IMUNOFLUORESHENCA

Coons, përshkroi në 1941 një teknikë që lejon me anë të konjugimit të një ngjyrosësi
fluoreshent në antitrupat të bëjë të dukshëm komplekset imune në mikroskop me rreze ultraviolet.
Në të vërtetë ky fiksim i një molekule fluoreshente mbi imunoglobulinat nuk prek veçoritë e tyre
imunologjike dhe veçanërisht aftësinë e tyre për bashkëveprim specifik me antigjenin.

Mund të përdoren shumë ngjyrosës fluoreshentë (ose fluorokrome); ngjyra që ata lëshojnë
duhet të jetë e ndryshme nga fluoreshenca ngjyrë blu që lëshohet në mënyrë natyrore nga indet.
Derivatet e fluoreshencës prodhojnë një rrezatim të ngjyrës së gjelbër, por në vend të izocianatit
të përdorur fillimisht nga Coons, preferohet izotiocianati. Derivatet e rodaminës (lisaminë dhe
rodamina B veçanërisht) japin një fluoreshencë ngjyrë portokalli. Përsa u përket D.A.N.S. (acidi
dimetil-amino-naftalen-sulfonik) ai jep një fluoreshencë të gjelbër por është pak i përdorur.

Konjugimi me antitrupat duhet të bëhet në prani të një teprice të moderuar fluorokromi. Ai

ka nevojë për një kohë kontakti të zgjatur: 18 orë të paktën në +4°C në pH alkalin (9 - 9.4). Teprica
e ngjyrosësit të pakonjuguar eliminohet më vonë, për shembull me absorbim në pluhur karboni
vegjetal, me dializë të zgjatur, ose me filtrim mbi xhel të sefadeksit.

Tre metoda mund të përdoren. Në çdo rast reaktivet e ndryshme lihen në kontakt gjatë 30
min; midis çdo etape larjet e kujdesshme eliminojnë të gjitha substancat e pafiksuara në reaksion
imunologjik.

Leximi bëhet me ndihmën e një mikroskopi të pajisur për fluoreshencë. Sistemi zotëron
një burim rrezesh ultraviolet; kjo dritë kalon nëpërmjet filtrave të quajtur filtra të eksitimit që lënë
të depërtojnë vetëm rrezet e gjatësisë së valës të afta të nxisin fluorokromin e përdorur. Rrezatimi
që lëshohet nga antitrupi fluoreshent kalon më pas nëpër një filtër i quajtur filtri i ndalesës që
ndalon rrezatimet parazite.

Metoda direkte

Me këtë metodë antitrupi korrespondues fluoreshent fiksohet drejtpërdrejt mbi antigjenin

që studiohet. Kjo metodë ka nevojë për konjugimin e antiserumit specifik për çdo antigjen, gjë që
kufizon zbatimet e saj. Megjithëkëtë ajo përdoret shpesh për kërkimin e depozitimeve të
imunoglobulinave, të komplementit ose të fibrinës në biopsi indore (lëkurë, veshkë). Ajo përdoret
gjithashtu për tipizimin imunologjik të qelizave (psh. limfociteve) me anë të antitrupave
monoklonalë të konjuguar me lëndë fluoreshente.
 Metoda e quajtur "sandwich"

Ajo shtron të njëjtin problem si metoda e drejtpërdrejtë. Me anën e saj vihen në dukje
antitrupa intraindorë. Mbi indin e studiuar vihet në veprim në fillim një tretësirë e antigjenit,
shtohet pastaj antitrupi specifik i bërë fluoreshent.

Metoda indirekte

Ajo përdoret sidomos për kërkimin e antitrupave të ndryshëm në një lëng biologjik si psh.
serum. Ajo nuk ka mungesa të teknikave të mësipërme si dhe ka një ndjeshmëri më të lartë. Pasi
të jetë vënë në bashkëveprim reaktivi që luan rolin e antigjenit (prerje indore ose strisho qelizore)
dhe serumi që duhet të testohet dhe supozohet se përmban antitrupat korrespondues, vendoset
anti-imunoglobulina humane fluoreshente e cila bashkëvepron me antitrupat e fiksuar. Pas çdo
faze inkubimi që zgjat secila 30 minuta, bëhen shplarje të bollshme për të larguar antitrupat e pa
fiksuar. Në qoftë se rezultati është pozitiv dmth. në serumin e studiuar ishin të pranishëm antitrupat
e kërkuar do të kemi fluoreshencë pozitive indore (në vend të fushës së errët në mikroskop do të
kemi imazh të ndritshëm, fluoreshent të strukturave indore të interesuara).

Anti-imunoglobulinat vijnë nga një serum i përftuar pas imunizimit në kafshë (zakonisht
lepur, dele ose dhi) me imunoglobulina me origjinë njerëzore. Pas konjugimit me fluorokrom
fitohet një reaktiv që mund të përdoret për reaksione të shumta (për kërkimin e çdo lloj antitrupi
human). Reaksioni mund të bëhet gjysmë sasior dhe titri i serumit të testuar shprehet nga emëruesi
i hollimit më të madh që jep akoma një fluoreshencë pozitive. Kjo metodë ka një përdorim të gjerë
për kerkimin e autoantitrupave të ndryshëm si antitrupat antibërthamore (AAB) apo antitrupat anti
ADN(AAADN) në lupusin eritematoz, antitrupat anti mitokondri në cirrozën biliare primitive,
antitrupat antimuskuj të lëmuar në hepatitin autoimun, antitrupat anti qeliza parietale të stomakut
në gastritin autoimun etj. Për këto qëllime, si burim autoantigjeni, përdoren prerje disamikronëshe
(4 deri 6 mikron) të organeve përkatës që ruhen në gjendje të ngrirë. Psh. për antitrupat
antibërthamorë përdoren prerjet e melçisë së miut apo dhe qelizat Hep-2, për antitrupat
antitiroidienë përdoren prerje të tiroides etj.

Kjo metodë përdoret gjerësisht dhe për zbulimin e antitrupave ndaj shumë agjentëve
bakterialë, parazitarë apo viralë (në rastin e këtyre të fundit përdoren qeliza humane të infektuara
nga virusi pra që shprehin edhe Antigjenët virale). Duke përdorur antitrupa fluoreshente specifike
për klasa të ndryshme imunoglobulinash (anti-IgG, anti IgM ose anti IgA) kjo metodë na lejon
edhe përcaktimin se kujt klase i përkasin antitrupat që na interesojnë. Kjo ka vlerë të veçantë
diagnostike, psh. prania e antitrupave të klasës IgM flet për një infeksion të freskët, ndërsa vetëm
e atyre të klasës IgG për një infeksion më të largët dhe përfaqëson më tepër praninë e një kujtese
imunitare ndaj një infeksioni të caktuar. Ndërsa prania e antitrupave të klasës IgA përfaqëson më
tepër një reaksion imunitar (autoimun apo infeksioz) që ndodh në mukozat e ndryshme.
Fig. 36.15. Imunofluoreshenca direkte.
Fig. 36.16. Imunofluoreshenca indirekte në studimin e antitrupave antibërthamorë.