë në melanomat, neuroblastomat, karcinomat
dhe leuçemitë.

• Mund të përdoren si molekula identifikuese për identifikimin e hershëm të

tumoreve ose për monitorimin e tyre specifik.
3. Përdorimi i antitrupave monoklonalë në diagnostikë dhe terapi.

• Përparësitë e përdorimit të antitrupave monoklonalë në diagnostikimin kanë të

bëjnë me faktin që ato mund të përsëriten në të njëjtat kushte dhe saktësia
analitike është më e lartë nga të gjitha metodat e tjera.

• Praktikë e zakonshme përdorimi i tyre për testin e shtatzanisë, në përcaktimin e

grupeve të gjakut dhe në analiza të tjera mjekësore

• Në diagnostikimin dhe në terapinë e tumorave. Janë përftuar antitrupa të tillë që

veprojnë me antigjene specifike të disa tumoreve humane, si p.sh. ata të
antimielomës, të antiadenokarcinomave gastrointestinale, etj.

• Mundësia e përdorimit të tyre në terapinë e tumoreve. Si të tillë, antitrupat mund

të përdoren të palidhur ose të lidhur me disa preparate antitumorale,
imunotoksinat.