TEKNIKAT RADIOIMUNOLOGJIKE

Në metodën me dozim me kompeticion në fazë të lëngët në mënyrë skematike janë të

pranishme tre reaktivë:

Një antigjen për shembull hormon i shënjuar me një izotop radioaktiv;

Një antiserum specifik (që përmban antitrupa antihormone) i titruar, i cili përgatitet me anën e
hiperimunizimit të kafshëve të një specie tjetër;

Lëngu biologjik në të cilin kërkohet të përcaktohet sasia e antigjenit (në shembullin e zgjedhur
hormoni jo i shënjuar ose "i ftohtë").

Antiserumi mund të kombinohet pa dallim me hormonin radioaktiv ose me atë jo të

shënjuar që përmbahet në serumin që shqyrtohet. Kur hormoni i shënjuar është vetëm i pranishëm
përcaktohet në fillim se çfarë sasie kapet nga antiserumi.

Më tej matet niveli i kapjes së hormonit radioaktiv nga antiserumi kur ky i fundit vihet në
prani të një përzierjeje hormoni të shënjuar dhe hormoni të pashënjuar. Sa më e madhe të jetë sasia
e këtij të fundit aq më pak hormon radioaktiv kapet nga antitrupi. Hartohet atëhere një kurbë
standart, në prani të përzierjeve të përbëra nga një sasi konstante të hormonit të shënjuar të cilit i
shtohen doza të njohura dhe në rritje të hormonit "të ftohtë". Niveli i hormonit të pranishëm në
lëngun biologjik përcaktohet duke e kalkuluar rezultatin e fituar mbi kurbën e referencës.

Variantet teknike

Ndërsa parimi bazë mbetet gjithnjë po ai, ekzistojnë disa variante teknike në lidhje me
metodën që u përshkrua për herë të parë për insulinën nga Yalow dhe Berson më 1960.

Kjo metodë është realizuar në fazë të lëngshme (dozimi radioimunologjik i mirëfilltë ose
radio-imuno-analizë), ndërkohë që shumica e testeve në ditët e sotme bëhen në fazë të ngurtë, duke
qenë njëri nga reaktivët i fiksuar mbi një suport (fundi i gropëzave të një pllake mikrotitrimi,
grimca lateksi ose disqe të celulozës). Për shembull, radio-imuno-sorbent-test (RIST) i përdorur
për dozimin e IgE (totale) ku janë antitrupat anti IgE që janë fiksuar mbi suportin e ngurtë.

Zbatime

Për shkak të ndjeshmërisë së tyre të madhe, meqenëse ato lejojnë të zbulohen sasira të
rendit të nanogramit për mililitër, këto metoda kanë zbatime të shumta. Ato mund të përdoren për
dozimin e çfarëdolloj antigjeni: medikamente, vitamina, prostaglandina, leukotriene, IgE totale
dhe sidomos hormonet. Megjithëse realizimi i këtyre metodave është delikat ato tani kanë hyrë në
praktikën e zakonshme.
 IMUNORADIOMETRIA

Kjo metodë u realizua më 1968 nga Hales dhe Miles. Ajo përdoret shumë, veçanërisht
kur nuk mund të realizohet shënimi i antigjenit. Ajo praktikohet kryesisht në fazë të ngurtë dhe
në fakt nuk është gjë tjetër veçse një metodë “sandwich” tipike për përcaktimin e antigjenit.
Antitrupi që i përgjigjet antigjenit që duhet dozuar vihet në fillim për t'u inkubuar në një gropëz
polistireni. Pas shplarjes, shtohen antigjenët që duhen studiuar të cilët kombinohen me antitrupin.
Pas një shplarjeje të re shtohet një tepricë antitrupi specifik i shënuar. Matet pastaj radioaktiviteti:
ai është proporcional me përqëndrimin e antigjenit. IgE totale, disa shënues tumoralë dhe viralë
(HBs, anti HBs, HBe) dhe mjaft antigjenë të tjerë dozohen me këtë teknikë.

TEKNIKA ME SHËNJUES FLUORESHENTË

Shumë metoda mund të përdoren. Vetëm dy shembuj janë të përmbledhur këtu:

Mundësia e parë përdor ekstinsionin (shuarjen) e fluoreshencës që pason një rregullim të

strukturës elektronike molekulare, që vihet re kur një antitrup kombinohet me një antigjen të lidhur
paraprakisht me lëndë fluoreshente. Ashtu si në teknikat radioimunologjike, antitrupi mund të
lidhet pa dallim me një antigjen fluoreshent ose me një antigjen jo të shënuar që përmbahet në
lëngun që duhet të shqyrtohet. Sa më i lartë të jetë përqëndrimi në antigjenin jo fluoreshent aq më
pak formohet kompleksi antitrup-antigjen fluoreshent dhe aq më shumë pakësohet fluoreshenca.
Krijohet kështu një kurbë standart me kontroll pozitiv të njohur dhe nuk mbetet veçse të kalohen
mbi të rezultatet e fituara me lëngje biologjike të panjohur.

Mundësia tjetër është quajtur e mbrojtjes të fluoreshencës. Në qoftë se vihen në prani një
antigjen i shënuar me një substancë fluoreshente dhe një antitrup korrespondues, fitohet një
kompleks fluoreshent. Nga ana tjetër kur ky antigjen fluoreshent është i përzjerë me një antitrup
të drejtuar kundër substancës fluoreshente formon një kompleks jo fluoreshent. Në qoftë se më në
fund realizohet një përzierje ku vihen së bashku antigjeni jo i shënjuar, antigjeni fluoreshent dhe
antitrupi korrespondues, ndodh një garë midis këtyre dy Antigjenëve në mënyrë që sa më i lartë
është përqëndrimi i antigjenit jo të shënjuar, aq më tepër mbetet antigjen fluoreshent i lirë, i
pakombinuar me antitrupin dhe pra i aftë të bashkohet më vonë me antitrupin e drejtuar kundër
substancës fluoreshente që shtohet më vonë.
 TEKNIKAT ME SHËNJUES ENZIMATIKË

Dozimi i antigjenëve

Njëra nga më të përdorurat është një metodë imunoenzimatike e drejtpërdrejtë me

kompeticion apo dhe sandwich (Enzyme Linked Immunoabsorbant Assays ose ELISA). Edhe
këtu, parimi është po ai si në teknikat radioimunologjike. Antitrupi këtu është i palëvizshëm, i
fiksuar në një suport të ngurtë (për shembull faqja e epruvetës, grimcat plastike). Ai do të reagojë
me: nga njëra anë një antigjen i shënjuar me një enzimë (peroxidazë, fosfatazë alkaline,
betagalaktosidazë); nga ana tjetër me një antigjen jo i shënjuar i pranishëm në një lëng biologjik.
Sa më e lartë të jetë sasia e këtij reaktivi të fundit aq më pak i rëndësishëm është formimi i
kompleksit midis antitrupave dhe Antigjenëve të shënjuar. Pasi hartohet kurba standart me
solucione kontrolli (antigjen të njohur), mund të përcaktohet më tej sasia e antigjenit (veçanërisht
hormone) që përmbahet në lëngun e panjohur.

Një teknikë tjetër e zbatueshme ndaj molekulave të vogla (barna, hormone steroid,
tyroksina) mbështetet në matjen e ndryshimeve të veprimtarisë enzimatike (glukozë 6-fosfat
dehidrogenazë, malikodeshidrogenaze), sipas rastit që antigjeni i shënuar me enzimë është i lirë
ose i kombinuar me antitrupin e tij. Ky është parimi i reaksioneve të tipit EMIT (Enzyme
Multiplied Immunoassay) që realizohet në mjedis të lëngët.

Metoda të tjera të quajtura "sandwich" nuk përdorin fenomenet e konkurimit. Për

shembull, antigjeni që duhet të përcaktohet inkubohet në fillim me një sasi të caktuar të antitrupit
korrespondues të fiksuar në një suport. Pastaj vihet në veprim një antitrup i shënuar me një enzimë
dhe që vjen e fiksohet mbi hapësirat e antigjenit të lëna të lira gjatë reaksionit të mëparshëm.
Veprimtaria enzimatike e fiksuar në këtë mënyrë mbi kompleksin është drejtpërdrejtë funksion i
sasisë së antigjenit.

Dozimi i antitrupave

Parimi është po ai si dhe për dozimin e antigjenëve. Antigjeni është i fiksuar mbi suportin
e ngurtë. Shtohet pastaj mjedisi biologjik që përmban antitrupat që duhen dozuar, pastaj një anti-
imunoglobulinë e shënuar nga një enzimë (fosfatazë ose peroksidazë) dhe më në fund një reagent
kromogjen që do të ndryshojë ngjyrën për të kaluar nga pa ngjyrë në ngjyrën e verdhë me
fosfatazën alkaline dhe në ngjyrën blu me peroksidazën. Çdo etapë shoqërohet me një kohë
inkubimi dhe mjaft shplarje. Shumica e antitrupave me rëndësi diagnostike në sëmundjet infektive
si antitrupat anti-HIV, anti –HbsAg, anti –HCV apo autoantitrupat e sëmundjet autoimune etj.
maten sot pikërisht me këto metoda ELISA.

Teknika të tjera

Metodat e imunotransferimit ose "Western blot" të quajtura edhe imunoprint ose

imunoblot kryhen në tri etapa. E para ka të bëjë me një elektroforezë në xhel të poliakrilamidit të
përzierjes antigjenike. Kjo ndiqet nga një elektro-transferim mbi nitrocelulozë (nën veprimin e një
fushe elektrike) dhe një zbulim imunoenzimatik të reaksionit antigjen-antitrup. Këto metoda të
shumta përdoren veçanërisht për vënien në dukje të antitrupave anti-HIV por gjithashtu dhe për
karakterizimin e imunoglobulinave monoklonale ose të disa antitrupave antibërthamorë, ose në
diagnostikimin e disa sëmundjeve infektive.

Përdorimi i shënjuesve të ndryshëm në metodat me shënjues:

- Në metodat radioimunologjike (RIA – radioimmuoassay) si shënjues radioaktiv

përdoret kryesisht J125 që ka një ndjeshmëri mjaft të mirë por një gjysëm jetë të shkurtër (60 ditë)
si dhe përbën rrezik ndotje radioaktive të ambjentit. Për këto arsye metodat radioimuologjike
(RIA) po zëvendësohen gjithnjë e më shumë me metoda të tjera po aq të ndjeshme por më të
“pastra” për ambjentin dhe me një qëndrueshmëri shumë më të lartë:

-Metodat imunoenzimologjike (EIA). Kur këto metoda përdoren në fazë të ngurtë quhen
dhe ELISA (enzyme-linked-immunosorbent assay). Enzimat që përdoren më shpesh janë
peroxidaza dhe fosfataza alkaline . Pas shtimit të substratit specifik ndodh zhvillimi i një ngjyre
që matet me fotometri.

-Shënjimi me lëndë fluoreshente. Fillimisht ky shënjim u përdor për imunofluoreshencë

indore, direkte apo direkte me anë të mikroskopit me fluoreshencë në substrate biologjike si inde,
qeliza, bakteree, parazitë. Shënjuesit më shpesh të përdorur janë FITC (izotiocianati i
fluorosceinës si dhe rodamina). Sot shënues fluoreshentë të tjerë të quajtur fluorofore po përdoren
gjithmonë e më tepër për teknika të ngjashme nga ndjeshmëria me metodat RIA. Këto metoda
quhen edhe FIA (metoda imunofluoreshente). Fluoroforet janë molekula që absorbojnë energji
dhe e rrezatojnë rishtas atë në një gjatësi vale me ndryshim 30-50 nm. Një shënjues i tillë i përdorur
shpesh është 4-Methylumbelliferonphosphat, i cili nëpërmjet fosfatazës alkaline defosforilohet në
fluoroforin 4-Methylumbelliferon.

- Shënimi me lëndë lumineshente. në metodat lumineshente (LIA) antigjeni ose antitrupi

shënohen me një substancë lumineshente. Këto janë molekula që pas një nxitje me energji
emetojnë një rrezatim.

Të tilla kemi substanca kemilumineshente që nëpërmjet një oksidimi kimik rrezatojnë dritë
si p.sh. Luminoli apo esteri i Akridines. Për nisjen e reaksionit të kemilumineshencës nevojiten
katalizatorë si psh. peroksidaza. Në biolumineshencë drita emetohet nëpërmjet një sistemi
lumineshent që e çliron një sistem enzimatik si psh. sistemi Luciferin-Luciferaze.