ĐÌNH TOẠI - NGUYỄN THỊ VÂN HẢI

t&ct viện cãa cÁútty t<ỳi

Xin vui lòng:
r
(}íuiỡ. rtùtmỹ, &<Ị*1 <£ã d ế* v é i

• Không xé sách
• Không gạch, viết, vẽ lên sách

THU VIEN DAI HOC NHA TR ANG

3000010669

C P
NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT
Trần Đình Toại - nguyễn Thị Vân lịảỉ

KỘNG HỌC CÁC QUÁ TRÌNH

XÚC TẮC SINH HỌC

TRƯƠNG8ẠÍ HỌCNliATRAHS
THƯ VIỀN
.... . ......... .. -I

Ị ự / 0 ^ 0

NHÀ XUẤT BÀN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT

 Chịu trách nhiệm xuất bản: PG S. T S. T Ô Đ Ả N G H A I

Biên tập: K IM AN H

N H À X U Ấ T BẢN K H O A H Ọ C VÀ K Ỹ T H U Ậ T

70 T R Ầ N H Ư N G Đ Ạ O , H À N Ộ I

6.6C8
KHKT - 2005

In 500 ouốn khổ 16*24 cm tại Nhà in Khoa học và Công nghệ.
Số giấy phép: 1288-52 cấp ngày 9/8/2005.
In xong và nộp lưu chiểu tháng 11/2005.
 LỜI NÓI ĐẦU

Sinh học là khoa học nghiền cứu về các đối tượng sống, từ nhỏ bé nhất, sơ
dẳng nhất như virus, vi khuẩn, tế bào tới các sinh vật bậc cao rồi tới người. Sình
học nghiên cứỉí các đối tượng, tìm ra các quy ỉnật phát triển của chúng. Phương
pháp của các nhà sinh học thiên về nghiên cứu mô ỉả hiện tượng một cách định tính
đ ể tìm ra bản chất của chúng.

Các nhà hóa sinh, khi nghiên cứu các đối tượng sinh học, đánh giá một
cách định lượng đ ể đi sâu vào bản chất. Đối với cấc nhà hóa sinh, bản chất của sự
sống chính lả một ỉoạt các phản ứng hóa học ỉiên tiếp xảy ra trong cơ thể sống.
Các nhà hóa sinh có nhiệm vụ nghiên cứu các phản ứng ấy trong hệ sinh học tìm ru
quy luật tiến hành chúng ngoài thực tế, đóng góp một phần trong công nghệ sinh
học phục vụ đời sống kinh tế quốc dân.

"Thếkỷ XXỈ ỉà thể kỷ của sình học. Trong kỷ nguyên sinh học ấyt cùng với
các mũi nhọn khúc, thì côìĩg nghệ sình học cũng sè là một mũi nhọn”. Vậy “Công
nghệ sinh học ’’ Ịà gì, đưa lại những thành quả ra sao ?

Công nghệ sinh học là ngành khoa học nghiên á m íữig dụng các quá trình
ị đối tượng) sinh học tìm ra quy luật phát triển của chúng đ ể đưa vào sản xuất (công
nghiệp) theo chiều hướng mong muốn.

Công nghệ sinh học chia ra các phần sau: công nghệ vi sinh, công nghệ tế
bào, công nghệ emym, công nghệ (kỹ thuật) gen. Theo thứ tự nêu trên, công nghệ
nêu trước là nền tảng cho công nghệ nêu sau, công nghệ nêu sau sẽ được tiến hành
tốt trên cơ sở đã thực hiện tốt các công nghệ nêu trước và có tác động trở ỉại tới sự
phớt triển của công nghệ nêu trước. Có thể nói, công nghệ vi sinh đã được ứng dụng

3
hàng nghìn năm nay, từ khi người ta biết lên men rượii và lên men dấm. Vào th ế kỷ
XIX, sau khi tách chiết được enzym (năm ỉ 833, haỉ nhà bác học Paien và Perso khi
nghiên cứii quá trình chuyển hóa đường thành rượu đã xác định được chất xúc tác
cố khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường), việc nghiên cứu các phản ứng
enzym ngoài cơ thể đã mở đầu cho công nghệ enzym phát triển. Đó là một đột biến
trong nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ sinh học bước vào giai đoạn
mới, hiệu quả hơn, mở rộng hơn những ứng dụng thực tế, đưa ra nhiều sản phẩm
mới hơn.

Tuy gọi tên các công nghệ khác nhau, nhưng bản chất của cấc công nghệ
đều là các phản ứng hoá học được xúc tác bởi enzym. Do đó, công nghệ enzym
chính là cốt lõi của công nghệ sinh học, chiếm vị trí quan trọng.

Nghiên cứu động học là phương pháp hóa lý nhằm nghiên cứu tốc độ, chiều
hưởng, ảnh hưởng các yểu tổ bẽn ngòai đến tiến triển của quá trình nhằm nâng cao
hiệu quả của chúng.

Như vậy, nghiên cứii xức tác sinh học, mà bản chất của chúng là chất sống
như: enzym, protein, tể bào, vi sinh với quan điểm hóa học, công nghệ là nền tảng
cơ sở Ịý luận, cho phép hiểu sâu bản chất của các quá trình sinh học, đ ể đưa chúng
vào ứng dụng thực tiễn một cách cồ hiệu quả.

Ngày nay, công nghệ sinh học đđ đạt được nhiềụ thành tựu phục vụ cho nền
kinh tê quốc dân, trong đố, eniym cũng đã được ứng đụng trong nhiều lĩnh vực như:
công nghiệp thực phẩm ; nông nghiệp; y dược; giấm sát và xử lý môi trường bị ô
nhiễm v.v.

Trong cuốn sách này chúng tôi muốn giới thiệu tì m ì hơn các quy luật động
học của quá trình xúc tác enzym\ vi sình giúp cho giáo viên, sinh viên, nghiên cứu
sinh trong các trường cao đẳng, đại học muốn đi sâu nghiên cứu cấc cồng nghệ này
với sự sáng tạo của mình nâng cao hơn nữa hiệu quả ứng dụng của' chúng, ứng
dụng những điều học được trong nhà trưởng vào thực tế phục vụ đời sống.

4
1
ĐỘNG HỌC XÚC TÁC ENZYM
■ ■

Chúng ta đểu biết thế nào là sự sống, biết phân biệt được chất sống và chất
không sống. Song, ở mỗi khía cạnh khác nhau lại có một định nghĩa khác nhau để
thật phù hợp với bản chất của sự sống. Với cách nhìn của các nhà hóa sinh thì sự
sống được biểu hiện bởi một dãy các phản ứng hóa học phối hợp, nối tiếp, Tốc độ
của các phản ứng này và bản chất của các chất tạo thành phụ thuộc vào những chất
xúc tác được tạo nên bởi những hệ sống. Những chất xúc tác này gọi là những chất
xúc tác sinh học hay gọi là “enzym”.

Enzym là gì, cố cấu trúc ra sao, cơ chế tác dụng thế nào là những vấn đề
được tranh cãi và nghiên cứu qua nhiều giai đoạn. Năm 1897 nhà hóa sinh người
Đức Buchner đã chiết được enzym chuyển hóa đường thành rượu ở dạng dung địch.
Kết quả này đã đặt nền tảng cơ sở cho việc tách chiết enzym từ những tế bào sống.
Tới năm 1926, lần đầu tiên Samer (1887 - 1955) đã tách được enzym urease ở dạng
tinh thể. Cho tới nay thì người ta đã biết chiết được khoảng hơn hai nghìn enzym,
trong đó có hơn 500 loại đã thu được ở dạng tinh thể.

1.1. ĐẶC TRƯNG CỦA ENZYM

1.1.1. Định nghĩa tính chất của enzym

Về mặt cấu trúc, enzym cũng là một loại protein, nhưng có phân tử lớn
njiất, chúng là những bộ máy chuyên môn để thực hiện các hoạt động của gen và
xúc tác các phản ứng hóa học để thực hiện việc ưao đổi chất.

5
 Theo cấu trúc, các enym có thể chia làm 2 loại. Một loại chỉ gồm thành
phần có tính chất protein, còn loại thứ hai, ngoài thành phần có tính chất protein,
còn chứa thành phần không có tính chất protein gọi là coenzym.

Nói chung, coenzym cũng có thể thực hiện vai trò xúc tác nhưng khi liên
kết với thành phần protein của enzym thì hoạt tính của nó tăng lên đột ngột. Trong
rất nhiều enzym, thành phần không có tính chất protein ià những vitamin. Chẳng
hạn, vitamin B6 là coenzym của hơn 30 loại enzym xúc tác quá trình chuyển dịch
nhóm amin từ aminoacid đến ketoacid; BI 5 là coenzym của hệ enzym xúc tác
chuyển dịch nhóm methyl trong quá trình tổng hợp glycogen ở gan.

Enzym cũng là protein, do đó, ở nhiệt độ cao chúng không bền vững, bị
biến tính (denaturation), mất tính chất xúc tác. Enzym đồng thời cũng là chất xúc
tác, đo đó tính chất xúc tác của nó phụ thuộc vào nhiệt độ cũng theo quy luật động
học. Chính vì vậy, đồ thị phụ thuộc hoạt tính xúc tác của enzym vào nhiệt độ có cực
đại. Hoạt tính xúc tác của đa số các enzym có cực đại nằm trong khoảng 30 - 40°c.
Nhưng cũng có những enzym có cực đại của hoạt tính xúc tác ở vùng nhiệt độ cao
hơn nữa.

Enzym có trọng lượng phân tử lổn cũng như protein, có thể dao động từ cỡ
10.10* đến 10.106 đơn vị. Thí dụ; xem bảng 1.1.

Bảng 1.1. Trọng lượng phân tử một số enzym

Enzym Trọng lượng phân tử

Rbonuclease 35.000
Hexokinase 96.000
Tritophan sintetase 117.000
Gluoseoxidase 154.000
Xantin oxidase 300.000

Glycogenphosphomlase 495.000

Glutamatdehyrogenase 1.000.000
 Nồng độ ion H+ có ảnh hương rất quyết định đến hoạt tính xúc tác cúa
enzym. Nồng độ ion H+ có tác dụng tới sự phân ly các nhóm chức của trung tàm
hoạt dộng, do đó ảnh hưởng tới hoạt tính của enzym. Mỗi enzym có vùng pH tối ưu
cho hoạt tính. Thí dụ: xem bảng 1.2.

Báng 1.2. pH tối ưu cho hoạt động của một số enzym

Enzym Ký hiệu Cơ chất pHopt

Pepsin 3.4.4.1 Hemoglobin 2,2

Pyruvatcarboxidase 6.4.1.1 Pyruvat 4,8

Phumarathydratase 4.2.1.2 Phumarat 6,8

Tripsin 3.4.4.4 Benzalargininamid 7,7

Arginase 3.5.1.1 Arginin 9,7

Ribonuclease 3.1.4.2.2 ARN 2,7

1.1.2. Câu trúc enzym

Enzym cũng là protein, do đó các liên kết trong enzym cũng có 4 bậc liên
kết như đối với protein. Ngoài ra, enzym còn có cặu trúc đặc biệt khác là trung tâm
hoạt động và trong tế bào tạo rhành hệ enzym.

1.1.2.1. Bậc cấu trúc và liên kết

❖ Cáu trúc bậc 1: đó là liên kết giữa các aminoacid trong protein của
enzym để tạo thành mạch dài:
H H H I H
R ,- C —CO OH + N H 2— C — R2 ------ ► R | - c —c o o NH C — R2
NH2 COOH NH2 , COOH

Các ĩLạcb protein được tạc thành cũng có thể liên kết với nhau qua cầu nối SH:
 ❖ Cấu trúc bậc 2: đó là mối liên kết hydro được tạo thành giữa các chất
cho và nhận năng lượng.

1,2A 1,7 Ả

Liên kết hydro trong các mạch peptit để tạo protein là liên thẳng. Có 2 khả
năng liên kết hydro:

• Liên kết au đó là liên kết giữa

những vòng xoắn của một mạch protein,
chung được tạo nên bởi những gốc 5,4 Ả
aminoacid ở cách xa nhau, không liền nhau.: (3,6 aminoacid)

Trung bình, mỗi liên kết a được tạo nên giữa

khoảng cách 3,6 aminoaciđ. Khoảng cách
trung bình giữa 2 vòng xoắn của mạch
protein ià 5,4Ả.

• Liên kết fi: liên kết được tạo nên giữa các vòng xoắn cùa nhũng mạch
protein khác nhạu, tạo nên mạng luới phẳng hoặc mạng lưới có cấu trúc không gian.

❖ Cấu trú c bậc 3: ngoài hai kiểu cấu trúc nồu trôn, mạch protein có thể
cuộn lại thành khối vững chắc. Đó là cấu trúc bậc 3.

❖ Cấu trú c bậc 4: trong một số trường hợp, phân tử rất lớn của enzym có
thể được tạo thành từ những đơn vị nhỏ.

Thí dụ: hydrogenase có 2 tiểu đơn vị; axetylcholinesterase có tới 4 tiểu đơn V Ị .
1 1 2.2. Trung tâm hoạt động của enzym

Hoạt tính xúc tác của enzym phần lớn thường được thể hiện và quyết định
bởi các trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động thường là một phức hoặc một
nhóm liên kết chặt chẽ với mạch protein của enzym. Các phản ứng thường xảy ra
trên bể mặt của trung tâm hoạt động. Các cơ chất tiến gần tới trung tâm hoạt động
tạo phức enzym - cơ chất, v ề mặt nhiệt động học, phức enzym - cơ chất làm giảm
nãng lượng hoạt hóa của phản ứng làm phản ứng xảy ra đễ dàng.

Thí dụ: trung tâm hoạt động của hydrogenase gồm 2 hình lập phương với

Các nhóm chức gắn trong mạch protein có thể từng cặp tạo thành trung tâm
hoạt động cùng hỗ trợ tham gia vào quá trình xúc tác.

Thí dụ:

- Nhóm immidazol của gốc histidin và nhóm súlíua (SH) cửa gốc cystin tạo
thành cặp trong trung tâm hoạt động của hexokinase (EC. 2.7.1.1), creatinkinase
(EC. 2.7.3.20 p-galactosidase (EC.3.2.1.2.3):

ấ
 r

- Cặp histidin (immidazol) và serin (hydroxyl OH) trong trung tâm hoạt
động của tripsin (EC.3.4.4.4), trombin (EC.3.4.4.13), a-chimotripsin:

1.1. 3. Phân loại và gọi tên enzym

1.1.3.1. Phương pháp phân loại enzym

Tất cả các enzym đều được gọi tên và được xếp vào “Hệ thống phân loại“
gồm lớp (class), lớp phụ (subclass), nhóm (section).

❖ Lớp: các enzym có cùng tính chất đặc trưng cho phản ứng mà enzym
xúc tác dược xếp vào cùng 1 lớp. Hệ thống phân loại gồm 6 lớp.

❖ Lớp phụ: các enzym trong cùng 1 lớp, nhưng tác động tới các nhóm
chức hoặc các liên kết khác nhau được xếp vào những lớp phụ khác nhau.

❖ Nhóm: các enzym trong cùng lớp phụ được xếp vào các nhóm đặc trưng
cho phản ứng biến đổi cụ thẻ từng cơ chất.

1.1.3.2. Tên và ký hỉệu enzym

(Chú ý: Chúng tôi xin được phép giữ nguyên tiếng Anh cho tên gọi các enzym).

❖ Tên enzym: tên enzym được gọi theo một số cách sau:

❖Theo cơ chất phản ứng mà enzym xúc tác (tên phân loại): thí dụ alcohol
dehydrogenase EC 1.1.1.1 là enzym xúc tác phản ứng làm mất hydro của alcohol:

Aicohoi + NAD+ = aldehyde; ketone + NADH + H+

❖ Theo nguồn gốc enzym: thí dụ papain (EC 3.4.22.2) là enzym xúc tác
phản ứng thủy phân (phá) liên kết peptit được lấy tên từ cây đu đủ Papaya có chứa
enzym này.

10
 • Tên thương mại: thí dụ neutrase của hãng Novo Đan Mạch chính là các
enzym đường hóa amylase dùng trong công nghệ sản xuất bia.

❖ Ký hiệu enzym: mỗi enzym có một ký hiệu riêng biệt dược biểu diền
bởi các cụm số: cụm số đầu tiên ký hiệu lớp. cụm sô thứ hai sau dấu chấm là lớp
phụ, cụm số thứ ba là nhóm, cụm số thứ tư là tên.

Thí dụ: enzym a-L-fucosidase có ký hiệu EC 3.2.1.51, trong dó số 3 đầu tiên

chỉ ra rằng enzym này thuộc lớp 3 hydrolase, sô' 2 sau dấu chấm thuộc lớp phụ 2
glycosylase, số 1 sau dấu chấm thuộc nhóm 1 glycosidase là các enzym thuỷ phân
hợp chất O- and S-glycosyl, cụm số cuối cùng 51 chỉ tên enzym xúc tác phản ứng:

a-L-fucoside + H20 = L-fucose + alcohol

1.1.3.3. Hệ thôhg phân loại enzym

Sau đây là hệ thống phân loại enzym:

EC 1 Oxidoreductase: các enzym xúc tác phản ứng oxy hóa - khử.

EC 2 Transferase: các enzym xúc tác phản ứng vận chuyển các nhóm chức.

EC 3 Hydrolase (và peptidase); các enzym xúc tác phản ứng thủy phân.

EC 4 Lyase: các enzym xúc tác phản ứng liên kết vào nối dồi.

EC 5 Isomerase: các enzym xúc tác phản ứng isome hóa.

EC 6 Ligase: các enzym xúc tác phản ứng có ATP tham gia để tạo liên kết.

1.1.4. Thí dụ phản ứng đặc trưng của một số enzym

1.1.4.1. EC 1 Oxỉdoreductase

EC 1.1.1.1: Alcohol dehydrogenase

Phản ứng : alcohol + NAD+ = aldehyde hoặc ketone + NADH + H+.

Tên khác: aldehyde reductase; alcohol dehydrogenase (NAD).

Tên phân loại: alcohol:NAD+ oxidoreductase.

11
EC 1.1.3.1: Glicolic acid oxidase

Phản ứng: CH2NH2.COOH + 0 2+ HzO -> COH.COOH + H20 2 + NH,

Acid glycolic Acid glyoxylic

EC 1.2.1.1: Formaldehyde dehydrogenase (glutathione)

Phản ứng: formaldehyde + glutathione + NAD+ = S-formylglutathione +

NADH + H+

Tên khác: NAD-linked formaldehyde dehydrogenase; formaldehyde

dehydrogenase.

Tên phân loại: formaldehyde:NAD+ oxidoreductase.

EC 1.3.1.57: Phloroglucinol reductase

Phản ứng: dihydrophlorogiucinol + NADP* = phloroglucinol + NADPH + H+

Tên phân loại: dihydrophloroglucinol’.NADP* oxidoreductase

EC 1.4.1.1: Alanine dehydrogenase

Phản ứng: L-alanine + H20 + NAD+ = pyruvate + NHj + NADH + H*

Tên khác: L-alanine dehydrogenase; alanine oxidoreductase;

Tên phân loại: L-alanine:NAD+ oxidoreductase (khử nhóm amin).

EC 1.4.3.2: L-amino acid oxiđase: xức tác chuyển hoá các amin dạng lập thể L

L-R-CH(NH2)-COOH +H20 + E-FMN R- COCOOH + NH3+ E-FMN.H2

E c 1.4.3.2: D-amino acid oxidase: xúc tác chuyển hoá các amin dạng lập thể D

D-R-CH(NH2)-COOH + H20 + E-FAD -> R-COCOOH + NH, + E-FAD.H2

EC 1.4.3.4: Monoaminoxidase

CH2NH2 + 0 2 + h 2o -> rcho + h 2o 2 + n h 3

EC 1.5.1.23: Tauropine dehydrogenase

12
 Phản ứng: tauropine + NAD+ + H20 = taurine + pyruvate + NADH + H+

Tên phân loại: N2-(D-1-carboxyethyl)taurine: NAD+ oxidoreductase.

EC 1.6.3.1: NAD(P)H oxidase

Phản ứng: NAD(P)H + H+ + Oz = NAD(P)+ + H20 2

Tên khác: thyroid NADPH oxidase; thyroid oxidase 2; NADPH oxidase.

Tên phân loại: NAD(P)H: oxygen oxidoreductase

EC 1.7.1.1: Nitrate reductase (NADH)

Phản ứng: nitrite + NAD+ + H20 = nitrate + NADH + H+

Tên khác; NADH-nitrate reductase; nitrate reductase (NADH2); NADH2:

nitrate oxidoreductase.

Tên phân loại: nitrite:NAD+ oxiđoreductase.

EC 1.8.1.3: Hypotaurine dehydrogenase

Phản ứng: hypotaurine + H20 + NAD+ = taurine + NADH + H+

Tên phân loại: hypotaurine; NAD+ oxidoreductase.

EC 1.10.2.2: ưbiquinol-cytochrome-c reductase

Phản ứng: QH2 + 2 ferricytochrome c = Q + 2 ferrocytochrome c

Tên khác: coenzym Q-cytochrome c reductase;.

EC 1.10.3.1: Catechol oxidase

Phản ứng: 2 catechol + 0 2 = 2 1,2-benzoquinone + 2 HzO

Tên khác: diphenol oxidase; ớ-diphenolase; phenolase; polyphenol

oxidase; tyrosinase; pyrocatechol oxidase; dopa oxidase; catecholase; O-diphenol;
oxygen oxidoređuctase; O-diphenol oxidoreductase.

Tên phân loại: l,2-benzenediol:oxygen oxiđoređuctase

13

1
 \

EC 1.10.3.4: O-aminophenol oxidase

Phản ứng: 2 2-aminophenol + 3 0 2 = 2 isophenoxazine + 6 H20

Tên khác: isophenoxazine synthase (ơ-am inophenol: 0 2 oxidoreductase).

Tên phân loại: 2-aminophenol:oxygen oxidoreductase.

EC 1.11.1.3: Fatty-acid peroxidase

Phản ứng: palmitate + 2 H20 2 = pentadecanal + C 0 2 + 3 H20

Tên khác: peroxidase acid béo mạch đài.

Tên phân loại: hexadecanoate:hydrogen-peroxide oxidoreductase.

EC 1.11.1.6: Catalase

Phản ứng: 2 H A = 0 2 + 2 H 20

Tên khác: equilase; caperase; optidase; catalase-peroxidase; CAT.

Tên phần loại: hydrogen-peroxiđe:hydrogen-peroxiđe oxidoreductase.

EC 1.11.1.7: Peroxidase

Phản ứng: donor + H20 2 = oxidized donor + 2 H20

Tến khác: myeloperoxidase; lactoperoxidase; verdoperoxidase; guaiacol

peroxidase; thiocyanate peroxidase; eosinophil peroxidase; Japanese radish
peroxidase; horseradish peroxidase (HRP); extensin peroxidase; heme peroxidase;
MPO; oxyperoxidase; protoheme peroxidase; pyrocatechol peroxidase; scopoletin
peroxidase.

Tên phân ioại: donorhydrogen-peroxide oxidoreductase.

EC 1.12.7.2: Ferredoxin hydrogenase

Phản ứng: H2 + oxidized ferredoxin = reduced ferredoxin + 2 H+

14
 Tên khác: H: oxidizing hydrogenase: H2 producing hycỉrogenase
[ambiguous]; bidirectional hydrogenase; hydrogen-lyase [ambiguous]; hydrogenase
(ferredoxin); hydrogenase I; hydrogenase ĨI: hydrogenỉyase [ambiguous]: uptake
hydrogenase [ambiguous].

Tên phân loại: hydrogenferredoxin oxidoreductase.

EC 1.12.99.6: Hydrogenase (acceptor)

Phản ứng: H2 + A = AH2

Tên khác: H-, producing hydrogenase.

Tên phân loại: hydrogen:(acceptor) oxidoreductase.

1. 1. 4. 2. EC 2 Transferase

EC 2.1.1.7: Nicotinate N-methyltransferase

Phản ứng: S-adenosyl-L-methionine + nicotinate =

S-adenosyl-£-homocysteine + N-methylnicotinate.

Tên khác: furanocoumarin 8-methyltransferase.

Tên phân loại: S-ađenosyl-L-methionine:nicotinate N-methyltransferase.

EC 2.1.3.5: Oxamate carbamoyltransferase

Phản ứng: carbamoyl phosphate + oxamate = phosphate + oxalureate

Tên khác: oxamic transcarbamylase.

Tên phân loại: carbamoyl'phosphate.oxamate carbamoyltransferase.

EC 2.3.1.157: Glucosamine-1-phosphate N-acetyltransferase

Phản ứng: acetyl-CoA + a-D-glucosamine 1-phosphate =

CoA + N-acetyl-a-D-giucosamine 1-phosphate

15
 Tên khác: acetyl-CoA:D-glucosamine-l-phosphate N-acetylưansferase.

Tên phân loại: acetyl-CoA:aa-£)-glucosamine-l-phosphate N-acetyltransferase.

EC 2.4.1.106: Isovitexin p-glucosyltransferase

Phản ứng: UDP-glucose + isovitexin = UDP + isovitexin 2"-ơ-p-D-glucoside.

Tên khác: uridine diphosphoglucose-isovitexin 2n-glucosyltransferase.

Tên phân loại: ƯDP-glúcose:isovitexin 2"-ơ-p-D-gliicosyítransferase.

EC 2.4.1.139: Maltose synthase

Phản ứng: 2 a-D-glucose 1-phosphate = maltose + 2 phosphate

Tên phân loại: a-D-glucose-1-phosphate:a-£)-giucose-l -phosphate 4-a-D-

glucosylưansĩerase (dephospho hoá).

EC 2.4.1.183: a-l,3-glucan synthase

Phản ứng: ƯDP-glucose + [a-D-glucosyl-(l-3)]n= ƯDP+ [a-D-glucosyl-(l-3XL|.

Tên khác: uridine diphosphoglucose-l,3-ot-gỉucan glucosyltransferase; 1,3-

a-D-glucan synthase.

Tên phân loại: UDP-glucose:a-D-(l-3)“glucan 3-a-D-glucosyitransferase.

EC 2.5.1.62: Chlorophyll synthase

Phản ứng: chiorophyllide a + phytyl diphosphate = chlorophyll a + diphosphate

Tôn phân loại: chlorophyllide-arphytyL-diphosphate phytyltransferase.

EC 2.6.1.1: Aspartate transaminase

Phản ứng: L-aspartate + 2-oxoglutarate = oxaloacetate + L-glutamate

EC 2.7.1.1: Hexokinase

16
 Phản ứng: a-ơ-Giucose -» a-Z)-Glucose-6-phosphat

Tên phân loại: (ATP: D-Hexose-6-phosphotransferase).

EC 2.7.1.11: Phosphofructokinase

Phản ứng: fructose-6-phosphat “ > fructosediphosphat

Tên phân loại: ATP: D-fructose-6-phosphat-1-phosphotransferase.

EC 2.7.1.40: pyruvatkinase

Phản ứng: COOH CH,

COPO,H2 +AD P c = 0 + ATP

II
CH; COOH

Phosphoenolpyruvate + ADP = pyruvate + ATP

Tên phân loại: ATP; pyruvát - phosphotransferase.

EC 2.8.1.6: Biotin synthase

Phản ứng: đethiobiotin + sulfur = biotin

Tên phân loại: dethiobiotin;sulfur sulfurtransferase.

1.1.4.3. EC 3 Hydrolase

EC 3.1.1.4: Phospholipase A2

Phản úng: phosphatidylcholine + H20 = 1-acylglycerophosphocholine +

carboxylate.

Tên khác: lecithinase A; phosphatidase; phosphatidolipase; phospholipase A.

Tên phân loại: phosphatidylcholine 2-acylhydrolase.

EC 3.1.1.32: Phospholipase A,
(V| A OỔ
 Phản ứng: phosphatidylcholine + H20 = 2-acylglycerophosphocholine +
carboxylate

Tên phân loại: phosphatidylcholine 1-acylhydrolase.

EC 3.1.1.6: Acetylesterase

Phản ứng: acetic ester + H20 = alcohol + acetate

Tên khác: C-esterase (in animal tissues); acetic ester hydrolase;

chloroesterase; p-nitrophenyl acetate esterase.

Tên phân loại: acetic-ester acetylhydrolase.

EC 3.1.1.7: Acetylcholinesterase

Phản ứng: acetylcholine + H20 = choline + acetate

Tên khác: choiine esterase I; cholinesterase; acetylthiocholinesterase;

acetylcholine hydrolase; acetyl, p-methylcholinesterase.

Tên phân loại: acetylcholine acetylhydrolase.

EC 3.1.2.7: Glutathione thiolesterase

Phản ứng: S-acylglutathione + H20 = glutathione + a carboxylate

Tên khác: citryL-glutathione thioesterhydrolase.

Tên phân lo ạ i:: S-acylglutathione hydrolase.

EC 3.2.1.1: a-amylase

Phản ứng: thuỷ phần (Enđohydrolysis) liên kết 1,4-a-D-glucosidic trong

polysaccháíỉde chứa hai hoặc nhiều hơn đcm vị 1,4-a- D-glucose.

Tên khác: glycogenase; a amylase, alpha-amylase; endóamylase; Taka-

amylase A. ... r
l ' • •. [-J*
Tên phàn loại: 1,4-a-D-glucan glucanohydrolase.

18
EC 3.2.1.2: P-amylase

Phản ứng: íhuỷ phân liên kết 1,4-p-D-glucosidic trong polysaccharide dể

giải phóng maltose khỏi mạch từ đầu không khử.

Tên khác: saccharogen amylase; glycogenase; p amylase, beta-amylase.

Tên phân loại: l,4-P‘/)-glucan maltohydrolase.

EC 3.5.4.1: Cytosine deaminase (cytosase)

Phản ứng: cytosine + H20 = uracil + NH}

EC 3.5.4.2: Adenine deaminase (adenase)

Phản ứng: adenine + H20 = hypocanthine + NH,

Tên phân loại: adenine aminohydrolase.

EC 3.5.4.3: Guanine deaminase (guanase)

Phản ứng: guanine + H20 = canthine + NH3

HC 3.5.4.4: Adenosine deaminase (adenosase)

Phản ứng: adenosine + H20 = inosine + N IỊ ị

Tên phân loại: adenosine aminohydrolase.

EC 3.6.1.1: Inorganic diphosphatase

Phản ứng: diphosphate + H20 = 2 phosphate

Tên phân loại: diphosphate phosphohydrolase.

EC3.6.1.3: Adenosinetriphosphatase

Phản ứng: ATP + H20 = ADP + phosphate

Tên phân loại: ATP phosphohyđrolase.

19
 1

1.1.4.4. EC 4 Lyase

EC 4.1.1.1: Pyruvate decarboxylase

Phản ứng: R-CO-COOH RCHO + C 0 2

2-0X0 acid aldehyde + C 0 2

Tên khác: a-carboxylase; pyruvic decarboxylase; a-ketoacid carboxylase.

Tên phân loại: 2-oxo-acid carboxy-lyase.

Serindeaminase còn gọi là serindehydratase có 2 dạng khác nhau biến đổi

các đồng phân khác nhau của cùng một cơ chất:

HO-CH 2-CH(NH2)COOH NH 3 + CH 3 -C O C O O H

EC 4.1.1.3: Oxaloacetate decarboxylase

Phản ứng: oxaloacetate = pyruvate + C 0 2

Tên khác: oxaloacetate p-decarboxylase; oxalacetic acid decarboxylase;

oxalate (3-decarboxylase.

Tên phân loại: oxaloacetate carboxy-lyase.

EC 4.1.2.5: Threonine aldolase

Phản ứng: L-threonine = glycine + acetaldehyde.

Tên phân loại: L-threonine acetaldehyde-lyase.

EC 4.2.1.2: Tumarate hydratase

Phản ứng: (S)-malate = fumarate + H20

Tên khác: fumarase; L-malate hydro-lyase.

Tên phân loại: (S)-malate hydro-lyase.

EC 4.2.1.13: L-serindeaminase biến đổi dạng L của serin

20
EC 4.2.1.14: D-serindeaminase biến đổi dạng D của serin

Tương tự như vậy, treonindeaminase còn gọi là treonindehydratase có 2

dạng khác nhau biến đổi các đồng phân khác nhau của cùng một cơ chất:

CHr CH(OH)-CH(NH2)COOH -> NH, + CHr CH2-COCOOH

EC 4.2.1.16: L-treonindeaminase biến đổi dạng L của treonin

EC 4.2.1.17: Z)-treonindeaminase biến đổi dạng D của treonin

EC 4.3.1.17: L-serine ammonia-lyase

Phản ứng: L-serine = pyruvate + NH3

Tên khác: serine deaminase; L-hydroxyaminoacid dehydratase; L-serine

deaminase; L-serine dehydratase; L-serine hydro-lyase (deaminating).

Tên phân loại: L-serine ammonia-lyase.

EC 4.3.1.18: D-serine ammonia-lyase

Phản ứng: D-serine = pyruvate + NH3

Tên khác: jD-hyđroxyaminoacid dehydratase; D-serine dehydrase; D-

hydroxy amino acid dehydratase; D-serine hydrolase; ỡ-serine dehydratase
(deaminating); D-serine deaminase; D-serine hydro-lyase (deaminating).

Tên phân loại: D-serine ammonia-iyase.

EC 4.4.1.1: Cysteindecylfhydratase

HS-CH(NH2)-CH2-COOH -> H2S + NH, + CHr COCOOH

1.1.4.5. EC 5 Isomerase

EC 5.1.1.1: Alanine racemase

Phản ứng: L-alanine = D-alanine

Tên khác: L-alanine racemase.

Tên phần loại: alanine racemase.

21
EC 5.1.1.2: Methionine racemase

Phản ứng: L-methionine = D-methionine

Tên phân loại: methionine racemase.

EC 5.1.1.5: Lysine racemase

Phản ứng: L-lysine = D-lysine

Tên phân loại: lysine racemase.

EC 5.1.1.9: Arginine racemase

Phản ứng: Zv-arginine = £>-arginine

Tên phân loại: arginine racemase.

EC 5.3.1.3: Arabinose isomerase

Phản ứng: Đ-arabínose = D-ribulose '

Tên khác: D-arabinose(L-fucose) isomerase; D-arabinose isomerase; L-

fucose isomerase; D-arabinose ketoi-isomerase.

Tên phân loại: D-arabinose aidose-ketose-isomerase.

EC 5.3.1.25: L“fucose isomerase

Phản ứng: L“fucose = L-fuculose

Tên khác: L-fucose ketoL-isomerase.

Tên phân loại: L-fucose aldose-ketose-isomerase.

EC 5.4.1.1: Lysolecithin acylmutase

Phản ứng: 2-lysolecithin = 3-lysolecithin

Tên khác: lysolecithin migratase.

Tên phân loại: lysolecithin 2,3-acylmutase.

22
EC 5.4.2.1: Phosphoglycerate mutase

Phản ứng: 2-phospho-D-glycerate = 3-phospho-O-glycerate

Tên khác: phosphoglycerate phosphomutase: phosphogiyceromutase.

Tên phân loại: £>-phosphoglycerate 2,3-phosphomutase.

EC 5.3.1.1: Triosophoisosoisomerase

Phản ứng:

c=o

CH, - o - P O ,2* CH2 - o ~ P O ,2

Tên phân loại: D-GlyceraldehyD-3-phosphat-keto£-isomerase.

EC 5.3.1.9: Glucosophosphatisomerase

Phản ứng:

CH2- o - PO.H; c h 2- o - p o 3h 2

Tên phân loại: (O-Glucose-6-phosphat-ketol-isomerase)

EC 5.3.1.18: Glucoisomerase

D’Glucose -> D-Fructose

EC 5.4.2.i: Phosphatglycerat-phosphomytase

23
 Phản ứng:
COOH
I
<-> ^ 0 [P ]
H2COH

Acid 3-Phosphatglyceric Acid 2-Phosphatglyceric

Tên phân ỉoại: D-phosphatglycerat-2,3-phosphomytase.

EC 5.4.2.10: Phosphoglucosamine mutase

Phản ứng: a-D-glucosamine 1-phosphate = Z)-glucosamine 6-phosphate.

Tên khác: D-glucosamine 1,6-phosphomutase.

Tên phân loại: a-D-glucosamine 1,6-phosphomutase.

EC 5.5.1.9: Cycloeucaienol cycloisomerase

Phản ứng: cycloeucalenol = obtusifoliol

Tên khác: cycloeucalenol-obtusifoliol isomerase.

Tên phân loại: cycloeucalenol lyase (cyclopropane-decyclizing).

EC 5.99.1.1: Thiocyanate isomerase

Phản ứng: benzyl isothiocyanate = benzyl thiocyanate

Tên khác: isothiocyanate isomerase.

Tên phân loại: benzyl-thiocyanate isomerase.

1.1.4.6. EC 6Ligase

EC 6.2.1.1: Acetate-CoA ligase

Phản ứng: ATP + acetate + CoA = AMP + diphosphate + acetyL-CoA

Tên khác: acetyl-CoA synthetase; acetic thiokinase; acetyl CoA ligase;

acetyl CoA synthase.

24
 Tên phân loại: acetate: CoA ligase (tạo AMP).

EC 6.2.1.7: Cholate-CoA ligase

Phản ứng: ATP + cholate + CoA = AMP + diphosphate + choloyl-CoA

Tên khác: choloyi-CoA synthetase; choloyl coenzym A synthetase; cholic

thiokinase; cholate thiokinase; cholic acid: CoA ligase.

Tên phân ỉoại: cholate: Co A ligase (AMP-forming).

EC 6.3.1.1: Aspartate-ammonia ligase

Phản ứng: ATP + L“aspartate + NH-, = AMP + diphosphate + L-asparagine

Tên khác: asparagine synthetase; L-asparagine synthetase.

Tên phân loại: L-aspartate:ammonia ligase (AMP-forming).

EC 6.3.1.1: Aspartate-ammonia ligase

Phản ứng: ATP + L-aspartate + NH;, = AMP + diphosphate + /,-asparagine

Tên khác: asparagine synthetase; L-asparagine synthetase.

Tên phân loại: L-aspartate:ammonia ligase (AMP-forming).

EC 6.3.3.3: Dethiobiotin synthase

Phản ứng: ATP+7,8-diaminononanoate+C02 = ADP+phosphate+dethiobiotin

Tên khác: desthiobiotin synthase.

Tên phân loại: 7,8-diaminononanoate:carbon-dioxiđe cyclo-ligase (tạo ADP).

EC 6.4.1.6: Acetone carboxylase

Phản ứng: acetone + C 02+ ATP + 2H20 = acetoacetate + AMP + 2 phosphate

Tên phân loại: acetone carbon-dioxiđe ligase (AMP-formin).

1.1.5. Hệ enzym

Trong tế bào, các enzym thường xúc tác một dãy phản ứng nối tiếp, chúng lập
thành một hệ có tác động hỗ ượ cho nhau. Trong một hệ, sản phẩm thu được do sự hoạt
động của enzym thứ nhất thường làm cơ chất cho enzym thứ hai và tiếp theo, sản phẩm
cuối cùng của hệ thường là chất ức chế đối với enzym ban đầu. Các hệ enzym có tính
chất rất quan trọng là tự điều chỉnh xủc tác. Các hệ enzym có thể xúc tác các phản ứng
đi theo chiều phân huỷ các chất hoặc ngược lại tuỳ theo sự đòi hỏi của tế bào trong từng
giai đoạn.

Trong cơ thể, bình thường quá trình này tự điểu chỉnh bởi một mối quan hệ
ngược nhau, khi sản phẩm phản ứng tích luỹ iại nhiều thì sẽ ức chế cho những phản
ứng enzym ban đầu.

Thí dụ: hệ enzym xúc tác chuyển hóa L-treonin thành L-isoleucin gồm 5
enzym xúc tác các phản ứng nối tiếp. Sản phẩm cuối cùng của hệ là chất ức chế đặc
trưng của enzym ban đầu. Khi isoleucin được tích luỹ nhiều thì nó ức chế phản ứng
enzym ban đầu.

Trong hệ enzym vừa xét, enzym thứ nhất E, gọi là enzym điều chỉnh
(regulator) hoặc enzym kết hợp (allosteric enzym). Chất ức chế gọi là effector hoặc
modulator.

26
 Hệ enzym tự điều chỉnh trên là hệ đơn giản nhất: sự điều chỉnh chỉ phụ
thuộc vào một chất điều chỉnh. Trong nhiều trường hợp khác, sự diều chinh phụ
thuộc vào nhiều chất điều chỉnh.

1.2. ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYM

1.2.1. Tính đ ặ c h iệu

1.2.1.1. Tính đặc hiệu cơ chất

Mỗi enzym chi tác động tới một cơ chất nhất định hoặc một nhóm cơ chất
có cấu trúc gần giống nhau. Hay nói cách khác, chỉ xúc tác một loại phản ứng nhất
định, phá vỡ liên kết của một câu trúc nhất định.

Thí dụ: các enzym tham gia vào quá trình thủy phân tinh bột (đường hóa)
tạo glucose đùng trong công nghệ sản xuất bia gồm có: a-amylase (EC 3.2.1.1): P'
âmylase (EC 3.2.1.2); glucoamylase (EC 3.2.1.3); maỉtase ; a (l-6)-giuosidase. Các
enzym này có tính đặc hiệu rất rõ rệt. '

Các amylase tác động tới liên kết a( 1- 4) của tinh bột như sau:
6

a , p-amylase chỉ tác động liên kết a(l-4 ) amylose của tinh bột. a(l-6)-
gluosidase cắt liên kết phân nhánh a(l-6 ) của amylopectin. Trong khi đó thì a-
amytase cắt tinh bột thành dextrin, còn p-amylase cắt tinh bột hoặc dextrin thành
maltose. Maltase tiếp tục cắt liên kết a (l- 4) của maltose để tạo thành glucose.

Cellulase mới có thể cắt liên kết p (l- 4) của cellulose.

27
1.2.1.2. Tính đặc hiệu môi trường

Tính đặc hiệu của enzym còn thể hiện ở trong môi trường. Thí dụ: a-
chimotripsin thuỷ phân mạch amide trong liên kết peptide ở mồi trường acid, trong
khi đó tripsin lại có thể tác dụng trong môi trường kiềm.

1.2.1.3. Tính đặc hiệu lập thế

Đó là trường hợp cơ chất ở các dạng đồng phần quang học, enzym chỉ có
tác động tới một đồng phân. Đầy là tính đặc hiệu tuyệt đối nghiêm ngặt.

Thí dụ: lactatdehydrogenase chỉ làm biến đổi dạng L không tác động tới
dạng D của acid lactic. Aminoaxylase cũng chỉ làm biến đổi dạng L của aminoacid:

A L -R -C H -C O O -► L-R -C H -C O O + D -R -C H -C O O H
I I I
NHCOOR’ NH2 NHCOOR’

1.2.1.4.Tính đặc hiệu tuyệt đối

Trong một số trường hợp người ta còn đưa ra khái niệm vể tính đặc hiệu
tuyệt đối. Đó là ưường hợp enzym chỉ xúc tác một phản ứng.

1.2.1.5. Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là hoạt tính xúc tác của enzym đối với một số liên kết. Độ đặc
hiệu cũng khác nhau như độ đặc hiệu bậc một, bậc hai.

Đối với cơ thể sống, tính đặc hiệu là một hiện tượng quan trọng trong việc
điều khiển quá trình trao đổi chất có phương hướng trong tự nhiên. Đối với các
phản ứng trong cơ thể sống, enzym không chỉ tăng tốc độ phản ứng mà còn lựa
chọn tác động đối với những chất nào cần tham gia phản ứng.

28
1.2.2. Tính chất xúc tác

1.2.2.1. Tăng tốc độ phản ứng

Tốc độ phản ứng có xúc tác enzym so với phản ứng mẫu thường tăng từ 106 -
10'2lần. Nhiểu phản ứng khi không có enzym xúc tác, xảy ra rất chậm hầu như không
xảy ra. Các phản ứng trong cơ thể sống thường xảy ra rất nhanh từ 10 tới 30 s và hầu
như không xảy ra nếu đưa ra ngoài cơ thể.

Có thể lấy thí dụ phản ứng sau để so sánh tốc độ của phản ứng có xúc tác
enzym so với xúc tác hóa học:

H1 + e_l ^ 1/2 H2

Tốc độ phản ứng này khi có hydrogenase tham gia sẽ nhanh gấp 1.10s lần
so với trường hợp xúc tác là platin.

12.2.2. Xúc tác mềm

Xúc tác enzym gọi là xúc tác mềm vì các phản ứng enzym thường xảy ra ở
áp suất thường và nhiệt độ thường.

Thí dụ: các phản ứng trong cơ thể người xảy ra ở nhiệt độ 37°c và áp suất 1
atm. Đối với phản ứng:

4H2 + C 0 2 = CH4 + 2H20

khi có chất xúc tác tham gia là enzym, thì điểu kiện để xẩy ra là 50°c và latm, nếu
chất xúc tác là Pt thì điều kiện cần là nhiệt độ 200°c và 100 atm.

1.2.2.3. Giảm năng lượng hoạt hoá của phản úng

Trong phản ứng enzym, xẩy ra quá trình tạo phức (ES) giữa enzym (E) và
cơ chất (S) giảm năng lượng hoạt hoá của phản ứng

29
 t
Hình 1.1. Phức trung gian (ES) làm giảm nâng lượng hoạt hoá phản ứng

1.2.2,4. Sô vòng phản ứng

Số vòng phản ứng là số phân tử cơ chất bị biến đổi bởi một phân tử enzym
(hoặc một trung tâm hoạt động của enzym) trong một đơn vị thời gian ở nhiệt độ 28
- 30°c. Thí dụ: xem bảng 1.3.

Bảng 1.3. Số vòng phản ứng của một số enzym

Enzym Số vòng/phút

Carbohydrase c 36.106

Xetostroidizomerase 17.106

Amylase 1.106

Galactosidase 12.500

Phosphogluconatase 1.240

Sucsinat dehydrogenase 1.150

1.2.3. Các giả thiết cơ chế xúc tác enzym

Cho tới nay, cơ chế xúc tác enzym vẫn còn là một vấn để phức tạp, chỉ một
vài enzym được nghiên cứu sâu nên người ta có thể hiểu được quy luật xúc tác của
chúng như chimotripsin, tripsin, catalase, celluỉase, hydrogenase, lactase... còn lại

30
hầu như đa sô các enzym chưa được nghiên cứu quy luật xúc tác của chúng, do đó
cho tới nay chưa có một quy luật chung nào cho tất cả các enzym.

Năm 1894: Fischer, giả thiết rằng enzym hoạt động theo kiểu chìa khóa và
ổ khóa, đối với từng loại cơ chất coi là chia khoá thì chỉ vừa một loại enzym nào dấy
(tức là ổ khóa).

Năm 1946: Pauling cho rằng enzym có tác động phá vỡ cấu hình của cơ
chất. Ông coi trung tâm hoạt động của enzym như là một đụng cụ dể tra tấn.

Năm 1958: Koshland lại cho rằng giữa enzym và cơ chất có sự tương tác
tương hỗ lẫn nhau, không những chỉ cơ chất mà enzym cũng bị thay đổi cấu hình
làm ĩãng entropi hoạt hóa đẫn đến việc giảm nãng lượng tự do, tăng tốc độ phản
ứng. ông coi trung tâm hoạt động là một cái túi, khi cơ chất vào túi thì túi sẽ co lại,
Ông gọi trung tâm hoạt động là cái bẫy entropi.

Theo thuyết tương hỗ của Koshland, khi enzym ở trạng thái ĩự do, các
nhóm chức có hoạt tính xúc tác nằm rải ra ở các vị trí không thể cùng một iúc tương
tác với các phần cơ chất. Khi cơ chất hấp phụ trên enzym để tạo phức trung gian thì
trung tâm hoạt động của enzym trở nên có hoạt tính xúc tác.

Năm 1956: Vlasov cho rằng cơ chế xúc tác enzym là cơ chế bù trừ entropi
và entalpi làm giảm năng lượng tự đo của phản ứng.

Năm 1959: Jencks cho rằng lực hấp phụ làm biến dạng các hợp phần của
phân tử tham gia vào phản ứng. Trong trường hợp ngược lại, nếu phân tử cơ chất
không biến dạng thì trung tâm hoạt động của enzym biến dạng theo. Có giả thiết
cho rằng khi tương tác, enzym chuyển sang vị trí cấu hình với mức năng lượng thấp,
nâng lượng tỏa ra làm thay đổi cấu trúc của cơ chất, do đó cơ chất dẻ dàng tham
gia vào phản ứng.

Nãm 1972: Vonkenstein cho rằng do tương tác enzym, các cấu trúc
electron của cả hệ thay đổi dẫn đến sự phân bố lại mật độ electron, khả năng phản
ứng của hệ tăng lên.

31
 Nảm 1974: Blumelfeld coi đặc tính xúc tác của enzym là tính đặc trưng
trầm tích làm phá vỡ các liên kết cũ tạo liên kết mới.

Nãm 1930: Heldein cho rằng phần hoạt động của enzym nằm trải ra trong
không gian sao cho khi tương tác với cơ chất nó sẽ co kéo một chút phân tử cơ chất
để hợp với cấu hình trung tâm hoạt động của enzym.

Đáng chú ý là giả thuyết của Henri về sự tạo phức giữa enzym và cơ chất,
sau đấy phức phân huỷ để tạo sản phẩm và giải phóng enzym. Quá trình phản ứng
có thể mô hình hóa như sau:

E + s -> ES

Năm 1913: Michealis và Menten phát triển thuyết này và cho rằng quá
trình tạo phức xảy ra vô cùng nhanh làm cho phức ES luôn ở trạng thái cân bằng với
E và s, cón sự phân huỷ sản phẩm trung gian xảy ra vô cùng chậm, thực tế không
ảnh hưởng tới nồng độ phức chất.

Nói chung, các giả thiết ưên hoặc ít hoặc nhiều, hoặc một phần đề cập tới
vấn đề không gian, một phần đề cập tới sự thay đổi năng lượng tự do của quá trình
hoạt hóa, đo đó trên cơ sở những hiểu biết chung về nguyên nhân gây ra hiện tượng
độc đáo của xúc tác enzym có thể tóm tắt lại ở 3 điểm:

- Hấp phụ cơ chất trên trung tâm hoạt động làm giảm năng lượng hoạt hóa.

- Tương tác hóa học tại nhiều điểm giữa enzym và cơ chất.

- Ảnh hưởng của môi trường vi mô tới trung tâm hoạt động của enzym.

Dưới đây là một số cơ chế đặc trưng của xóc tác enzym:

Đường đồ thị động học (tốc độ phản ứng enzym phụ thuộc vào nồng độ cơ
chất) v= f([S]) của các enzym tuân theo cơ chế Michealis - Menten có dạng đường
hyperbol. Thí dụ như đường đồ thị động học của papain tách từ nhựa quả đu đủ
xanh.

32
 Sau này, trong quá trình nghiên cứu một số enzym có cấu trúc bậc IV,
người ta thấy đường đồ thị động học của các enzym này có dạng hình chữ s hay
dạng sigma. Thí dụ như đường đổ thị động học của ribonuclease chiết từ nọc rắn hổ
mang Naja naja.

Động học của các enzym dạng sigma đối với ribonuclease được giAi thích
là enzym tồn tại trong dung dịch ở dạng những tiểu phần khác nhau. Nhưng tiểu
phần này có thể biến đổi qua lại và những mối tương tác qua lại giữa chúng trong
quá trình xúc tác tạo động học sigma.

Hình 1.2. Đồ thị động học của các enzym theo cơ chế:

1 - Michealis- Menten (papain) và 2 - Sigma (ribonuclease)

Sau đây là một vài thành tựu của công nghệ sinh học, trong đó công nghệ
enzym có vị trí không thể thay thế được.

1.2.4. ứng dụng enzym trong công nghiệp thực phẩm, rượu, bỉa

1.2.4. 1. Enzym trong sán xuất bia

Để thực hiện đường hóa trpng quy trình sản xuất bia, người ta dùng a , p-
amylase cắt liên kết a (l-4 ) amylose của tinh bột tạo thành dextrin, rồi thành
maltose. Sau đó, dùng maltase tiếp tục cắt liên kết a(l-4 ) của maltose để tạo thành
glucose.

Để bảo quản bia, papain được dòng làm chất ổn định, nhất là khi pha bia có
glutathiol và acid ascobic. Papain còn làm trong bia và nước giải khát lên men.

33
1.2.4.2. ứng dụng enzym để tạo ra những thục phẩm có giá trị dinh
dưỡng cao

Papain mang tính chất như một enđopeptidase, đồng thời cũng như một
exopeptidase, thủy phân protein thành polypeptid, oligopeptid và các aminoacid.
Tính chất đặc hiệu của papain đối với cơ chất rất lớn. Papain có khả nấng thủy phân
tất cả các liên kết peptit, trừ các liên kết của prolin và acid glutamic. Papain từ nhựa
quả đu đủ xanh có hoạt lực thủy phân mạnh ngang với chế phẩm Substilizin
Bungary và mạnh hơn chế phẩm Neutrase của Hãng Novo Đan Mạch.

Một số loại tảo như: spiruỉina, Chỉoreĩỉa có hàm lượng protein dự trữ rất
cao (từ 55 đến 65% trọng lượng khô), nhưng hệ tiêu hóa của con người không thể
sử dụng trực tiếp các lọai tảo này được. Vì vậy, khi dùng tảo để sản xuất những loại
thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, phải thủy phân chúng. Quá trình thủy phân
này được papain, với tính chất như trên, xúc tác một cách có hiệu quả.

1.2.5. Enzym trong phân tích (đặc biệt là phân tích chất độc hoá học)

Acetylcholinesterase Là một ứng dụng quan trọng của enzym trong quân sự
để phát hiện các chất độc thần kinh có chứa cơ phospho hoá trị 5 như zoman, zarin.
Phương pháp hoá học chỉ phát hiện được các chất độc này ở nồng độ lớn gấp 10.000
so với liều chết. Phương pháp enzym có độ nhậy gấp 106 so với phương pháp hoá học.

Dùng urease hoặc peroxidase cho phép đo Hg2+ ở nồng độ 106 mg/ml.
Dùng alcoholdehydrogenase phát hiện Ag1+ở nồng độ 2.1 O'4 mcg/ml.

Dùng màng có enzym cố định phủ lên điện cực để phân tích.

Thí dụ: dùng điện cực enzym glucoseoxidase để phân tích glucose:

Phủ màng polystyrol hoặc gel polyacrylamide có glucoseoxidase cố định lên

điện cực Platin. Trong màng điện cực cố định glucoseoxidase xẩy ra phản ứng sau:

,TA ~ Glucoseoxidase .
Glucose + H20 + 0 2 > Acid gluconic + H20 2

34
 Điộn cực ghi lại tín hiệu H20 2, sản phẩm của phản ứng. Qua đó, xác định
được glucose, cơ chất cần phân tích, hoặc:

Glucoseoxidase
Glucose + benzoquinon > Acid gluconic + hydroquinon + H20

Hydroquinon được điện cực Platin ghi lại như sau:

Platin
Hydroquinon ^ Benzoquinon + 2H+ + 2e

Tương tự như vậy,

~ Dùng điện cực thủy tinh được phủ màng gel polyacrylamide có urease cố
định để phân tích ure:

H2N-CO-NH, + H20 + H+ — Ure-ase > 2NH; + HCOj

- Dùng điện cực cực phổ được phủ màng gel polyacrylamide có
alcoholoxireductase cố định để phân tích alcohol (methanol, ethanol):

Alcoholoxi reductase
Alcohol

1.2.6. ứng dụng enzym trong y, dược

1.2.6.1.ứng dụng enzym để tạo các dược phẩm

ứng dụng tính đặc hiệu lập thể tuyệt đối nghiêm ngặt của enzym, chỉ tác
động tới một đồng phân quang học, cho phép tách đổng phân mong muốn, mà các
phương pháp hoá học không thực hiện được. Dựa vào tính chất này của enzym cho
phép thu nhận đồng phân quang học của hợp chất hữu cơ để làm được phẩm.

Lactatdehyđrogenase chỉ làm biến đổi dạng L không tác động tới dạng D
của acid lactic. Aminoacylase cũng chỉ làm biến đổi dạng L của aminoacid.

35
 Glucosamine sulphat ià loại đường amino, tham gia vào cấu trúc của nhiều
kháng sinh, đo đó được sử dụng rộng rãi, nhưng sử dụng có hiệu quả nhất là làm
thuốc chữa viêm khớp (osteoarthritis), có tác dụng cùng với chondroitin sulfate.

Để sản xuất glucosamine, người ta dùng các enzym (chitosanase, chitinase,

aminidase) để thủy phân chitin thành N-acetylglucosamine, sau đó dùng esterase để
deacetyỉ hóa thành glucosamine. Hoặc có thể deacetyl hóa chitin thành chitosan,
sau đó dùng chitosanase, aminidase để thủy phân chitosan thành glucosamine theo
sơ đồ sau:
Deacetyl hóa (kiềm)
Chitin —> Chitosan
Chinase, Chitosanase
, , aminidase V
Esterasse
N-acetylglucosamine ^ Glucosamine

Điều chế glucosamine bằng phương pháp enzym cho phép thu sản phẩm
sạch với hiệu suất cao hơn so với phương pháp hóa học.

Ribonuclease là enzym thủy phân, được tách ra từ nguồn động vật như tụy
bò, nọc rắn, ếch Châu Phi... Hiện nay, ribonuclease từ nọc rắn độc được sử dụng
nhiểu trong y học như một dược phẩm điều trị một số bệnh nhiễm trùng vừus. Thí
dụ: các ribonuclease tuỵ từ lâu đã được sử dụng để chữa bộnh viêm não.
Ribonuclease-L có khả năng ức chế nhân đôi ADN vi khuẩn trong các đại thực bào
màng bụng. Gần đây, nhiều kết qủa nghiên cứu chỉ ra rằng ribonuclease ngăn cản
sự phát triển cùa tế bào ung thứ, và có thể là vũ khí mới để chống ung thư.

1.2.6.2. Vi sinh và enzym đố! VỚI sắn xuất và định lượng chất kháng sinh

Vi sinh và enzym giữ vai trò không thể thay thế được trong sản xuất kháng sinh:

Các chất kháng sinh bán tổng hợp, hoặc các dẫn xuất của các chất kháng
sinh thường có ưu điểm hơn hẳn các chất kháng sinh ở chỗ bển vững, ít độc hơn,
hoạt tính kháng sinh mạnh hơn, biệt là không gây đị úng. Vì vậy, sau khi đã thu
nhận được các chất kháng sinh do các chủng vi sinh tổng hợp, cần tiến hành các
phản ứng tiếp theo để sản xuất các dẫn xuất của các chất kháng sinh này hoặc là

36
các chất kháng sinh bán tổng hợp. Trong các phản ứng tiếp theo ấy thì enzym giữ
vai trò không thể thay thế được.

Thí dụ: penicillin do chủng vi sinh penỉciỉỉinum chrysogenum tổng hợp- Để

chuyển penicillin thành amino penicillinic acid (6-APA), người ta dùng
penicillinase cố định trên chất mang, sau đó dùng acylase để chuyển
aminopenicillinic acid (6-APA) thành ampicillin-(D-a-aminobenzen penicillin).

Cephalosporin c là kháng sinh tự nhiên do chủng Cephaỉosporium tạo nên.

Cephalosporin bán tổng hợp như acephalecin và acephaloglicin được sản xuất từ
cephalosporin tự nhiên bằng phương pháp enzym dùng penicillinase cô' định trên
chất mang.

Enzym trong định lượng chất kháng sinh: định lượng chất kháng sinh là vấn
để khó khăn đối với phương pháp hoá học. Vấn để này có thể giải quyết được bằng
phương pháp enzym. Thí dụ: để định lượng penicillin, người ta dùng penicillinamidase,
cố định trên thủy tinh lỗ xốp. Phương pháp này cho phép định lượng penicillin trong
nồng độ 5-100 mM, hoặc dùng điện cực enzym cho phép định lượng penicillin với
độ nhậy tới 0,01 mM.

1.2.7. s ử dụng enzym để giải quyết vấn đề năng lượng

Hydrogenase để giải quyết vấn đề nãng lượng

Trước tình hình khủng hoảng năng lượng trên thế giới ngày càng trầm
trọng. Các nhà khoa học đã có nhiều phương hướng tìm kiếm nguồn năng lượng
cho tương lai. Những nguồn nãng lượng có triển vọng nhất có thể kể đến là năng
lượng mặt trời và năng lượng nhiệt hạch. Nhưng từ nãm 1975, nãng lượng mặt trời
là nguồn năng lượng đã được chọn dứt khoát cho tương iai.

Đã 3 tỷ năm qua và 3 tỷ năm tới, hàng năm mặt trời cho trái đất một khối
lượng năng lượng khổng íồ không thay đổi: 3.1024 Jun, tương đương với 64 nghìn tỷ
tấn dầu mỏ, gấp 5.000 tất cả các nguồn năng lượng mà trái đất có. Năng lượng mặt
trời cho Trái đất lớn như vậy, nhưng con người chỉ sử dụng được khoảng 0,01%, số

37
còn lại tán xạ ra ngoài khí quyển. Do đó, nếu có phương án nào sử dụng có hiệu quả
hơn nguồn năng lượng khổng lồ ấy, thì con người sẽ vĩnh viễn thoát khỏi tình hình
khủng hoảng năng lượng.

Cơ sở của vấn đề: quá trình quang hợp là quá trình biến đổi năng lượng mặt
trời Ợĩ v) về dạng dự trữ trong sinh khối (CHzO), được thực hiện trong tự nhiên nhờ
các sinh vật có các bộ phận quang hợp :

c o 2+ h 2o % CH2o + 0 2
Quá trình quang hợp trên có thể tách thành 2 giai đoạn như sau:

Giai đoạn 1: HjO ^ 2H+ + 2e + 1/2 ố 2

Giai đoạn 2: C 0 2 + 2H+ + 2 e~ -» (CH20 ) + l/2 0 2

Nếu cho chất mang electron A hóa trị 2 vào giai đoạn 1» chất A sẽ thu nhận
electron thành chất khử A'2 . Chuyển chất khử A 2 này vào giai đoạn 2, thì có thể
thực hiện được phản ứng tạo thành H2 từ 2H+ và 2e“.

2H+ + 2 ế H2

Phản ứng tạo thành H2 trên được hydrogenase xúc tác. Enyme này có đặc
điểm là chỉ thấy trong rong biển, không có trong plastid (bào quan) của thực vật.

Tổng hợp giai đoạn 1 và phản ứng tạo thành H2 được phương trình quang
phân iy nước:
_ hv
H20 -> 1/2 0 2+ H2

Như vậy, về nguyên tắc, có thể sử đụng áng sáng mật tròi và các quátrình
sinh học để thực hiện quang phân ly nước liêntục* trong đó có hydrogenase xúc
tác, tạo hydro và oxy:
 Quang hợp
hv

Hình 1.3. Sơ đồ quang phân ly nước

Người ta đã chứng minh được bằng thực nghiệm ý tưởng của phương pháp
sinh học nhờ áng sáng mặt trời và các qua trình sinh hớc để chuyển hóa một cách
liên tục nâng ỉượng mặt trời từ dạng bức xạ về dạng dự trữ (nhiên iiệu hydro).

Trên dây là một số thí dụ chứng minh cho hiệu quả sử dụng công nghệ vi
sinh, cồng nghệ enzym phục vụ cho nền kinh tế quốc dân. Các công nghệ này đã
được nghiên cứu tương đối đầy đủ tỉ mỷ về thực nghiệm cũng như lý thuyết, đồng
thời các công nghệ này đã đạt được nhiểu kết quả phục vụ dời sống kinh tế quốc
dàn.

1.3. ĐỘNG HỌC PHẢN ÚNG ENZYM HAI GIAI ĐOẠN

1.3.1. Phương trình động học - phương trình Michaelis - Menten

Sơ đồ phản ứng enzym hai giai đoạn theo cơ chế Michealis - Menten có thể
viết như sau:

E + S =s=^= ES — » E+P (1.1)

k -Ị

[E] - nồng độ enzym;

[S] - nồng độ cơ chất;

[ES] -- nồng độ phức trung gian enzym - cơ chất;

39
 [P] - nồng độ sản phẩm;

k+,, k_| - hằng số tạo phức và hằng số phân ly phức trung gian;

k2- hằng số tốc độ phản ứng, số vòng phản ứng, còn gọi là hằng số xúc tác.

Theo sơ đồ phản ứng trên, tốc đô phản ứng sẽ là: V= = k2[ES]

dt

Sư biến đổi nồng đô phức trung gian: = k^fEjtS] - (k_1 + k2) [ES]
dt

Ở trạng thái ổn định, nồng độ phức trung gian không thay đổi, do đó:

^ § 1 =0 suyra:ktl[E ][S]-(k2+k.,)[ES] = 0
dt

Biết [E]0 là nồng độ enzym ban đầu. Có thể coi nồng độ enzym ban đầu
[E]0 bằng nồng độ tổng cộng của tất cả các ưạng thái enzym:

[E]0 = [ES] + [E]; [E] = [E]0 - [ES]

Thay các nồng độ vào phương trình tốc độ:

k+1[E]()[S] - k+I[ES] [S] - (k2 + k_,) [ES] = 0

[ES]{(k2 + 1 0 + M S ]} = M E ] 0[S]

[ES] = M E ] .[ S ] ____________ [E],[S]

(k 2 + k _ ,) + .k +1[S] (k 2 + k . , ) / k +1 +[S]

M EUS1 _ _ k +ic

VMgọi là tốc độ cực đại của phản ứng, K„ - hằng số Michaelis, khi íy:

V- VMfS]
(L 2 )

40
 Trong trường hợp nồng độ cơ chất lớn hơn nhiều so với nồng độ enzym [S]n
» [E]n thì có thể coi lượng cơ chất biến đổi không đáng kể: [S] = [S](), do đó công
thức (1.2) có thể viết thành (1.3).

v = _ Y m P ] ọ_ 3)
k m + [S]0

Thường thường, trong các phản ứng enzym, nồng độ cơ chất bao giờ cũng
lớn hơn nhiều so với nồng độ enzym, do đó có thể sử dụng công thức (1.2) cũng có
giá trị như (1.3).

Phương trình (1.2) hoặc (1.3) gọi là phương trình Michaelis - Menten.

Nếu tăng nồng độ cơ chất lớn lên sao cho lớn hơn nhiéu so với hằng số
Michaelis: [S] » KM, khi ấy KM+ [S] = [S] suy ra V = k2 [E](j. Như vậy, khi nồng
độ cơ chất tăng tới một giá trị nào đó, tốc độ ổn định của phản ứng đạt tới một giá
trị nhất định. Tốc độ khi ấy gọi là tốc độ cực đại của phản ứng, VM.

VM= k2[E]0 (1.4)

Hằng số Michaelis KMbiểu thị ái lực của cơ chất đối với enzym, thường
hằng số Michaelis có giá trị từ 10~s -» 10-IM ( xem bảng 1.4).

Khi k2 nhỏ, K„ » -- - = Ks , khi ấy Ks là hằng số phân ly phức trung gian

k +,

enzym - cơ chất

Bảng 1.4: Các giá trị KMvà Ks của một số enzyvn

Enzym Cơ chất Km <M) KS(M)

Tripsin Bensoil-L-argínrin 1,0.1(T5 0,6.10“5

Este etylic 1,0.10“4

Chimotripsin Axetyl-L-phenyl-alanin 0,9.10"4

Invertase Saccharose 3,0.10"2 0,9.10“2

41
 Trong trường hợp đơn giản, dùng hằng sở phân ly phức trung gian enzym -
cơ chất (Ks) để dẫn phương trình tốc độ phản ứng:

[E][S] ([E]0 -[ES])[S]

- rrr:
[ES] [ES]

Ks [ES] = [E]„[S]-[ES][S]

[ES] (Ks +[S]) = [E]„[S]; [ES] = tE]„[S]/(Ks + [S])

M E ]ọ[S ] Vs VM[S]o
V = k2 [ES] * (1.5)
K s + [S] K s +[ S]0

Công thức (1.5) cũng có thể thu được từ (1.3) trong trường hợp tốc độ phân
ly phức chất trung gian thành cơ chất ban đầu vô cùng lớn so với tốc độ phân ly tạo
thành sản phẩm le, » k2 (k2/k+l rất nhỏ):

KM= (k _ !+ k 2)/k*i = k_,/k+l + k2/k+ị = K s + k2/k+1 ; KM~KS

Như vậy K m và Ks khác nhau ở chỗ KMlà hằng số động học còn Ks là hằng
số cân bằng và chênh lệch một đại lượng k2/k+i

K m và Ks thường có giá trị cùng bậc (gần giống nhau) ( xem bảng 1.4).

1.3.2. Xác định các thông số động học

1.3.2.1. Xác định tốc độ ban đẩu v0

Đối với phản ứng enzym bao giờ cũng cần biết giá trị tốc độ cực đại VMđặc
trưng cho tính chất động học của phản ứng. Ở thời điểm bắt đầu của phản ứng, khi
chưa có ảnh hưởng cùa các tác động khác (thí dụ sản phẩm phản ứng), thì phản ứng
xảy ra đúng với tốc độ thực, gọi là tốc độ ban đầu (V()). Tốc độ ban đầu chính là đạo
hàm của đường đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc sản phẩm (P) vào thời gian (t). Nếu
xác định được chính xác v 0 thì xác định được chính xác VM. Việc xác định tốc độ
ban đầu thường gập khó khăn vì sau một thời gian nào đấy, sản phẩm phản ứng
được tạo thành và khi đạt tới một nồng độ nhất định, có thể gây hiện tượng ức chế

42
hoặc hoạt hoá enzym, ảnh hưởng tới tốc d(> phản ứng (có thể tăng hoặc giảm không
đúng với giá trị thực). Do đó, đường dồ thị biểu dién sản phẩm sẽ không tuyến tính
với thời gian và có dạng cong. Muốn mô tả đúng bản chất của quá trình thì phải
tách sản phẩm ra khỏi môi trường phản ứng. Trong thực tế. không thực hiện dược,
vì phản ứng enzym thường dược tiến hành trong dung địch, không cho phép tách
ngay sản phẩm.

Đế xác định dược tốc độ ban dầu

V0 . từ gốc tọa độ phải vẽ đường tiệm cận
với dường biểu diễn sản phẩm, lúc đó Vị,
là độ nghiêng của đường tiệm cận: v„ =
tg(x. Phương pháp này thường gặp sai số
lớn, vì phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật vẽ
dường tiệm cận (Hình 1.4).

Để khắc phục những sai sót trên,

người ta dùng các phương pháp gần đúng
khác nhau để xác định V{). Một trong những phương pháp trên là phương pháp
Niuton-Gregori. Nội đung của phương pháp như sau:

Trên trục thời gian (t) của đồ thị

động học tạo thành sản phẩm (P) (Hình
1.5), lấy các giá trị tị, t2, t,. ...ti có khoảng

cách sao cho At = t| - to = t2 - tj = t* - 12 =

t, - 1,,j; từ đó xác định các giá trị sản phẩm

tương ứng: p,, P2, p„ ...P). Khi ấy, các giá
trị Ap được biểu diễn gần đúng như trong
bảng i.5.

Hình Ỉ.5

43
Bảng 1.5. Các giá trị gần đúng Ap tương úng với 5 mốc thời gian có khoảng cách như nhau

ti p, APj A2Pj a 3p, A<P;

to (= 0) Po (= 0)

ti Pi A P 0= P ,-P o

^2 p2 A P^P j-P, a 2p 0 = a p 1 - a p 0

*3 p3 A P2 = P3 - p2 A2P, = AP 2 - Ap, A3P 0=A2P r A2P 0

t4 p4 Á p 3 = P 4 - P 3 a 2p 2 = AP 3 - AP 2 A3P i =A2P 2 - A2P t A4P 0=A3P 1 -A3P 0

Khi ấy, tốc độ ban đầu V0 có thể biểu diễn bằng công thức gần đúng:

a 2 p, AP, A 4P„
V - Ap0
v0 — t, + t, t, t, M , .
At 2!(At) 3!(AAỈ 4!(AAf

Để tính tốc độ được chính xác cần lấy nhiều mốc thời gian. Đối với mỗi
phản ứng cần lấy ít nhất từ 7 đến 10 mốc thời gian.

13.2.2. Xác định VM, KM

Các thông số động học khác của phản ứng enzym cần được xác định là VM,
Km và một số hằng số như k+!; k_i ; k 2 v.v... Để xác định các thông số động học,
thường dùng một số phương pháp sau: phương pháp Lineweaver Burk, phương pháp
Idi, phương pháp Dixon v.v... Mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm.
Các phương pháp này sẽ được xem xét cụ ỵ*
thể sau này.

Cách đơn giản nhất để xác định

VMvà K m là lập đồ thị V = f([S]) (Hình
1.6). Trên đồ thị thấy rõ VM là giới hạn
cùa V. Để xác định KM tiến hành như
sau: lấy điểm trên đồ thị có tung độ

Hìnhỉ.6

44
V=V m/2, khi ấy hoành độ tương ứng là [S] = KM, hoậc có thể tính như sau:

Lấy V=Vm/2 khi ấy VM/2 =VM[S]/(KM+ [S]) -» 2[S] = KM+ [S] và KM= [S].

1.3.2.3. Xác định các thông sồ động học tiìeo phương pháp Uneweaver- Burk

Để các thông số động học theo phương

pháp Lineweaver Burk lập đồ thị — = f

d/[S]) (Hình. 1.7):

V v„ v„ [SJ

Đổ thị v = f([l/S]) là đường thẳng có

K,
góc nghiêng a với tga = và điểm cắt

trên true tune với tọa độ — - và điểm cắt trên trục hoành với tọa độ — -
V K

Cho — = 0, từ công thức (1.6) suy ra hoành độ 7 ^- = ■

V [S] Km

Theo Phương pháp Lineweaver Burk, để xác định các thông số động học
cũng có thể lập đồ thị [S]/V = f([S]) như công thức (1.7) (Hình. 1.8):

ỊSỊ K,
[S] + (1.7)
V V..
M
- - V.
’ M

Toạ độ điểm cắt trên trục hoành:

[S] = -Km

45
1.3.2.4. Xác định các thông sô động học theo phưong trình idỉ

Để các thông số động học theo

phương trình Idi này cần lập đồ thị:

V = f(V/ [S] 0) (Hình 1.9).

Biến đổi biểu thức (1-3) được:

+ V, ( 1 .8 )
JS]o

(-tga = -tgP = Km)

Hình . 1.9

1.3.2.5. Xác định các thông số động học theo phương pháp Dixon

Khi xử lý các thồng số động học

trong trường hợp có hiện tượng ức chế
thường sử dụng phương pháp Dixon. Theo
phương pháp này, cần lập các đồ thị là hàm
số của f([I]) hoặc f(l/[I])» v.v...

Thí dụ: lập đổ thị — = f([I])

Vi
(Hình. 1.10) dể xử lý các thông số động học
Hình 1.10
của hiện tượng ức chế chống cạnh tranh
(anti-competitive).

1.4. HIỆN TƯỢNG ỨC CHẾ

Quá trình ức chế trong phản ứng enzym là hiện tượng khi có những chất lạ,
thậm chí có thể là cơ chất hoặc sản phẩm của phản ứng, tác dụng với enzym làm
giảm hoạt tính của enzym, chất lạ đó gọi là chất ức chế. Quá trình ức chế có thể là

46
thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Trong trường hợp bất thuận nghịch, chất ức
chế có thể phá huỷ trung tâm hoạt động của enzym dẫn đến hiện tượng biến tính.

Để mô tả hiện tượng ức chế một cách tổng quát có thể biểu diễn theo sơ đồ
phản ứng sau:

Ks
■
- -w K,.
E + s -c------ ES ■- 2- > E+P
J|+i 1 +»
\ K
f 1 <*KSw
EI ^ ] ES - - 2 -> EI + P

Hiện tượng ức chế có thể chia ra thành một sô' trường hợp sau:

- Úc chế hỗn hợp (mixed type inhibition), a * p * i. Trong trường hợp này
cả chất ức chế và cơ chất đều phản ứng với những phần khác nhau của enzym. Các
hệ số a và p khác nhau và khác 1 .

- Úc chế cạnh tranh (competitive inhibition) a -» chất ức chế có thể chỉ

kết hợp với enzym khỏng thể kết hợp với phức trung gian enzym-cơ chất, a —> (3
không có ý nghĩa coi như = 0 và [IES] = 0. Trường hợp này chia thành 2 loại: hoàn
toàn và không hoàn toàn cạnh tranh (purely competitive và partially competitive
inhibition).

- Úc chế không cạnh tranh (non-competitive), a = 1; p = 0. Trong trường

hợp này, chất ức chế vừa có thể kết hợp với enzym vừa có thể kết hợp với phức
trung gian enzym - cơ chất. Trường hợp ức chế này cũng chia thành 2 loại: hoàn
toàn và không hoàn toàn không cạnh tranh (purely non-competitive và partially
non-competitive inhibition).

- Úc chế thiếu cạnh tranh (incompetitive). a = p < 1. Trong trường hợp này,
chất ức chế vừa có thể kết hợp với enzym, vừa có thể kết hợp với phức trung gian
enzym - cơ chất tạo thành phức ba enzym - cơ chất - chất ức chế, giống trường hợp
ức chế hỗn hợp, nhưng đặc biệt ở chỗ là hệ số phân ly các phức trung gian này bằng
nhau và nhỏ hơn 1. Trường hợp này cũng chia thành 2 loại: ức chế hoàn toàn và

47

i
không hoàn toàn thiếu cạnh tranh (purely uncompetitive và partially uncompetitive
inhibition.

- Úc chế chống cạnh tranh (anti-competitive). p = 0; Kị —> ~.ẳTong trường

hợp này, chất ức chế chỉ kết hợp với phức trung gian enzym-cơ chất, không kết hợp
với enzym.

- Trường hợp ức chế giả cạnh tranh (pseudo-competitive) p = 1

Sau đây là một số trường được xem xét:

1.4.1. ứ c c h ế h ỗ n h ợ p . ( a * p * 1 )

Đó là trường hợp chung của quá trình ức chế được mô tả theo sơ đồ (1.9).

Khi ấy, tốc độ phản ứng sẽ là: Vi = k 2[ES] + pk 2[IES]. Trong đó:

[E][I] [ESJ[I]
Ki = otKị =
[EI] [IES]

K -IIM .
15 [ES] [IES]

Nồng độ tổng cộng cùa enzym sẽ là: [E]„ = [E] + [ES] + [El] + [IES]

Từ các hằng số cân bằng, có thể tính các nồng độ các phức chất.

[E] = Ks ỉ | p ; rHl = [ E ] i ỉ l = K , . M m = fES1 % i í l '

[S] ; tH1 [E1 K - Ks- V X tES] I [S] K,

[IES] = - Ẹ - [ E I ] = J ẵ L ỈĨS]ị ầ L . ỉ ấ ) [ES] iỉL

aKc aK s {[S ] K j aK:

[EL = [ES] + 1+ ỉk iỉl [I]

[S] US] KJ aK

48
 [E]„ = [ES] Í , + I!T +
[S] K.J a K ,J

[E]„
[ES] =
K s (l + 13-l +
[S] ^ «K,J

Vi = k2[ES] + Pk2[IES] = kj[ES] + Ẽ k . i l l [ES] = kJ ] + i i ỉ l Ị [ES]

a K; a K;

v,=
k4 +a|}|El
Ks f,1 + XA
Mi +f liili
[s K j ( a K j

Nhân tử và mẫu số của biểu thức trên với [S]a Kj, và chia cho (ctKj + [I]) được:

k ,2 -^ ìH íi[E ].[S ]
ctK, + [ ] ] V„[S)
Vi = -> V; = ( 1. 10)
a K g Ấ , Ị Ú L +[S] KMi +[S]
s c t K ; + [I]

Trong đó: VMi = k 2 ơ K ; + f f .y [ E ] , (1.11); KMi = Ks g f f ! + ( 1. 12)

cxK, + [ 1 ] a K , + [ 1]

Như vậy ức chế hỗn hợp gây ảnh

hưởng tới V Mvà cả tới KMvới những đại
lượng khác nhau ( 1 . 1 1 ) ( 1 . 12 ).
Để xác định các thông số a, p cần
lập đồ thị: 1 /Vj = f(l/[S]) (Hình 1.11), đồ
thị là những đường thẳng cắt nhau tại điểm
có íọa độ:

49

ấ
 1

1 p -1
[S] K s cx-p

1 a -1
V. VMi a - p

1.4.2. ức chê hoàn toàn cạnh tranh (purely competitive inhibition)

Trường hợp khi chất ức chế chỉ kết hợp với enzym, không kết hợp với phức
enzym - cơ chất gọi là ức chế hoàn toàn cạnh tranh Hiện tượng ức chế này được mô
tả theo sơ đồ sau:

E+S ES ■» E + p (1.13)
1k
EI

Trong trường hợp, này khi a -» ao; p không có ý nghĩa coi như bằng 0 và

phức [IES] không được tạo thành (= 0). Khi ấy, tốc độ phản ứng được viết như sau:

V -k JE S ]

K
[EL = [E] + [ES] + [El] = [ES]
[S] K. [S]

[E],
[E]„=[ES] ụ + 1+13- • -> [ES] =
[S] K; ,1 + K s In ­ i n
[S] K,

M E ]„
V, = Vj - ■■■ (1.14)
, Ks
1+ ~ Ks5 f i + & l + [S]
+ '

[S] I KJ l kJ

50
 V, = VM[S]
(1.15)
K Mi+[S]

111
K mì - K, 1 + (1.16)
K:

VMi = k2[E]0 Suy ra: VMi =VM

Như vậy, ức chế hoàn toàn cạnh tranh không gây ảnh hưởng tới VMchỉ gây
ảnh hưởng tới KM. Công thức (1.14) cũng có thể thu được khi thay a = oo; p = 0
vào eông thức chung ( 1 . 10 ).

Xác định các thông số dộng học: 1/Vi

- Xác định VM: Để xác định VM

lập cần đổ thị l/v , = /(1/[S]) (Hình 1.12):
các dường đồ thị cắt nhau tại một điểm
trên trục tung.

I K s (1 +[IỊVK,
v „ + [S]

Xem xét trường hợp ức chế hoàn toàn cạnh tranh, thấy rằng giá trị VM
không thay đổi, tốc độ Vi giảm khi tăng nồng độ chất ức chế [I]. Nếu lấy giá trị cơ
chất lớn [S] thì Vị = VM = k2[B]0. Như vậy, có thể loại bỏ ức chế cạnh trạnh bằng
cách lấy nồng độ cơ chất [S] lớn.
KMi/Ks
- Xác định K|: để xác định Kị!
cần lập đổ thị KMi/Ks = /([I]) (Hình
1.13):

K m/ K s = 1 + [I]/Ki ; t g a = l / K i

Chú ý: khi [I] = 0, KMj -> Ks

Hình 1.13

51
 Trong trường hợp ức chế không hoàn toàn cạnh tranh (partially competitive
inhibition) được mô tả theo sơ đồ (1.17), chất ức chế chỉ vây một phần không gian
của enzym, không cản trở cơ chất kết hợp với enzym:

Ks
E + s ES
J|
- z > E + p (1.17)

f K' aKs
lu x;
EI IES - E I+ p

1.4.3. ức chế hoàn toàn không cạnh tranh. (a= 1; p = 0)

Chất ức chế có thể kết hợp vứi enzym đồng thời cũng có thể kết hợp với
phức enzym- cơ chất với sơ đồ phản ứng được mô tả như sau:

Ks
E+S ES - — > E + p (1.18)
11 Ki 1Lk s
Ỷ 1 K* lr
EI IES

Trong trường hợp này [IES] không có hoạt tính. Suy từ công thức chung (1.10)
được:

r K, 1
K,+[I]
Vi = (1.19)
K s +[S]

v VMi[S]
( 1 .20 )
‘ K s + [S]

V mì — XI) [E](, ' K. -

VMi = k 2 [E],| ( 1.21)
K , + [ 1]

K ' K, -
^(xt) ^2 VMi = V M ( 1.22 )
K i + [1]
I K , + [ 1]
 Như vậy ức chế không cạnh tranh chỉ gây ảnh hưởng tới VM(1.21) một đại
\

lượng , không ảnh hưởng tới KM(KM=KS).

K , + [ 1]

Xác định các thông số động học:

- Xác định Ks: để xác định Ks cần

lập đồ thị: Ì/Vị = f (1/[S]) (Hình 1.14).

Các đường đồ thị cắt nhau tại một

-1/K
điểm trên trục hoành với toạ độ -1/K S

- Xác định Kị: để xác định Kị cần

lập đồ thị: l/v , = /([I]) (Hình. 1.15)

Ị _ K s +[S] | K s + [S] ỊỊỊ

V, k 2 [E] 0[S] k 2 [E] 0[ S ] ' K i

= K s +[S] | K s +[S] ụỵ
VM[S] V JS ] Kị
ỵx r

Từ đồ thị trên xác định được:

y -W
_
7 [1]
Ks +[S]
tgP . Từ đó suy ra Kj.
Vm [S]K, Hình 1.15

Hoặc lập đồ thị —— = f([I]) (Hình

(1.23)

Từ đồ thị trên xác định được tgcp

1/Kj; từ đó suy ra Ki = l/tg(p

53
1.4.4. ức chế không hoàn toàn không cạnh tranh, (a = 1; p * 0)

Phản úng ức chế không hoàn toàn không cạnh tranh được mô tả bởi sơ đồ sau:

E + ss *vy bS
ES — k (1.24)
-- ị\
K:
TT Ỉ K‘ Bk
EI =^= IES ---- P-.2—■
> EI + P

Trong trường hợp này phức IES có hoạt tính, đo đó tốc độ phản ứng có thể viết:

V; = k 2[ES] + pk 2[IES]

1.4.5. ức chế hoàn toàn thiếu cạnh tranh

Đó là trường hợp phản ứng có sơ đồ phản ứng như sau(a = p < 1):
Kv
E+S ES ■> E + p (1.25)

Ũ aK;
EI
L
aKs
=5=^ IES
Bk,
— > EI + P

Từ trường hợp chung ta có thể suy ra

o O V H ỊỊD
2 a K ị + [I] Jo1 J v= VMj[S]
V, (1.26)
Ks ^ ± m +[S] ' K s +[S]
a K ,+ [I]

v Mi.K=(xt)If L ^ J or *p ] •K ( X I ỵ) “
V “ kữ2 —
ot k —^ + ^ * Y = « ( K , ;KM
+ m ) --- !
i—Ks
a K , +[ I ] a K i + [I]

(kxt: là k của p hản ứng có xúc tác)

[I]
aK; j^s
(1.27)
I 1! VM[S]
1+
K-

54
 ưc chế thiếu cạnh tranh gây ảnh hưởng tới KMvà VMcùng một đại lượng
(1.26). Do đó. đồ thị 1/Vj = f(l/[S]) (Hình 1.17) là những đường thẳng song song.
Đồ thị 1/Vị = f([I]) có dạng parabol (Hình 1.18).

Vì a < 1 , do đó, khi [I] nhỏ, có thể bỏ qua biểu thức a[I]:

VM — ^ — [S]
2 a K ị + [ 1] ° cxK, + [ [ ]
V; = -» Vi = (1.28)
aK ị + a[I]
K + [S] K s - a K ì - - + [S]
s a K ,+ [I]

aK aK ;
Trong đó: VMi = V (1.29); KMi = Ks (1.30)
aK, +[\) aK , + [ 1]

«K,+m
Nhân tử và mẫu của phương trình (1.28) với được:
aK,

1+ I!L
VM[S] aK , K,
vs = (1.31); 77 - =
VM [S]
Ks +[S] 1+ i ỉ l
aK i /
 Đồ thị 1/Vị = f([I]) theo công thức (1.29)
là đường thẳng (giống như trường hợp ức chế
chống cạnh tranh ở phần sau).

- Xác định K t: lập đồ thị V(/Vị = /([I])

(Hình 1.19):

K , + [S ]f 1+ -ÍỈ1
V. s « K :i / [S] [I]
=1+
V, K s +[S ] K s +[S]' aKj

Đồ thị Vo/Vị = /([I]) là đường thẳng có giao điểm tại trục tung với tọa độ =
1.

Trên đổ thị xác định được tg <p ; qua đó,

khi a =1, xác định Kj*.

[S] [S]
tg(Ị> = • ~~ ; Ki =
K s +[S] K; ■ K s +[S] tg<p

- Lập đổ thị VM/VMi=/([I]) (Hình 1.20):

a K i + [I] ill
= 1 +
VMi ctK CtK:

Từ đó suy ra: tg(p = 1/oiKj

Cũng có thể lập đồ thị A = /(1/[I]) để xác

định a ; Ki (Hlnh 1.21):

Biến đổi biểu thức k,xl): ——— s a — +M .

k2 a K ,+ [ i] ;

k(xt) _ J = aKj + a [ I ] - o t K i ~ m
aK ,+ [I]

56
 g [l]-[I] [ l ] ( c t - 1)

a K i + [I] a K i + [I]

Lấy đại lượng nghịch đảo của các vế phương trình và đặt:

1 aic, 1 1
A ———
— ----- —> A = -- — H---
k(xt) 1 a -l [I] a -1
k 2

Đồ thị A = /(l/[I]) ỉà đường thẳng có giao điểm với trục ngang tại tọa độ =
l/(a -1) và góc nghiêng T| với tgrị = aKi /(a -1). Qua đó xác định được Kị và a.

1.4.6. ức chế không hoàn toàn thiếu cạnh tranh

Đó là trường hợp phản ứng có sơ đồ như sau:

E+ s ES — > E+P ( 1.32)

1.4.7. ức chế chống cạnh tranh

Trong trường hợp ức chế chống cạnh tranh, chất ức chế chỉ kết hợp với
phức chất enzym-cơ chất, không kết hợp với enzym: p = 0 ; Kị —» 00 . Sơ đồ phản
ứng như sau:

E+ s ES — > E+P (1.33)

If'
IÉS

Để tìm tốc độ phản ứng cần tìm biểu thức nồng độ [ES] để thay vào công
thức tốc độ V = k2[ES].

57
 [E]„ = [E] + [ES] + [EIS] = [ES] ^ + 1+ - Ẹ - i
US] aK j

[E],
[ES] . Thay biểu Ihức [ES] vào công thức tốc độ V| = k 2[ES]:
Ks , [I]
[S] aK s

k2 - aK ' [ E ] 0 [S]
ME]ọ 2 a K , + [ 1] °
Vi V: = (1.34)
K,
+ Ị + ■[I] :
Ks aKị +[S]
[S] aK, aK ị + [I]

V - YmiỊSỊ... ( 1 .3 5 ) ; VMi = k 2 aK ' [E]0 (1.36)

K Mi+ [ S ] a K , + [ĩ] Jo

aK
K„; = Ks- ( 1 .3 7 )
a K i +[1]

Công thức này cũng có thể suy ra từ 1 /v *1

trường hợp chung khi cho p = 0; Kị =

Qua các biểu thức trên có thể thấy

rằng, ức chế chống cạnh tranh, cũng như ức chế
thiếu cạnh tranh, gây ảnh hưởng tới VMvà KM
aK
cùng một đại lượng 1— (trong 1.34). Vì / / /
oK i + [I] 1 /[S]

Vậy. đồ thị 1/Vi = f(l/[S]) là những đường thẳng Hình ỉ,22

song song có cùng góc nghiêng <|> (Hình 1.22)

với tgệ = Ks/VM.
 - Xác định Kj.’ để xác định Kj cần lập đồ thị l /v= f([I]) (Hình 1.23) (xem
công thức 1.29).

(tg<p = 1 /aKj) 7

1.4.8. ức chế giả cạnh tranh ((pseudo - comjx Hỉnh 1.23

Từ trường hợp chung biến đổi công thức (1.10), được phương trinh sau:

[S],

Đồ thị theo biếu thức (ĨV.6 ) trên trong tọa độ Lineweaver Burk I/V, =
f(l/[S]) như đồ thị trên hình J.10 là đường thẳng. Nhưng trong tọa độ Dixon l/v=
f([I]) không là dường thẳng. Điểu này cho ta phân biệt ức chế giả cạnh tranh với các
trường hợp khác.

1.4.9. Phân biệt các trường hợp ức chế

1.4.9.1. ứ c c h ế h ổ n h ợ p (mixeD-type inhibition)

59

ấ
f .4.9.2. ức chế hoàn toàn cạnh tranh (purely competitive inhibition)

1.4.9.3. ức chế không cạnh tranh (non-competitive)

1/v,

[I]

[l] = 0
1/[S]

1.4.9.4. ức chề thiếu cạnh tranh (un-competitive)

1.4.9.5. ức chế chống cạnh tranh (anticompetitive)

1.4.10. ức chế bỏi cơ chất

Theo phương trình Michaelis - Menten thì khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ
ban đầu của phản ứng tăng lên tới một giới hạn, gọi là tốc độ cực đại của phản ứng.
Trong một sổ trường hợp khi tăng nồng độ cơ chất, tốc độ ban đầu của phản ứng chỉ
tãng tới một giá trị nào đấy sau lại giảm xuống, có thể chưa đạt tốc độ cực đại. Đó
là hiện tượng ức chế bởi cơ chất.

Có thể chia hiện tượng ức chế bởi cơ chất thành các trường hợp sau:

1.4.10.1. Trường hợp thứ nhất

Lượng dư cơ chất kết hợp với phức enzym-cơ chất tạo thành phức ba ESS
khồng có hoạt tính enzym p = 0. Có thể mô tả phản ứng theo sơ đồ sau:

■» E+P (1.38)

ES2

[ES][S]
[ES2]

Nhân tử và mẫu với [S]

k ,[E ]„ [S ] y M[S]
Ys = (1.39)

Nhu vậy, lượng dư cơ chất không ảnh hưởng đên VM.

61
 Để xác định K ’.s cần lập đổ thị 1/V = f(l/[S]) (Hình 1.24):

J_ = Ks 1 [S] 1
vs ■ V M[S] + VM+ V M K's

rsi
Khi [S] nhỏ* biểu thức của phương trình (1.39) coi như bằng 0,
K's
phương trình này có dạng phương trình Michaelis-Menten (1.2), do đó:

Khi [S] » Ks, Ks coi như bằng 0, phương trình (1.39) chuyển thành:

Trong trường hợp này, để xác định K ’s cần lập đồ thị 1 / v s= f([S]), (Hình 1.24).

Độ nghiêng của đồ thi b ằ n g -----------.

*K’S

Để kiểm tra hoạt tính của phức ba ES2, cần lập đồ thị v s= log[S]. Nếu đồ
thị có dạng hình chuông đối xứng thì phức này không có hoạt tính. (Hình 1.25).

1/VẠ

[S]

Hình 1.24 Hình 1.25

62
1.4.10.2. Trường hợp thứ hai

Lượng dư cơ chất kết hợp với phức enzym - cơ chất tạo thành phức ba ESS..
Phức này có hoạt tính enzym nhưng ít hơn phức ES (p <1). Có thể mô tả phản ứng
theo sơ đồ sau:

E + S ES — — > E+ P (l.4l)

IESrị R,
— e k —). ES + P

[E]„ = [E] + [ES] + [ ESj], v s = kj[ES] + pk2[ES2]

K [E][S] [E] = [ES] JS i

[ES] [S]

K’s= íẵ[ES2]
Ịf ; [ E S ^ f E S J -K
g -s.

Tương tự trường hợp thứ nhất:

rB1 + rpsi [E]°

[E],,=[ ] Ị [S] K'J
[S] K-s

MS]
v s = k2 [ES] + p k2 [ESj] = k2 [ES] (1 + )
K's

------- V„,[S]

vms= M 1 + ÍP )[E ]0
K s

63
Khi nồng độ cơ chất lớn: [S] > Ks; [S] = [S]{), có thể viết:

M l + ^ ) [ E ]0
K s
V=
[S Ị
1+
K ',

V
Đặt k* = = k 2 --------
[E]( 1+ í ? k
K 7S

B= - = - K 's 1
1-kV k* 1 - P + 1-P[S1

Lập đồ thị B = f( 1 /[S]„) (Hình 1.26) (tg a = K \s /(1 - P))

1.4.10.3. Truờng hạp chung

Trong trường hợp này, dư nhiều cơ chất tạo thành phức enzym - cơ chất
ES(n+l) không có hoạt tính enzym:

Ks
E + s ẸS — E+ (1.43)

I?
ES(n+i)

VM[S]
v s= (n+l) (1.44)
[S]
K s +[S] +
K ',

Công thức này giống như công thức (1.39), chỉ khác số mũ của [S].

Lập đổ thị V = f([S]) (Hình 1.26) cho phép xác định được lượng cơ chất tối

K K/
J— a— 1

64
1.4.11. ức chế bởi sản phẩm

Trong một số trường hợp. khi phản ứng đạt tới một chiều sâu nào đấy,
lượng sản phẩm tích lũy lại nhiều có thể sinh ra hiện tượng ức chế bởi sản phẩm.
Có thể giải thích hiện tượng ức chế bởi sản phẩm bởi một số cơ chế động học khác
nhau:

1.4.11.1, ức chế cạnh tranh

Trong trường hợp này, cũng gần giống ưường hợp ức chế cạnh tranh bởi chất
ức chế (1.14), sản phẩm sinh ra trong quá trình phản ứng có thể kết hợp với enzym tạo
thành phức enzym-sản phẩm không có hoạt tính. Sơ đồ phản ứng có thể mô tả như sau:

K<
E + s
Is

EP
Kp
(1.45)

[E][SỊ [E] = [ES] i k [EP] = [E] — = [ES] - ^ 1!!!

K„ =
[EP] [S] Kp [S]Kp

'E i- |E1 * IES1* IBP|=|ES1Ị I+ Ì +H r }

[E]„
[ES] =
Ks l + m
[S] K p,

V, = k2 [ES]

k 2[E]0[S] VM[S] (1.46)

v,,= K
1+^S - ị x , S L ) K s Í1 + P Ì + [S] K s ịi + S l } +[S]
[S] V. Kp J
a.

65
 v„ = V M[S] (1.47)
K mp + [S]

I£ 1
trong đó: 1+ (1.48)
Kp /

Như vậy. sản phẩm chỉ ảnh hưởng tới KM.

Thực nghiệm cho phép xác định được [P]. Để xác định các thông số động
học cần lập đồ thị tiếp theo như sau:

Lập đồ thị 1/Vp = f (1/[S]> (Hình 1.27):

1 1 Ks 1 + [P]/K p
p
VM VM [S]

(tg <p=K J V m (1+[P]/K,.))

Ks, VMvà [P] xác định được, từ đó suy ra Kị> Hình 1.27

Để giảm bớt phức tạp, có thể sử dụng biểu thức:

V K S[P] J_
= 1+
[S] + K s ■K p ’

Sau đó xét 2 trường hợp:

V rpi
+ Khi Ks» [S] thì: — = 1 + ,
vp Kp

lập đồ thị V/Vj> = f([P]) (Hình 1.28) để xác định Kp.

+ Khi [S] » Ks, coi như [S] = [S]0, thì:

V: _J, KstP] J _ =1+i£ I K

Vp [S]0 +Ks 'Kp [S], 'K

Lập đổ thị V/V|, = f([P]/[S]„ (Hình 1.29) để xác định Ks/K,,.

66
1.4.11.2. ức chế không cạnh tranh

Trong trường hợp này, sản phẩm sinh ra trong quá trình phản ứng vừa có
thể kết hợp với enzym vừa có thể kết hợp với phức enzym - cơ chất tạo thành phức
không có hoạt tính, tương tự trường hợp ức chế không cạnh tranh bởi chất ức chế
(SĐ.IV.3a). có thể mò tả phản ứng bằng sơ đồ chung như sau:

E+P (1.49)
[ k ,. 1k
EP ESP

Tương tự. có thể mô tả tốc độ phản ứng bằng phương trình sau:

K
k, — [E]0[S]
Kp + fpj
V|.= (1.50); v„ = VMP[S] (1.51)
K .+ [S ] K .+ [S ]

K
Trong đó: VM1,= k 2 [E]„; VM,.= V, (1.52)
Kp + [ P ] vKp+[ P]

Như vậy. chất ức chế chi ảnh hưởng lới VM(1.52). để xác định thông số
động học Kị, cần lập đồ thị l/v|, = f(l/[S]) hoặc l / v J, =

67

Á
1.5. HIỆN TƯỢNG HOẠT HÓA

Hoạt hóa là hiện tượng tăng tốc độ tốc độ phản ứng enzym khi có chất lạ,
chất hoạt hóa (A), tham gia vào phản ứng. Hiện tượng hoạt hóa có thể chia ra thành
một số trường hợp sau:

1.5.1. Hoạt hóa hỗn hợp

Hoạt hóa hổn hợp là trường hợp chung khi a *l,p *1. Phản ứng được mô tả
bằng sơ đồ của như sau:

+ s ^ ES ■» E+P (1.53)
Ka aKy
0tKs
EA AES -» EA + P

Tốc độ của phản ứng mô tả theo (1.53) giống như trường hợp ức chế hỗn
hợp, a * p * 1 (xem 1.10) khi thay các hằng số Ki bằng KAnhư sau :

Ị aKA +P[A]Ị
2Ị aKA +[A] f JoL Jo VMA[S]„
V A= v» = (1.54)
K ma +[S]0
ctK.sj K* + [A] Ị[S]„
sỊaKA+ [A ]f

«k.a +P[A]
V ma= M E ] o ( 1 .5 5 ) ; k(«) = ki (1.56)
a K A +[A]

Ka +[A]
K ma = aK s (1.57)
aKA + [A]

Để xác định a, p lập đồ thị

l/V A=f(l/[S]) với các nồng độ khác nhau của
chất hoạt hoá được chùm đường thẳng cắt
nhau tại điểm M với tọa độ (Hình 1.30):

68
 Ị 1 P -1
[S] 0 ~ K s a - p ;

1 1 g -1
Va " vm o -P'

1.5.2. Hoạt hóa đồng lực

Đó là trường hợp khi a < 1. p = 1. Có thể mô tả theo sơ đồ phản ứng như sau:

E + s 3 * ES — k’ > E + P (1.58)

ịK
EA
a
aK, I
AES
aK;
*> EA + P

Tốc độ của phản ứng được viết như sau:

M E ] 0[S ]0
V A= VA= (1.59)
K a +[A] MA + [S]<
aK , + [S]0
aKA-f[A]

K a +[A]
K ma —aK s (1.60)
a K A +[A]

Như vậy hoạt hóa đổng lực khồng gây ảnh hưởng tới VM, chỉ gây ảnh
hưởng tới Km.

Lập đồ thị I/V= f( 1/[S]„) (Hình 1.31) với

các nồng độ khác nhau của chất hoạt hoá, tương tự
đồ thị ức chế cạnh tranh, được chùm đường thẳng
cắt nhau tại điểm trên trục tung với toạ độ 1 /VM, từ
đó có thể xác định VM.

69

á
 Để xác định các thông sô' dộng học khác: a,
Ka, lập dồ thị B = f(l/[A]) (Hình 1.32).

B=
[,1 - K j j " = _ L + ±
[ Ks J 1 -a 1 - a [A]

tg <p = a K a/(1 - a); Biết a suy ra KA.

3. Hoạt hóa không cạnh tranh

Đó là trường hợp chung k h i a = l , p > l . S ơ đ ồ của phản ứng như sau:

K,
E + s ^ (1.61)
K Ks 1U (*2
EA - AES ■ ■> EA + P

Tốc độ cùa phản ứng:

K ^ + p [A ]
2 K . +[A] Jo1 Jo V mạ[S]q
V A= VA= (1.62)
K s +[S ]0 K s +[SL

V |vlA = [E ]() (1.63)

K A + p[A]
(1.64)
K a +[A]

Như vậy, hoạt hóa không cạnh tranh

không gây ảnh hưởng tới KM, chỉ gây ảnh
hưởng tới VM. Đồ thị l/v = f(l/[S]0) với các
nồng độ khác nhau cùa chất hoạt hoá, tương
tự đồ thị ức chế không cạnh tranh, là chùm
Hình 1.33
đường thẳng cắt nhau tại điểm trên trục

ngang với toạ độ — — (Hình 1.33).

Ks

70
 Để xác định p. KA vẽ dồ thị B = f(l/[A])
(Hình 1.34):

k (x t) l K a + P K a - K a - [ A ] . _ P[A] + [A]
k2 K a +[ A] ' K a + [ A]

K a + [ A]
B = |^ >
P [A ]-[A ]
Hình 1.34
_ K a/[A] + 1 _ 1 ka 1
(3-1 " P - 1 + P - 1 [ A]

1.5.4. Hoạt hóa thiếu cạnh tranh

Đó là trường hợp chung khi a = p > 1. Sơ đổ của phản ứng như sau:

Ks
E+ s w ES — > E+ p (1-65)
«K a
~ lĩ
EA AES EA + p

Tốc độ của phản ứng:

ak2
q K A +[A] V m a [S ] „
VA = VA= ( 1. 66)
aK J I aJ J A L „ Km*+IS].
aK A + [A]

K ạ +[A]
V m a = k,„, [E]„ (1.67): k„„= a k 2 ( 1.68 )
a K A + [A]

Như vậy. hoạt hóa thiếu cạnh tranh vừa gây ảnh hưởng tới VMvừa gây ảnh
hưởng tới K m với cùng một dại lượng ct(KA+[A])/(aKA+[A]).

71
 Đồ thị 1/VA = f(l/[S](,) (Hình 1.35) với các nồng độ khác nhau của chất
hoạt hoá được chùm đường thẳng song song tương tự đồ thị ức chế thiếu cạnh tranh.
Để xác định các thông số động học a và KA, vẽ đồ thị.

Với B = f(l/[A ]j hoặc c = f(l/[A]) (hình 1.36), trong đó:

'k (x t)
B= lị = J _ +^ - L ; c = Ị ^ - i | = — + ^ —
Ị a-1 a-1 [A] [ Ks j a-1 a-1 [A]

1.5.5. Hoạt hóa bỏi cơ chất

Trong một số trường hợp, khi tăng nồng độ cơ chất quá nhiẻu cũng gây ra
hiện tượng hoạt hóa làm tăng tốc độ phản ứng. Đó là hiện tượng hoạt hóa bởi cơ
chất. Trong trường hợp đơn giản nhất của hoạt hóa bởi cơ chất có thể mổ tả giống
như sơ đổ ức chế bơi cơ chất nhưng p > 1 :

K s,
E + s ES (1.69)
ụ
ES, B i. ES + P

[E][S] [ES][S]
K ,= K'
[ES] • [ES2]

[E]„ = [E] + [ES] + [ES,], trong đó: [E] = [ES](K.s/[S]); [ESj] = [ES]([S]/K's)

72
 [E],
[E]„=[ES] J l + ^ + [S] [ES] =
[S] Ks
[S] K's

v s = k,[ES] + pk,[ES,] = k2[ ES:] ị 1+ p

Ks

k 2[E]0 M E ] 0[S]
Vs
K s . [S] |I + P K.S^ =
1+ - ^ + [S] + K s + p -
[S] K's Ks

M E]p [S] . v = V J S ]
Khi [S] « KV V (giống cồng thức ( 1 .2 ))
Ks + [S] Ks + [S]

Khi [S] » Ks: v s s= MEJo

1+M
K. s

IS ]
t+p.w
K s
Đặt k* = v s = k*[E]„
[E]„ [S]_
1+
Ks

...... k- ,+^ 7 . k* Ks Ks
ưy: kj , . [S] ; k " 1■ 1+ M .
1+
K '. K'»

o IS ] [S]
jl: ,1 v r £
J i+jạ
K s

[S]
kj*
-1 '= l + p K's = ỈSl 1M = _ K j _ _L +
k2 flJ S L -M PIS]- ts] (P -1 ) [S] (P -!)
r IS ! ./ /
K

73
 [k * ,r '_ Ks 1 1
ặt: = | k 2 J = ( P - 1 ) [S] + ( p - D

Khi [S] » Ks, có thể coi [S] = [S]„

[k 2 J (( 3 - 1 ) [S] (P-l)

Lập đồ thị B = f(l/[S]„) (Hình 1.37) để xác định

K ’s và p:

1.6. PHẢN ỨNG ENZYM BA GIAI ĐOẠN

Do cấu trúc bậc ba của enzym nên một số nhóm chức của nó ở gần nhau
tương tác với nhau tạo thành một khối như là một tác nhân có ái lực cao. Tác nhân
ấy tương tác với cơ chất tạo thành phức trung gian-axyl-enzym.

Thí dụ: khi thủy phân ester phức tạp R C -(0 )-O R \ thì chỉ có hai nhóm chức
của enzym tham gia vào qua trình thủy phân. Đó là OH của serin 195 và imiđasol của
histidin 57. Trong trường hợp cơ chất có tính đặc hiệu cao thì axyl-enzym là phức
trung gian không bển vững, khi có nước sẽ bị thủy phân tạo thành sản phẩm và enzym
tự do.

[E] [S] [ES] [EA] p, [E] P;

74
Nếu R = CH 3 có thể viết như sau:

E-OH + R ’O -C O -CH j Í5F=^ E -O H R ’O-CO-CH,

^ -^ E -O -C O -C H , -----> E-OH + CHrCOOH (P2)

R ’OH(P,)

Sơ đồ tóm tắt của phản ứng có thể viết như sau :

Ks k, k
E + s ES > EA — » E + p2 (1.70)

p,

[E] - nồng độ enzym; [P,], [P-J - nồng độ sản phẩm;

[S] - nồng độ cơ chất; [ES] - nổng độ phức trung gian.

[EA]-phức axyl-enzym-hợp chất trung gian được tạo thành do quá trình
axyl hóa trung tâm hoạt đông của enzym.

1.6.1. Phương trình động học của phản ứng

Nồng độ tổng cộng của enzym:

[E][S]
[E]„ = [E] + [ES] + EA]; Ks =
[ESI

s u . y w i : ^ U íE A ]
dt dt

Ở trang thái ổn đinh: —— - = k2[ES] - k,(EA] = 0

dt

Do đó k,[ES] = k,[EA]; [EA] = ^ - [ E S ] ; Vây: v, = v 2

k, at at

75
IE],, = [E] + [ES] + [EA] = ^ [ES] + [ES] + ^ [ES] = [ES] | l + -j~j + ~ |

[E]„
[ES] =
, K-s k 2
1+ — + —
[S] k 3

k , [ E ]0 k 2 [E]„[S]
Vi =

' +I +Ĩ 7 lsr H tK :

Nhãn tử và mẫu số với ta được:

k 2 + k3

k2 +k. k(xt)[E ]„[S]

Vi = (1-71); v ,= (1-72)
K M ( b k ) + [S]
Kt -——— + [S]
’ k 2 + k,

k 2k J (1.73)
k,„, =
k2 +kj

K m <I>Io - K s (1.74)
k2 +k3

2
hoặc -1 (1.75)
M (bk)

Lập đồ thị l/v = f(l/[S]) ( Hình 1.38) Hinh 1.38

Các phương trình trên khổng cho phép xác định riêng biệt giá trị các thông
số k2, k}, Ks . Để xác định riêng biệt các giá trị trên có thể dùng phương pháp sau:
cho vào hệ phản ứng một tác nhân có ảnh hưởng riêng tới từng hằng số, chỉ ảnh
hưởng tới một hằng số mà khồng ảnh hưởng tới hằng số khác, gọi là tác nhân có

76
tính chất chọn lọc. Từ đó có thể xác định hằng số bị ảnh hưởng. Để đơn giản hóa.
viết phản ứng enzym ba giai đoạn trên (1.70) như phản ứng theo cơ chế Michealis -
Menten:

E+ s =5 ^ = ES ----- xtL > E. P , . P 2 (1.76)

1.6.2. Ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc đến qúa trinh alxyl hóa

Trong phương pháp này cần lựa chọn tác nhân (N) sao cho chỉ ảnh hưởng
đến quá trình axyl hoá, tức là chỉ ảnh hưởng đến k2khi ấy:

k * „ „ = 7 ^ T - (1 -7 7 ); K-M(bk) ( 1 .7 8 )
k;+k, k;+k3

1.6.2.1. Trưởng hợp k2 » k3

Khi ấy k 2 » k3; k*xt) = k, - constant; K ^ (bk) =K„ —

(N- tác nhàn thêm vào, thường là các ester phức tạp).

Như vậy, tác nhân không gây ảnh hưởng tới

VM chỉ ảnh hưởng tới K ^ j (bk). Hằng số kì quyết

định tốc độ phản ứng.

Để xác định các thông sô' động học, có thể

lập đồ thị: ì / v = /(1/[S]) (Hình 1.39). Đổ thị là
chùm đường thẳng cắt nhau tại điểm trên trục tung.

16.2.2. Trường hợp k2« k3.

Khi ấy k ‘2 = k ’xt); K*M(bk) = Ks = constant.

11'
 Như vậy, tác nhân không gây ảnh

hưởng tới K ^ (bk), chỉ ảnh hưởng tới VM.

Để xác định các thông số động học,

có thể lập đồ thị: 1/V=/(1/[S]) (Hình 1.40).
Đồ thị là chùm đường thẳng cắt nhau tại
điểm trên trục hoành với toạ độ -1/KS.

1.6.2.3. Trường hợp k2 ~ k3

Đồ thị 1/V=/(1/[S]) là chùm dường

thẳng cắt nhau tại điểm M (Hình 1.41). Giải
phương trình v=v* cho phép xác định các
toạ độ của điểm cắt:

y _ y « . k(xt)[E ]°[S] k*(xt)[E] 0[S]

= K* +[S] + K- +[S]

J __ + K,
--s
v = k 2k 3[E]0 k J E ],

1 _ kj+k, Ks ]
■ k f k J E ] , + k*2[E]0 W ]

Giải phương trình = - ỉ- cho phép tìm đươc toa đô của điểm cắt M:
V V*

1 _ 1 . 1 1
[S] Ks : V k 3[E]

Qua đấy có thể xác định được k„ Ks và từ phương trình: — = —^ ----- 1 , suy ra k,.
^ 3 ^M (bk)
 Giải phương trình: — = ——
V V*

k2 jjja + Ks = k; + k 3 + K.
..s J_
k 2k ,[E ] , k 2[E]0 [S] k;k.,[E]„ k ;[E ]0 [S]

l Ks r 1 1> 1 ík;+k3 k2 +k.,ì

[S] [E], , k 2 k ; , " M E]„ V K k2 J
1 Ks < \ r 1 1 í > 'ì

ị* rj
1
1 r1
[S] [E], ” M E ]. " [E]0

1 Ks í 1 1ì 1 f_L_ 0 J _ _ __ Ị_
[S] [E], k*2, " [E]„ , k 2 k 2V [S]~ Ks

Thay — = — — vào biểu thức — sẽ tìm được: — = — —

[S] Ks V V k 3[E]0

1.6.3. Ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc đến quá trình dealxyl hóa

Trong phản ứng có sự tham gia chuyển dịch tác nhân axyl, có thể dùng
phương pháp thêm HX). Tác nhân axyl và nước cạnh tranh nhau nên sơ đồ tóm tắt
của phản ứng có thể viết như sau:
M H 2ơ ]
E + P,
Ks
ES UN]. (1.79)
E + P,

[N] - tác nhàn thêm vào, thường là các ester phức tạp (chất tác nhân hay được sử
dụng là 1 -4 butadiol HO-(CH4)4-OH.)

[E] - nồng độ enzym; [S] - nồng độ cơ chất; [EA]- phức axyl-enzym

[ES] - nồng độ phức trung gian; [P ,], [P2], [P3] - nồng độ sản phẩm

d[P.] „ d[P3]
V, = Ể ỊV Ị = k2 [ES]; v 2= = k2 [EA]; v 3= = k 4 [N][EA];
dt dt dt

79
Ở trạng thái ổn định có thể viết:

J = k, [ES] - (k, + k4[N])[EA] = 0; [EA] = [ES] ------

dt k , + k 4[N]

k2[ES] = (k, +k4[N])[EA]; V, = v 2 + V,

1.6,3.1. Tính tốc độ phản úng tạo các sản phẩm

❖ Tính V,: tốc độ phản úng tạo các sản phẩm p r:

V ,= k 2[ES]; Ks = [E][S]/[ES]

,1+ —
Ks + k 2
2 N
[E]„ = [E] + [ES] + [EA] = [ES]
[S] k 3 + k 4[N]

k 2[E]0 _ k 2[E]0[S]
[ES] =
l + ^ + — ha­ K s +[S] + [S] kỉ
ts] k , + k 4[ N ], k,+kJN]

k 2[E]0[S] k 2[E ]JS]

K
'+4+™FK
‘+[S
Ifó; k , + k 3 + k 4[Nl
[N]

^2 + ^3 + fc<ị[N]
Nhân tử và mẫu số với
k 3 + k 4[N]

k 3 + k 4[N]

V = 2 k 22 + k ,3 + k 4[N]_____
JoL _Jo /1 om. \r -
v<!>
M(bk)l.[S]#
J0
(1.81)
K k*3 +
+ kK<lN
nsll + [S] ( ); V| KM
»(bk)
r + I r[S],
sr
s k2 + k 3 +kJN ] Jo

Khi [N] = 0 -----> công thức (1.80) trở thành công thức (1.71)

80
Trong đó: V M(bk)= k ;” [E]„: = Ks - k , + k -4[N 1 :
k 2 + k , + k 4[N ]

k 2 (k 3 + k 4[N])
L(1> =
k 2 + k , + k 4[N]

❖ Tính v 2: tốc độ phản ứng tạo các sản phẩm P- (tương tự như đối với sản
phẩm p ,)

k 3 + k 4[N] t K s k , + k 4[N ]Ị
[E]„ = [EJ + [ES] + [EA]: [E]„ = [EA] •<1 + —
k2 [S] k2 I

[EA] =
, + i i ỉ + M N Ị + Ks k ; + k J N ]
k3 [S] k,

V i = ______________ M Ẹ l ọ ______________
2 , . ( k 3 + k 4 [N]) , K s ( k 3 + k 4 [NJ)

1+ k r i kr
[S]0 k 2
Khi [S] lớn thi [S] = [S](); Nhân tử và mẫu v ớ i------ ----------------
k 2 + k , + k 4[N]

k 3 + k 4[N] (2| _
Trong đó: k)= k ^ [E ] „ ; K $ bk)= K s
k 2 + k 3 + k 4[N] (x,r k 2 + k 3 + k 4[N]

81
 ❖ Tính v 3: tốc độ phản ứng tạo các sản phẩm P 3 (tương tự như tính v 2):

k 2 k 4[N]
[E] 0[S]0
k 2 + k , + k 4 [N] Vff»,[S]»
(1.84): v ,= (1.85)
k 3 + k 4[Tsỉ] K‘mĨh«, + [S]o
K, + [S]C
k 2 + k 3 + k 4[N]

Trong đó: = k (‘x t)[E]

1/(3) V- k ,+ k 4[N] ,m k ,k 4[N]

^ M (bk) “
( 1 .86); k S = ------ — (1.87)
k2 + k3 + k 4[N] ,x,) k, +k, +k,[NỊ

1.6.3.2. Tính các hằng s ố động học

Ngoài tốc độ phản ứng tạo các sản phẩm, có thể tính các hằng số động học
như sau:

Biết: k|» = k<«

(Xí) + k'íxwt)

k 2k 4[N]
Rút ra kí** đối với sản phẩm p,: ki^j =
k 2 + k 3 + k 4[N]

Các giá trị k(x0 được xác định từ thực nghiệm. Ks là hằng số Michaelis thực của giai
đoạn axyl hóa.

Để xác định các thông số động học, lập đồ thị — = f với các giá
vễ [■?]

trị [N] khác nhau. Các đường đổ thi — =: f ứng với các giá trị [N] khác
V, [S lJ
nhau là những đường thẳng cắt nhau tại một điểm ợ góc trái của hộ trục toạ độ (xem
hình 1.40). Qua đồ thị ta có thể xác định được k,; Ks, từ đó suy ra k2.
 Có thể lập đồ thị ứng với các giá trị [S] khác nhau. Đồ thị
[NL
này là chùm đường thẳng cắt nhau tại một điểm ở góc trái của hệ trục toạ độ với

toa dô ngang ỉà - “ (Hình 1.42).

K

Hoặc có thể lập đồ thị —!— = f([N]). Thí dụ, đồ thị: —7 - = f([N]). Đồ thi
1, ( 2)
k(xt) K (xt)

+k
này là đường thẳng cắt trục hoành với toạ độ và trục tung với toạ độ

fỵ ỉ}
(Hình 1.43).
vk 3 k 2y

K
- - 1
kK(xt)
(2) k 3 + k 2,

Hình 1,43
Hình 1.42

1.6.4. Động học của quá trình ức chế peroxidase bỏi ion Hg:

Nhiều tác nhân, trong đó có ion kim loại, gây ức chế làm giảm hoạt tính
của enzym. Qua độ giảm hoạt tính enzym (giảm tốc độ phản ứng) có thể đánh giá

83
được nồng độ các chất ức chế có mặt trong môi trường. Đó là nguyên tắc dùng
enzym để định lượng các ion kim loại nặng gây ô nhiễm môi trường. Một trong
những thí dụ để minh họa nguyên tắc trên là ứng dụng tính chất bị ức chế của
peroxidase bởi ion Hg2+ để giám định môi trường bị ô nhiễm bởi ion kim loại này.

Nguyên tắc của phương pháp: peroxidase xúc tác qúa trình chuyên hóa
indigocarmin dạng khử có màu xanh sang dạng oxy hóa có màu vàng, Khi có mặt
Hg2+, hoạt tính của peroxidase giảm. Qua độ giảm hoạt tính enzym có thể đánh giá
dược nồng độ ion kim loại, ở đây, hoạt tính enzym được xác định ĩhông qua tốc độ
chuyển màu của indigocarmin theo phản ứng sau:

Indigocarmin + H 20 2 peroxidase ^ Indigocarmin + H20 + l/2 0 2

(dạng khử, màu xanh) {dạng oxy hóa, màu vàng)

Để thu được các số iiệu động học của quá trinh ức chế peroxidase bởi các
ion kim loại nặng, đã tiến hành phản ứng enzym với cơ chất có nồng độ từ 1 . 1 0 *
đến 10.10 *M, dưới ảnh hưởng của Hg2+ với nồng độ từ 0,1.10 4M đến 0 ,6 .10 4M.
Các số liệu thu được về động học của quá trình phản ứng được trình bày trong bảng
1.6, 1.7, 1.8 và trên hình 1.44 và 1.45.

Bảng 1.6. Ảnh hirởng của Hg2+ đến tốc độ phản ứng thủy phân H20 2
với các nồng độ khác nhau

2 4 6 8 10
[Hg2+]-104, M \ ^

0 0,63 1,03 1,23 1,34 1,39

0,1 0,42 0,71 0,85 0,92 0,95

0,3 0,27 0,46 0,58 0,66 0,70

0,6 0,16 0,30 0,38 0,43 0,48

84
Bảng 1.7. Ảnh hưởng cua Hg2+đến đại lượng l/v của phản ứng thủy phân H2()2,
xúc tác bởi peroxidase

^ \ 4 / [ S ] . 1 0 5,1/M
0,1 0,125 0,167 0,25 0,50
[Hg2+].104, M ^ ^

0,6 2,01 2,27 2,63 3,33 6,01

0,3 1,25 1,48 1,85 2,30 3,70

0,1 0,96 1,05 1,21 1,42 2,38

0,0 0,67 0,75 0,85 1,18 1,61

Bảng 1.8. Ảnh hưởng của Hg2+đến các thông sô' động học
của quá ỉrình thủy phân H20 2xúc tác bởi peroxidase

[H2+].104,M v m. 106 Km.105 k ( x t)

1/k(xl,1 0 2

0 5,0 2,02 25,2 3,9

0,1 2,5 2,01 15,4 6,5

0,3 1,7 2,01 9,3 10,7

0,6 1,4 2,00 6,5 15,4

Hỉnh 1.44. Ảnh hưởng của Hỷ* đến tốc độ quá trình thủy phân H20 2
xúc tác bồi peroxidase (vẽ từ số liêu bảng 1.6)

85
 1/V . 10(exp -6)

7
4

• r
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/ [S].10(exp - 5)

Hình 1.45: Sự phụ thuộc IỈV = / (ỊS]) của quá trình thảy phân H20 2
xúc tác bởi peroxidase (vẽ từ sô' liệu bảng 1.7)

1- [Hg2+] = 0; 3- [Hg2*] = 0,3.10-\M;

2- [Hg2+] = 0P1.10^,M; 4- [Hg2+3 = O.aiO^.M.

Khi xem xét hình 1.45 thấy rằng, các đường đồ thị trên hình này cắt nhau
tại một điểm trên trục hoành. Điều này có thể giải thích rằng, ức chế quá trình thủy
phân H20 2 xúc tác bỏi peroxidase bởi ion Hg2+ là ức chế không cạnh tranh (non
competitive). Các số liệu thu được trong bảng 1.8 cũng khẳng định điều đó, Km-
hằng số Michaelis không thay đổi khi có mặt chất ức chế, ngược lại, Vm - tốc độ
phản ứng cực đại giảm với sự tăng nồng độ chất ức chế. Từ đó suy ra : Km= Kị

Phần lớn các phản ứng enzym thường xảy ra theo cơ chế gồm 3 giai đoạn:

E+S ES ( 1.88)

p,

E - enzym; EA- trạng thái trung gian axyl-enzym;

s - cơ chất; p t; p2 - sản phẩm phản ứng;

ES - phức cơ chất - enzym; k - các hằng số tốc độ phản ứng.

86
 Trong phản ứng, các ion kim loại (chất ức chê) có thể tạo phức với enzym.
hoặc với phức cơ chất - enzym. Có thể mô tả sơ đồ phản ứng sau:

^ ^ k, *3 v
V — E +p2 (1.89)

Để tìm phương trình các thông số động học, có thể diễn giải như sau:

- Nồng độ ban đầu cân bàng của enzym trong phản ứng

[EL = [E] + [ES] + [EA] + [IE] +[IES]

- Hằng sổ phân ly của các phức enzym với cơ chất và chất ức chế

Sự thay đổi lực ion của dung dịch (do có mặt ion kim loại nặng) chỉ gây tác
động chọn lọc tới tốc độ axyl hoá. Do đó, trong sơ đồ phản ứng có thể bỏ qua Pị.

Tốc độ tạo sản phẩm P2 là V = k 3[EA]

Như vậy, ở trạng thái ổn định, có thể mô tả sự biến đổi nồng độ axyl-enzym như sau;

= kj ES] - k, [EAJ = 0
dt

Phương trình tốc độ phản ứng khi có mặt Hg3t:

v k (x t)[E ]JS ]0
Trong đó : klxl) = — - ; KM = Ks
K m[S]0
k3 Ki

87
 Vẽ đồ thi — = f(I) (Hình 1.46) v ớ i----- = -— (•-— + 7 ~ “ • đổ thị này
k,„n
'(XI) (xt)
k 2 k, k 2Ks

1
cho phép xác định được: ' ± J _ ' và tga =
vk 2 + k v k 2Ki

K K
Lâp đổ thi — — =f([I]) để xác đinh —- và Kj (Hình 1.47).
k(xt) k2

Từ đồ thị trên hình 1.46 thu được: tga = 3,8.10’; -- 1-- 1 = 3,2. 10
k 2K, k
V 2 k3 y

Biết Km = Kị = 2,01 10"5 M; Suy ra k, = 1,31.10* s' 1 và k ,= 4,l.s '.

K
Từ đồ thị thu được trên hình 1.46 có thể xác định được: —- - 8.10-7.
k,

Biết k2 = 1.31.102 s_l: Suy ra: Ks =1.04.10^ M.

Các thông số dộng học của quá trình ức chế peroxidase bởi ion Hg:*:

Ks = l.O-UO^M. k, = 1.31.102 s-1

Kị = 2 ,01 . 10"SM. k, = 4,1.10 s~

88