FAKULTETI I INFERMIERISE DEPARTAMENTI I DIAGNOSTIKES DHE REHABILITIMIT DEGA: TEKNIK -LABORATORI

TEMA:

REAKSIONET E PRECIPITIMIT KAPITULLI 8

1) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

PERMBAJTJA

1. Bashkeveprimi

Ag At

1.1 Afriniteti 1.2 Aviditeti 1.3 Ekuilibri Dinamik 2. Kurba e Precipitimit 2.1 Zona e ekuivalences 2.2 Parazona dhe Postzona 3. Matja e precipitimit nga shperhapja e drites 3.1 Turbidimetria 3.2 Nefelometria 4. Teknikat Imunodifuzionit Pasiv
4.1 Imunodifuzioni Radial

4.2 Penetrimi i dyfishte Oucterlony

5. Teknikat e Elektroforezes 5.1 Imunoelektroforeza ne forme rakete 5.2 Imunoelektroforeza 5.3 Imunofiksim 5.4 Kerkimet e gabimeve ne Elektroforeze 6. Krahasimi i Teknikave te Precipitimit 7. Referencat

2) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

Hyrja

Bashkeveprimi i nje antigjeni specific me nje antitrup specific luajne nje role te rendesishem ne diagnostikimin e semundjeve te ndryshme. Analizat imunologjike bazohen ne detektimin e nje antitrupi ose antigjeni qe variojne nga testet manuale te thjeshta, analizuese deri tek teste me te komplikuara te automatizuara. Shume analiza bazohen ne principin e aglutinimit dhe precipitimit. Ne kete kapitull do te fokusohemi ne reaksionet e precipitimit. Per here te pare precipitimi eshte folur nga Kraus i cili gjeti nje filtrat kulture te E.Coli qe formonte precipitim kur biente ne kontakt me nje antitrup specific. Reaksione te tilla zhvillohen kur te dy si antigjeni dhe antitrupi kane zona lidhese per njeri tjetrin kur perqendrimi i tyre eshte i barabarte,pra sa antitrupa te kemi aq duhet te kemi dhe antigjen. Karakteristikat e lidhjes se antitrupit quhen afriniteti dhe afiditeti qe luajne nje rol te rendesishem ne analizat imune.

3) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

1) BASHKEVEPRIMI ANTIGJEN ANTITRUP 1.1) Afriniteti Afriniteti eshte forca terheqese qe ekziston midis nje zone te vetme te Fab qe ndodhet ne molekulen e antitrupit me nje epitop te vetem ose zones fundore te antigjenit, pra e thene ndryshe, afriniteti eshte forca terheqese qe ekziston midis nje antitrupi dhe nje antigjeni. Mirepo bashkeveprimi antigjen me antitrup nuk mund te lidhen bashke ne qofte se nuk ekzistojne disa forca terheqese qe i mbajne te lidhura .

Lidhja ndermolekulare

Antigjenet determinant stimulohen nga antigjenet me afri te larte

Antigjeni me reaktivitet te kryqezuar nuk kane afrinitet te larte

Figura 8: Afriniteti dhe Aviditeti.A) Afriniteti eshte bashkeveprimi i nje Ag me nje At.Stimulimi i Ag origjinal eshte me i forte se i nje Ag hibrid. B) Aviditeti eshte shuma e te gjitha forcave terheqese qe ekzistojne mes nje Ag dhe At.

Keto forca jane disa:

4) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

a) Lidhjet e hekurit qe formohen perballe nje grimce te ngarkuar

b) Lidhjet hidrogjenore e cila eshte nje lidhje ndermolekulare e realizuar ne raste tipike

ndermjet molekulave HF me njera tjetren, H2O me njera tjetren mund te mendohet qe lidhje hidrogjenore seshte gje tjeter vecse lidhje elektrostatike dipol-dipol ( ku skajet e dipoleve me ngarkesa te kunderta terheqin njera tjeten).
c) Forcat e Van Der Valsit tregohen te gjitha forcat qe veprojne ndermjet molekulave

asnjanese dhe qe sjane lidhje hidrogjenore. Keto forca perfshijne dy kategori te medha: terheqje dipole-dipol dhe forcat e Londonit. Por ama qe keto forca te ekzistojne duhet me patjeter qe largesia nuk duhet te jete ne distance me te larget se 1x10-7 mm, ne kete menyre qe antigjeni me antirupin te lidhen ne menyre komplementare. Fuqia e lidhjes midis nje antitrupi me antigjeni varet nga specifiteti qe ka ky antitrup per ate antigjen. Nje antitrup ka aftesi per tu lidhur me me shume se nje antigjen por ajo qe vendoset se me cilin antigjen duhet lidhur, eshte epitopi i cili eshte specific vetem per nje antigjen qe lidhet ne menyre komplementare me nje antitrup, pra nje antitrup lidhet ne menyre komplementare me nje antigjen ne menyre te tille si brava me celesin. Disa antitrupa jane te afte te bashkeveprojne me antigjen te cilet jane te ngjashem strukturalisht me antigjenet e vertete. Ky bashkeveprim quhet reaktivitet i kryqezuar.(Hibridizim) 1.2) Aviditeti Aviditeti paraqet shumen e te gjithe forcave qe ekzistojne midis antigjenit dhe antitrupit, kjo tregon nje fuqi te madhe qe ekziston mes lidhjeve te antitrupit me antigjenin multivalent qe formojne nje kompleks me stabilitet te plote. E thene ndryshe lidhja ndodh, kur forcat terheqese arrin te mbaje komplekset antigjen-antitrup se bashku. Stabiliteti i kompleksit te formuar antigjen-antitrup eshte shume thelbesore per te detektuar te panjohuren, qe mund te jete antigjen ose antitrup qe perdoren ne diagnostikimin e shume semundjeve te ndryshme. 1.3) Ekuilibri dinamik: (Low of mass action) Te gjitha bashkeveprimet antigjen antitrup formojne reaksione te prapesueshme qe njihet me emrin ekuilibri dinamik. Ky ligj qendron ne vetin qe reaktantet jane ne ekuiliber me produktet perfundimtare. Konstantja e ekuilibrit paraqet raportin e produkteve perfundimtare qe ne rastin tone eshte kompleksi antigjen antitrup me prodhimin e reaktanteve qe jane perqendrimi i antigjenit me perqendrimin e antitrupit ne fuqi perkatese qe ne rastin tone eshte nje. Ag-antigjen Ab-antitrup k1- konstantja e reaksionit te drejte ( qe con ne formimin e produkteve ) k2- konstanja e reaksiont te zhdrejte ( qe con ne shperbashkimin e produktit perfundimtar )
5) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

[AgAt]= eshte perqendrimi i komplekseve AgAt [Ag] = perqendrimi i Ag ( mol/l) [At] = perqendrimi i At (mol/l) Kjo konstante varet nga fuqia e lidhjes se antigjenit me antitrup. Ne rast se njeri nga perqendrimet te antigjenit ulen, kahu i zhvillimit te reaksionit zhvendoset ne drejtimin qe kundershton ndryshimin e bere ( parimi Le Shatilie ). Ne laboratoret klinik kushtet ideale qe duhet te kete antitrupi jane: afrinitet te larte nje force fillestare terheqese aviditet te larte lidhje te fuqishme

Kur vlera e konstantes se ekuilibrit eshte e larte tregon qe nje sasi e madhe e kompleksit antigjen antitrup eshte shume e dukshme ose detektohet lehtesisht nga ky bashkeveprim.

2) KURBA E PRECIPITIMIT 2.1) Zona e ekuivalences Precipitimi varet nga perqendrimet relative te antitrupit me antigjenin. Precipitimi optimal ndodh vetem ne zonen e ekuivalences qe do te thote perqendrimi i antitrupit eshte i barabarte me perqendrimin e antigjenit. Pra ne kete zone, precipitimi vjen si rezultat i reaksioneve te prapsueshme ku cdo antitrup lidhet me me shume se nje antigjen dhe ansjelltas, duke formuar nje rrjet te qendrueshme ( Lattice ). Hipoteza e kesaj rrjete eshte formuluar nga Marrac, ku ky ligj bazohet se cdo antitrup ka si perfundim vetem dy vende lidhese ndersa antigjeni eshte multivalent. Hejdelberger dhe Kendall jane themeluesit e reaksionit klasik te precipitimit. Kurba e precipitimit ka tre zona:

6) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

Parazone C i kompleks it AgAt

Rritja e perqendrimit te antigjenit Perqendrimi i antitrupit eshte konstant

antitrup

Antigjen i tretshem

Figura 8.2 Kurba e precipitimit.Kurba e precipitimit shfaq se si sasia e precipitatit ne ndryshim te perqendrimit te Ag perqendrimin e At konstant. 2.2) Parazona dhe Post zona
-

ndryshon duke mbajtur

Parazona eshte hapesira me teprice antitrupash. Pikerisht kjo tregon se ndryshimi i sasise se antigjenit ndikon ne precipitim. Kur perqendrimi i antigjenit eshte i vogel dhe antitrupat jane me teprice, kjo tregon se sasia e komplekseve qe formohen eshte shume e paket. Megjithate ne supernatant mund te mbetet sasi reziduale antitrupash pas centrifugimit te perzierjes. Me shtimin e sasise se antigjenit formohen agregat te medhenj qe do te thote se kemi precipitim. Pikerishte kjo quhet zona e ekuivalences. Ne kete zone ne supernatant nuk ka as antigjen as antitrupa te pa lidhura. Post zone - quajme ate zone ku me shtimin e sasise se antigjenit , madhesia e agregateve zvogelohet per precipitim. Prandaj ne vend qe ai te arrij platen, kemba zbret poshte.

Fenomenet parazone dhe post zone duhen te merren ne konsiderate ne rastet klinike, sepse reaksionet fals-negative ndodhin ne te dy fenomenet. Nje reaksion fals (-) merret ne parazone ku perqendrimi i antitrupit eshte me teprice, ne kete raste duhet te bejme hollim duke shtuar antigjen ne menyre te tille qe te marrim rezultatin e duhur. Nje reaksion fals (-) merret edhe ne poste zone, ku teprica e antigjenit fsheh prezencen e nje numri te vogel antitrupash. Ne keto raste testi perseritet pas nje jave. Ruhet kjo kohezgjatje ne menyre qe te kete mundesi qe te prodhohen antitrupa ne organizmin e ketij pacienti. Ne rast se marrim serish nje test negative
7) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

ka shume mundesi qe ky pacient te mos kete antritrupa te vecante per kete antigjen. Duhet theksuar se precipitimi formohet vetem ne zonen e ekuivalences.

3) MATJA E PRECIPITIMIT NGA SHPERHAPJA E DRITES

3.1) Turbidimetria. Precipitimi eshte nje nga metodat me te thjeshta ne detektimin e antigjen antitrup sepse shume antigjen jane multivalent dhe si rrjedhim formojne agregate kur bashkeveprojne me antitrupat korrespondues. Precipitimi ne lengje matet me dy metoda qe njihen me emrin turbidimetria (turbullira) dhe nefelometria qe te dyja keto metoda shfrytezojne turbulliren qe formohet gjate bashkeveprimit Ag-At. Turbidimetria eshte matja e turbullires ose formimit si nje re ne tretesire. Merret nje tub qe brenda saj ka nje tretesire me antigjen- antitrup qe perdoren ne klinika te ndryshme. Detektori i cili eshte pajisje qe vihet drejt me rrezen renese, dhe kjo pajisje mat rrezet qe kalojne direkt tretesiren, pra mat intensitetin e tyre pasi kalojne tretesiren. Intensiteti varet nga numri, lloji dhe perqendrimi i molekulave qe ndodhen ne tretesire. Matesit qe perdoren sot jane spektrofotometria ose analizatoret automatik.

3.2) Nefelometria Nefolometria mat driten e cila shperhapet ne nje kend te vecante nga nje tufe drite renese qe kalon tretesiren. Ne epruvete ku behet prova hidhet nje rreze drite, pasi kalon tretesiren drita e shperhapur bie me nje kend, ne rastin tone 70 dhe keto rreze drite te pasqyruar maten me ane te nje detektori, ose me ane te nje kompjuteri me ekstrapol i cili i jep perqendrimet aktuale ne milligram per decilitre (mg/dL) ose ne unite internacionale (IU/mL) (USA). Intensiteti i tyre eshte ne perpjestim te zhdrejt me sasine e komplekseve qe formohen. Kjo metode eshte nje metode sasiore. Detektoret e nefelometrise masin driten e shperhapur me nje kend qe varion 10 - 90.

8) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

Figura 8.3 Principi i Nefelometrise.Drita e shperhapur ne detektor bie me nje kend qe ne rastin tone 70,ndersa ne rastin e turbidimetrise drita shperhapese qe matet nga detektori bie direkt, pra pasi kalon tretesiren.

Kjo metode ka zevendesuar ne mase te madhe imunodifuzionin radial sidomos kur duhet te analizohen shume mostra. Nefelometria ka sensitivitet me te larte, me te shpejte dhe eshte me e automatizuar se turbidimetria. Gjithsesi eshte me e kushtueshme ndaj dhe ka rentabilitet kur analizohen nje numer i madhe mostrash. Kjo metode eshte e zgjedhur per te matur perqendrimin e komplementit dhe imunoglobulines ne rastet kur kemi nje numer te madh mostrash.

4) TEKNIKAT E IMUNODIFUZIONIT PASIV Precipitimi i kompleksit antigjen antitrup mund te vendoset gjithashtu edhe ne terrene te ngurta xhel- agar, qe eshte nje polisaharid kompleks me peshe molekulare te larte e cila eshte derivuar nga algat, agaroza dhe agar i paster qe jane perdorur per kete qellim. Agari dhe agaroza ndihmojne ne procesin e stabilizimit te difuzionit dhe lejojne qe bandat e precipituara te jene sa me te dukshme. Reaktantet jane hedhur ne xhel dhe bashkeveprimi antigjen-antitrup ndodh me ane te difuzionit dhe ne kete metode nuk perdoret ndonje fushe elektrike qe pershpejton procesin. Kjo teknik njihet me emrin imunodifuzioni pasiv.Faktoret qe ndikojne ne difuzion jane:
-

permasat e grimcave
9)

Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ

Pranoi: Dr. KASTRIOT

temperatura viskoziteti i xhelit sasia hidratuese

1. Metoda e penetrimit rrethor te njefishte ( RID ) James Oudin ishte i pari qe perdori xhelin per reaksionet e precipitimit, ai ishte i pari qe kete teknike e quajti metoda e penetrimit rrethor te njefishte. Antitrupat me specifitet te caktuar inkorporohen ne nje shtrese agaroze ne test tubin. Antigjeni vendoset ne krye te tubit duke levizur per tek xheli ne tub, kjo con ne formimin e precipitimit i cili varet nga sasia e antigjenit qe eshte present. Imunodifuzioni radial eshte nje nga metodat e modifikuar te penetrimit rrethore te njefishte pra RID qe eshte nje teknike shume e perdorshme (rutine) ne laboratoret klinik. Ne kete teknike antitrupi me nje sasi standarte inkorporohet ne nje shtres agar-xhel. Ne kete shtrese hapen puse te vogla dhe ne disa prej tyre futen sasi te njohura antigjenesh, kur antigjeni difuzon ne xhel formohet nje unaze precipitimi aty ku arrihet zona e ekuivalences, pra aty ku raportet antigjen-antitrup jane adekuat. Ne momentin qe arrihen raportet e pershtatshme formohet nje unaze e cila ka nje diameter te caktuar qe varet nga perqendrimi i antigjenit. Ky mund te perdoret per te ndertuar nje kurbe kalibrimi qe me pas mund te perdoret per te percaktuar perqendrimet e mostrave te panjohura. Duke njohur perqendrimet e 1, 2 dhe 3 gjejme 4 . Pra ne baze te kurbes sic tregohet ne figure arrijme te gjejme perqendrimet e atyre qe ne duam.

Puset e hapura mbi xhel permbajne antitrupa specifik

Figura 8.4 Imunodifuzioni Radial.Sasia e precipitatit te formuar varet nga perqendrimi i Ag te pranishem ne tretesire. Ne Mancini metod perqendrimi eshte ne perpjestim te drejte me diametrin e unazes se formuar.
(From Nakamura, RM, Tucker, ES III, and Carlson, IH Immunoassays in the clinical laboratory. In Henry, JB Diagnosis and Management by Laboratory Methods, ed. 18. WB Saunders, Philadelphia, 1991, p. 858, with permission.)

Njihen edhe dy teknika te tjera te imunodifuzionit radial.

10) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

a) Metoda and point ( Mancini Metod) Ne kete teknik antigjeni difuzon deri sa nuk ka me antitrup qe te bashkeveproje me te, pra derisa vjen nje moment qe diametri i unazes se formuar nuk ndryshon me. Kjo ndodh ne intervali 24 - 72 oresh, pra diametri i unazes se formuar eshte ne perpjestim te drejte me perqendrimin e antigjenit.
b) Metoda kinetike ( Metoda Fahey and Mc Kelvey )

Ne kete metode diametri i unazes nuk eshte ne perpjestim te drejte me perqendrimin e antigjenit si ne metoden end point por eshte ne perpjestim te drejte me log e perqendrimit te antigjenit. Avantazhet dhe kufizimet: Megjithese nuk eshte aq sensitive sa metodat e tjera, imunodifuzioni radial eshte nje metode e besueshme per matjet e perqendrimit te shume proteinave ne serum. Kjo teknike perdoret rutine ne imunologjine klinike, mat imunoglobinat te tilla si IgG, IgA, IgM, IgE, perbersit e komplementit, trasferinen, PCR, FP qe shoqerohet me disa tumore te melcise.

2. Metoda e penetrimit rrethor te dyfishte.(Oucterlony)

Penetrimi i dyfishte eshte nje teknik ku te dy si antigjeni dhe antitrupi difuzojne ne menyre te pavarur ne nje medium gjysme solid nga te dyja anet, horizontalisht dhe vertikalisht. Kjo metode behet ne kete menyre.Hapim puset mbi xhel dhe shtojme reaktantet mbi te. Vendosim periudhen e inkubacionit qe eshte 12-48 ore. Pas periudhes se inkubacionit do te vezhgojme rezultatin e mare. Dallojme tre raste: a) Reaksioni i antigjeneve identik. Ku vija e precipitimit midis antitrupit te antiserumit dhe antigjenit 1, antigjenit 2 eshte vazhdueshme si nje vije e vetme. Kjo do te thote se antigjeni 1 eshte i njejte me antigjenin 2.

11) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

b) Reaksioni i antigjeneve pjeserishte identik. Vija e precipitimit te antiserumit dhe dy antigjeneve jane ne vazhdimesi por antigjeni 1 ka disa epitope qe nuk jane te pranishme tek antigjeni dy ndaj edhe formohet nje zgjatim.

c) Reaksioni i antigjeneve te ndryshem. Vijat e precipitimit midis antiserumit dhe dy tretesirave me antigjen si antigjen 1 dhe antigjen 2 nuk fuzionojne me njera tjetren e rrjedhimisht keta antigjen jane krejtesisht te ndryshem me njeri - tjetrin. Pozicioni i vijes ka te bej me peshen molekulare te antigjenit perkates.

Ne pergjithesi metoda e penetrimit te dyfishte perdoret per te percaktuar pranine ose mungesen e nje antigjeni te caktuar ne lengjet e organizmit. Perdoret per indetifikimin e Aspergillus, Blastomyces, Cocciddiodes, Candida, gjithashtu perdoret edhe per indentifikimin e shume semundjeve autoimune. Avantazhet kryesore jane thjeshtesia ,fakti qe duhen pak paisje dhe specifiteti. Nese behet me kujdes metoda e penetrimit te dyfishte eshte 100 % e sakte. Kufizimet kryesore jane mungesa e sensitivitetit si dhe koha qe duhet per zhvillimin e nje precipitimi te dukshme kur antigjeni dhe antitrupi jane ne perqendrime te vogla.
12) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

5. TEKNIKAT E ELEKTROFORES 5.1)Imunoelektroforeza Difuzioni mund te kombinohet me elektroforezen per te pershpejtuar rezultatin. Imunoelektroforeza eshte nje metode qe perdoret per te ndare dhe per te indetifikuar antigjenet ne baze te ndryshimeve te tyre te levizshmerise ne nje fushe elektrike. Kjo metode perdoret ne imunologjine laboratorike per te bere nje vleresim cilesore dhe gjysem sasior, per sa i perket perqendrimit te imunoglobulinave dhe eshte me dy stade: Stadi i pare: merret nje sasi serumi dhe hidhet ne puse dhe vihet ne nje fushe elektrike duke qene i aplikuar ne nje terren te pershtatshem si agaroza. Stadi i dyte: pasi eshte kryer elektroforeza, depozitohet antiserumi specific ne nje kanal te hapur paralelisht me boshtin e elektroforezes. Proteinat e ndara nga elektroforeza dhe antiserumi do te difuzojne ne drejtim te njera tjetres dhe ne zonen e raportit te pershtatshem Ag/ At do te formohet precipitat ne formen e harqeve.

Figura 8.7 Ne kete figure na eshte paraqitur nje film elektroforeze qe ne njeren ane ka kontrollet normal (odd-numbered wells) dhe ne ane tjeter serumi (even numbered wells).Pusi A permban Ig antitotale,B anti- .C anti- ,D anti-, E anti-.Nje elektroforeze me levizshmeri te kufizuar shikohet ne pusin 1 me imunoglobuline antitotale , dhe ne puset 5 ne pacientet qe kane IgM me gamopati monoklonale.

Kjo teknik eshte gjysme sasiore ka perdorim te gjere ne laboratoret e ndryshem per detektimin e mielomes, limfomes malinje dhe ne disa semundje te tjera te limfomave proliferative. Por
13) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

gjithashtu perdoret edhe per disa semundje te imunodificences dhe deficencat e komplementit. Interpretimi i ketyre analizave eshte i veshtire dhe interpretuesi duhet te kete eksperience.

5.2) Imunoelektroforeza sasiore ne forme rakete. Imunoelektroforeza ne forme rakete, per here te pare eshte folur nga Laurell ne vitet e hershme te 1960.Antitrupi eshte shperndare ne xhel, Antigjeni eshte vendosur ne puse qe jane hapur ne xhel.Elektroforeza perdoret per te lehtesuar migrimin e antigjenit ne agar, kur antigjeni fillon te largohet nga puset pikerisht ky moment con ne formimin e fillimit te precipitimit. Duke qene se perqendrimi i antigjenit ndryshon, ketu ndodh nje shperdarje dhe reformim i precipitimit ku distanca ndermjet puseve ka nje rritje te qendrueshme.

Figure 8.6 Imunoelektroforeza ne forme Rakete, ku eshte formuar precipitat ne forme harqesh.Standartet jane ne puset 1 dhe 3.Mostra e pacientit eshte ne puset me numer 4, 6.Duhet theksuar se pusi me numer 4 nuk ka Ag pra nuk kemi formimin e nje harku.Pusi me numer 5 ka nje perqendrim te vogel te Ag dhe 6 ka nje perqendrim te larte te Ag.

Si perfundim vija e precipitimit e formuar eshte ne forme konike, qe ngjan me nje rakete dhe keshtu do kemi precipitim ne forme rakete.Lartesia e raketes , matet nga pusi deri te kulmi i precipitimit ne forme rakete , qe eshte ne perpjestim te drejte me perqendrimin e Ag.Mund te ndertojme edhe nje grafik ku ne mund te gjejme perqendrimin e Ag te panjohur. Roket Imunoelektroforeze eshte shume me shpejte se RID. Kjo eshte shume e perdorshme per percaktimin e albuminave, ceruloplasmines dhe transferines. Ne kete teknik eshte shume thelbesore perdorimi i pH per testet qe perdoren, sepse kjo percakton direkt migrimin ne xhel, pasi pH i perzgjedhur ben qe antitrupat nuk levizin ne xhel, ndersa antigjeni migron ne anoden positive. Kjo teknike perdoret per matjen e imunoglobulinave me buferat, me pH=8.6
14) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

5.3) Imunofiksimi Imunofiksimi eshte nje metode mjaft sensitive per te zbuluar perqendrime te vogla te proteinave monoklonale ne serum. Ne kete metode serum i holluar i nenshtrohet elektroforezes ne xhel per te ndare proteinat. Numri i bandave te formuar varet nga buferi dhe perberja e xhelit qe perdoren gjate aplikimit. Pasi hapi i pare serumi kalon nje elektroforeze te thjeshte paralel me boshtin e kesaj elektroforeze vendosen shirita letra special, secili me nga nje antitrup monoclonal te pershtatshem per te zbuluar nje protein te caktuar. Antigjenet difuzojne ne agar dhe reagojne ne antitrupa perkates, pas difuzionit te antitrupit ne xhel formohen vija precipitati sa here qe antigjeni takohet me antitrupin perkates. Me pas xheli lahet qe te zhvendoset i gjithi, antigjen-antitrup i lire dhe me pas mund te ngjyroset per te lejuar vizualizimin e precipitatit.Kjo eshte shume e perdorshme per te percaktuar antigjenet qe jane present ne serum, urine ose ne lengun cerebrospinal me perqendrime te vogla. LCS eshte perzgjedhur per te diagnostikuar sklerozen multiple, urina perdoret per te detektuar proteinen Bence Jons qe gjendet te pacientet qe kane sklerozen multiple. Kjo teknik eshte me sensitive se imunoelektroforeza, por hollimi behet ne qofte se eshte i rendesishem per te shmangur zonen me teprice antigjenesh. a) Wester Blotting Nje nga teknikat me te pershtatura te imunoprecipitimit eshte edhe Wester Blotting i cili perdoret si test konfirmues te antitrupave te imunodificences humane (SIDA) kryesisht te HIV1.

Figura 8.8 Imunofiksimi.Komplekse te tilla si proteinat jane ndare nga imunoelektroforeza.Nje antiserum eshte shperndare ne xhel.Proteinat fiksative te tilla si IgM,IgA,IgG,K,lambda jane hedhurne xhel.Pas 30 minutash inkubim ,xhelin e ngjyrosim dhe me pas shohim rezultatin .Qe ne rastin tone pacient ka te pranishme At IgG monoklonale.

METODIKA.

Nje pjese e antigjeneve te ndryshem vendoset ne xhel. Me ane te elektroforezes behet ndarja e komponenteve.
15)

Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ

Pranoi: Dr. KASTRIOT

Me pas komponentet transferohen ne nitroceluloze e cila vendoset mbi xhel, Hedhim serumin mbi nitroceluloz dhe lejojme te veprojne. Me pas stripi lahet dhe ngjyroset. Shikojme bandat e formuar ne baze te komplekseve antigjen-antitrup.

6. KERKIMET E GABIMEVE NE ELEKTROFOREZE Shume kerkime jane te njejta per te gjitha teknikat e imunoelektroforezes.
1- Aplikimi i tensionit elektrik ne drejtim te gabuar, kjo shkakton qe mostra te largohet

nga xheli ose te mos ndahet.

2- Aplikimi nje pH jo korrekt dhe mos respektimi i kohes se duhur te elektroforezes con

qe komponentet ndares te fshihen pra te mos jene vizual. 3- Duhet patur kujdes ne perqendrimin e antigjeneve dhe antitrupave ne menyre te tille qe te formohet zona e ekuivalences pra te kemi formim te komplekseve antigjen-antitrup, ne qofte se kemi luhatje te perqendrimeve precipitimi i tyre sdo te jete i mundur.
4- Nje rol te rendesishem luan edhe fuqia e tensionit elektrik nese kjo fuqi eshte e dobet do

te kemi nje ndarje jo te plote, nese fuqia eshte e larte nxehtesia con ne denatyrimin e proteinave.

7.KRAHASIMI I TEKNIKAVE TE PRECIPITIMIT Cdo teknik e precipitimit ka avantazhet dhe disavantazhet e saja. Ne tabelen e meposhtme jane paraqitur krahasimet, avantazhet dhe disavantazhet e seciles teknike

Paisjet qe nevojiten jane te shtrenjta eshte pajisje e automatizuar, sensitive

Sasiore me e ngadalte jo aq sensitive sa nefelometria

16) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

Gjysme sasiore e ngadalte e veshtire per tu interpretuar E shpejte, sasiore dhe shume e kerkuar teknikishte E ngadalte, gjysem sasiore, e veshtire per tu interpretuar Shume e shpejte, gjysem sasiore, sensitive

REFERENCA
1. Kindt, TJ, Goldsby, RA, and Osborne, BA. Kuby Immunology, ed. 6. WH Freeman and Co., New York, 2007, pp. 145167. 2. Kricka, LJ. Principles of immunochemical techniques. In Burtis, CA, Ashwood, ER, and Bruns, DE (eds): Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, ed. 6. Saunders Elsevier,St. Louis, 2008, pp. 155170. 3. Ashihara, Y, Kasahara, Y, and Nakamura, RM. Immunoassays and immunochemistry. In McPherson, RA, and Pincus, MR (eds): Henrys Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, ed. 21. Saunders Elsevier, Philadelphia,2007, pp. 793818. 4. Mak, T, and Saunders, ME. The Immune Response: Basic andClinical Principles. Elsevier Academic Press, Burlington, MA,2006, pp. 147177. 5. Kricka, LJ, and Park, JY. Optical techniques. In Burtis, CA,Ashwood, ER, and Bruns, DE (eds): Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, ed. 6. Saunders Elsevier, St. Louis, 2008, pp. 6383. 6. Warren, JS. Immunoglobulin quantitation. In Detrick, B,Hamilton, RG, and Folds, JD (eds): Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, ed. 7. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C., 2006, pp. 6974. 7. Kang, S, Suh, J, Lee, H, Yoon, H, et al. Clinical usefulness of free light chain concentration as a tumor marker in multiple myeloma. Ann Hematol 84:588593, 2005. 8. Mancini, G, Carbonara, AO, and Heremans, JF. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochem 2:235, 1965. 9. Fahey, JL, and McKelvey, EM. Quantitative determination of serum immunoglobulins in antibodyagar plates. J Immunol 94:84, 1965. 10. Lindsley, MD, Warnock, DW, and Morrison, CJ. Serological and molecular diagnosis of fungal infections. In Detrick, B, Hamilton, RG, and Folds, JD (eds): Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, ed. 7. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C., 2006, pp. 569605. 11. Reeves, WH, Satoh, M, Lyons, R, Nichols, C, et al. Detection of autoantibodies against proteins and ribonucleoproteins by double immunodiffusion and immunoprecipitation. In Detrick, B, Hamilton, RG, and Folds, JD (eds): Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, ed. 7.American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.,2006, pp. 10071018. 12. Orton, SM, Peace-Brewer, A, Schmitz, JL, Freeman, K, et al.Practical evaluation of methods for detection and specificity of autoantibodies to extractable nuclear antigens. Clin Vaccine Immunol 11:297301, 2004.

17) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT

13. Laurell, CB. Antigen-antibody crossed electrophoresis. Anal Biochem 10:35861, 1965. 14. McPherson, RA, and Massey, HD. Laboratory evaluation of immunoglobulin function and humoral immunity. In McPherson, RA and Pincus, MR (eds): Henrys Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, ed. 21. Saunders Elsevier, Philadelphia, 2007, pp. 835848. 15. Alper, CA, and Johnson, AM. Immunofixation electrophoresis: A technique for the study of protein polymorphism. Vox Sanguinis 17:445, 1969. 16. Katzman, JA, and Kyle, RA. Immunochemical characterization of immunoglobulins in serum, urine, and cerebrospinal fluid. In Detrick, B, Hamilton, RG, and Folds, JD (eds): Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, ed. 7. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C., 2006, pp. 88100. 17. Keren, DF, and Humphrey, RL. Clinical indications and applications of serum and urine protein electrophoresis. In Detrick, B, Hamilton, RG, and Folds, JD (eds): Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, ed. 7. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C., 2006, pp. 7587.

18) Punoi: ELIDA MUCA SHYTAJ Pranoi: Dr. KASTRIOT