KULTIVIMI DHE

IDENTIFIKIMI I AGJENSËVE
INFEKTIVË
 Fjalët kyçe
• Izolimi (kultura) • Testet biokimike (fiziologjike)
• pllakat e agarit • Testet molekulare
ADN-ADN homologjia
• kolonitë sekuentimi 16S ARNr
• terrenet e lëngëta - • Profilimi kimik
epruvetat • Metodat tjera të gjetjes së
mikrobeve
Polymerase chain reaction
• Identifikimi & (PCR)
taksonomia Aglutinimi (gjetja e
Familja antigjeneve)
Ngjyrosja
Gjinia Serologjia (gjetja e
Lloji antitrupave
Tipi
 Taksonomia
• Definon vetitë e përbashkëta ndërmjet
grupeve të ndryshme të baktereve

• Zakonisht gjenetike

• Mundëson zhvillimin e kiteve diagnostike

 Llojet vs nëntipet
- selektimi i cilësive dalluese
 Klasifikimi
Nëntipi (shtami): një izolat i vetëm ose
një linjë e vetme bakteresh
Tipi: grup i nëntipeve të përafërta
Lloji: tipe të përafërta
Gjinia: lloje të përafërta
Familja: gjini të përafërta
Identifikimi i agjensëve infektivë
në laboratorin e mikrobiologjisë

• Ndihmon mjekimin
• Ndihmon përzgjedhjen e antibiotikëve
• Laboratoret spitalore të përgjithsme
– Testet biokimike (fiziologjike)
• Laboratoret referente
– testet gjenetike
Hapat në izolimin dhe identifikimin e
baktereve

• Hapi 1. Mbjellja e mostrave në terrenet ushqyese

– kolonitë pas inkubimit(p.sh. 24 orë)

– madhësia, ndërtimi, ngjyra, hemoliza
– kërkesat për oksigjen
 Kultura në agar gjak

Bacillus cereus. Bacillus anthracis

CDC/Dr. James Feeley

Kolonitë e përziera
Figura 1 Kultura e Bacillus anthracis në pllakat e agar-
bikarbonatit dhe agar-gjakut. Kolonitë e lëmueshme në
bikarbonat (majtas) dhe kolonitë e thepisura në agar-
gjak (djathtas).
Hapi 1. Mostrat e pacientit (p.sh. gjaku, urina, lëngu
trunoshpinor etj.) kultivohen në pllakën me terren ushqyes.
Pas inkubimit prej një apo disa ditësh, mund të vërehen
koloni të veçuara të baktereve që mund të shihen me sy
(Figura 1). Secila koloni e përmban miliona qeliza
bakterore. Gjatë kësaj faze të identifikimit të baktereve
rëndësi shumë të madhe ka vrojtimi i këtyre kolonive për të
përcaktuar madhësinë, ndërtimin, ngjyrën si dhe hemolizën
(nëse rriten në agar gjak). Një faktor tjetër i rëndësishëm në
dallimin e mikroorganizmave është edhe kërkesa e tyre për
oksigjen.
 Izolimi dhe identifikimi

• Hapi 2. Ngjyrosja e kolonive

sipas Gramit
– vrojtimi mikroskopik i qelizave
bakterore
Figura 2.Procedura e ngjyrosjes sipas Grami

Hapi 2. Kolonitë ngjyrosen sipas Gramit dhe qelizat

individuale bakterore vrojtohen me mikroskop.
Gram negative Gram pozitive
Fiksimi/tharja

Ngjyrosja me kristal violet

Fiksimi me jod

Çngjyrimi me alkool

Ngjyrosja me safraninë
 Morfologjia e ngjyrosjes së Gramit
• forma
– koke (rreth)
– bacile (shkop)
– spirale ose të lakuar (p.sh. spirohetat)

• Qeliza të veçuara apo të bashkuara

– vile rrushi (p.sh. staphylococcus)
– varg (p.sh. streptococcus)

• Gram pozitive ose negative

 NGJYROSJA SIPAS GRAMIT
Kolonia e baktereve thahet në xham mikroskopik dhe më tej
procedohet si vijon (Figura 2 dhe 3):
Streptococcus mutans. Ngjyrosja
Bacillus brevis.
Ngjyrosja sipas sipas Gramit. Në pllakat e agar
gjakut vërehen forma sikur koke
Gramit.
pa radhitje vargore. Këto mikrobe
mund të shkaktojnë endokardit
subakut bakterial dhe karies
dental.
FIGURA 3. SHEMBUJ TË NGJYROSJES SIPAS GRAMIT
Streptococcus mutans.
Bacillus anthracis. Ngjyrosja sipas Gramit.
Ngjyrosja sipas Gramit Kultura nga tioglikolati.
Gjatë kultivimit në bujon
duken me formë
shkopthore në varg.
Mund të shkaktojnë
endokardit subakut
bakterial dhe karies
dental
-Hapi 1. Ngjyrosja me kristal violet. Bakteret marrin ngjyrë të
kaltër.
-Hapi 2. Fiksimi me jod. Kjo procedurë e stabilizon ngjyrën
kristal violete. Bakteret mbesin me ngjyrë të kaltër.
-Hapi 3. Ekstraksioni me alkool apo me ndonjë tretës tjetër.
Gjatë kësaj procedure disa baktere çngjyrosen (Gram
negativet), por disa të tjera mbajnë të njejtën ngjyrë (Gram
pozitivet).
-Hapi 4. Ngjyrosja me safraninë. Bakteret Gram pozitive
mbesin të kaltra, kurse bakteret Gram negative tashmë marrin
ngjyrën e kuqe të safraninës.-
Në vazhdim vrojtohen vetitë e baktereve me mikroskop. Pas
vrojtimit, shtrohen këto pyetje:
-A janë Gram-pozitive apo Gram-negative, bakteret e
vërejtura?
-Çfarë forme kanë ato - shkopthore, koke, spirale apo
pleomorfe (formë e ndryshueshme)?
-A janë të rradhitura veç e veç apo janë në çifte, vargje etj.?
-Çfarë madhësie kanë qelizat bakterore të vërejtura?
Përveç ngjyrosjes sipas Gramit, në praktikën laboratorike
mikrobiologjike ndonjëherë përdoren edhe ngjyrosje të tjera
(psh. ngjyrosja e sporeve dhe ajo e kapsulave).
-Në vazhdim të ecurisë së diagnozës mikrobiologjike, merret
një koloni tjetër e ngjashme e bakteres nga pllaka kultivuese
dhe ekzaminohet për veçoritë biokimike; p.sh., a i fermenton
sheqernat, siç është llaktoza?
-Në disa raste, bakteret identifikohen përmes antitrupave
komercialë që reagojnë me antigjenet e caktuar sipërfaqësor të
tyre (p.sh. përmes aglutinimit).
-Po ashtu, për diagnozën e infeksioneve bakterore, në përdorim
të gjerë janë edhe shumë teste komerciale molekulare.
 Hapi 3. Emërtimi i llojit të
bakteres së izoluar

• Kryesisht duke u bazuar në testet

biokimike (fiziologjike)

Hapi 3. Bakteret identifikohen duke shfrytëzuar

kolonitë e rritura në terrene kultivuese. Kjo procedurë,
shpesh kërkon edhe 24 orë shtesë të rritjes.
Tavolina tipike e laboratorit
mikrobiologjik
 Hapi 4.
Antibiogrami
 Testimi i antibiogramit
I ndjeshëm(sensitiv) Rezistent

Kolonitë
bakterore

rritja
S'ka
rritje

Disku me antibiotikë
KARAKTERIZIMI TAKSONOMIK I
BAKTEREVE

-Edhe përbrenda vetë llojeve bakterore ekziston një

ndryshueshmëri e konsiderueshme.
-Prandaj, krahasimi i llojeve bakterore përfshin
krahasimin e shumë nëntipeve për secilin lloj.
-Këto krahasime bazohen kryesisht në analizat kimike
dhe molekulare.
 ANALIZAT KIMIKE

Për studimin e strukturës së baktereve janë në

dispozicion pajisje të sofistikuara, që kryesisht
mundësojnë profilimin e acideve të ngopura,
karbohidrateve ose profilimin ubikuitar (të
gjithanshëm).
- Në taksonominë e baktereve, ndihmesë mund të
ofrojë edhe karakterizimi i prodhimeve të
sekretuara të metabolizmit (psh. alkoolet e
avullueshme dhe acidet yndyrore me vargje të
shkurtëra).
Identifikimi molekular
• Gjenomika

• Karakterizimi i gjeneve
– Sekuencimi
– PCR

• Hibridizimi

• % guaninë + citozinë
-Do të ishte ideale sikur të krahasoheshin sekuencat e tërë ADN-së
kromozomale të baktereve.
-Por, kjo metodologji nuk është praktike, sepse për secilin nëntip të
baktereve do të duhej bërë sekuentimi i miliona nukleotideve.
-Gjatë disa viteve të fundit është arritur sekuentimi i tërë gjenomit të
ndonjërit përfaqësues (psh. një nëntipi) të disa llojeve bakterore.
-Kjo procedurë kërkon një punë voluminoze nga ana e shumë
grupeve kërkimore të dedikuara vetëm për sekuentim.
-Në të kaluarën, ngjashmëria gjenomike ndërmjet baktereve është
vlerësuar përmes raportit të përmbajtjes së guaninës (G) plus
citozinës (C), e cila zakonisht është shprehur si përqindje (%GC).
-Sot, zbatohen dy alternativa të tjera: hibridizimi dhe sekuentimi (më
së shpeshti për gjenin që kodon ARNr 16S).
 Sekuencimi i 16S ARNr

• Dallon llojet bakterore

• Zhvillimi i testeve klinike të bazuara
në sekuenca gjenetike (p.sh. PCR)
• (reaksioni zingjiror i polimerazes)
 Real-time PCR
ds ADN
Cikli 1
Ngjyra

Cikli 2

Cikli 30
2 30
 Hibridizimi ADN-ADN
Shtami 1

nxehtësia

+ Shtami 2

0% Homologji Homologji 100%

-Për të krahasuar afërsinë gjenetike të nëntipeve të
ndryshme të baktereve përdoret teknika e ADN-ADN
homologjisë-d.m.th. me çfarë përputhshmërie dy shtame të
ADN-së nga bakteret e ndryshme lidhen-hibridizohen së
bashku.
-Nëse ADN-ja nga dy nëntipet bakterore tregon shkallë të
lartë të homologjisë (d.m.th. vargjet lidhen mirë), atëherë
konsiderohet se këto nëntipe i përkasin të njejtit lloj të
baktereve.
-ADN-ja e llojeve të ndryshme bakterore nuk tregon
homologji të strukturës gjenetike.
-Gjatë viteve të fundit, sekuentimi i molekulave ribosomale
të 16S ARNr është bërë “standard i artë” në taksonominë e
baktereve.
-Kjo molekulë përafërsisht posedon 1600 nukleotide në
varg. Sekuentimi i 16S ARNr jep përgjigje në vlerësimin e
ngjashmërisë së gjenomeve mbi nivel të llojeve duke lejuar
krahasimin e afërsisë përgjatë tërë mbretërisë së baktereve.
-Llojet e afërta bakterore shpesh kanë sekuenca identike të
ARNr. Kjo teknikë ofron një informatë komplementare të
hibridizimit ADN-ADN.
-Në laboratorin e mikrobiologjisë klinike, përcaktimi i
sekuencës së gjeneve 16S ARNr dhe regjioneve të tjera
gjenetike përdoret për identifikimin e nëntipeve të
baktereve.
 Profilet
• Acidet e ngopura
- strukturore (p.sh. membrana qelizore)
- acidet e ngopura me vargje të gjata
- gjatësia e vargjeve

• Proteinat (proteomika)
• Profili metabolik
– avullueshmëria
* alkoolet
* acidet e ngopura me vargje të
shkurta
Diagnoza e shpejtë pa kultivim
në terrene ushqyese

• KUR DHE PSE?

• Rriten shumë pak

• Nuk rriten fare në terrene
ushqyese
-Disa mikrobe patogjene që prekin njeriun (përfshirë shkaktarët e
tuberkulozit, sëmundjes së Llajmit dhe sifilisit) nuk mund të rriten
fare në terrene ushqyese ose rriten në sasi të pamjaftueshme.
-Veçimi i këtyre mikroorganizmave është i ngadalshëm, madje
nganjëherë edhe i pamundshëm.
- Megjithatë, në praktikën laboratorike ekziston mundësia e zbulimit
të baktereve nga mostrat klinike, pa i kultivuar ato fare në terrene
ushqyese.
-Një shembull i diagnozës së shpejtë, që përdoret në shumë
ordinanca mjekësore është zbulimi i antigjeneve të streptokokut
hemolitik të grupit A. Kjo realizohet duke marrë strisho nga gryka e
pacientit dhe duke nxjerrë drejtpërdrejt nga mostra antigjenin
streptokoksik (pa e kultivuar paraprakisht në terren ushqyes).
-Antigjeni bakteror zbulohet përmes fenomenit të përngjitjes
(aglutinimit) së antigjenit me antitrupat e lidhur në kokërrzat
komerciale të lateksit.
 Testi i shpejtë “Strep”
Ekstrakti i antigjenit
streptokoksik
Antitrupi

Grimcat latex
Sekuencat bakterore të ADN-së të
amplifikuara drejtpërdrejt nga
lëngjet trupore

• polymerase chain reaction (PCR)

• sukses i dalluar në diagnozën e

tuberkulozit.
Mikroskopi
• lëngu trunoshpinor
(meningjiti)

• këlbaza
(tuberkulozi)

• sensitivitet i ulët
-Sekuencat e ADN-së së njeriut mund të amplifikohen drejtpërdrejt
nga lëngjet trupore të pacientit ( reaksioni zingjiror i polimerazës,
PCR). Me këtë metodë mund të krijohen dhe veçohen sasi të mëdha
të gjeneve specifike apo të pjesëve të tyre.
-Një qasje e tillë ka gjetur përdorim të madh në diagnozën e shpejtë
të tuberkulozit.
-Ndihmesë diagnostike në laboratorin e mikrobiologjisë mund të
ofrojë edhe vrojtimi i drejtpërdrejtë mikroskopik i disa mostrave
klinike të pacientit për praninë eventuale të baktereve – p.sh.
vrojtimi mikroskopik i M.tuberculosis në këlbazë (baciloskopia).
Identifikimi serologjik
• përgjigja e organizmit duke prodhuar
antitrupa ndaj agjensit infektiv

• disa javë pasi të shfaqet infeksioni

-Në diagnozën e infeksioneve mikrobike përdoren
edhe testet serologjike.
- Identifikimi i përgjigjes me antitrupa ndaj agjensit
infektiv në serumin e pacientit mund të jetë i
suksesshëm disa javë pas shfaqjes së infeksionit.
Dr.sci. Islam Zeqiri

45