2.1.

SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI ĆELIJE

Slika 2.1. Pregled sedam glavnih klasa receptora na površini ćelije.

U mnogim signalnim putevima vezivanje liganda za receptor vodi aktivaciji transkripcionih faktora u citosolu,
dozvoljavajući im da se translociraju u nukleus i da regulišu ( češće stimulišu, a redje inhibišu) transkripciju
njihovih ciljnih gena. Alternativno, aktivacija receptora moţe da vodi ka aktivaciji citosolnih protein kinaza koje
se potom translociraju u nukleus i regulišu aktivnost transkripcionih faktora. Neki aktivirani receptori,
prvenstveno GPCR, mogu da indukuju promene u aktivnosti postojećih proteina. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):
Citokinski receptori
i JAK/STAT
signalni putevi
 4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI
Druga velika klasa receptora na površini ćelije su citokinski receptori čiji
je citosolni domen veoma blisko asociran sa jednim članom familije citosolnih
tirosin kinaza, JAK kinazom (engl. JAnus Kinase).
Treća klasa receptora su receptori tirozin kinaze (engl. Receptor
Tyrosine Kinases - RTKs) čiji citosolni domen ima aktivnost tirozin kinaza, te se
stoga ovi receptori zovu tzv. receptori sa „unutrašnjom” enzimskom aktivnosti.

Mehanizmi kojima se ligandom aktiviraju citokinski receptori i receptori

tirozin kinaze su veoma slični i postoji značajno preklapanje u intracelularnim
putevima transdukcije signala koji se uključuju aktivacijom receptor obe klase.

U nekim drugim slučajevima, receptor je dimer i u odsustvu liganda, a

vezivanje liganda menja konformaciju ekstracelularnih domena obe
subjedinice. Bez obzira da li je monomer ili dimer, u svakom slučaju, formacija
funkcionalnog dimernog receptora prouzrokuje da jedna slabo aktivna citosolna
kinaza fosforiliše tačno odredjene tirozinske ostatke na delu molekule druge
kinaze koji se zove aktivaciona usna. Fosforilacija tirozina u aktivacionoj usni,
aktivira kinaznu aktivnost pomenute kinaze i vodi aktivaciji druge kinaze u
dimeru, kao i nekoliko tirozin kinaznih ostataka u citosolnom domenu receptora.
Fosforilacija ostataka u aktivacionoj petlji je generalni mehanizam kojim se
aktiviraju mnoge kinaze.
 4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI
4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedničke
karakteristike signalinga

Slika 4.6. Dimerizacija receptora za

EGF, receptora sa tirozin kinaznom
aktivnosti.
A – Šematski prikaz poloţaja
ekstra-celularnih i transmembranskih
domena EGF receptora. Vezivanje jedne
EGF molekule za monomerni receptor
prouzrokuje izmenu strukture petlje
loicirane izmedju dva EGF-vezujuća
domena monomernog receptora.
Dimerizacija dva identična monomerna
receptora koja su prethodno vezala
ligand se odvija u ravni membrane i to
interakcijom prvenstveno dva
„aktivirana” segmenta sa petljama. B –
Struktura ekstracelularnih domena
dimernog EGF receptora koji su vezali
TGFa, homolog EGF . Uočiti interakciju
izmedju dva „aktivirana” segmenta sa
4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedničke
karakteristike signalinga

Šematski prikaz položaja ekstra-celularnih i transmembranskih

domena EGF receptora.
Vezivanje jedne EGF molekule za monomerni receptor prouzrokuje
izmenu strukture petlje loicirane izmedju dva EGF-vezujuća domena
monomernog receptora. Dimerizacija dva identična monomerna receptora
koja su prethodno vezala ligand se odvija u ravni membrane i to
interakcijom prvenstveno dva „aktivirana” segmenta sa petljama.
Struktura ekstracelularnih domena dimernog EGF receptora koji su vezali TGFa,
homolog EGF .
Uočiti interakciju izmedju dva „aktivirana” segmenta sa petljama.
4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedničke
karakteristike signalinga
Slika 4.7. Generalna struktura
ligandom-indukovane aktivacije
RTKs i citokinskih receptora.
1 – Citosolni domen RTKs ima katalitičko
mesto proteina tirozin kinaze, dok je citosolni
domen citokinskih receptora asociran sa
odvojenom JAK kinazom. 2 – U oba tipa
receptora, vezivanje liganda prouzrokuje
konformacione promene koje favorizuju
formiranje funkcionalnog dimernog receptora,
pribliţavajući ili dva domena koja imaju
katalitičku atkivnost tirozin kinaze (RTKs) ili
dva citosolna domena koja su asocirana sa
JAK kinazama (citokinski receptori). Ovi
pribliţeni domeni potom fosforilišu jedan drugi
na mestima tirozinskih ostataka na aktivacionoj
usni. 3 – Fosforilacija prouzrokuje da se usna
pomera iz katalitičkog mesta kinaze, te to
dozvoljava da se ATP ili proteinski supstrat
veţu. Aktivirana kinaza potom fosforiliše druge
tirozinske ostake u citoso-lnom domenu
receptora. Dobijeni fosforilisani tirozini
funkcionišu kao mesta za pristajanje (engl.
docking sites) različitih proteina koji
4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedničke
karakteristike signalinga

Slika 4.7. Struktura ligandom-indukovane aktivacije RTKs.

1 – Citosolni domen RTKs ima katalitičko mesto proteina tirozin kinaze. 2 – U oba tipa receptora, vezivanje
liganda prouzrokuje konformacione promene koje favorizuju formiranje funkcionalnog dime-rnog
receptora, pribliţavajući ili dva domena koja imaju katalitičku atkivnost tirozin kinaze (RTKs). Ovi
pribliţeni domeni potom fosforilišu jedan drugi na mestima tirozinskih ostataka na aktivacionoj usni. 3 –
Fosforilacija prouzrokuje da se usna pomera iz katalitičkog mesta kinaze, te to dozvoljava da se ATP ili
proteinski supstrat veţu. Aktivirana kinaza potom fosforiliše druge tirozinske ostake u citosolnom
domenu receptora. Dobijeni fosforilisani tirozini funkcionišu kao mesta za pristajanje (engl. docking sites)
različitih proteina koji učestuvuju u transdukciji signala.
4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedničke
karakteristike signalinga

Slika 4.7. Struktura ligandom-indukovane aktivacije citokinskih receptora.

1 – Citosolni domen citokinskih receptora je asociran sa odvojenom JAK kinazom. 2 – U oba tipa receptora,
vezivanje liganda prouzrokuje konformacione promene koje favorizuju formiranje funkcionalnog dimernog
receptora, pribliţavajući citosolna domena koja su asocirana sa JAK kinazama (citokinski receptori). Ovi
pribliţeni domeni potom fosforilišu jedan drugi na mestima tirozinskih ostataka na aktivacionoj usni. 3 –
Fosforilacija prouzrokuje da se usna pomera iz katalitičkog mesta kinaze, te to dozvoljava da se ATP ili proteinski
supstrat veţu. Aktivirana kinaza potom fosforiliše druge tirozinske ostake u citoso-lnom domenu receptora.
Dobijeni fosforilisani tirozini funkcionišu kao mesta za pristajanje (engl. docking sites) različitih proteina koji
4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedničke
karakteristike signalinga

Slika 4.8. Regrutovanje signal-transdukcionih

proteina prema ćelijskoj membrani preko
vezivanja za fosfo-tirozinske ostatke aktviranog
receptora.
Citosolni proteini sa SH2 ili PTB domenima se
mogu vezivati za specifične fosfotirozinske
ostatke aktiviranog RTKs (prikazano na slici) ili
citokinskog receptora. U nekim slučajevima su
signal-transdukcioni proteini fosforilisani ili sa
receptorskom-unutrašnjom ili sa receptorom-
asociranom tirozin kinazom, te se time pojačava
njihova aktivnost. Neki RTKs i citokinski
receptori koriste “multidocking” proteine kao što
je IRS-1 da bi povećali broj signal-transdukcionih
proteina koji se regrutuju i aktiviraju. Posledična
receptor- kinazna fosforilacija IRS-1 kreira fosfo-
tirozinske ostatke koji funkcionišu kao dodatna
“docking” mesta za SH2 domene signal-
trandukcionih proteina.
 4.2.2. Citokini utiču na razvoj mnogih tipova ćelija

Citokini su familija relativno malih, sekretornih proteina (generalno sadrže oko

160 aminokiselina) koji kontrolišu mnoge aspekte rasta i diferencijacije u
specifičnim tipovima ćelija.

Struktura eritropoetina (Epo) vezanog za

ekstracelularne domene dimernog
eritropoetinskog receptora.
Epo sdrţi 4 konzervisana dugačka a
heliksa rasporedjena u specifičnom
araţmanu. EpoR monomer je gradjen od
dva subdomena, od kojih svaki ima 7
konzervisanih b lanaca rasporedjenih u
karakterističnom maniru. Ostaci bočnih
lanaca dva heliksa Epo ostvaruju vezu sa
kontaktnom petljom jednog EpoR
monomera, dok se ostaci na druga dva
Epo heliksa vezuju za drugi EpoR
monomer, te time značajno stabilizuju
dimerni receptor. Struktura drugih
citokina i njhovih receptora su slične.
(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology.
WH Freeman and Company; adaptiorano od Syed i sar.
(1998), Nature 39:511.).
4.2.2. Citokini utiču na razvoj mnogih tipova ćelija

Slika 4.9. Uloga eritropetina u formiranju

eritrocita.
Eritroidne progenitorne ćelije koje se nazivaju
eritroidne kolonija-formirajuće jedinice (engl. Colony
Forming Units Erythroid – CFU-E) su derivati
hematopoetskih pluripotentnih stem ćelija koje
takodje daju progenitorne ćelije i za druge tipove
ćelija krvi. U odsustvu eritropoetina CFU-E ćelije
ulaze u apoptozu tj. proces programirane ćelijske
smrti. Vezivanje eritropetina za njegov receptor na
CFU-E indukuje transkripciju nekoliko gena koji
kodiraju proteine koji sprečavaju apoptozu,
dozvoljavajući CFU-E ćelijama da preţive i da prolaze
kroz program od tri do pet završnih deoba ćelije.
Eritropoetin takodje indukuje ekspresiju proteina
specifičnih za eritrocite kao što je globin koji potom
formira hemoglobin, kao i membranski protein
glikoforin i jono-izmenjivački protein. Receptori za
eritropoetin, kao i drugi membranski proteini se gube
sa površine CFU-E ćelija kada one ulaze u proces
diferencijacije. Ukoliko se CFU-E ćelije gaje u kulturi
sa eritropoetinom u polučvrstom medijumu (npr.
sadrţi metilcelulozu), ćelije koje su potomci ne mogu
da se udaljavaju, te svaka CFU-E ćelija produkuje
koloniju od 30-100 eritroidnih ćelija.)
 4.2.2. Citokini utiču na
razvoj mnogih tipova ćelija

Slika 4.10. Model signalnih puteva koji se uključuju kao odgovor na hipoksiju, a posredovani su HIF-1.
Lokalna koncentracija kiseonika se registruje verovatno „kiseoničnim senzorom” koji zahteva hem-asocirane
proteine (S-heme). Nedostatak kiseonika na senzoru aktivira intermedijere (X) koji potom stimulišu povećanu
produkciju obe subjedinice HIF-1 (engl. Hypoxia Induced Factor 1). HIF-1 aktivira transkripciju gena koji kodiraju
proteine koji posreduju kratkotrajne i dugotrajne odgovore na deficit kiseonika. HIF-1 aktivira različite ciljne gene
u različitim ćelijama ukazujući time da verovatno deluje u kombinaciji sa drugim proteinima koji regulišu
transkripciju gena. VEGF (engl. Vascular Endothelial Growth Factor) – vaskularni endotelijalni faktor rasta; iNOS
 4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju
slične puteve signalne transdukcije

Svi citokini imaju sličnu tercijarnu strukturu koju grade četiri duga konzervisana a
heliksa (a-helikoidna struktura) grupisana zajedno u specifičnoj orjentaciji. Slično,
struktura svih citokinskih receptora je ista.

Svi citokinski receptori se sastoje od jednog ili više transmembranskih proteina čiji je
ekstracelularni deo odgovoran za vezivanje citokina, a citoplazmatski deo je
odgovoran za iniciranje signalnih puteva. Ekstracelularni domen je gradjen od dva
subdomena, od kojih svaki ima sedam konzervisanih b lanaca grupisanih zajedno u
specifičnom maniru. Tipični putevi signalne transdukcije se aktiviraju ligand-
indukovanom aktivacijom receptora, približavajući citoplazmatske delove jedne ili više
receptornih molekula u procesu analognom signalingu preko T i B receptora (detaljniji
opis je moguće naći u skripti Molekularna i ćelijska imunologija, Kostić i Andrić, 2007).

Citokini svoj efekat ispoljavaju vezujući se sa velikim afinitetom za svoje receptore koji
pripadaju odredjenim strukturnim familijama (Slika 4.11.). Aktivacija receptora
stimuliše specijalizovane signalne puteve kao što je npr. JAK-STAT signalni put (Janus
tirozin Kinaze u citoplazmi koje fosforilišu STAT-engl. Signal Transducer and Activator
of Transcription). Svi citokinski receptori su vezani sa jednom ili više JAKs. Postoje
četiri identifikovane JAKs sa definisanom strukturom: JAK1, JAK2, JAK3 i Tyr2). Na
primer, receptori za a-interferon su socirani sa JAK1 i Tyr2, dok su receptori za g-
interferon asocirani za JAK1 i JAK2 (Tabela 4.3.).
 4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju
slične puteve signalne transdukcije

Tabela 4.3. Neki signalni proteini koji deluju preko citokinskih receptora i
JAK-STAT signalnog puta
LIGANDI JAKs UDRUŢENE sa AKTIVIRANI NEKI ODGOVORI
RECEPTOROM STATs
g-interferon Jak1 i Jak2 STAT1 Aktivira makrofage; povećava
ekspresiju MHC proteina
a-interferon Tyr2 i Jak2 STAT1 i STAT2 Povećava otpornost ćelije na viralne
infekcije
Eritropoetin Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju eritrocita
Prolaktin Jak1 i Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju mleka
Hormon Jak2 STAT1 i STAT5 Stimuliše rast indukujući produkciju
rasta IGF-1
GM-CSF Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju granulocita i
makrofaga
IL-3 Jak2 STAT5 Stimuliše ranu produkciju uobličenih
elemenata krvi
(Preuzeto iz Alberts i sar. (2005): Molecular Biology of The Cell. Garland Science.
 4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju
slične puteve signalne transdukcije

Slika 4.11. Strukture citokinskih receptora.

A – Receptori za različite citokine klasifikovani su u familije na osnovu konzervisane
strukture ekstracelula-rnog domena (WSXWS: triptofan-serin-X-triptofan-serin); B - Različiti
citokinski receptori izgrađeni su od specifičnog ligand-vezujućeg lanca koji se nekovalentno
asocira sa signalnom subjedinicom koja je zajednička za receptore različitih citokina.
 4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju
slične puteve signalne transdukcije

Tabela 4.4. Mehanizmi signalne transdukcije citokinskih receptora

PUTEVI SIGNALNE CITOKINSKI RECEPTOR
TRANSDUKCIJE KOJI KORISTI DATI SIGNALNI MEHANIZAM
SIGNALNI PUT
JAK/STAT put Tip I i tip II citokinskih JAK-posredovana fosforilacija i aktivacija STAT
receptora transkripcionih faktora
Signaling TNF TNF familija receptora: Vezivanje adapterskih proteina, aktivacija
receptora preko TRAF TNR-RII, CD40 transkripcionih faktora
Signaling TNF TNF familija receptora: Vezivanje adapterskih proteina, aktvacija kaspaze
receptora preko tzv. TNR-RI, Fas
»death« domena
Tirozin kinaze M-CSF receptor Unutrašnja aktivnost tirozin kinaze u receptoru
povezane sa Receptor faktora stem
receptorima ćelija (SCF)
G protein signaling Hemokinski receptori GTP zamena i disocijacija Ga:GTP od Gbg,
Ga:GTP aktivira različite ćelijske enzime, ali i neke
druge proteine
 4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju
slične puteve signalne transdukcije
Vezivanje citokina ili indukuje receptorne lance da se oligomerizuju ili da se reorijentišu i
formiraju oligomer. I jedno i drugo dovodi do približavanja asociranih JAKs dovoljno blizu da
bi mogle da se unakrsno/medjusobno fosforilišu, te time povećavaju aktivnost tirozin-kinaznih
odmena. JAK potom fosforiliše tirozine na citokinskom receptoru formirajući tako fosfo-
tirozinske ostatke koji imaju funkciju „docking“ mesta za STATs i druge signal-transdukcione
proteine.
Postoji sedam poznatih STATs (STAT1,STAT2, STAT3, STAT4, STAT5, STAT6 i STAT7), a
svaki od njih ima SH2 domen koji ima dve funkcije. (1) Posreduje vezivanje STAT proteina za
fosfo-tirozinska „docking“ mesta na atkiviranom citokinskom receptoru (ili RTKs). Kada se
STAT veže biva fosforilisan od strane JAK na tirozinskim ostacima, što prouzrokuje njegovu
disocijaciju od receptora. (2) SH2 domeni na oslobodjenom STAT molekulu sada posreduju
vezivanje STAT molkula za fosfo-tirozine drugih STAT molekula, formirajući tako ili STAT
homodimer ili heterodimer. Potom se STAT dimer translocira u nukleus u kome se, u
kombinaciji sa drugim genskim regulatornim proteinima, vezuje za specifičan region na DNK
molekuli, tzv. „DNK element koji odgovara“ (engl. DNA Response Element - DRE), različitih
gena i stimuliše njihovu transkri-pciju (Slika 4.13.). Na primer, kao odgovor na hormon
prolaktin koji stimuliše ćelije mlečne žlezde da produkuju mleko, STAT5 stimuliše transkripciju
gena koji kodira proteine mleka.
Citokinski receptori aktiviraju odgovarajuće STAT proteine zbog toga što SH2 domeni ovih
STAT proteina prepoznaju jedino specifične sekvence fosfotirozinskih „docking“ mesta. Na
primer, aktivirani receptor za a-interferon regrutuje i STAT1 i STAT2, dok aktivirani receptor za
g-interferon regrutuje jedino STAT1. Ukoliko bi se SH2 domen a-interferonskog receptora
zamenio SH2 domenom g-interferonskog receptora, aktivirani hibridni receptor bi regrutovao i
STAT1 i STAT2, kao i a-interferonski receptor sam po sebi.
Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu
i aktiviraju slične puteve signalne transdukcije
Slika 4.13. JAK-STAT signalni put
aktiviran vezivanjem a-interferona za
svoje receptore.
Vezivanje interferona prouzroku-je ili
dimerizaciju dva odvojena polipeptidna
lanca (kao što je prikazano) ili reorjentiše
recepto-rne lance da formiraju dimer. U
svakom slučaju, asocirani JAK molekuli
se približavaju jedan drugom tako da
mogu da se medjusobno unakrsno
fosforilišu na mestima gde su tirozinski
ostaci, što pokreće proces transdukcije
signala, odnosno aktivira signalni(e)
put(eve). Dva različita receptorna lanca
su asocirana sa različitim JAKs (Tyr2 i
JAK1) te tako regrutuju različite STAT
molekule (STAT1 i STAT2). Aktivirani
fosforilacijom STATs se disociraju od
receptora i formiraju heterodimere koji se
translociraju u nukleus gde se vežu za
specifična mesta na DNK sekvenci
(engl. DNA respo-nse elements) i
zajedno sa dru-gim genskim
regulatornim protei-nima indukuju
transkripciju gena.
 4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju
slične puteve signalne transdukcije

Slika 4.14. Pregled intracelularnih puteva transdukcije signala koji se aktiviraju vezivanjem
liganda za eritropetinski receptor (EpoR), tipični citokinski receptor.
Četiri velika signalna puta mogu da transdukuju signal od aktiviranog EpoR-JAK (videti donji deo slike
4.7.). Svaki signal-transdukcioni put reguliše transkripciju različitih setova gena. A – U najdirektnijem
putu, transkripcioni faktor STAT5 se fosforiliše i aktivira direktno u citosolu. B – Vezivanje tzv. »linker«
proteina, Grb2 ili Shc za aktivirani EpoR prouzrokuje aktivaciju Ras-MAP kinaznog puta. C i D –
Aktivaciju EpoR prati idukcija dva fosfoinozitidna puta koja se aktviraju regrutovanjem fosfolipaze Cg
PI3 kinaze na membranu. Povećan nivo Ca2+ i aktivirana protein kinaza B (PKB) takodje modulišu
aktivnost citosolnih proteina koji nisu uključeni u regulaciju transkripcije, nego imaju druge funkcije u
procesima transdukcije signala ili drugim procesima u ćeliji.
4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju
slične puteve signalne transdukcije
.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore

Ubrzo nakon otkrića i kloniranja citokina, izlovana je i većina njihovih receptora

različitim eksperimentalnim tehnikama. Genetičkim analizama je potvrdjeno da se
vezivanjem liganda za citokinske receptore aktiviraju dva ključna signal-transdukciona
proteina: JAK kinaza i STAT transkripcioni faktor. Pokazano je da su jedan
(ponekada i dva) od četiri humana JAK proteina i makar jedan od nekoliko STAT
proteina uključeni u signaling u donjem toku signalnog puta svih citokinskih receptora.

Za razumevanje fukcionisanja JAK i STAT proteina uvek se kao primer prezentuje,

najbolje proučen i razjašnjen citokinski signalni put, a to je signalni put koji se uključuje
nakon aktivacije eritropoetinskog receptora (engl. Erythropoietin Receptor – EpoR).
Ovaj signalni put je veoma važan za formiranje zrelih, funkcionalnih eritrocita, a time i
za transport gasova, odnosno opitmalno snabdevanje svih ćelija i tkiva kiseonikom. Svi
početni elementi EpoR-signalnog puta (eritropoetin, EpoR, kao i JAK2) su neophodni za
formiranje adultnog-tipa eritrocita koje normalno počinje dvanaestog dana
embrionalnog razvića kod miša. Embrioni miša kojima nedostaju funkcionalni geni koji
kodiraju ili EpoR ili JAK2 (Slika 4.15) ne mogu formirati adultni-tip eritrocita i često
umiru zbog nesposobnosti da obezbedjuju potrebne i dovoljne količine kiseonika
fetalnim organima.
.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore

Slika 4.15. Studije sa mutantnim miševima su pokazale da su i eritropoetinski receptor

(EpoR) i JAK2 esencijani za razvoj eritrocita.
Miševi kod kojih su oba alela za EpoR i JAK2 gene uklonjena (engl. »knocked out«) razvijaju se normalno do
trinaestog embrionalnog dana, a potom počinju da umiru zbog anemije uzrokovane nedostakom eritrocitima-
posredovanog transporta kiseonika do fetalnih organa. Zatamnjeni deo kod normalnog tipa embriona (+/+) je
fetalna jetra koja je glavno mesto produkcije eritrocita u ovoj razvojnoj fazi. Nedostatak boje/zatamnjenja kod
mutantnih embirona (-/-) ukazuje na odsustvo eritrocita koji sadrţe hemoglobin. Sem toga, mutantni embrioni
izgledaju normalno, što ukazuje da je glavna funkcija EpoR i JAK2 u ranom razvoju kod miša da stimulišu
produkciju eritrocita.
.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore

Epo se vezuje simultano za ekstracelularne domene dva EpoR

mononomera (videti sliku 4.12.). Aktivacija EpoR rezultira
približavanjem JAKs molekula dovoljno blizu da bi mogle medjusobno
da se fosforilišu unakrsnom fosforilacijom na kritičnim tirozinima
aktivacione usne (videti sliku 4.7). Kao i kod drugih kinaza,
fosforilacija aktivacionih usana prouzrokuje konformacione promene
koje smanjuju Km za ATP ili supstrat koji treba da bude fosforlisan, te
time povećavaju kinaznu aktivnost.

Jedan deo informacija za ovaj mehanizam aktivacije dobijen je u

studijama sa JAK2 mutantima kod kojih su kritični tirozini na
aktivacionim usnama mutirani u fenilalanin. JAK2 mutant se normalno
vezuje za RpoR, ali ne može da bude fosforilisan. Ekspresija ovog
JAK2 mutanta u eritroidnim ćelijama u količinama većim nego što je
uobičajeno potpuno blokira EpoR signaling, zbog toga što JAK2
mutant blokira funkciju normalnog/divljeg-tipa (engl. wild-type)
proteina. Ovakav tip mutacije se naziva dominantna negativna
mutacija i prouzrokuje gubitak funkcije čak i u ćelijama koje nose
kopije normalnog gena (engl. wild-type gene).
.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore

Kao što je napomenuto, aktivirane JAK kinaze fosforilišu nekoliko

tirozinskih ostataka na citosolnom domenu receptora. Neki od ovih fosfo-
tirozina potom imaju funkciju veznih mesta za grupu STAT transkripcionh
faktora.

Svi STAT proteini imaju: (1) N-terminalni SH2 domen kojim se vezuju za
fosfo-tirozine receptornog citosolnog domena; (2) centralni DNK-vezujući
domen; (3) C-terminalni domen sa kritičnim tirozinskim ostacima. Kada se
STAT protein veže za aktivirani receptor, C-terminalni tirozini se fosforilišu
sa asociranom JAK kinazom. Ovakav aranžman osigurava da se u
odredjenim ćelijama aktiviraju samo oni STAT proteini sa SH2 domenima
koji mogu da se vežu za odredjeni receptorni protein. Fosforilisani STAT
disocira spontano od receptora, a dva fosforilisana STAT proteina
medjusobno formiraju dimere tako što se SH2 domeni svakog od njih
vezuju za fosfo-tirozine drugog STAT proteina. Zbog dimerizacije se
izlaže signal za nuklearnu lokalizaciju ili nuklearni lokalizacioni signal
(engl. Nuclear Localisation Signal - NLS) (Slika 14.16.), te se STAT dimer
translocira u nukleus, gde se vezuje za specifične pojačivačke sekvence
(engl. enhancer sequences) koje kontrolišu ciljne gene.
.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore
Različiti STAT proteini aktirivaraju različite gene u različitim
ćelijama. Na primer, u eritroidnim progenitornim ćelijama
stimulacija eritropetinom dovodi do aktivacije STAT5, a ovaj
aktivirani transkripcioni faktor indukuje povećanu eskpresiju
proteina Bcl-xL, koji sprečava programiranu ćelijsku smrt tj.
apoptozu ovih progenitornih ćelija, te im time dozvoljava
da proliferišu i diferenciraju se u eritroidne ćelije
Slika 4.16. JAK-STAT singalni put.
Prateći vezivanje liganda za citokinski
receptor i aktivaciju asocirane JAK kinaze,
JAK fosforiliše nekoliko tirozinskih ostataka
na receptornom citosolnom domenu (videti
sliku 4.7.). Nakon što se inaktivni
monomerni STAT protein veţe za receptor,
fosforiliše se aktivnom JAK kinazom.
Fosforilisani STATs spontano disociraju od
receptora i spontano se dimerišu. S obzirom
da STAT homodimer ostvaruje dve interakcje
izmedju fosfo-tirozina i SH2 domena, iako je
za stabilizaciju receptor-STAT kompleksa
dovoljna samo jedna ovakva interakcija,
fosforilisani STAT nema tendenciju da
ponovo veţe za receptor.
4.2.5. SH2 i PTB domeni se vezuju za specifičnu sekvencu koja okružuje
fosfoserinske ostatke

SH2 domen Src tirozin kinaze se snažno vezuje za bilo koji peptid koji sadrži četiri
kritična ostatka osnovne sekvence: pTyr-Glu-Glu–Ile. Ove četiri aminokiseline ostvaruju
intimni kontakt sa peptid-vezujućim mestom u Src SH2 domenu. Vezivanje liči na
umetanje dvokrakog „zatvarača” (pTyr i Ile bočni lanci peptida) u dvokraku „duplju” u
SH2 domenu. Dva Glu ostatka se veoma tesno fituju i priljubljuju se u i na površinu
SH2 domena izmedju fosfo-tirozinske duplje i hidrofobnog džepa koji prihvata ostatak Ile

Variranje u hidrofobnoj duplji u SH2 domenima

različitih STAT proteina, kao i drugih signal-
transdukcionih proteina, dozvoljava im da se
vežu za fosfo-tirozine vezane za različite
sekvence, računajući na razliku u njihovim
vezujućim parametrima.

Slika 4.16. Površinski model SH2 domena Src kinaze

vezanog za peptid koji ima fosfo-tirozine.
Fosfo-tirozin (Tyr0 i OPO3-) i izoleucin (Ile3) ostaci se
uklapaju u dvokraku duplju na površini SH2 domena. Dva
glutamatna ostatka (Glu1 i Glu2) su vezani za mesta na
površini SH2 domena koja su izmedju dve duplje.
4.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulsan negativnim signalima

Signalom-indukovana aktivacija transkripcije ciljnih gena na neki duži period

može biti jednako opasna za ćeliju kao i jako mala indukcija.

Ćelije moraju biti sposobne i osposobljene da prekinu signal-transdukcioni put

veoma brzo ukoliko i iako ekstracelularni signal ostaje konstantno prisutan.

Intracelularnu transdukciju signala od različitih citokinskih receptora preko

JAK/STAT signal-transdukcionog puta negativno regulišu tri familije proteina:

(1) Fosfataze koje sadrže SH2 domene (engl. SH2-containing Phosphatases –

SHP)

(2) Supresori citokinskog signalinga (engl. Suppressors Of Cytokine Signaling -

SOCS)

(3) Proteini inhibitori aktiviranih STAT proteina (engl. Protein Inhibitors of

Activated STATs – PIAS).

U različitim progenitornim ćelijama odredjene klase proteina imaju ulogu da

prekinu signalnu transdukciju citokinskih receptora, jedni u kratkom periodu (meri
se minutama), a drugi u dužim periodima i trajno.
4.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulsan negativnim signalima

Slika 4.17. Dva mehanizma za prekidanje transdukcije signala od receptora za eritropoetin (EpoR).
A – SHP1, protein tirozin fosfataza, je prisutna u neaktivnoj formi u nestimulisanim ćelijama. Vezivanje SH2 domena SHP1
proteina za odredjeni fosfo-tirozin aktiviranog receptora „razmaskirava” tj. otkriva fosfatazno katalitičko mesto SHP1 i
pozicionira ga dovoljno blizu fosforilisanog tirozina u regionu atkivacione usne JAK2, što omogućava SHP1 da defosforiliše
tirozin na aktivacionoj usni. Uklanjanje fosfata sa ovog tirozina inaktiviše JAK kinaznu aktivnost. B – SOCS proteini, čija je
ekspresija indukovana u ertropoetinom-stimulisanim eritroidnim ćelijama, inhibišu ili trajno prekidaju sinaling na duţi period.
Vezivanje SOCS za fosfo-tirozinske ostatke na EpoR ili JAK2 blokira vezivanje drugih signal-transdukcionih proteina (levo).
SOCS boksevi mogu takodje „naciljati” i delovati na proteine kao što je JAK2 preko ubiquitin-proteazomnog puta (desno). Slični
mehanizmi regulišu intracelularnu transdukciju signala i od drugih citokinskih receptora.
4.2.6.1. Kratkotrajna regulacija je indukovana SHP1 fosfatazama

Slika 4.17A. Prekidanje transdukcije

signala od receptora za eritropoetin
(EpoR) SHP1 fosfatazama.
SHP1, protein tirozin fosfataza, je prisutna
u neaktivnoj formi u nestimulisanim
ćelijama. Vezivanje SH2 domena SHP1
proteina za odredjeni fosfo-tirozin
aktiviranog receptora „razmaskirava” tj.
otkriva fosfatazno katalitičko mesto SHP1
i pozicionira ga dovoljno blizu
fosforilisanog tirozina u regionu
atkivacione usne JAK2, što omogućava
SHP1 da defosforiliše tirozin na
aktivacionoj usni. Uklanjanje fosfata sa
ovog tirozina inaktiviše JAK kinaznu
aktivnost. Slični mehanizmi regulišu
intracelularnu transdukciju signala i od
drugih citokinskih receptora.
4.2.6.2. Dugotrajna regulacija je indukovana SOCS proteinima

Slika 4.17B. Prekidanje

transdukcije signala od
receptora za eritropoetin
(EpoR) SOCS proteinima.
SOCS proteini, čija je
ekspresija indukovana u Epo-
stimulisanim eritroidnim ćelija-
ma, inhibišu ili trajno prekidaju
sinaling na duţi period.
Vezivanje SOCS za fosfo-
tirozinske ostatke na EpoR ili
JAK2 blokira vezivanje drugih
signal-transdukcionih proteina
(levo). SOCS boksevi mogu
takodje „naciljati” i delovati na
proteine kao što je JAK2 preko
ubiquitin-proteazomnog puta
(desno). Slični mehanizmi
regulišu intracelularnu transdu-
kciju signala i od drugih
citokinskih receptora.
Ubikvitinom-posredovani proteolitički put.

Slika 4.18. Ubikvitinom-posredovani

proteolitički put.
A – 1 – Enzim E1 se aktivira kačenjem molekula
ubiquitina (Ub). 2 – Aktivirani E1 za koga je
zakačena molekula Ub prenosi vezani Ub
molekul do E2. 3 – Ubiquitin ligaza (E3) vrši
transfer Ub molekule vezane za E2 na bočni
lanac sa ostakom koji ima amino grupu (-NH2).
Dodatne molekule se dodaju na ciljni protein
ponavljanjem koraka 1,2 i 3., te se tako formira
poliubiquitirani lanac koji usmerava ciljni
protein prema proteozomu (4). 5 – U okviru
ovog velikog kompleksa, ciljni protein se cepa
na veliki broj malih peptidnih fragmenata. B –
Kompjuterom-generisana slika otkriva da
proteazom ima cilindričnu strukturu sa
poklopcima na svakom kraju središnjeg dela ili
jezgra. Poroteoliza ubiquitinima-etiketiranim
proteinima se odvija duţ unutrašnjeg zida
jezgra.
 The Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK)
Cascades

The Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Cascades

Several MAPK cascades have been identified in mammalian cells, including the extracellular signal-related kinase pathways
(ERK1/2, ERK5) and the stress activated kinase pathways (JNK/SAPK, p38 MAPK). These pathways are linked to many G
protein-linked cell surface receptors and receptor tyrosine kinases. Thus, most cytokines, growth factors, hormones, and
neurotransmitters can selectively activate these cascades via receptor activation of intracellular second messengers. All MAPK
pathways operate through sequential phosphorylation events to phosphorylate transcription factors and regulate gene
expression. They can also phosphorylate cytosolic targets to regulate intracellular events. These cascades are implicated in the
 Akt Signaling

Akt Signaling
The serine/threonine protein kinase Akt/PKB is the cellular homologue of the viral oncogene v-Akt and is activated by various growth and
survival factors. In mammals, there are three known isoforms of the Akt kinase, Akt1, Akt2, and Akt3. Many cell surface receptors induce
the production of second messengers that activate phosphoinositide 3-kinase (PI3K). Akt is located downstream of PI3K and, therefore,
functions as part of a wortmannin-sensitive signaling, pathway. PI3K generates phosphorylated phosphatidylinositides (PI-3,4-P2 and PI-
3,4,5-P3) in the cell membrane that bind to the amino-terminal pleckstrin homology (PH) domain of Akt. PI-3,4-P2 and PI-3,4,5-P3 also
activate phosphoinositide-dependent kinase (PDK) which phosphorylates Thr308 of membrane-bound Akt. Ser473 is phosphorylated by
integrin-linked kinase (ILK). Activated Akt promotes cell survival through two distinct pathways: 1) Akt inhibits apoptosis by
phosphorylating the Bad component of the Bad/Bcl-XL complex. Phosphorylated Bad binds to 14-3-3 causing dissociation of the Bad/Bcl-
XL complex and allowing cell survival. 2) Akt activates IKK-a which ultimately leads to NF-b activation and cell survival.
 2.1. SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI ĆELIJE

Slika 2.1. Pregled sedam glavnih klasa receptora na površini ćelije.

U mnogim signalnim putevima vezivanje liganda za receptor vodi aktivaciji transkripcionih faktora u citosolu,
dozvoljavajući im da se translociraju u nukleus i da regulišu ( češće stimulišu, a redje inhibišu) transkripciju
njihovih ciljnih gena. Alternativno, aktivacija receptora moţe da vodi ka aktivaciji citosolnih protein kinaza koje
se potom translociraju u nukleus i regulišu aktivnost transkripcionih faktora. Neki aktivirani receptori,
prvenstveno GPCR, mogu da indukuju promene u aktivnosti postojećih proteina. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):