TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



BÀI BÁO CÁO

Môn: Thực hành công nghệ sinh học

SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN - KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT
TRIỂN CỦA NẤM MEN TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Giảng viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Minh Hải
Th.S Nguyễn Tấn Anh Nguyên
Th.S Nguyễn Quỳnh Dao
Sinh viên thực hiện:

STT Họ và tên Lớp MSSV

1 Trần Thị Mộng Cầm D20_TP02 DH62006441

2 Trần Kiến Hào D20_TP02 DH62007278

3 Trương Huỳnh Thanh Phước An D20_TP02 DH62007220

4 Trương Tổ Dân D20_TP02 DH62004754

5 Phạm Quốc Đạt D20_TP02 DH62006450

Tháng 3/2023
 BÀI 1: SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN - KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH
PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
I. NẤM MEN SACCAROMYCES CEREVISIAE
- Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có
trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại vi sinh
vật thuộc chi Saccharomyces lớp Ascomycetes ngành nấm. Loài này có thể
xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm
trước đến nay [1]
- Saccharomyces cerevisiae là một trong những loài sinh vật nhân chuẩn được
khoa học dùng nhiều nhất, cùng với E.coli là hai loài sinh vật mô hình phổ biến
nhất
- Là một sinh vật đơn bào, Saccharomyces cerevisiae là một phần của giới nấm.
Mặc dù tên gọi chung của nó là nấm men bánh mì (Vì có tác dụng làm bột mì
trương nở) hoặc nấm men bia thì tên chi của nó lại bắt nguồn từ cụm từ
saccharose (đường) và mycelium (nấm). Tên loài là ‘cerevisiae’ nghĩa là bia
lúa mạch hoặc lúa mì lên men truyền thống của Gauls [2]
- Cấu tạo chủ yếu là protein, lipit và ít polisaccarit
- Ứng dụng của saccharomyces cerevisiae:
+ Trong sản xuất bánh mì
+ Trong sản xuất bia
+ Trong sản xuất rượu
II. NGUYÊN VẬT LIỆU
- Giống nấm men: Saccharomyces cerevisiae

Hình 1: Saccharomyces cerevisiae

- Thiết bị lắc ổn nhiệt
- Kính hiển vi

Hình 2: Kính hiển vi

- Buồng đếm hồng cầu

Hình 3: Buồng đếm hồng cầu

- Lame kính

Hình 4: Lame kính

- Ống cuvet
 Hình 5: Ống cuvet
- Máy đo quang phổ OD (optical density)

- Micropipette

Hình 6: Micropipette được dùng trong phòng thí nghiệm

 - Môi trường lên men M4 gồm
+Dịch chiếc cà chua: 250 ml
+ glucose: 5%
+ ampicilline: 0.5ml (phòng thí nghiệm đã chuẩn bị)
 Cách pha chế dịch chiết cà chua: 75g cà chua được lột vỏ, cắt nhỏ và
đun sôi với 300 ml nước trong 30 phút. Lọc qua vải mỏng (hoặc rây) lấy
phần dịch trong. Bổ sung nước cho đủ 250ml

Hình 7,8: pha chế dịch chiết cà chua

- Metyl blue: hoá chất nhuộm được sử dụng phổ biến trong các phòng thí
nghiệm y sinh học. Nó được ứng dụng nhiều trong đánh giá tỷ lệ sống chết của
tế bào, tế bào nấm men
- Tại sao phải dùng Methyl blue?
Bởi vì nguyên lý của phương pháp này là dựa vào đặc tính thấm khác nhau
giữa tế bào sống và tế bào chết. Những tế bào còn sống, màng có tính thấm
chọn lọc, do đó thuốc nhuộm như methylene blue không thể đi qua. Ngược lại,
đối với tế bào chết, màng mất đi tính thấm chọn lọc, nên khi nhuộm với hoá
chất này nó sẽ bắt màu xanh đậm. Ngoài ra, methylene blue còn được sử dụng
để nhuộm trực khuẩn, đặc biệt trực khuẩn bạch hầu. Đối với phương pháp này
tế bào trực khuẩn sẽ được nhuộm với methylen blue trong môi trường kiềm
hoá
III. Cách tiến hành

1. Sản xuất sinh khối:

B1: Hút 5ml nấm men từ bình nấm men đã được chuẩn bị từ phòng thí nghiệm
chuyển vào môi trường sử dụng (Saccharomyces cerevisiae được nuôi trong
môi trường Hansen trong 48h ở điều kiện nhiệt đồ phòng)
B2: Lắc đều
B3: Đem bình môi trường vào thiết bị lắc ổn nhiệt, lắc với tốc độ 220rpm, nhiệt
độ 28-35oC

Hình 9: Những bình môi trường được đặt vào thiết bị lắc ổn nhiệt

2. Chuẫn bị mẫu đo OD

Chuẩn bị 9 ống nghiệm

đánh số từ t0 → t8

Lấy 1ml dung dịch mẫu + 4 ml nước

cất vào 8 ống còn ống blank (t0) là 5ml
nước cất

Lắc đều

Đo OD λ = 600nm

Ghi kết quả

  Cách đo độ hấp thụ A600nm
B1: Mở máy đo
B2: Chỉnh λ= 600nm
B3: Cho nước cất làm mẫu blank và cho vào cuvet
B4: Bấm mesure sau đó bấm B
B5: Lấy cuvet khác tráng nước
B6: Sau khi đổ nước cất, tiếp tục tráng bằng dung dịch mẫu

B7: Cho 1 ít dung dịch mẫu cần đo vào cuvet

B8: Để vị trí rồi đậy nắp máy đo

B9: Bấm số 1
B10: Ghi kết qủa

3. Xác định tổng số tế bào/ml bằng buồng đếm hồng cầu

B1: Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm
B2: Cho 1 giọt methylene blue
B3: Lắc đều
B4: Lấy lame kính để lên buồng đếm
B5: Lấy 1 ít mẫu trong ống nghiệm bỏ vào buồng đếm
B7: Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi
B8: Ghi kết quả

IV. KẾT QUẢ TÍNH TOÁN VÀ BIỆN LUẬN

 Thời gian
( giờ) Số tế bào Tổng tế bào

Sống 113
T0
Chết 37
Độ pha loãng n=1
Chồi 6 156

Sống 67
T1
Chết 4 107
Độ pha loãng n=1
Chồi 36

Sống 101 127

T2
Chết 23
Độ pha loãng n=1
Chồi 3

Sống 114
T3
Chết 35 292
Độ pha loãng n=1
Chồi 143

Sống 143
T4
Chết 21 169
Độ pha loãng n=2
Chồi 5

Sống 200
T5
Chết 29 232
Độ pha loãng n=2
Chồi 3

Sống 108 152

T6
Chết 43
Độ pha loãng n=2
Chồi 1

Sống 133
T7
Chết 43
Độ pha loãng n=2
Chồi 2 178
 Thời
gian N N1 N2
( giờ)
0 7800000 1850000 3000
1 5350000 200000 18000
2 6350000 1150000 1500
3 14600000 1750000 71500
4 8450000 1050000 2500
5 11600000 1450000 1500
6 15200000 4300000 1000
7 17800000 4300000 2000

Ta có:
N = {a/b x 400/0.1} x 103 x n
N1 = {a1/b x 400/0.1} x 103 x n
N2 = {a2/b x 400/0.1} x 103 x n
Trong đó:
- N: tổng số tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu
- N1: tổng số tế bào chết trong 1ml mẫu nghiên cứu
- N2: tổng số tế bào nảy chồi trong 1ml mẫu nghiên cứu
- a: tổng số tế bào trong 5 ô vuông lớn
- a1: tổng số tế bào chết trong 5 ô vuông lớn
- a2: tổng số tế bào nảy chồi trong 5 ô vuông lớn
- b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn ( 16*5 = 80)
- 400: tổng số ô vuông nhỏ
- 0.1 : thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3 ) chứa trên ô trung tâm
- 103 : số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml)
- n: độ pha loãng của mẫu dung dịch nuôi cấy trên nấm men

Thời Tỉ lệ Tỉ lệ nảy
lgN lg N1 lg N2 c
gian A600nm chết chồi g 
(tb/m) (tb/m) (tb/m) ( giờ)
( giờ) (%) (%)
0 0.424 15.870 14.431 8.006 23.72 0.04 0 - -
1 0.324 15.493 12.206 9.798 3.74 0.34 -1.998 -0.501 -0.345
2 0.283 15.664 13.955 7.313 18.11 0.02 4.596 0.218 0.150
3 0.398 17.190 15.068 11.871 11.99 0.49 -0.884 -1.131 -0.781
4 0.389 16.643 14.557 8.517 12.43 0.03 3.501 0.286 0.197
5 0.194 16.960 14.880 8.006 12.50 0.01 4.196 0.238 0.164
6 0.481 16.537 14.581 6.908 14.14 0.01 -1.908 -0.524 -0.362
7 0.460 16.695 15.274 7.601 24.16 0.01 -2.202 -0.454 -0.313

Ta có:
t ln 2(t 2−t 1)
Thời gian thế hệ g: g = n = (lnN −lnN 0)
lnN −lnN 0
Tốc độ tăng trưởng riêng:  (t−t 0)

1 n
Hằng số tốc độ phân chia: c = g = t

Mối liên hệ giữa hằng số tốc độ sinh trưởng (µ), hằng số tốc độ phân chia (c )
và thời gian thế hê (g) là c = 0,69 * c/g
Tỉ lệ chết (%) = N1/N x 100
Tỉ lệ nảy chồi (%) = N2/N x 100
*Biểu đồ

Biểu đồ biểu diễn A600nm theo thời gian t

0.6
0.481
0.5 0.46
0.424
0.398 0.389
0.4
A 600nm

f(x) = 0.00905952380952381
0.324 x + 0.337416666666667
R² = 0.0529216178934562
0.283
0.3
0.194
0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t (Giờ)

Nhận xét, biện luận:

- Độ hấp thu của mẫu có xu hướng tăng dần nhưng giảm mạnh ở thời gian
t5.
 - Cao nhất ở t6 là 0.481A còn thấp nhất là 0.194A ở t5

Đồ thị biểu tổng số tế bào (N) theo thời gian t

20000000
17800000
18000000
16000000 15200000
f(x) = 1533928.57142857 x 14600000
+ 5525000
14000000 R² = 0.670456132104188
11600000
12000000
N (tb/ml)

10000000 8450000
7800000
8000000 6350000
6000000 5350000

4000000
2000000
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t (giờ)

Nhận xét, biện luận:

- Dựa vào biểu đồ ta thấy tổng số tế bào ở giai đoạn t1 thấp nhất và tăng
nhanh cho đến t5 đạt tổng số lượng tế bào cao nhất, sau đó do pha loãng
mà tế bào giảm ở giai đoạn t6, t7 cho tổng số tế bào xấp xỉ nhau.

0 1 2 3 4 5 6 7
Tỉ lệ chết 23.72 3.74 18.11 11.99 12.43 12.50 14.14 24.16
Tỉ lệ nảy chồi 0.04 0.34 0.02 0.49 0.03 0.01 0.01 0.01
 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ chết, tỉ lệ nảy chồi (%) theo thời gian t
30.00

25.00 23.72 24.16

22.29

20.00
18.11

15.00 14.14
%

12.43 12.50

10.00

5.00 3.74

0.04 0.34 0.02 0.05 0.03 0.01 0.01 0.01

0.00
0 1 2 3 4 5 6 7

t ( giờ )
Tỉ lệ chết Tỉ lệ nảy chồi

Nhận xét, biện luận:

- Qua biểu đồ trên ta thấy tỉ lệ tế bào chết tăng giảm liên tục theo thời
gian, ở thời gian t0 tế bào chết khá nhiều vì tế bào nấm men vừa được
thêm vào môi trường chưa kịp thích ứng với môi trường nuôi cấy nên tỉ
lệ chết cao
- Tỉ lệ này chồi của tế bào nấm men chiếm rất ít so với tỉ lệ chết
- Tỉ lệ chết của nấm men qua các t tiếp theo giảm dần vì khi đó các tế bào
nấm men sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để sinh
trưởng và phát triển nhưng lại tăng cao ở t6 và t7

[1] Feldmann, H. (2011). Yeast: molecular and cell biology. John Wiley &
Sons
[2] https://chatluongthucpham.com/moi-truong-nuoi-cay-saccharomyces-
cerevisiae/?fbclid=IwAR3GSgtnnikzxWeR-zinBRYUFQ-
yXo_tGEhrnj5lvOQ_8_18id0vmPfZVQA