Teknika imunokimike ELISA 2020

Tema: ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)

https://www.youtube.com/watch?v=OcLxojwp0yI
ELISA eshte nje test I shpejt per zbulimin cilesor dhe sasior te
Antitrupave dhe antigjeneve te ndryshem si viruset,bakteret. Metoda
ELISA eshte pjese e metodave imunokimike te shenjuara ne faze te
ngurt.Quhet ne faze te ngurt ose solide seose reaksioni imun zhvillohet
ne nje siperfaqe te ngurt ne faze solide(pllaka me 96 bucela polistireni
per matje).
Principi I ELISA
Funksioni I fazes solide eshte te imobilizoj Ag ose At ne sample dhe ti
lidh ata. Pas inkubimit pllaka shpahet qe te largohen te gjithe elementet e
palidhur.Ne kete metoda shtohet substanca konjuguese dhe behen
inkubime ne vazhdim.
Nje konjugat eshte nje Ag ose nje At tjeter I shenjuar me nje enzyme.
Lloji I konjugatit ndryshon ne varesi te llojit te ELISA. Pranija e
enzymes te konjugati sherben per identifikimin e kompleksit imun te
Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 1
Teknika imunokimike ELISA 2020

formuar.Pas shtimit te konugatit realizohet inkubim dhe me pas behen

shplarje per te larguar konjugatet e palidhur. Identifikimi I kompleksit
imun realizohet pasi ne te pus eshte shtuar substrati specific I
enezimes(peroksid hidrogjeni ose kromogjen). Ngjyra qe formohet
deshmon per formimin e kompleksit imun ndersa percaktimi sasior
realizohet me ane te aparatit lexues te ELISA, I cili do te percaktoj nga
ana sasiore kompleksi Ag-At.
Shenim: Hapat dhe reagentet jane te ndryshem ne varesi te llojit te
ELISA.Prandaj per cdo analize duhet ti referohemi fletees se kitit
bashkeshoqeruese. Jane disa lloje te ELISA.
Format e ELISA
Në përgjithësi, ELISA mund të grupohen në katër kategori kryesore:
1. ELISA direkte
2. ELISA indirekt,
3. ELISA sanduiç
4. ELISA konkurruese
ELISA direkte
https://www.youtube.com/watch?v=c-LyVc_GEhk
Figura ilustron e ELISA direkte; një antigjen eshte I fiksuar ne muret e
nje pjate ELISA. Ne te shtohe At I shenjuar me enzyme.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 2

Teknika imunokimike ELISA 2020

Ne kurben e absorbimit lidhja midis OD se ngjyres dhe sasise se

kompleksit imun te formuar eshte ne perpjestim te drejte. Sa me shume
At ne serum te jene aq me e madhe do jete sasia e enzimes se lidhur me
substratin dhe aq me e madhe do jete intesiteti I ngjyres.

ELISA direke përdoret zakonisht per te zbuluar pergjigjen immune ndaj

nje Ag te caktuar,pra per te identifikuar nje At kur Ag eshte I
percaktuar.
Avantazhet

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 3

Teknika imunokimike ELISA 2020

 ELISA direke është shumë më e shpejtë se teknikat e tjera të

ELISA pasi kalon ne më pak hapa.
 Gjithashtu eshte më pak e prirur ndaj gabimit pasi nevojiten më
pak reagentë
Disavantazhet e kësaj metode.
 Antigjenit nuk ka specifitet te lartë
 Mudesi per reaksione te kryqezuara
ELISA Indirekte
https://www.youtube.com/watch?v=YIc_3PTpNM8
https://www.youtube.com/watch?v=ECjGF1qMx6w laborator
Ne formen indirekte, At I sample qe duhete te identifikohet,lidhene me
Ag te fiksuar ne muret e kyvetes. Ne kete form shtohet si konjugat nje
Anti Antitrup(anti At) I dyte I cili eshte I shenjuar me enzyme.
Identifikimi I kompleksit Ag-At-antiAt realizohet pas shtimit ten je
substrati kromofor specific me enzimen. Ky substrat shoqerohet me
ndryshim ngjyre. Ngjyra e formuar eshte propocionale me sasine e At te
lidhur te mostres qe po analizohet. Sa me I madh nr I At te pranishem ne
moster aq me I madh do jete edhe intesiteti I ngjyres qe formohet. Lidhja
midis OD dhe sasise se kompleksit Ag-At te formuar eshte ne perpjestim
te drejte.
Kjo form eshte e vlefshme per identifikimin e sasise se At ne nje
kampion.
Hapat per ELISA indirekte
1. Ne paretet e puseve jane te fiksuar Ag.
2. Me pas ne te do te shtohet sample(At qe do te identifikohen)

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 4

Teknika imunokimike ELISA 2020

3. Behet inkubim per te formuar kompleks Ag-At.

4. Wash per te larguar komponentet e palidhur.
5. Shtohen anti-At te shenjuar me enzyme I cili do te lidhet me At e
pare.
6. Inkubohen
7. Wash
8. Shtohet substrat qe do te lidhet me enzyme.
9. STOP solucion
10. Formimi I ngjyres(ndryshon nga e vershe ne blu)
11. Matet intesiteti I ngjyres ne READER ELISA

ELISA indirekte është më e përshtatshme për përcaktimin e përqendrimit

total të antitrupave në nje moster.
Avantazhet e kësaj metode.
 Ndjeshmëri e lartë sepse perdor nje At sekondar

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 5

Teknika imunokimike ELISA 2020

 Kosto e ulet pasi kerkohen me pak anti-At te shenjuar

Disavantazhet e kësaj metode.
 Mundesia per reaksione te kryqezuara
 Procedure me e gjate se ELISA direkte
Forma me konkurim(Competitive)
https://www.youtube.com/watch?v=Kb26nQVMHds
Ne kete form te ELISA, At specific te sample konkurojne me At e
shenjuar me enzime. Me pas shtohet nje substrat kromogjen qe eshte
specific per enzimen qe eshte shenuar At konkurues. Ne kete rast sasia e
ngjyres se formuar eshte ne perpjestim te zhdejt me sasine e At te
pranishem ne moster. Sa me I madh perqendimi I At aq me e vogel
eshte ngjyra e formuar . Kjo tregon qe At e shenjuar nuk kane mundur te
lidhen me Ag.
Hapat e ELISA Competitive
1. Ne muret e kyvetes jane te fikuar Ag.
2. Shtohen njekohesisht edhe sample(At) edhe At konkurues te
shenjuar me enzim.
3. Inkubim
4. Wash
5. Substrat kromofor
6. Formohet ngjyre
7. Stop
8. Ndryshon intesiteti I ngjyres.
9. Matet intesiteti ne aparat.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 6

Teknika imunokimike ELISA 2020

Ne kete rast sa me I madh te jete sasia e At ne moster aq me I vogel

eshte perqendrimi I At konkurues I shenjuar me enzim qe do te lidhet
per pasoj intesitei I ngjyres do te jete I ulet. Pra lidhja midis OD se
ngjyres se formuar dhe sasise se kompleksit imun eshte ne perpjestim te
Zhdrejte.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 7

Teknika imunokimike ELISA 2020

Avantazhet e kësaj metode

 Nuk kerkon mostra te pastra
 Jep me pak reaksione false
Disavantazhet e kësaj metode
 Perdoret At qe njohin vetem nje epitop te Ag te ndryshem
Forma Sandwich ( Identifikimi I Ag)
https://www.youtube.com/watch?v=cHSVmzZ84FU
https://www.youtube.com/watch?v=ojYHnZZbwz8
Ne kete form Ag I mostres identidifikohet me ane te nje metode
Sandwich duke u lidhur njekohesisht me 2 At,njeri I cili eshte I fiksuar
ne paretet e posit dhe nje At tjeter I cili eshte I shenjuar me enzyme. At
conjugate mund te jete monoclonal ose poliklonal. Shtimi i një reagenti
substrati-kromogjen qe eshte specific per enzimën realizon forminim e
ngjyres. Kjo ngjyrë është drejtpërdrejt proporcionale me sasinë e
antigjeni te pranishëm në mostër.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 8

Teknika imunokimike ELISA 2020

Kjo metode sherben per te identifikuar Ag ne nje moster komplekse.

Avantazhet e kësaj metode.
 Avantazhi kryesor i një sanduiçe ELISA është
ndjeshmëria(sensitiviteti) e saj e lartë; është 2-5 herë më shumë të
ndjeshme se sa ELISA direkte ose indirekte.
 Specifiteti per shak te perdorimit te dy At qe kane specifitet te larte
per epitope te ndryshme te te njejtit Ag
Disavantazhet e kësaj metode
 Reaksionet e kryqezuara pasi kerkohen cifte At qe lidhen me
epitope te ndryshme te Ag
Përbërësit e ELISA
https://www.youtube.com/watch?v=0c2FdQH33hk
Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 9
Teknika imunokimike ELISA 2020

Një ELISA e standartizuar permban një grup reagentësh të standardizuar

dhe pllaka me bucela qe jane specifike per nje analize. Nje ELISA
permban disa perberes:
 Pllaka të veshura (pllaka të ngurta dhe / ose shirita),
 Diluent Reagent
 Wash Reagent
 Konjugat Reagent
 Substrat Reagent
 Solucion Stop
Cdo set eshte specific ne varesi te Lotit qe ka nje Kit.
SHENIM: Nuk duhet qe te perzihen component qe I perkasin Loteve te
ndryshme.
Avantazhet e ELISA
• Testoni një numër të madh të mostrave në të njëjtën kohë
• Automatizimi I procedures me ane te pajisjeve automatike e bene
procedure te thjeshte ne zbatim.
• Kompjuterizimi leheteson llogaritjen dhe raportimin e rezultateve.
Komponentet e ELISA
Pllakat
Cdo ELISA ka ne perberjen e tyre 96 bucela(12 rreshta me 8) qe te cilat
kane te fiksuar Ag ose At ne parete e tyre. Ne kete menyre ata mund te
lidhin At ose Ag qe duam te identifikojme ne moster. At ose Ag e
palidhur largohen pas inkubimit me ndihmen e Solucioneve shplarese.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 10

Teknika imunokimike ELISA 2020

Diluent Reagent
Shume teste kane solucione hollimi specifike. Keta solucione sherbejne
per te holluar paraprakisht mostrat perpara se te hidhen ne puset e
matjes.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 11

Teknika imunokimike ELISA 2020

Kontrollet
Kontrollet positive permbajne Ag ose At. Kontrollet negative nuk
permbajne Ag ose At. Keto kontrollet standartizojne pllakat e ELISA.
Kontrollet jane te vlefshme per validimet dhe per kalkulimet e
rezultateve te testeve. Ne shumicen e ELISA keto kontrolle jane te
parapergatitura dhe jane gati per tu perdorur. Duhet te ndiqen te gjitha
instruksionet e kitit per perdorim.
Reagent Konjugat
Ky reagent permban At ose Ag te shenjuar me enzyme qe jane specific
per Ag ose At qe duhet te identifikojme.Konjugatet e palidhur largohen
pas inkubimit me sol Wash perpara se te shtohet substrati. Desiteti optic
I ngjyres qe formon substrati eshte ne perpjestim te drejte me sasine e At
te lidhur me enzyme.
Substrati
Kur si shenjues perdoret enzima peroksidaze,substrati eshte nje perzjerje
e Peroksidit te Hidrogjenit me nje kromogjen I cili reagon kur bie ne
kontakt me enzimen duke formuar ngjyre.
Wash Reagent
Si Wash sherben nje Bufer qe eshte detergent per te larguar elementet e
palidhur nga kyvetat.
STOP solucion
Permban nje reagent qe perfundon reaksionin Enzim-Substat duke cuar
ne ndryshimin e ngjyres.
Pajisjet ELISA

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 12

Teknika imunokimike ELISA 2020

Pajisjet e ELISA jane gjeresisht te perdorshme. Ne keto pajisje hyne:

 Lexues ELISA
 Pipeta
 Sol Wash
Pipetat
 Pipeta me volum fix,pipeta me ndryshim volumi(1–20 μL10–100
μL, 20–200 μL)
 Pipeta te shumefishta
 Pipeta gjysemautomatike
 Pipeta automatike

Pipeta te thjeshta dhe pipeta te shumefishte

Sistemi Wash
 Sisteme manual te Wash te kyvetave teke ose Wah ne seri.
 Sisteme gjysemautomatike qe shebejn per Wash te nje shiriti ose te
nje pjate ELISA.
 Sisteme te automatizuara qe mund te bwjnw Wash shume pllaka
njekohesisht.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 13

Teknika imunokimike ELISA 2020

Lexuesi ELISA
 Lexuesit manuale që lexojnë një rresht ose një pus në një kohë
 Lexuesit gjysëm të integruar që lexojnë një pllakë në të njëjtën
kohë
 Sisteme plotësisht të automatizuara që mund të përpunojnë shumë
pllaka në të njëjtën kohë.

Pajisje te tjera
• Mbulesa pllake (për të shmangur avullimin)
Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 14
Teknika imunokimike ELISA 2020

• Inkubatori i pllakave (nuk kërkohet për të gjithë ELISA)

Mirëmbajtja dhe Kalibrimi i Pajisjeve
Mirëmbajtja dhe kalibrimi i pajisjeve laboratorike është jashtëzakonisht i
rëndësishme në marrjen e rezultateve të sakta dhe të riprodhueshme e
rezultateve. Sherbimet ditore dhe kalibrimet duhet te behen sipas
protokollit. Sherbimet ditore te pajisjeve duhet te behen perpara se te
fillojne matjen e analizave.
Keshillohet qe pipetat tju shenohet data e kalibrimit si edhe te mbahet
nje regjister per te shenuar te gjitha sherbimet e aparateve qe jane kryer.

Rekomandohet që laboratori të vendosë specifikimet në lidhje me

performancën e mikropipetave bazuar sipas standardeve të tyre të
brendshme ose akreditimit. Si rregull, mikropipetat dhe pipetat e
shumëfishta duhet te kene nje saktësi + / - 10% për vëllim <10ul dhe +
/ - - 5% për vëllime më të mëdha.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 15

Teknika imunokimike ELISA 2020

Protokollet e Kalibrimit
Pajisjet gjithmonë duhet të jenë në kalibrimin e duhur. Pajisjet që janë
jashtë kalibrimi mund të prodhojë rezultate false ose të pasakta.
Trajtimi dhe përgatitja e reagentit
Kur merren reagentet e rinj duhet te shenohet data ne te cilen do te
merren ne dorezim. Reagentet duhet te ruhen ne temperature specifike
sipas protokolleve qe shoqerojne kitin. Ne raste se jane disa teste ne
perdorim duhet te perdoren te parat ato qe jane sa me afer dates se
skadences.

Trajtimi i Përgjithshëm I Reagentit

Duhet te respektohen kushtet e ruajtjes se reagenteve. Disa teste
rekomandojnë që të gjitha reagentët dhe pllaka të sillen temperatura e
dhomës (18–26 ° C) para përdorimit; të tjerët tregojnë se vetëm reagents
specifike duhen te ruhen ne temperaturën e dhomës. Per reagentet qe

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 16

Teknika imunokimike ELISA 2020

dalin nga frigoriferi ne temperature e dhomes duhet te nxirren të paktën

2-3 orë para fillimit të analizës. Shumica e testeve bashkeshoqerohen me
kontrolle te parapergatitura,ndersa disa te tjere pergatiten sipas
udhezimit te fletes se kitit.
Trajtimi dhe pergatitja e komponenteve te testit
Shumica e pllakave të testit janë paketuar individualish. Nga paketimi
duhet te hiqen aq testes a nevojiten,pjes tjeter e testeve duhet te ruhen ne
paketim sipas kushteve te standartizuara. Gjithashtu para testimit duhet
qe Reagenti konjugat dhe Wash duhet te lihen ne temp e dhomes (18-25
° C) . Zakonisht konjugati dhe Wash jane shishet me te medha te
paketimit dhe kerkojne me teper kohe qe te arrine temperature e kerkuar.
Nëse Wash ka formuar precipitat perpara se te perdoret duhet te
homogjenizohet.
Pjese e rendesishme e Kitit jane edhe kontrollet te cilat zakonisht jane te
parapergatitura.Per cdo matje te analizes duhet te shoqerohet edhe me
kontrolle te cilat do te shtohen ne pllake ne te njejten metode dhe kohe si
kampioni qe do te punohet.
Nje reagent I rendesishem eshte edhe Conjugati I cili nqs eshte I
kontaminuar apo I ruajtur jo mire do te sjell ulje te aktivitetit enzimatik.
Per kete arsye parapelqehet qe testet ELISA te zhvillohne ne erresire dhe
larg metaleve ne menye te tille qe te ruhet aktiviteti enzimatik.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 17

Teknika imunokimike ELISA 2020

Paketimi I puseve te ELISA.

Kontrolli i cilësisë
Ashtu si edhe per te gjitha testet e tjera keshillohet qe para se te fillojne
matjet te kryhen Kontrollet e cilesise(QC). Ne keto teste kontrollet jane
te rendesishme sepse punohet me mostra me sasi te vogla. Si kontrolle
mund te perdoren edhe serume me vlera te njohura.
Kontrollet ndahen ne sample cup dhe ruhen ne ngrirje. Perpara
perdorimit ata duhet te shkrihen,te homogjenizohen ne temp e dhomes.
Cdo sample cup duhet te jete I etiketuar me daten e shkrirjes,emrin e
QC. Kontrollet pas shkrirjes duhet te perdoren menjehere. nuk
keshillohet qe keta kontrolle te ringrihen perseri pasi u shkakton atyre
shok termik duke ulur ne kete menyre aktivitetin enzimatik. QC kane ne
qendrueshmeri 3-5 dite ne temp 4°C.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 18

Teknika imunokimike ELISA 2020

Pamja e grafikeve te kontrolleve te ruajtura ne aparat sipas datave qe

jane kyerer.
Perpunimi I kampioneve
Cilësia e kampionit mund të ketë një ndikim të rëndësishëm në vlersimin
e rezultateve përfundimtare. Eshte e rendesishme klasifikimi I
kampioneve per te identifikuar probleatikat qe mund te kete. Pasi nje
kampion I kompromentuar interferon ne forminin e kompleksit imun.
Mostrat Serum / Plasma: Kur serumi eshte I hemolizuar ose lipemik
(pamja e qumështit) mund te kete interferime ne rezultatin
perfundimtare. Per kete arsye kerkohet qe te shmangen keto kampion.
Gjithashtu nqs mostra eshte e koagukuar duhet patur kujdes gjate
aspirimit te saj qe te shmangim sa te jete e mundur fibrinen.
Mostrat liprmike: Zakonisht kete mostra nuk preferohen qe te
punohen,por mund te punohen pas centrifugimit me 2000G ose pas nje
qendrimi ne frigorifer per 24 ore ne temp 2-8°C.Duhet qe shtresa e
siperme e kilomikroneve te hiqet me kujdes dhe te merret kampion nga

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 19

Teknika imunokimike ELISA 2020

shtresa e poshtme. Gjate interpretimit te rezultateve duhet te kihet

parasysh Prania e kilomikroneve.

Kampion Lipemik
Ruajtja e mostrave
Eshte e rendesishme qe ruajtja e kampioneve te behet sipas protokolleve
standarte. Per nje ruajtje afatshkurter te kampionit,ruajtja behet ne temp
2-8 ° C deri per 5 ditë. Nëse mostrat duhet të ruhen për një kohë më të
gjatë, kampioni duhet te hiqet nga tubi dhe duhet te ruhet ne ngrirje ne
temperature -20 ° C.
Duhet qe kampionete te jene te etiketuar dhe te mbyllura sic duhet per te
shmangur avullimin. Reagentet liofilizat duhet te treten perkohesisht dhe
te ndahen,ato nuk mund te ngrihen te papergatitura sepse rrezikohet
stabiliteti I reagentit.
Duhet te shmangen Shoku termik sepse demton At apo Ag ne moster.
Maksimalisht dihen jo me shume se 3-5 cikle.
Përdorimi i mostrave të ngrira

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 20

Teknika imunokimike ELISA 2020

Mostrat e ngrira mund të shkrijnë në temperaturën e dhomës ose në

frigorifer. Të gjitha mostrat e shkrira duhet të përzihen plotësisht para
perdorimit për të siguruar nje homogjenizim te kampionit. Keshillohet
homogjenizimi me Vortex ose nje përmbysja së paku pesë herë.
Përzierja e tepërt e mostrave do të shkaktojë denaturim te proteinave të
serumit.

Mostra e shkrirë e pahomogjenizuar; proteina të vendosura në fund të

tubit;
Pipetimi
Pipetimi eshte I rendesishem gjate teknikes ELISA pasi punohet me sasi
te vogla. Ndiqen 2 metoda pipetimi. Pipetimi standart dhe ai revers.
Perdoret pipetimi standart per hollime ndersa ai revers per kontrollet QC
dhe reagentet.
Teknika e pipetimit
1. Pipeta duhet te jete e kalibruar
2. Largohet sasia e teper e solucionit duke fshire majat.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 21

Teknika imunokimike ELISA 2020

3. Duhet qe pipeta te mos kete marr ajer dhe te kete marre sasine e
duhur.
Kur përdoren pipeta te shumefishta dhe puset në pjatën janë bosh,maja
e pipettes duhet te vendoset ne fund te pusit plastike duke e prekur ate.
Nese puset kane solucion,pipeta duhet te bjere ne kontakt me pjesen
plastike anash saj,siper solucionit.

Kalibrohet pipeta per sasine qe do marre.

Sasite e teprta largohen nga maja e pipettes.

Preket anash tubit me maje për të hequr lëngun e

tepërt.

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 22

Teknika imunokimike ELISA 2020

Nxirret me kujdes pipeta nga tubi.

Pamja nga pipetimi me pipet te shumefisht

Pozicioni i duhur për të shpërndarë reagentët në puse bosh

duke përdorur një pipetë te shumefishte në këndin e poshtëm të secilit
pus.

Pozicioni i duhur për shpërndarjen e reagentëve në puse që

përmbajnë solucion duke përdorur një pipetë te shumefishte; sipër
lëngut.
Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 23
Teknika imunokimike ELISA 2020

Pipetimi standard (përpara) dhe përgatitja e mostrës

1. Vendosni një majë të re në një pipetë me një kanal dhe sigurohuni që
ajo të jetë e shtrënguar.
2. Shtypet pipeta në ndalesën e parë.
3.Fillohet pipetimi duke mbajtur te shtypur pipeten ne kohen e dyte.
4. Maja nuk duhet qe te futet shume thelle te kampioni.
5. Preket maja në anën e mostres për të hequr tepricen e sol ne anen e
jashtme te majes.
6. Zbrazet pipeta duke kaluar nga koha e pare te e dyta.
7. Përziejini mostrat me pipetë te shumefishte përpara shpërndarjes së
mostrave në pjata. Homogjnizimi mund ta bëhet duke e shtyrë pirunin 3-
6 herë.
8. Hiqet maja

Pipete e shumefishte

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 24

Teknika imunokimike ELISA 2020

Koha e inkubimit te pjates ELISA

Pas shtohen kontrollet dhe mostrat,element shume I rendesishem eshte
edhe inkubimi I tyre ne temp dhe ne kushtet standarte sipas udhezimeve
te shprehura ne fleten e kitit. Zakonisht procesi I hedhjes se mostrave ne
kyveta merr nje kohe te kosiderueshme prandaj keshillohet qe te mbahet
shenim diferenca koheore midis mostres se pare dhe te fundit. Per te
shamngur diferencat kohore midis kampioneve,perdoren pipetat e
shumefishta. Nqs gjate procedures se hedhjes se mostrave,ndodh
shkeputje atehere per te shmangur gabime gjate testimit ne fund te pjates
hedhim nje kontroll positive dhe e krahesojme me kontrollin fillestar.
Pas pipetimit eshte e rendesishme te perdoret kronometer per te matur
kohen e inkubimit. Gjate kohes se ikubimit,pllakat duhet te ruhen ne
siperfae horizontale qe te shamnget mundesia e derdhjes se kyvetatve
ose perzjerjes se tyre.

Perdorimi I kronometrave gjate inkubimit

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 25

Teknika imunokimike ELISA 2020

Shplarja e pjatave te ELISA

ELISA mund te kryhet ne sisteme auomatike dhe gjysem automatice por
edhe manuale. Diferencimi I tyre lidhet edhe me sistemin e shplarjes se
pllakave. Ne sistemet automatike dhe gjysemautomatike,perdoren
sisteme shplarese me gjilpera per te larguar perzjerjen nga kyveta. Ne
keto aparate duhet te kihet parasysh qe sistemi shplares te jete I
mirembajtur dhe I paster. Te kontrollohen gjilpera per demtime si edhe
te jene te kalibruara.Ne ELISA manuale shplarja realizohet me pipeta.

Gjilper e bllokuar
Per shplarje te kyvetave perdoret Wash Solution I cili parapergatitet nga
ne sipas udhezimeve qe ka kiti. Gjithmone para se te hidhet ky solucion
duhet qe kyvetat te jene te zbrazura nga solucioni I pare. Numri I
shplarjeve percaktohet ne fleten e kitit. Shumica e testeve kerkojne 300-
350μl sol Wash per cdo kyvet.
Kujdes:
Sol Wash duhet te jete mbi nivelin e reagenteve por nuk duhet qe te
derdhen.Nëse kjo ndodh, rezultatet e testit mund të jetë i pavlefshëm.
Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 26
Teknika imunokimike ELISA 2020

Gjithashtu nuk duhet qe pllakat te thahen midis larjeve dhe para shtimit
te reagenteve. Pas cdo solucioni shplares,duhet te behett zbrasja e
kyvetave duke I plasur ato ne nje leter filtri. Dhe kontrollohet filtri per
ngjyren e reagentit. Duhet te vazhdohet shplarja deri sa ne letren e filtrit
te mos ngelet shenje ngjyre nga reagent.
Ne raste se mostrat jane lipemike,kane protein te larta ose jane ikterike
mund te behen edhe shparje shtese,pasi keto protein jane te veshtira per
tu hequr nga muri I kyvetes.
Kujdesi I vacant duhet qe gjate shplarjes te procedohet shpejte nga
rreshti I pare te I fundit. Nqs kjo kohe eshte e gjate mund te ndodh qe
puset qe jane te zbrazura nga inkubimi ne temp mund te thahen.
Gjithashtu duhet qe siperfaqja e kyvetes te mos preket sepse kjo mund te
conte te largimin e komplekse At-Ag te lidhur ne muret e saj.

Pllaka e tejmbushur; kjo mund të kontaminojë puse të tjera

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 27

Teknika imunokimike ELISA 2020

Pozicioni i duhur i gjilpërave gjate shplarjes per te shtuar Wash

Solucion

Posicioni I duhur I gjilperes per te aspiruar sol

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 28
Teknika imunokimike ELISA 2020

Reader ELISA dhe menaxhimi I te dhenave

Hapi I fundit I ELISA eshte leximi dhe interpretimi I rezultateve.Per
shume teste,desiteti optic (sasisa e ngjyres)i solucionit te kyvetave mund
te matet me spektofotometer I njohur si Reader ELISA. Per cdo analize
ka nje gjatesi specifike qe lexon absorbimin. Shumica e testeve maten ne
gjatesine e vales 450-650nm. Shumica e Reader ka nje filter maximal
650nm me te cilen behet edhe matja e shumices se analizave. Perdorimi
I nje filtri me te ulet se 650nm shkakton ulje te desitetit optic. Pllakat
duhet te maten sa me shpejte qe te jete e mundur pas shtimit te STOP
solution.

Reader ELISA
Interferimet gjate leximit te desitetit optic(OD)
Vlera te larta te OD

Shkaku Rekomandimet
Uji me cilësi të dobët i përdor Rekomohet perdorimi I anpulave
për të larë pjatat me uje destile
ose për të përgatitur një Wash

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 29

Teknika imunokimike ELISA
sol.
Substat I kontaminuar
Pamjaftueshmeri I Sol Wash
Sistemi I Wash I konatminuar
Reader I demtuar (Filtri)
Temperatura me e lart ose me e
ulet e laboartorit
Reagentet e kontaminuar
Desitet optic I ulet(OD)
Shkaqet
Temaperatura e ulet e
laboratorit
Sol Wash I pergatitur jo sic
duhet ose perdorimi I Wash Sol I
gabuar
Perdorimi I shume cikleve te
shplarjes
Periudh e inkubimit e shkurter
Reagentet dhe pllakat te ftohta
Reagentet e skaduar ose te
2020
Duhet te behet Wash sipas
udhezimeve te fletees se kitit.
Duhet per cdo kyvet 350μl sol
Pastrimi I sistemit
Behen kontrolle me standarte dhe
shikohet procedura e zbrasjes se
kyvetave
Temperature e laboratorit duhet te
jete 18-25°C. Duhet te shmangen
tempaeraturat e larta per te
shmangur avullimin.
Perdoren reagent te rinj
Rekomandimet
Shmanget temp e larte. Te punohet
larg dritareve.
Sol Wash duhet te jete I fresket dhe
per cdo perdorim duhet te shenohet
Perpiquni qe te zbatohen Wash
sipas fletes se kitit
Te matet koha me kronometer per
cdo pllake
Sigurohuni që pllaka dhe reagentët
të jenë në temperaturën e dhomës
duke i nxjerrë ato
nga frigoriferi, të paktën 2-3 orë
para fillimit të analizë
Duhet te kontrolleohen reagentet
Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 30
Teknika imunokimike ELISA
perzier me Lot te ndryshme
Konjugat I gabuar ose I
pergatitur keq
Pllaka te lexuara ne gjatesi te
gabuar filtri ose me Reader te
demtuar
Kontroll positive I holluar
Stresi termik
Pllaka te kontaminuara
Procedura e kalibrimit te pipetave
Pipetat qe perdoren te ELISA duhet te kalibrohen sepse punohet me sasi
te vogla,gje qe rrit marshin egabimit gjste pipetimit dhe matjeve. Cdo
2020
dhe Lot para perdorimit te tyre
Sigurohuni që konjugati i përdorur
është ai që erdhi me kitin. Cdo
konjugat eshte specific sipas Lotit.
Keshillohet qe konjugati te
pergatitet sa me afer kohes se
perdorimit.
Kontollohet filtri perpara matjes.
Kalibrohet llampa
Kontrollet Nuk hollohen vetem ne
rastese kerkohet nga kiti
Perpara perdorimit te kitit duhet te
kontrollohet sa here ka dal kiti nga
frigoriferi
Pllakat duhet te ruhen ne frigorifer
te mbyllura qe te ruajne stabilitet.
Perpara perdorimit te tyre ato duhet
te marrin temp e dhomes.
Nëse janë pjata të perdorura
pjeserisht
sigurohuni që të etiketoni puset e
përdorura për të parandaluar
ripërdorimin;
Puset e mbetura duhet te perdoren
sa më shpejt të jetë e mundur.
Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 31
Teknika imunokimike ELISA 2020

pipet kalibrohet per 2 sasi,per nje volum minimalist dhe per nje volum te
madh. Kur perdoren sisteme automatike kalibrimi behet automatic. Per
te raelizuar kalibrimin e pipetave duhen:
1. Pipeta
2. Uje destile
3. Termometer
4. peshore
5. Tuba qelqi
Gjate procedures se kalibrimit te pipetave eshte e rendesishme
temperature e ambientit. Per te shamngur avullimin duhet qe kjo
temperature te mbahet 18-25°C.
Procedura:
1. Merret uje destile
2. Zbraset pipeta dhe matet sasia e uji qe ka marr pipeta
3. Merret perseri uji destile.(Kjo procedure perseriytet 10 X)
4. Llogaritet SD
5. Mbahet shenim data e kalibrimit dhe ribehet kalibrim sipas
protokollit.
Cdo laborator ka formulare per te pasqyruar kalibrimet,kontrollet dhe
mirembajtjen qe u ben aparateve. Ky eshte nje dokumentacion I
rendesishem per cdo pajisje qe eshte present ne laborator. Hartimi I
ketyre formulare realizohen me qellim organizimin sa me te mire te
punes per te rritur cilesine,saktesine dhe besueshmerin ne rezultatet e
nxjerra. Keto formular jane te rendesishem gjithashtu edhe per
procedure e akreditimit te nje laboratory sepse deshmojne nje pune
sistematike te bere nga personeli laboratorik. Ato deshmojne se cdo dite,

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 32

Teknika imunokimike ELISA 2020

per cdo rezultat jane beresherbime, kalibrime dhe kontrolle perpara se te

filloj matja e analizave.
Paraqitja e nje formulary per mirembajtjen

Griselda ZACAJ | Protokolli ELISA 33