Basic Microbiology & CLS 241

Week - 7
Lab # 7

Assistant Professor: Dr. Huma Naim

7 March 2022 1
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Concept of Simple staining ‫مفهوم الصبغ البسيط‬
▪ At the end of this lecture, the student should be able to know:
‫ يجب أن يكون الطالب قادرون على معرفة‬،‫▪ في نهاية هذه المحاضرة‬
i. Introduction ‫مقدمة‬
ii. What is Dyes/Stain and its types ‫ماهي الصبغات وأنواعها‬
iii. Requirements for smear preparation, ‫شروط تحضير اللطخة‬
iv. Preparation of bacterial smear ‫تحضير اللطخة البكتيرية‬
v. Heat fixation ‫التثبيت الحراري‬
vi. Types of Simple Staining (positive and negative) )‫أنواع الصبغ البسيط ( اإليجابي و السلبي‬

7 March 2022 2
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Introduction ‫مقدمة‬
▪ Bacteria are microscopic organisms. They are colourless for the most part.
.‫ بدون لون لمعظم أجزائها‬.‫▪ البكتيريا هي كائنات مجهرية‬
▪ In order to visualize them to study their structure, shape and other structural characteristics, it becomes necessary to make
them more easily visible.
‫ أصبح من الضروري جعلهم أسهل بالرؤية‬،‫ الشكل و الصفات الهيكلية األخرى‬،‫▪ من أجل رؤيتهم لدراسة تراكيبهم‬
▪ This means that the structures have to be contrasted from their environment so that they can be seen easily.
‫▪ هذا يعني أن التراكيب يجب أن تتباين عن بيئتهم بالتالي يمكن رؤيتهم بسهولة‬
▪ Therefore, Staining is of primary importance for the recognition of bacteria.
.‫ الصبغ هو الضرورة الرئيسية لمعرفة البكتيريا‬،‫▪ بالتالي‬
▪ Staining may be: ‫الصبغ يمكن أن يكون‬
Simple staining ‫الصبغ البسيط‬
Differential staining. ‫الصبغ التمايزي‬

7 March 2022 3
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Introduction ‫مقدمة‬
▪ Most commonly, fixed and stained smears are used for the study of cell morphology,
intracellular constituents and structures.
.‫ المكونات والتراكيب داخل الخاليا‬،‫ يتم استخدام اللطخات المصبوغة الثابتة لدراسة البنية الخلوية‬،‫▪ األكثر شيوعا‬
▪ The chemistry of simple staining is based on the principle that different charges attract,
while similar charges repel each other.
‫ بينما الشحنات المتشابهة تتنافر مع بعضها البعض‬،‫▪ كيمياء الصبغ البسيط تعتمد على مبدأ أن الشحنات المختلفة تنجذب‬
▪ In an aqueous environment, at pH 7, the net electrical charge produced by most bacteria
is negative.
‫ محصلة الشحنة الكهربائية الناتجة بواسطة معظم البكتيريا سالبة‬، 7 PH ‫ عند‬،‫▪ في البيئة المائية‬

7 March 2022 4
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Dyes/Stain ‫الصبغة‬
▪ Dyes/Stain applied for staining could be acidic, basic and neutral dyes according to their chemical
characteristics.
‫ قاعدية أو متعادلة حسب صفاتهم الكيميائية‬،‫ الصبغة المطبقة للصبغ يمكن أن تكون صبغات حمضية‬/‫▪ الصبغات‬
▪ Stain is a dye used to color the living or dead organelles.
‫▪ الصبغة هي المادة الصبغية المستخدمة لتلوين العضيات الحية أو الميتة‬
▪ Each stain contains a cation (positive charge) and an anion (negative charge) and either one could be the
chromophore (the part of the molecule that is colored).
‫▪ كل صبغة تحوي كاتيونات ( شحنات موجبة) و أنيونات ( شحنات سالبة) و احدها يمكن أن تكون حامل اللون ( الجزء من الجزيء الذي يكون‬
)‫ملون‬
▪ Staining can be performed with only one dye (Simple staining) or more dyes (Complex staining).
)‫▪ يمكن إجراء الصبغ بصبغة واحدة فقط ( الصبغ البسيط) أو صبغات أكثر ( الصبغ المعقد‬
▪ In case of complex staining, the first stain is called “Primary stain” and the second one as “Counterstain”.
"‫ تسمى الصبغة األولى " الصبغة األولية" و الثانية تسمى " الصبغة المضادة‬،‫▪ في حالة الصبغ المعقد‬
7 March 2022 5
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 ....Contd ‫متابعة‬
➢ Acidic stain/dyes: carry a negative charge on their chromophore, the bacterial cells (also negatively charged) reject these dyes. It also be
conducted with dyes having a colloidal particle size that therefore cannot enter the cell.

‫ يمن إجراء الصبغ السلبي بصبغات تمتلك جزيء غروي‬.‫ الخاليا البكتيرية ( أيضا سالبة الشحنة ) ترفض هذه الصبغات‬، ‫➢ الصبغات الحمضية تحمل الشحنة السالبة على حامل اللون‬
‫وبالتالي ال يمكن أن تدخل الخلية‬

▪ Examples: the black colored India ink and Nigrosin.

‫ الحبر الهندي الملون باألسود و النيغروسين‬: ‫▪ مثل‬

➢ Basic stain/dyes: They have a positive charge and result the staining of bacterial cells, since they bind to proteins and nucleic acids
(carrying a negative charge), so they attract the stain.

‫ بالتالي تجذب الصبغة‬،)‫ حيث ترتبط إلى البروتينات و األحماض النووية( التي تحمل شحنة سالبة‬، ‫ تمتلك شحنات موجبة و تسبب صبغ الخاليا البكتيرية‬: ‫➢ الصبغات القاعدية‬

▪ Examples: Safranine (red), Methylene blue (blue), Malachite green (green), Crystal violet (violet).

،)‫ البلورات البنفسجية ( بنفسجي‬،)‫ الماالتشيت األخضر (أخضر‬،)‫ الميثلين األزرق (أزرق‬،)‫ السافرانين (أحمر‬: ‫▪ مثال‬

➢ Neutral dyes: Both positive and negative charged imparts different color to different components.

‫ كالهما المشحونة موجبا وسلبا تحمل ألوان مختلفة ألجزاء مختلفة‬: ‫➢ الصبغات المتعادلة‬

▪ Examples: Geimsa stain, Leishman stain. ‫ صبغة ليشمان‬، ‫مثل صبغة الجيمسا‬
7 March 2022 College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department. 6
 Requirements for smear preparation
‫شروط تحضير اللطخة‬
1. Clean grease-free glass slide. ‫تنظيف الشريحة الخالية من الدهن‬
2. Bacterial colony/inoculum to be stained. ‫ الطعم المراد صبغه‬/ ‫المستعمرة البكتيرية‬
3. Normal saline or water. ‫المحلول الملحي أو الماء‬
4. Plastic pipette or dropper. ‫ماصة بالستيكية أو قطارة‬
5. Inoculating loops (transfer bacterial suspension to slide).
)‫حلقات التطعيم ( نقل المعلق البكتيري إلى الشريحة‬
6- Bunsen burner (sterilise inoculating loops before and after use).
)‫موقد بنزن ( تعقيم حلقات التطعيم قبل وبعد االستخدام‬
7- Pencil marker (mark particularly central portion of slide where bacterial smear is applied).
)‫قلم رصاص للتحديد ( يحدد الجزء المركزي بشكل خاص على الشريحة أثناء تطبيق اللطخة البكتيرية‬

7 March 2022 7
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Preparation of bacterial smear
‫تحضير اللطخة البكتيرية‬
Smear - is a distribution of bacterial cells on a slide for the purpose of viewing them under the microscope.
‫ توزيع الخاليا البكتيرية على الشريحة بغرض رؤيتهم تحت المجهر‬-‫اللطخة‬
Method of Smear preparation ‫طرق تحضير اللطخة‬
▪ Take one drop of normal saline on the glass slide and then add bacterial colony with inoculating loop in the central portion
of slide and expand in a circular fashion OR Putting of bacterial suspension (bacteria in liquid) to be stained on the central
portion of slide and expand in a circular fashion.
‫▪ خذي قطرة من المحلول الملحي على شريحة زجاجية ثم أضيفي المستعمرة البكتيرية بحلقة التلقيح في الجزء المركزي من الشريحة ووسعيها بنمط دائري أو‬
‫ضعي المعلق البكتيري ( البكتيريا في السائل) المراد صبغه على الجزء المركزي من الشريحة ووسعي بنمط دائري‬
▪ This is then allowed to air dry. ‫ثم اتركيها تجف في الهواء‬
▪ The next step is heat fixation to help the cells adhere to the slide surface.
‫▪ الخطوة التالية هي التثبيت الحراري لمساعدة الخاليا على االلتصاق على سطح الشريحة‬
▪ The resultant preparation called bacterial smear - appears dull white.
‫▪ التحضيرة الناتجة تسمى اللطخة البكتيرية – تبدو بيضاء باهتة‬
7 March 2022 8
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Preparation of bacterial smear
‫تحضير اللطخة البكتيرية‬

7 March 2022 9
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Heat fixation ‫التثبيت الحراري‬
Smear fixation/Heat fixation ‫ التثبيت الحراري‬/ ‫تثبيت اللطخة‬
▪ Pass air-dried smears through a flame two or three times or may use hot plate .
‫▪ مرري اللطخة المجففة بالهواء عبر اللهب مرتين أو ثالث مرات‬
▪ Do not overheat.‫ال تفرطي في التسخين‬
▪ Allow slide to cool before staining. ‫اتركي الشريحة تبرد قبل الصبغ‬
▪ Heat fixing kills the organisms, makes them adhere to the slide, and permits them to accept
the stain.
‫ و يسمح لهم بقبول الصبغة‬،‫ يجعلهم ملتصقين بالشريحة‬،‫▪ التثبيت الحراري يقتل الكائنات‬

7 March 2022 10
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Types of Simple Staining ‫أنواع الصبغ البسيط‬

1.Simple positive stain techniques.

‫تقنية الصبغ اإليجابي البسيط‬
▪ Staining can be performed with basic dyes
such as Crystal violet or Methylene blue.
‫▪ يمكن إجراء الصبغ بالصبغات القاعدية مثل‬
‫البنفسجي البلوري أو الميثلين األزرق‬
▪ Those positively charged dyes are attracted to
the negatively charged materials of the
microbial cytoplasm. Such a procedure is the
Simple positive stain procedure.
‫▪ هذه الصبغات ذات الشحنات الموجبة تنجذب للمواد‬
‫ هذا‬.‫المشحونة سلبا في السيتوبالزم الميكروبي‬
‫اإلجراء هو إجراء الصبغ اإليجابي البسيط‬

7 March 2022 11
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Types of Simple Staining ‫أنواع الصبغ البسيط‬

1.Simple positive stain techniques. ‫تقنية الصبغ اإليجابي البسيط‬

▪ Staining can be performed with basic dyes such as Crystal violet or Methylene blue.
‫▪ يمكن إجراء الصبغ بالصبغات القاعدية مثل البنفسجي البلوري أو الميثلين األزرق‬
▪ Those positively charged dyes are attracted to the negatively charged materials of the microbial cytoplasm. Such a
procedure is the Simple positive stain procedure.
‫ هذا اإلجراء هو إجراء الصبغ اإليجابي البسيط‬.‫▪ هذه الصبغات ذات الشحنات الموجبة تنجذب للمواد المشحونة سلبا في السيتوبالزم الميكروبي‬
Procedure ‫الخطوات‬
▪ Make a thin smear on a slide and heat fixes the smear.‫قومي بعمل لطخة الرقيقة على الشريحة‬
▪ Pour Loeffler’s methylene blue over the smear and allow it to stand for 3 minutes (or with crystal violet wait for 1 min or
safranine wait 3-4min).
)‫ دقائق‬4-3 ‫ دقيقة أو مع السافرانين انتظري‬1 ‫ دقائق ( أو مع البلورات البنفسجية وانتظري‬3 ‫▪ صبي الميثلين األزرق ليوفلر فوق اللطخة واتركيها حتى تتوقف لمدة‬
▪ Wash the stained smear with water and air dry it. ‫اغسلي اللطخة المصبوغة بالماء ودعيها تجف في الهواء‬
▪ Observe the smear first under low power (10x) objective, and then under oil immersion (100x) objective.

7 March 2022 )‫ مرة‬100( ‫ ثم تحت العدسة الشيئة المغموسة بالزيت‬،)‫ مرات‬10 ( ‫اللطخة أوال تحت قوة منخفضة‬12‫▪ شاهدي‬
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 ....Contd ‫متابعة‬
2. Simple negative stain techniques. ‫تقنية الصبغ السلبي البسيط‬
▪ Staining can be performed with acidic dyes such as Nigrosin or Indian ink.
‫ الصبغات الحمضية المشحونة سلبيا‬،‫▪ يمكن إجراء الصبغ بالصبغات الحمضية مثل النيغروسين أو الحبر الهندي‬
▪ The negatively charged dyes are repelled by the negatively charged cytoplasm and gather around the cells, leaving the cells clear and unstained.
.‫ تاركة الخاليا شفافة و غير مصبوغة‬، ‫▪ الصبغات المشحونة سلبيا يتنافرون بالسيتوبالزم المشحون سلبا و تتجمع حول الخاليا‬

▪ This technique is called the Simple negative stain technique. ‫هذه التكنيك يسمى تقنية الصبغ السلبي البسيط‬
Procedure ‫الخطوات‬
▪ Place a small drop of Indian ink at the one end of the slide. ‫ضعي قطرة صغيرة من النيغروسين على نهاية الشريحة‬
▪ Place a loopful of sample (bacterial colony/microorganisms) and mix with drop of Indian ink.
‫▪ ضعي حلقة من العينة ( خليط من الكائنات الدقيقة) و اخلطي مع قطرة النيغروسين‬
▪ Using the edge of another slide spread the drop out across the slide. Allow to air dry.
‫ دعيها تجف في الهواء‬. ‫▪ استخدمي حافة شريحة أخرى ووزعي القطرة عبر الشريحة‬
▪ Place one drop of immersion oil and examine under a microscope (100X). )‫ مرة‬100( ‫ضعي قطرة من زيت الغمس و افحصي تحت المجهر‬

7 March 2022 13
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 ‫أهمية الصبغ‬
‫دعنا نفهم بواسطة هذا المثال‬

1. ANSWER: D

:A

‫بدون صبغ‬ ‫الصبغ البسيط‬

‫الصبغ السلبي‬ ‫الصبغ التمايزي‬

7 March 2022 14
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 Questions from SLLE related to the topic of
this presentation
‫ متعلقة بموضوع هذا العرض‬SLLE ‫أسئلة من‬

1. WHICH OF THE FOLLOWING IS TRUE OF STAINING?

‫أي من التالي صحيح حول الصبغ؟‬
A) It is the process that renders the different tissue components more visible through
variation in color.
‫هي العملية التي تجعل األجزاء النسيجية المختلفة أكثر وضوحا من خالل اختالف اللون‬
B- Accomplished by the use of dyes and stains ‫يطبق باستخدام الصبغات‬
C- Promotes easier optical differentiation ‫يحسن التمايز البصري األسهل‬
D- All of the above ‫جميع ما سبق‬ ANSWER: D

:A

7 March 2022 15
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.
 References ‫المراجع‬

Basic Microbiology by Patric R Murray.

Textbook of Microbiology by Surinder Kumar, Jaypee brothers medical
publications.

7 March 2022 16
College of Applied Medical Sciences – Dawadmi Campus – Clinical laboratory Department.