Фармацевтска хемија 1 практикум PDF

„ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО
ФАРМАЦЕВТСКА ХЕМИЈА1 -
МЕТАБОЛИЗАМ И ДИЗАЈНИРАЊЕ НА ЛЕКОВИ’’
За студенти од студиска програма магистер по фармација
Проф. Д-р . Кристина Младеновска

Асс.М-р. Зоран Стерјев
Асс. М-р. Зорица Серафимоска
Асс. М-р Александра Капедановска Несторовска
Скопје, 2010
Универзитет” Св. Кирил и Методиј”
Фармацевтски Факултет- Скопје
Вовед
Во рамките на фармацевтските науки, фармацевтската хемија, чиј синоним е

медицинската хемија, е високо интердисциплинарна наука која ја комбинира
органската хемија со биохемијата, компјутерската хемија, биофармацијата,
фармакологијата, фармакогнозијата, молекуларната биологија и физичката хемија.
Централно место во оваа научна дисцплина заземаат истражувањата поврзани со
откривањето, дизајнирањето и развојот на нови лекови.
Во раните фази од својот развој фармацевтската хемија била насочена кон

изолирање на лековити соединенија од растително потекло. Денес, научниците се
подеднакво заинтересирани и за лековите добиени по синтетички пат или како
производ на биотехнолошката индустрија. Истражувањата во полето на
фармацевтската хемија се одвиваат во многу истражувачки центри и тие не се
насочени само кон добивање на лекот, туку и кон разбирање на неговите основни
физикохемиски својства и хемиските реакции во кои стапува, на биофармацевтските и
фармакокинетските својства, односно патиштата по кои лекот навлегува и се движи
низ организмот, како и на механизмите со кои го манифестира терапевтскиот ефект и
несаканите ефекти.
Идеалниот лек мора да е ефикасен и безбеден за употреба, хемиски стабилен,

метаболички отпорен (доколку не е синтетизиран во облик на пролек или
биопрекурсор) и да поседува оптимална растворливост – доволна поларност за да се
раствори во телесните течности и избегне таложење во крвта и доволна липофилност
за да може да помине низ клеточните мембрани.
Процесот на дизајнирање на лековите започнува со откривање на лековите што

опфаќа идентификација на водечко соединение преку библиотечно пребарување и
проучување на веќе постоечките соединенија со сакани биолошки својства.
Откривањето на водечкото соединение се дефинира како идентификација на
соединение кое активира специфичен биолошки одговор. Оваа фаза вклучува многу
техники за успешна идентификација, меѓу кои и комбинаторната хемија, но во голема
мерка успехот се темели на интуиција, знаење и истражувачко искуство.
Истражувањата во ова сфера се претежно насочени кон биолошката цел (дизајнирање
базирано на рецепторот) за која е познато дека игра улога во развојот на одредено
заболување или почнуваат од молекул со интересни биолошки дејства (дизајнирање
базирано на фармакофорот). Традиционалната и молекуларната биологија
придонесуваат за студиите на биолошките и сигнализирачките патишта и даваат
можност за идентификација на болестите поврзани со биолошките цели.
ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

ФАРМАЦЕВТСКА ХЕМИЈА1 - МЕТАБОЛИЗАМ И ДИЗАЈНИРАЊЕ НА ЛЕКОВИ
Следната фаза, фазата на оптимизација, опфаќа понатамошна хемиска

модификација на водечкото соединение со цел подобрување на неговите биолошки и
хемиски својства. Оваа хемиска модификација може да биде насочена кон
оптимизирање на физичко-хемиските, биофармацевтските, фармакокинетските,
фармакодинамските и/или токсиколошките својства на водечкото соединение.
Хемиската модификација може да го подобри препознавањето на лекот-кандидат,
односно на фармакофорот од страна на рецепторите, да го оптимизира афинитетот на
лекот-кандидат кон рецепторите, да обезбеди негова дистрибуција до рецепторите, да
ја оптимизира стабилноста за време на неговата метаболичка разградба и со тоа да
обезбеди добивање на селективен, специфичен, ефикасен и безбеден лек.
Оптимизацијата завршува со идентификација на најдобриот аналог. Во изнаоѓањето на
најдобриот аналог важна улога има квантитативниот однос на неговата структура,
односно на структурата на фармакофорот со неговата активност. Овој однос го
дефинираат многу теории, помеѓу кои Ханшовата анализа која ги опфаќа Хаметовите
електронски параметри, стеричните параметри и параметрите кои ја дефинираат
липофилноста на лековите. Процесот на оптимизација е комплетен кога ќе се постигне
оптимален резултат за биолошки активниот профил и хемиска синтеза на лекот.
Финалната фаза, фазата на развој на лековите, опфаќа избор на лекот кој ќе

влезе во претклиничките и клиничките испитувања. Целта на овие истражувања е да се
докаже ефикасноста на лекот, неговата безбедност, соодветниот квалитет и предност
над фармакотераписки сличните лекови. Во оваа фаза се оптимизира и методот на
добивање на лекот-кандидат, како и на соодветната лековита форма која внесена по
определен пат ќе создаде основни предуслови за дистрибуција на лекот до целното
место.
Овој Водич низ практичната настава по предметот фармацевтска хемија 1,

наменет за студентите од студиската програма магистер по фармација, има за цел да
опфати низа практични содржини посветени на дизајнирањето и развојот на лековите.
Содржините и распоредот на вежбите ја следат теоретската настава.
Првиот блок на вежби има за цел на студентот да му го предочи значењето на

познавањето и модификацијата на физичко-хемиските својства на лековите во фазата
на откривање, оптимизација и развој на лековите. Имено, основен предуслов за
системско дејство на лековите е нивната ресорпција откако ќе се ослободат од
фармацевтско-технолошкиот облик. Ослободувањето на лекот е контролирано од
неговите физичко-хемиски карактеристики и од карактеристиките на готовиот
фармацевтски препарат, како и од природата на местото на примена и на ресорпција на
лекот. Најголем дел од лековитите супстанции кои се користат во терапевтски цели се
однесуваат како слаби органски киселини, слаби органски бази или како соли на слаби
органски киселини и бази. Физичко-хемиски својства од суштинско значење се
липофилноста, растворливоста во поларни растворувачи и киселоста, односно базноста
на лекот изразени преку соодветни константи. Овие физичко-хемиски својства на

органските соединенија се функција на нивните структурни (конформациски)

карактеристики. Оттука, првиот блок на вежби ја обработува поврзаноста на
структурата на лекот со неговите физичко-хемиски својства и со основните фактори на
средината (рН, температура, состав, итн.) преку основните теории и равенки кои ги
поврзуваат овие параметри како што се Хендерсон-Хаселбаховите равенки, Фиковиот
закон на дифузија, итн.
За еден лек да биде ефикасен, не е доволно само да се ресорбира и да покажува

афинитет кон рецепторите. Тој треба во соодветни концентрации и со соодветна
брзина да пристигне на местото на дејствување. Концентрациите на лекот во единица
време на рецепторното место се функција од количеството на применетиот лек
(дозата), интервалот на дозирање, брзината и обемот со кои лекот се ослободува од
лековитата форма, механизмот и кинетиката со кои се апсорбира, како и од кинетиката
со која се дистрибуира и елиминира. На патот до целта, лекот наидува на многу
бариери, покажува афинитет кон одредени макромолекули (на пример, специфични
влезни и излезни транспортери, плазматски (глико)протеини, итн.), поминува низ
места во кои може да се загуби (на пример, масни ткива), за на крајот да се врзе за
специфичните рецептори. На овој пат, особено ―проблематични‖ се лековите со висок
степен на врзување за плазматските протеини кои се карактеризираат со мала
терапевтска широчина. Кинетиката на ЛАДМЕ1 процесите ја определуваат
биофармацевтските и фармакокинетските својства на лековите кои се повторно
функција од нивните физичко-хемиски својства, односно од нивната структура.
Оттука, вториот блок на вежби ги обработува физичко-хемиските фактори (а со тоа и
структурните карактеристики на лекот) и факторите на средината кои го определуваат
видот на интеракциите помеѓу лекот и одредена макромолекула, афинитетот на лекот
кон макромолекулата, како и математичките модели кои овозможуваат определување
на константата на асоцијација, односно афинитетот на лекот кон соодветната
макромолекула, која може да биде плазматска (на пример, албумин) или клеточна
компонента (на пример, рецептор).
Во случаи во кои рецепторот не е познат најчесто се пристапува кон индиректно

дизјанирање т.е. дизајнирање базирано на фармакофорот. Овој дизајн се базира на
стереохемиските и физичко-хемиските својства на познатите лекови. Анализата на
активните и неактивните молекули дава сознанија за тоа како структурните варијации
можат да ги променат биолошките својства на лекот и овозможуваат создавање на
хипотеза за интеракциите на лекот со рецепторот. Оваа стратегија се состои од
позиционирање на 3D релативната локација на структурните елементи препознаени
како неопходни во структурата на активниот молекул и со тоа како неопходни во
структурата на новите хемиски ентитети (молекуларна мимикрија). Дизајнот базиран
1
Л-либерација, А-апсорпција, Д-дистрибуција, М-метаболизам, Е-елиминација.

на рецепторот се применува кога е позната 3D структурата на рецепторот кој може да

биде протеин или нуклеинска киселина. Овој дизајн ги користи препознавачките и
детерминирачките способности на рецепторното место за да формира директна
интеракција помеѓу саканиот молекул или атом или функционалната група на лекот и
целта. Кристалографијата со X-зраци ги открива есенцијалните структурни
карактеристики на активното место, а потоа се користи како извор на нови идеи за тоа
како да се креира нов прототип на молекулот. Во молекулот на лекот може да се
инкорпорираат специфични интермолекуларни интеракции со цел да се зацврсти
неговото врзување за активното место на целниот рецептор. Како најдобра почетна
точка за овој дизајн на лекови е познавањето на кристалографската структура на
комплексот на лекот со рецепторот. Ако ова не можно, може да се стекнат сознанија со
примена на моделирачки техники. Предност на дизајнот базиран на рецептор е што
овозможува визуелна конструкција на директен дизајн на нови прототипови, како и
детална 3D карактеризација на активното место преку претставување на одредени
функционалности во дизајнираниот лек. Со моделирање може брзо да се пристапи до
можното решение и да се измери напредокот постигнат во текот на дизајнирањето.
Ваквото моделирање е предмет на проучување во следниот блок на вежби.
Голем број од проблемите во текот на развојот на лековите се должат на

метаболичките трансформации на кои тие подлежат. Овие ―проблематични ―лекови
покажуваат неколку од следниве карактеристики: нерастворливост/релативно висока
липофилност, висок ефект на прв метаболизам, многу брз или многу спор метаболизам,
сатурациска (нелинеарна) кинетика на метаболизирање, генетски полиморфизам во
метаболизмот, несоодветен стереохемиски облик, индуцираат или инхибираат
метаболизам на лекови, покажуваат автоиндукција, се метаболизираат до токсични
метаболити, итн. Решавањето на овие проблеми во фазата на дизајнирање и развој на
лековите бара познавање на метаболичките трансформации на лековите, како и на
поврзаноста на структурата на лековите со нивната метаболичка трансформација. Овие
сознанија се од особено значење кога се дизајнираат пролекови и биопрекурсури.
Оттука, последниот блок на вежби е посветен на запознавање со фазите на
метаболичка трансформација на лековите, пролековите и биопрекурсорите, со ин
витро и ин виво техниките кои се користат за определување на патиштата на
метаболичка трансформација на лековите, како и со најчестите инструментални
техники кои се користат за идентификација и определување на концентрацијата на
метаболитите на лековите.
Како заклучок, големиот напредок во медицината и фармакотерапијата налага

проучување на болестите, начинот на нивно лечење и последиците од терапијата, што
наметнува потреба од соработка и учество на голем број експерти од различни области.
Дополнително, новите лекови застапени во новата фармакотерапија, иако
поселективни и поефикасни, условуваат се посложен однос лек - пациент. Оттука,
помеѓу лекарите се појасно се чувствува потребата од вистински научни информации
за лековите. Се очекува ваквите информации најсоодветно да ги обезбедат
5

фармацевтите кои во текот на своето образование се стекнуваат со знаења од

медицината и од фармацијата. Сознанијата стекнати со изучување на теоретските и
практичните содржини од овој предмет го сочинуваат темелот на овие знаења.

Име и Презиме _______________________________

Дата: ___________
Досие бр: __________________ Група
Работно место _____________

ВЕЖБА БР 1
КОЕФИЦИЕНТ НА ЛИПИДНО-ВОДЕНА
РАСПРЕДЕЛБА (Р-ПАРТИЦИОНЕН КОЕФИЦИЕНТ) И
КОЕФИЦИЕНТ НА ДИСТРИБУЦИЈА (D)
1.1 Претходни предзнаења
Хидрофобност-соединување на неполарни групи или молекули во водено опкружување кое

произлегува од тенденцијата на водата да ги истисне неполарните молекули (IUPAC)
Липофилност-афинитет на молекулата или соединението за липофилно опкружување (IUPAC)
Р-Реален коефициент; Вистински партиционен коефициент; Внатрешна липофилност
D- Привиден партиционен коефициент, Коефициент на дистрибуција
1.2 Теоретски дел
За да биде апсорбирана лековитата супстанца треба да се ослободи од лековитиот

облик и да се раствори. Биорасположливоста на лековитата супстанца е одредена од физичко-
хемиските особини на лековитата супстанца. Физичко-хемските особини на лековитата
супстанца значајни за нејзиното ослободување и апсорпција се:
- киселост / базност
- липофилност
- растворливост во поларни растворувачи и брзина на раставарање
- големина на честички
- образување на соли, естри

- полиморфизам и псевдополиморфизам
- комплексирање и атсорпција
- вискозитет
- хемиска стабилност
- меѓусебно влијание на лековитата супстанца и другите активни и помошни

супстанции (интеракции)
1.2.1 Коефициент на липидно-водено распределба (партиционен коефициент)
Партициониот коефициент (Р) претставува значајна физичка величина која се користи

во предвидувањето на апсорпцијата, дистрибуцијата и елиминацијата на лековите во човечкиот
организам. Познавањето на вредноста на Р може да се користи за предвидување на појавата на
дејство на лекот или времетраењето на дејството на лекот, или дали лекот воопшто ќе биде
активен. Овој параметар игра значајна улога и во рационалниот развој и дизајнирањето на
новите лекови, односно дава можност за одредување на структура-активност врската преку
математички пресметки, односно преку одредување на биолошката активност на лекот во
зависност од неговите физичко-хемиски карактеристики.
Историски, партициониот коефициент бил прв пат корелиран со биолошкта активност

на хипнотичките и наркотичните лекови од страна на Mayer и Overton. Mayer уште во 1899
година укажал на тоа дека хемиски нереактивните компоненти како што се етрите,
јаглехидратите, халогените јаглеводороди, имаат наркотично дејство кое е пропорционално со
нивната способност да се концентрираат во ткивата, како што се нервните клетки, во кои
липидните супстанции доминираат. Нивната ефикасност како хипнотици или анестетици
според тоа зависи од партициониот коефициент, кој ја детерминира дистрибуцијата на
соединенијата помеѓу водената и липидната фаза во ткивата.
Mayer и Overton ја поставиле теоријата за влијание на коефициентот на распределба

липидна-водена фаза врз брзината и потполноста на преодот на лековитите супстанции низ
биолошките мембрани, која потоа била потврдена од многу други научници.
Во хемијата познато е својството на хемиските супстанции да се двојно растворливи,

односно да се хидрофилни и липофилни. Nernst утврдил дека поголем број органски
супстанции делумно се растворуваат во поларни растворувачи (вода) и делумно во неполарни
(липиди). Кога една супстанца се додава (растворува) во пар од два растворувачи кои
меѓусебно не се машаат, истата се дистрибуира во двата растворувачи во зависност од
нејзиниот афинитет за секоја од фазите. Поларните супстанции (пр. шеќери, амино киселини
или јонизирани лекови) имаат поголем афинитет кон водената, поларна фаза, додека
неполарните супстанции (пр. нејонизирани лекови) имаат поголем афинитет кон неводената,
односно органската фаза. Распределбата на супстанцата во двете фази се одвива според
законот на партиционирање, кој гласи ―една супстанца, на одредена температура, ќе се
дистрибуира во двата растворувачи кои меѓусебно не се мешаат на константен однос на

концентрации‖. Овој константен однос се вика коефициент на липидно-водена распределба на

супстанцата и математички може да се изрази на следниов начин:
P (D) = (органска)/(водена)
Каде Р претставува партицонен коефициент на супстанцата; (органска) е
концентрацијата на супстанцата во органската фаза, или маслена фаза; и (водена) е
концентрацијата на супстанцата во водената фаза.
Пример, дистрибуција на 100мг лек poмеѓу 50мл органски растворувач (етер,

хлороформ или октанол) и 50 мл вода. Лекот се додава во смесата од двете течности кои
меѓусебно не се мешаат во одделителна инка и се остава тој да се распредели до рамнотежна
состојба. При испитување на органската фаза, одредено е дека таа содржи 66,7мг од
супстанцата. Од овие податоци за партициониот коефициент може да се одреди процентот на
лекот кој е екстрахиран со органската фаза (слика 1.1).
Масата на лекот која се наоѓа во водената фаза = 100-66,7мг = 33,3мг; концентрацијата

на лекот во органската фаза = 66,7/50 = 1,33мг/мл, и концентрацијата на лекот во водената фаза
= 33,3/50 = 0,67мг/мл. Според ова, партициониот коефициент е претставен како
(органска)/(водена)=(1,33 мг/мл)/(0,67мг/мл) =2
Партициониот коефициент претставува однос на концентрациите и претставува

бездимензионална величина.
Слика1.1
Пример за
закон за
партиционирање
9

Процентот на лекот кој е екстрахиран во органската фаза во претходниот пример е

даден преку масата на лекот во органската фаза поделена со вкупната маса на лек, пр.
66.7/100=67%.
Оваа едноставна равенака на пресметување на партициониот коефициент е применлива

само во случај доколку растворената супстанца се наоѓа во нејонизирана форма на работната
рН. Доколку растворената супстанца претставува слаба киселина или база (а најголемиот број
на лекови всушност и тоа претставуваат), јонизираните анјони или катјони значително ќе го
променат профилот на растворливост на лекот. Целосно јонизираните видови се многу
порастворливи во вода од нејонизираните киселини или бази, па горенаведениот однос ќе се

разликува во зависност од рН на која се врши определувањето.
Постојат два пристапи кон овој проблем: или експерименталните услови се подесуваат
со цел да се осигураме дека измеренaтa Р вредност се однесува на партициониот коефициент
на нејонизираната молекула (ова значи дека Р вредноста за киселини е измерена на ниска рН
кога киселината се наоѓа во нејонизирана форма и, слично на ова партициониот коефициент на
базите се мери на висока рН за да се спречи јонизацијата); или подобро, односот се
прилагодува и се нарекува привиден партиционен коефициент, со цел да се направи разлика од
партициониот коефициент на нејонизираните видови, кој се нарекува вистински партиционен
коефициент.
Привидниот партиционен коефоциент (Рпри) зависи од делот на супстанцата присутен

во растворот, кој зависи од рН вредноста или
Рпри (D)=Рхf нејонизира
каде f нејонизира е фракцијата од вкупната количина на лек која е нејонизирана при таа
рН. При тоа f нејонизира = 1 ако Рпри = Рвистински и супстанцата е нејонизирана.
За илустрирање на овој ефект на јонизација ќе го земеме повторно претходниот

пример. Доколку рН на водената фаза се подеси за лекот да биде 66,75 јонизиран, само 40мг од
лекот партиционира во органската фаза (бидејќи јонизираниот лек е помалку растворлив во
растворувачот), па партициониот коефициент може да биде пресметан на следниот начин
(слика 1.2)
10

Слика1.2 Партиционирање на јонизираниот лек
Масата на лекот во водената фаза = 100 – 40 = 60мг.
Масата на јонизираниот лек во водената фаза = вкупна маса х јонизирана фракција, која
изнесува 60 х 0,666 = 40мг.
Масата на нејонизираниот лек во водената фаза = 60 х 0,333 = 20мг.
Концентрацијата на лекот во органската фаза = 40/50 = 0,8мг/мл.
Концентрацијата на нејонизираниот лек во водената фаза = 20/50 = 0,4мг/мл.
Концентрацијата на вкупниот лек во водената фаза=60/50=1.2 мг/мл.
Процентот на лекот кој е екстрахиран во органската фаза = (40мг/100 мг) х 100 = 40%.
Партициониот коефициент на нејонизираниот лек (вистинскиот партиционен коефициент) би

требало да остане константен и е даден со равенката
Р = (лек) во органска фаза/ (нејонизиран лек) во вода
Р = 0,8 мг/мл/0,4 мг/мл = 2
11

Истиот одговор како оној кој го добивме претходно.
Со употреба на вкупната концентрација на лекот во водената фаза може да се пресмета

привидниот партиционен коефициент:
Рпри = (лек) во органска фаза/ вкупен(лек) во водена фаза
Рпри = 0,8 мг/мл/1,2мг/мл
Рпри = 0,67
Одговорот за Рпри може да се провери со примена на равенката (1.2)
Рпри = Р х f нејонизира
0,67=2 х 0,33
Опсегот на можните вредности за Р на лековитите молекули е огромен, од мали

фракции па се до неколку илјади. Од оваа причина, се применува логоритамска вредност (со
основа 10) на партициониот коефициент, или log P. Ова е особено значајно кај
квантитативниот однос структура-активност (quantitaive structure activity relationship, QSAR),
каде физичко-хемиските карактеристики на лекот (како хидрофобност, стерни интеракции или
електронски ефекти) се квантифицираат со цел да се добие равенка со која може да се
предвиди биолошката активност на други, слични лекови. Техниката на QSAR стана популарна
со развојот на моќни компјутери способни за споведување на мултипли регресиони анализи
неопходни за да се добијат прилично сложени пресметки.
Експериментално определување на партициониот коефициент
Постојат три начини на определување на партициониот коефициент во хемиските

лаборатории. Метод на оддилетелна инка, тенкослојна хроматографија TLC и HPLC метода.
Метод на одделителна инка
Со методот на одделителна инка, лекот чиј Р се определува се додава во одделителната

инка која содржи смеша од две фази кои меѓусебно не се мешаат, иако истото може да се
направи и со употреба на епрувета за центрифугирање (и при тоа потребен е помал примерок).
Вообичаена комбинација на немешливите течности е 1-октанол и пуфер со рН 7.4. Октанолот
се применува за определување на партициониот коефициент бидејќи истиот е најдобра
симулација на биолошките услови in vivo. Ова може да е последица бидејќи осумте јаглеродни
атоми се особено хидрофобни (не сакаат вода), додека едната хидроксилна група е хидрофилна
(сака вода) па заедно даваат најблиска симулација на рамнотежата која е карактеристична за
мембраните на хуманите клетки. Водениот пуфер со рН 7,4 ги претставува водените
компартменти во телото пр. крвна плазма.
12

Двете фази се мешаат со цел да се добие пуферски-заситен октанол во горната фаза и

октанол-заситен пуфер во долниот дел. Штом еднаш ќе се разделат двете фази (ова може да
потрае одреден временски период) се додава лекот и одделителната инка се меша механички,
најмалку еден час. Двете фази се оставаат да се оделат и потоа се определува концентрацијата
на лекот во водената фаза. Ова може да се изведе со титрација доколку лекот е доволно кисел
или базен или почесто, да се определи спектрофотометриски. Концентрацијата во октанолската
фаза се пресметува со одземање на концентрацијата на лекот во водениот пуфер од вкупната
количина на лек. Овој метод функционира перфектно добро доколку имаме на располагање
доволно количество лек и доколку лекот содржи хромофор кој овозможува
спектрофотометриско определување на водената фаза.
Она што е значајно да се забележи за водено-водената екстракција од овој тип не е

волуменот на органската фаза туку бројот на изведените екстракции. Пет екстракции со по
10мл органска фаза ќе екстрахира повеќе супстанца отколку една екстракција со 50мл, иако
вкупниот волумен на органскиот растворувач е ист. Слично 10 екстракции со по5 мл ќе бидат
уште поефикасни. Овој ефект (кој е општ за сите екстракции) е реален. Секој пат едната фаза
се отстранува и се заменува со свеж растворувач, рамнотежата за процесот на распределување
мора повторно да се воспоставува според вредноста за односот на партициониот коефициент и
лекот мора да ја напушти водената фаза за да може да премине во органската фаза и повторно
да ја воспостави рамнотежната состојба.
Равенката која се користи за пресметување на ефикасноста на повеќекратната

екстракција наспроти единечната екстракција е следната:
Wn=W [A/(PS+A)]n
Каде Wn е маса на лек која останува во водената фаза после n екстракции, W е почетна
маса на лек во водената фаза, А е волумен на водената фаза, Ѕ е волумен на растворувачот (или
органската) фаза, Р е партиционен коефициент и n е бројот на екстракции.
Тенкослојна хроматографија (TLC)
Кај оваа техника Rf вредноста на лекот се поврзува математички со партициониот

коефициент. Плочата со тенок слој се прекрива со органска фаза (најчесто парафин или
октанол) и се остава да се исуши. Се аплицира примерокот на плочата и истата се остава да се
развие. Мобилната фаза која се користи е или вода или смеша на вода со мешливи органски
растворувачи (како ацетон) за да се подобри растворливоста на лекот. Штом ќе се развие
плочата, се забележуват петна (со примена на ултравиолетова лампа доколку лекот содржи
хромофор, или јодни пареи доколку не содржи хромофор) и се пресметува Rf за секое од
петната. Rf растојанието кое го има поминато од петното поделено со
растојанието поминато од растворувачот, односно до фронтот на растворувачот и се изразува

како децимална вредност. Rf вредноста се поврзува со партициониот коефициент преку
следнава равенка:
13

P=k/(1/Rf)-1
каде k е константа за дадениот систем, која се определува преку испитување на многу

стандардни супстанции со познат Р во системот.
TLC методот на определување на Р е најдобар за определување на супстанции со

слична структура и физички карактеристики. Предноста на примената на оваа техника во
определувањето на Р е тоа што истовремено може да се испитаат многу супстанции. Од друга
страна, може да претставува тешкотија наоѓањето на соодветен стандард, и мобилната фаза
која содржи голема количина на воден растворувач може да бара многу време за да протече
низ големата TLC плоча.
Течна хроматографија под висок притисок (HPLC)
Овој аналитички метод се темели на некои хемиски принципи кои се значајни за

определување со TLC, освен тоа ефикасноста (и трошокот) на техниката значително се
зголемува. Наместо Rf вредноста, се мери ретенционото време на лекот и се поврзува со Р со
примена на равенка која е слична со равенката која се применува кај TLC. Ретенционото време,
како што кажува и самото име, е времето потребно примерокот да се елуира од HPLC
колоната. Треба да се внимава при користењето на оваа техника лекот кој се употребува да
содржи хромофор, бидејќи само тогаш може да се користи UV детектор. Во случај на лекови
без хромофори се применуваат детектори на рефракторниот индекс (RI) или електрохемиски
детектор (ECD).
RI детекторот ги мери промените на рефракторниот индекс на мобилната фаза како

што се врши елуцијата и се врши детектирање, додека ECD функционира како мала електрода
со која се врши оксидација или редукција на аналитот како што истиот се елуира. Сепак оваа
метода е многу поедноставна за определување на супстанции со хромофори. Предностите на
овој метод се состојат во тоа што не е потребно многу примерок и истиот не мора да биде
100% чист.
Хипотеза на рН распределба
Биолошките мембрани се во основа неполарни или хидрофобни, што се должи на

долгите јаглеводородни вериги на фосфолипидните молекули. За лекот да помине мембрана со
вакви карактеристики, тој мора да премине од воден раствор на екстраклеточната течност,
преку липидната мембрана во водениот раствор на интраклеточната течност (види слика 1.3).
На пр., лекот мора да биде доволно растворлив и во водената и во липидната фаза за да може
ова да го оствари.
14

Слика 1.3 Партицонен дијаграм на клеточна мембрана
За многу лекови (за било која биолошка мембрана) мора да постои оптимална вредност
за партициониот кофициент за транспорт на лекот за да се овозможи пренос низ мембраната.
Состојбата станува дури и покомплицирана доколку лекот јонизира на рН вредноста во

компартментите на организмот. За слабите киселини и слабите бази, водената и липидната
растворливост на соединението ќе зависи и од степенот на јонизација на самиот лек, што
зависи всушност од рКа на киселите и базните групи на лекот како и од рН на околината.
Слабите киселини јонизираат:
НА Н+ + А-
При што нејоницираниот дел од молекулот (НА) е многу полипосолубилен и затоа ќе

ги помине биолошките мембрани многу побрзо од анјонот (А-). Ова сугерира дека слабите
киселини ќе се апсорбираат многу поефикасно низ мембраните кога рН на околниот раствор е
ниска и кога слабите киселини доминантно ќе се наоѓаат во нејонизирана форма. Тоа е случај
во желудечниот сок, каде поради високата концентрација на хлороводородна киселина, рН е 1-
2 (ова е причина зошто гастричните улцери даваат болка, раната во желудникот е под влијание
на киселината и делува на мускулниот слој). Оваа теорија е наречена теорија на рН
распределба, и предвидува дека слабо киселите лекови како аспирин, барбитуратите,
фенитоинот, итн. во поголем обем ќе се апсорбираат во желудникот, а во многу помал обем во
алкалната средина на тенкото црево. Во средина со висока рН, киселите лекови ќе јонизираат и
даваат А-, кој бидејќи содржи полнеж, нема лесно да дифундира преку хидрофобната липидна
мембрана.
Слабите бази јонизираат:
B + H2O  BH+ + OH-
При што поголема липосолубилност поседува нејонизираната слободна база В, која е

присутна во најголем дел во раствор со висока рН, кој се наоѓа во тенкото црево (рН во опсег
6-8). Хипотезата на рН распределба предвидува дека базните лекови (како морфин, кодеин,
15

антихистаминици, итн.) ќе се апсорбираат во поголем обем во тенкото црево отколку во

желудникот каде што средината е кисела и ваквата средина ја фаворизира јонизираната форма
на базите. Ова е значајно за пациентите, бидејќи доколку лекот може да биде апсорбиран од
тенкото црево ќе има сигурно одложување на појавата на дејството на лекот доколку тој се
применува орално. Лекот треба да биде голтнат и да го помине желудникот (при што доколку е
базен тој ќе биде доминантно во јонизирана форма) пред да се испразни желудникот и лекот да
премине во тенкото црево каде започнува процесот на апсорпција. На пример, доколку
пациентот користи базен лек како на пример антихистаминик за симптоматски третман на
гадење од патување, треба да се советува да го земе својот лек најмалку еден час пред
почетокот на патувањето за да се дозволи да помине потребното време додека лекот се
апсорбира и да премине во крвотокот.
Ограничувања на хипотезата на рН распределба
Хипотезата на рН распределба е многу корисна како модел со кој се опишува

апсорпцијата во телото, но сепак треба да се потенцира дека постојат ограничувања на овој
модел. Теоријата предвидува дека слабите киселини ќе бидат апсорбирани од желудникот,
додека слабите бази од тенкото црево, но најголемиот број на лекови се апсорбираат од
тенкото црево независно од нивниот степен на јонизација. Причина за ова е тоа што тенкото
црево има три дела, дуоденум, краток извиткан сегмент кој се наоѓа во задниот дел од
абдоменот, јејунум и илеум, два големи сегменти кои се извиткани во абдоминалната празнина.
Ова значи дека тенкото црево е долго (6,5 м кај возрасни) и има многу поголема површина
(околу 100м2) од желудникот. Дебелото црево, кое прави обвивка околу тенките црева
продолжува по тенкото црево и има должина од околу 1,5м. Ова значи дека вкупната должина
на ГИТ е над 8 метри, околу 5 до 6 пати од висината на човекот. Големата површина на
тенкото црево се должи на постоењето на микровили, специфични структури во облик на
цевчиња, како кратки влакненца, кои се наоѓаат во луменот на ГИТ. Тенкото црево исто така е
многу добро снабдено со крв, што значи дека храната или лековитите молекули штом ќе ја
поминат ГИ мембрана, се носат со крвотокот, иницијално во црниот дроб, и оттаму се
дистрибуира низ организмот.
16

Слика 1.4. Дијаграм на тенко црево, со прикажана површина прекриена со вили кои се
обложени со микровили
Она што е значајно во пракса е дека лековите се апсорбираат релативно ефикасно од

тенкото црево дури и ако се доминантно во јонизирана форма. Апсорпциониот процес се
покорува на законот за дејство на масите. Овој закон всушност претставува рамнотежен
процес, и како и секој друг рамнотежен процес, брзото отстранување на продуктите или
соединенијата во десно на стрелката за рамнотежа ќе го помести овој процес во таа насока. Ова
е точно тоа што се случува низ ГИ мембрана: мало количестви на нејонизиран лек се
апсорбира со пасивна дифузија и се отстранува со богатиот крвоток на ГИТ. Ова е причина
рамнотежниот процес повторно да биде воспоставен и се поголемо количество на лек се
апсорбира. На овој начин, киселите и базните лекови, кои може да бидат и до 99% во
јонизирана форма на рН во ГИТ, може да се апсорбираат релативно ефикасно во телото.
Некои јонизирани лековити молекули може да ја поминат липофилната мембрана на

ГИТ преку поврзување со јон со спротивен полнеж за да формира јонски пар. Јонскиот пар
иако е формиран од два јона се однесува како природна молекула со висок партиционен
коефициент и може да ја помине биолошката мембрана. Соединенијата кои претставуваат
кватернерни амониумови соли и имаат одреден електронски полнеж на одредена рН, може да
се апсорбираат во организмот на овој начин:
N+R4 + A-  [N+R4A-] јонски пар кој лесно се апсорбира.
Екскреција и реапсорпција на лековите
Истите физиолошки процеси како и при апсорпцијата на лекот се одвиваат кога истиот
се реапсорбира во крвта и се екстрахира низ бубрезите.
Бубрезите се сместени на задниот дел од абдоменот од двете страни на ‗рбетниот столб.

Во нив се одвиваат бројни функции значајни за организмот, меѓу кои е и создавањето на урина
и екстракција од организмот на нискомасени молекули (со релативана маса пониска од 68 000
далтони), водено растворливи молекули, вклучувајќи ги тука и најголемиот број лекови. Секој
бубрег содржи околу еден милион нефрони – структури одговорни за продукција на урина.
Нефронот содржи голем број крвни капилари наречени гломерули, кои делуваат како значаен
17

филтер за отстранување на штетните материи од крвта како отпад, и од долга структура во

облик на цевка која се нарекува тубула (слика 1.5)
1.5 Дијаграм на нефрон
Бубрезите имаат голем крвен дотур (околу една четвртина од вкупниот минутен
волумен на срцето, 5 литри во минута) и од овој волумен на крв (околу 170 литри) на филтрат
се создаваат секој ден. Логично е дека телото би дехидрирало многу брзо доколку овој волумен
на течност се губи преку уринарниот систем, па затоа најголемиот дел од неа се реапсорбира
назад во крвотокот, или преку процес на пасивна дифузија (според Фик-овиот закон) или преку
користење на енергија во процесот на активен транспорт кој е сличен со оној при апсорпција
во ГИТ. Треба да се нагласи дека реапсорпцијата на гломеруларниот филтрат и враќањето во
крвотокот имаат влијание на времетраењето на дејство на лековите, и лековитата молекула
може да се филтрира и да се реапсорбира повеќе пати пред финално да се екскретира од
телото.
Во случај на предозирање со лекови посакувано е да се елиминира токсичниот лек од

организмот колку што е можно побрзо и се применува техника со која се минимизира процесот
на реапсорпција на лекот од тубулата на бубрегот и со тоа многу се забрзува екскрецијата.
Доколку лекот се реапсорбира со пасивна дифузија преку тубуларната клеточна мембрана,
тогаш тој мора да се наоѓа доминантно во нејонизирана форма. Ова е целосно во согласност со
процесот на апсорпција во организмот која настанува по оралната примена на лекот како што е
опишано претходно. Доколку рН на урината се прилагоди за да се зголеми количеството на лек
кој ќе се наоѓа во јонизирана форма, тогаш ќе се намали реапсорпцијата (бидејќи
нејонизираните видови ја минуваат мембраната полесно со пасивна дифузија). Доколку лекот
со кој е извршено предозирање е слаба киселина (пр. барбитурат, фенитоин или најголемиот
броја на НСАИЛи) тогаш екскрецијата ќе биде фаворизирана, а реапсорпцијата минимизирана,
со додавање на агенс кој ќе ја зголеми рН вредноста на урината. Оваа техника е наречена
форсирана алкална диуреза и резултира со побрз клиренс на киселите лекови. Пример на агенс
кој се користи за да се зголеми рН на урината е натриумбикарбонат, Na+HCO3- (сол на јака база
18

и слаба киселина, која е базна при парцијалната хидролиза), и се администрира во инфузија

како 8,4%м/в.
Доколку лекот со кој е извршено предозирање е база, на пример, бензодијазепин,

транквилизер или антихистаминик, екскрецијата се фаворизира со ацидификација
(закиселување) на урината. Агенсите кои се користат за оваа цел го вклучуваат амониум
хлоридот, NH4+Cl- (кисела сол со парцијална хидролиза) и аскорбинската киселина (витамин
Ц). Доколку рН на урината вештачки се намали, техниката се нарекува форсирана кисела
диуреза.
1.3. Практичен дел
Принцип на вежбата
Со практичниот дел од вежбата ќе извршиме симулација на гастроинтестиналниот
тракт, поточно промената на рН вредноста во желудникот рН=1,2; тенкото црево рН=6,2;
дебелото црево рН=9,8 и крвта рН=7,4. При тоа ќе го одредиме влијанието на различната рН
вредност врз промената на партициониот коефициент, а со тоа и на процесот на апсорпција на
лекот во организмот.
1.3.1 Потребна лабораториска опрема
- Одделителна инка
- Пипети
- Епрувети
- Спектрофотометар
- Кивети
1.3.2 Потребни реагенси
- Салицилна киселина
- Аспирин
- Na-салицилат
- Хлороформ
- Пуферски раствор рН=1,2; рН= 6,2; рН=7,4; и рН=9,8
- Етанол
1.3.3 Експериментално определување на партициониот коефициент
1.3.3.1 Стандарни раствори на Na-салицилат, салицилна киселина и аспирин

19

Се приготвуваат стандардни раствори на Na-салицилат, салицилна киселина и аспирин

во фосфатен пуфер со рН=1,2; рН=7,4 во ацетатен пуфер со рН=6,2 и во амонијачен пуфер со
рН=9,8 во концентрација од 0,002mg/ml.
1.3.3.2 Изведување на постапката за распределба
Системот за распределба се состои од еквивалентни волумени (10ml) пуфер во кој се

наоѓаат растворени испитуваните супстанции во концентрација од 0,2 mg /ml и ист волумен на
хлороформ. Системот за распределба се става во одделителна инка и механички се меша со
рака во период од 45 минути. По истекот на времето двете фази се разделуваат. Се одмерува
1ml од водениот слој и се разредува до 10ml со соодветниот растворувач. Вака подготвените
анализи се спектрофотометрираат.
1.3.3.3 Спектрофотометриско определување на апсорбансите на Na-салицилат,

салицилна киселина и аспирин во водената и органската фаза од распределителниот
систем
Стандардните раствори на Na-салицилат, салицилна киселина и аспирин во пуфер и во

хлороформ со концентрација од 0,002 mg /ml се спектрофотометрираат на 295nm на Na-
салицилат и салицилна киселина и на 303 nm за аспирин.
Запомнете!
Внатрешната липофилност (Р) е рамнотежа на нејонизираниот лек помеѓу органската

и водената фаза!
Нето липофилноста (коефициентот на дистрибуција, D) е севкупниот однос на

лекот, јонизиран и нејонизиран, помеѓу фазите, земајѓи ги предвид рН на водената фаза и
киселоста/базноста (рК) на лекот.
1.3.3.4 Пресметување на партициониот коефициент од експериментално

добиените резултати
Внатрешната липофилност (привиден партиционен коефициент) P (logP) се

пресметува според следнава равенка:
Рпри или D = V1(C0-C1)/V2C1
1.3.3.5 Равенка за графичко пресметување на коефициентот на распределба
За монопротонски киселини: log D = log P – log (1 + 10pH - pKa)
За монопротoнски бази: log D = log P – log (1 + 10pKa - pH)
Гореневдените равенки може да се претставата и како равенка на права:
20

1/D = 1/P + Ka/ P*1/[H+]
каде: y = 1/D, x = 1/[H+], 1/Р – отсечка на правата со y – оската (интерсепт), Ka/P – агол
што правата го образува со х-оската (slope).
21

1.4. Резултати
ТАБЕЛА БР. 1
рН Апсорбанса во пуфер
Стандард на Na-салицилат
1,2
6,2
7,4
9,8
Стандард на Салицилна киселина
1,2
6,2
7,4
9,8
Стандард на Аспирин
1,2
6,2
7,4
9,8
22

рН Апсорбанса во Концентрација во Концентрација во

пуфер пуфер mg/ml хлороформ mg/ml
Анализа на Na-салицилат
1,2
6,2
7,4
9,8
Анализа на Салицилна киселина
1,2
6,2
7,4
9,8
Анализа на Аспирин
1,2
6,2
7,4
9,8
23

рН Коефициент на Партицонен коефициент

дистрибуција
D logD P log P
Na-салицилат
1,2
6,2
7,4
9,8
Салицилна киселина
1,2
6,2
7,4
9,8
Аспирин
1,2
6,2
7,4
9,8
24

1.4.1.Графички приказ
25

1.5 Заклучок и коментар
1.6 Задачи:
1. Базен лек, рКа=9,4, Р=65 бил даден на пациент и 5 мл на крвна плазма била
искористена за анализа. Овие 5 мл на примерок биле екстрахирани со 10 мл на
октанол и концентрацијата на лекот во октанолот изнесувал 34 ng/ml.
Пресметајте:
а) привиден партиционен коефициент на рН 7,4
б) концентрација на лекот пред екстракција
в) процент на екстрахиран лек во единечна екстракција
2. 5 мл од примерокот на плазма (рН 7,4) кое содржи кисел лек (рКа = 6,5) бил
екстрахиран со 10 мл на етер. Концентрацијата на лекот во двата слоја била
одредена и добиените резултати биле следни:
Вкупната концентрација (нејинизирана + јонизирана) во плазмата = 16µg/ ml
Концентрацијата во етерот = 17 µg/ ml
Од овие податоци може да се одреди следново:

26

а) Дистрибуцијата на лекот меѓу двете фази во рамнотежна состојба
б) Привиден партиционен коефициент рпри
в) Партиционен коефициент Р
г) Екстрахиран процент
д) Колку може да биде подбрена ефикасноста на екстракцијата со модификација на рН
ѓ) Екстрахиран процент во променети услови
Проблеми:
1. Објаснете ја разликата меѓу вистинскиот партицонен коефициент и привидниот

партиционен коефициент. Наведете како вистинскиот партиционен коефициент на
водено растворлив лек како сулфометоксазол (рКа=5,6; Р етер:вода=125) може
сигурно да биде измерен (види слика 1.13)
4мл аликвот на плазма 9рН7,4) бил земен од пациент кој примал терапија со
сулфометоксазол и бил екстрахиран со 2 х 5 мл аликвоти на етер. Етерските
фракции биле собрани, евепорирани до сув остаток и повторно ратворени во 2 мл
на хлороформ. Концентрацијата на сулфометоксазол во хлороформот била 15,8 µg/
ml.
Пресметајте ја оригиналната концентрација на лекот во плазматскиот аликвот.
Кој процент на лек бил екстрахиран во процедурата објаснета погоре и како истата
може да биде промемента за да се зголеми вредноста на екстракцијата?
2. Структурата на β-блокаторот атенолол (рКа=9,6; Р етер:вода=275) е претставен на

сликата 1.14.
5мл на примерок од плазма (рН 7,4) бил земен од пациент кој бил третитан со
атенолол и бил екстрахиран со 2 х 5 мл аликвоти на етер. Етерските слоеви биле
собрани и евапорирани до сув остаток кој потоа би растворен во 5 мл на метанол.
Концентрацијата на атеноло во метанолот изнесувала 0,604 µg/ ml.
Пресметајте ја оригиналната концентрација на атенолол во примерокот на плазма и
процентот на екстрахиран лек.
Како може процедурата на екстракција да биде промета за да се подобри процентот
на отстранет лек?
27

Решенија на задачи:
28

Решенија на проблеми:
Освоени кредити: Асистент:
29

Ime i prezime _______________________________

Data: ___________
Dosie br: __________________ Grupa ____________
Rabotno mesto _____________

VE@BA BR 2
ODREDUVAWE NA RASTVORLIVOSTA NA SLABA KISELINA
(SALICILNA KISELINA) i NA NEJZINA SOL (Na - SALICILAT) VO
ZAVISNOST OD rN NA RASTVORUVAÔT I TEMPERATURATA NA
RASTVORUVAWE
2.1 Вовед
2.1.1. Rastvorlivost i rastvoruvawe
Rastvorlivosta i brzinata na rastvoruvawe se fizi~ko-hemiski osobini

karakteristi~ni za sekoja lekovita supstancija koi se od osobeno zna~ewe za
procesite na osloboduvawe na lekovitite supstancii od lekovitite formi i za
apsorpcija na istite koga treba da deluvaat sistemski. Postojat dve definicii
za rastvorlivost: термодинамичка и кинетичка дефиниција.
Pod rastvorlivost ili stepen na rastvorlivost od termodinami~ki aspekt se
podrazbira: maksimalno koli~estvo na lekovita supstancija koja moè da se rastvori
vo daden volumen od nekoj rastvoruva~ pri konstantna temperatura:
(1)
Ovaa ravenka se odnesuva na rastvoruvawe na cvrsti supstancii vo idealni rastvori.

Dokolku se raboti za realni rastvori mora da se zeme predvid i vlijanieto na drugi
faktori.
(2)
Cs - rastvorlivost na supstancata koja se rastvara

H - toplina na rastvarawe
T - apsolutna temperatura
R - gasna konstanta
30

Od aspekt na dizajnirawe i razvoj na lekovite, mnogu pogolemo zna~ewe ima

kineti~kata definicija za rastvorlivost. Kineti~kata rastvorlivost, pri koja {to
lekot se dodava vo mediumot za rastvorawe se dodeka ne se postigne maksimalna
rastvorlivost, se definira kako koncentracija posle koja doa|a do precipitacija i
zavisi od vidot na precipitatot, stabilnosta na lekot, polimorfizmot, mediumot, itn.
Vo taa nasoka, rastvorlivosta na slabite elektroliti (slabi bazi i kiselini)

zn~itelno varira vo zavisnost od pH vrednosta na sredinata. Toa e od osobeno zna~ewe
pri podgotovka na rastvori za intravenska i intraarteriska primena, kako i za
brzinata na osloboduvawe na lekovitite supstancii od lekovitite formi.
Dopolnitelno, rastvorlivosta vo polaren medium e obratno proporcionalna so brojot
i vidot na lipofilnite grupi vo molekulata i gustinata na kristalnoto pakuvawe.
Eden od najzna~ajnite faktori koi vlijaat na brzinata na rastvoruvawe e

povr{inata na cvrstata materija koja e vo kontakt so rastvoruva~ot. Pri primena na
lekovi koi se vo cvrsta farmacevtska forma (tableti, kapsuli, pra{oci i dr),
brzinata so koja lekovitata supstanca se osloboduva i preminuva vo rastvorot moè da
bide pomala od brzinata na apsorpcija. Pri vakvi slu~aevi brzinata na rastvoruvawe e
faktor koj ja ograni~uva apsorpcijata.
Zaradi seto pogore navedeno, kineti~kata rastvorlivost i brzinata na

rastvoruvawe, pretstavuvaat difuziski process, opi{an so Fick-oviot zakon za
difuzija koj moè da se pretstavi so slednite ravenki (3 i 4):
dm/dt = - D S dC/dx (3)
Rastvorlivost (m)
Koncentraciski gradient (dC/dx)
Debelina na difuziski sloj (x)
Viskoznost (sodràna vo D)
Golemina na ~esti~ki (sodràna vo S)
Povr{ina na rastvoruvawe (sodràna vo S)
Temperatura (sodàna vo D)
(4)
dm/dt - brzina na rastvoruvawe

S – povr{ina na cvrstata materija koja se rastvara
K – konstanta na brzina na rastvoruvawe
Cs – koncentracija na zasituvawe (maksimalna rastvorlivost)
Ct – koncentracija na rastvorenata supstancija vo vreme t
31

Vrednosta za konstantata na brzinata na rastvoruvawe, {iroko varira od

supstancija do supstancija. Lekovitite supstancii koi se javuvaat vo pove}e kristalni
oblici moè da imaat pove}e razli~ni vrednosti za konstantata na brzinata na
rastvoruvawe. Rastvorlivosta moè da se doteruva so promena na strukturata na lekot.
Opredeluvawe na rastvorlivosta moè da se vr{i :
po eksperimentalen pat, naj~esto vo golem set na rastvoruva~i so vklu~uvawe na

komponenti va`ni za in vivo korelacija: òl~ni soli, PAS, enzimi,
fosfolipidi, pufer, hrana vo uslovi na eksperimentalno kontrolirana
temperatura;
so upotreba na predviduva~ki modeli koi se temelat na molekularni
deskriptori koi pomagaat da se odredi koi karakteristiki ja ograni~uvaat
rastvorlivosta (QSPR – kvantitativen odnos struktura-svojstvo )
Y = aX1 + bX2 + cX3 +...
Kade:
Y = fizi~ko-hemisko svojstvo (pr. log Cs, log P)
Xn = specifi~en molekularen deskriptor
a,b,c = konstanti
Molekularniot deskriptor e finalen rezultat na logi~ka i matemati~ka

procedura koja vrz osnova na rezultatite od odreden eksperiment ja transformira
hemiskata informacija vo kodiran simbol (korisen broj - pokazatel). Brojot
pretstavuva svojstvo na molekulata i u~estvuva vo predviduvaweto na svojstvata na
drugi molekuli.
Dobrite molekularni deskriptori treba da imaat vrednost koja:
• ne zavisi od toa kako se ozna~eni molekulskite atomi

• ne zavisi od pozicijata na molekulata
• e vo profatlivo numeri~ko podra~je
• dava tolkuvawe za strukturata
• dobro korelira so najmalku edno svojstvo
• ne stapuva vo interakcija so drugi molekularni deskriptori
• se menuva soodvetno na promenata na strukturata
• ne e ograni~ena na premal broj molekuli
• gi razlikuva izomerite
Rastvorlivosta moè da bide opredelena od molekularni deskriptori.

Dopolnitelno i samata rastvorlivosta moè da bide molekularen deskriptor preku
koj se opredeluva apsorpcijata/biolo{kata aktivnost na lekovitata supstanca.
So predviduva~kite modeli se izbegnuva nepotrebna :

32

• sinteza na nerastvorlivi soedinenija

• analiza na nerastvorlivi soedinenija
So toa, otkrivaweto i razvojot na lekovite se fokusira na istraùvaweto na

soodvetnite lekovi i se namaluvaat naporite, vremeto, tro{ocite za istraùvawe na
soedinenijata so mala verojatnost za uspeh in vivo.
2.1.2. Kineti~ka rastvorlivost
Poa|aj}i od pretpostavkata deka rastvoruvaweto vo osnova e difuziski proces,

toa moè da se pretstavi so pomo{ na Fikoviot zakon za difuzija:
(4)
Bidej}i koncentracijata se menuva od Cs do Ct, a debelinata na difuzniot sloj

(h) e konstanta, ravenkata 4 moè da ja napi{eme vo sledniov oblik
(5)
Vo poslednata ravenka D i h se konstanti, pa spored toa D/h moè da se zameni so

konstanta k (-D/h=k). Bidej}i Cs e mnogu pogolemo od Ct, ravenkata 5 moè da se napi{e
vo sledniov oblik:
(6)
Na osnova na ravenkite 5 i 6 moè da se sogledaat faktorite koi vlijaat

na brzinata na rastvoruvawe i pati{tata preku koi taa moè da se zgolemi.
Koeficientot na difuzija, a obi~no i Cs, se zgolemuvaat so porast
na temperaturata. Me|utoa, koeficientot na difuzija e obratno
proporcionalen na viskozitetot, pa brzinata na rastvoruvawe se
namaluva so zgolemuvawe na viskozitetot na rastvoruva~ot.
Brzinata na me{awe na rastvoruva~ot okolu ~esti~kite koi se
rastvoruvaat isto taka vlijae na debelinata na difuzniot sloj.
Kolku e pointenzivno me{aweto, slojot e potesen i procesot na
rastvoruvawe e pobrz.
33

Na brzinata na rastvoruvwe vlijae i goleminata na ~esti~kite

koja e vo kontakt so rastvoruva~ot. Brzinata na rastvoruvawe
moè da se zgolemi preku namaluvawe na goleminata na ~esti~kite.
Isto taka i vidot na rastvoruva~ot i negovata pH vrednost vlijaat
na rastvorlivosta Cs, pa so toa i na brzinata na rastvoruvawe.
Za da se sledi promenata na koncentracijata vo edinica vreme, potrebno

e ravenkata 5 da se podeli so V (dm/dt:V=dC/dt), pri {to se dobiva:
(7)
So integracija na gorenavedenata ravenka i zamena na izrazot –D/hV so

konstantata k (konstanta na brzina na rastvoruvawe) se dobiva sledniov izraz:
(8)
Od ovoj izraz se dobivaat ravenkite 9 i 10 koi se koristat za

presmetuvawe na konstantata na brzinata na rastvoruvawe (rav. 9) i sledewe na
promenata na koncentracijata vo edinica vreme (rav. 10).
(9)
(10)
Ravenkata 10 vaì po pretpostavka deka rastvoruvaweto na molekulot na

cvrstata supstancija vo te~nosti e posledica na ednostavna difuzija na rastvorenite
molekuli od povr{inata na supstancijata vo okolinata na rastvorot. Pritoa,
~esticite na cvrstata supstancija se obloèni so sloj na za{titen rastvor (okolen
rastvor) vo koj koncentracijata opa|a so odale~enosta od povr{inata.
Konstantata na brzinata na rastvarawe moè da se presmetuva i na
osnova na grafi~ki prikaz. Ako grafi~ki go prikaème logaritamot na
momentalnata koncentracija na lekovitata supstancija vo rastvorot vo odnos
na vremeto t, vo semilogoritamskiot koordinaten sistem, ja dobivame pravata
~ii nagib e - kS/2,3.
34

Cs – koncentracija na zasituvawe
Ch – koncentracija vo za{titniot (okolniot) rastvor
h – debelina na difuzniot sloj
D – konstanta
Navedenite ravenki 9 i 10 vaàt samo vo slu~aj koga promenata na

povr{inata na lekovitata supstancija e zanemarliva. Vo realni uslovi sepak
povr{inata postojano se menuva.
2.1.3. Razdeluvawe na sme{i

Mnogu ~esti vo tekot na farmacevtskite i/ ili hemiskite postapki se dobivaat
sme{i na hemiski supstancii. Ova moè da bide rezultat na nekompletna hemiska
reakcija, dopolnitelni produkti na reakcijata. Poznavaweto na kiselobaznite
osobini na lekovite e osnova za efikasna separacija na lekovitite supstancii od
vakvite sme{i.
Pri jonizacija na lekovitata molekula, profilot na rastvorlivost na
supstanciite zna~ajno se menuva. Slobodnite kisleini i bazi, vo joniziran oblik
dobro se rastvoruvaat vo nepolarni organski rastvoruva~i kako dietil eter,
hloroform ili etil acetat. Posle jonizacijatata, kiselinata formira anjon,a bazata -
konjugirana kiselina. Ovie dva oblika se mnogu porastvorlivi vo vodeni rastvoruva~i
kako voda ili puferi. Ova zna~i deka kiselite lekovi se pove}e rastvorlivi vo
organski rastvoruva~i na poniska rN (koga se nejonizirani) i vo polarni rastvoruva~i
pri visoka rN vrednost. Bazite, sprotivno na ova, se rastvorlivi vo organski
rastvoruva~i pri poviska rN vrednost (koga bazata e vo nejoniziran oblik), i vo voda
pri niski rN vrednosti.
35

2.3. Prakti~en del
2.3.1 Potrebna laboratoriska oprema
- odmerni tikvici
- pipeti
- epruveti
- staklena inka
- filter hartija
- friìder
- termostat
- spektrofotometar
- kiveti
2.3.2 Potrebni reagensi
- salicilna kiselina
- Na - salicilat
- pufer so pH=1,2; pH=6,8;
- standarden rastvor na HCl
2.3.3. Princip na ve`bata
Eksperimentalno odreduvawe na kineti~kata rastvorlivost na salicilnata kiselina i

Na-salicilatot vo zavisnost od rN i temperaturata na sredinata na rastvarawe.
2.3.3.2. Tehni~ka izvedba na ve`bata
2.3.3.2. a. Odreduvawe na rastvorlivosta na salicilna kiselina pri

pH=1.2
Se zemaat dve probi od po 20ml rastvor na salicilna kiselina vo 0.1 mol/l HCl
(rN = 1.2) so koncentracija 20µg/ml. Ednata proba se ostava da stoi vo termostat na
37 S, a drugata proba na 4 S. Pritoa, na sekoi 5 minuti rastvorot se prome{uva, dodeka
na sekoi 10 minuti se vadat po 5ml od analizite i se dopolnuvaat so novi 5ml 0.1 mol/l
HCl. Otpipetiraniot volumen od rastvorot se filtrira i razreduva vo odnos 1:100. Na
ovoj na~in se podgotvuvaat po pet rastvori od dvete probi. Vo prigotvenite rastvori
spektrofotometriski se opredeluva koncentracijata na salicilna kiselina na
branova dolìna 295 nm, vo odnos na standarden rastvor na salicilna kiselina vo 0.1
mol/l HCl so koncentracija 10 g/ml.
36

2.3.3.2. b Odreduvawe na rastvorlivosta na salicilna kiselina pri

pH = 6.2
Se zemaat dve probi od po 20ml rastvor na salicilna kiselina vo acetaten
pufer (rN = 6.2) so koncentracija 80 µg/ml. Ednata proba se ostava da stoi vo termostat
na 37 S a drugata proba na 4 S. Pritoa, na sekoi 5 minuti rastvorot se prome{uva,
dodeka na sekoi 10 minuti se vadat po 5ml od analizite i se dopolnuvaat so novi 5ml 0.1
mol/l HCl. Otpepitiraniot volumen od rastvorot se filtrira i razreduva vo odnos 1 :
200. Na ovoj na~in se podgotvuvaat po pet rastvori od dvete probi. Vo podgotventite
rastvori spektrofotometriski se opredeluva koncentracijata na salicilna kiselina
na branova dolìna 295 nm, vo odnos na standarden rastvor na salicilna kiselina vo
acetaten pufer so koncentracija 10 g/ml.
2.3.3.2.v. Odreduvawe na rastvorlivosta na Na - salicilat pri pH=1.2
Se podgotvuvaat 20ml rastvor na natrium salicilat vo 0.1mol/L HCL (rN 1.2) so

koncentracija 40mg/ml koj se ostava na sobna temperatura so postojano me{awe sekoi
10 min. vo tekot na 2 ~asa. Vo sekoj interval od 15 min. se vadat 5 ml od analizite i
dopolnuvaat so novi 5 ml 0.1mol/L HCL.
Posle filtriraweto na rastvorot i soodvetnoto razreduvawe, se
odreduva koncentracijata na natrium salicilatot spektrofotometriski na
branova dolìna 236nm vo odnos na standarden rastvor na natrium salicilat vo
0.1mol/L HCL so koncentracija 10 g /ml.
2.3.3.3. Presmetki
Koncentracijata na rastvorenata lekovita supbstancija vo soodvetniot

rastvoruva~ se presmetuva spored slednite ravenki:
a. Cs= (HA) + ( A-)

b. Ka=( A-) ( H+)/ (HA)
Cs- vkupna rastvorlivost

HA-rastvorlivost na nejonizirana kiselina
A-rastvorlivost na joniziran oblik
Ka- kiselinska konstanta na disocijacija
Spektro fotometrisko opredeluvawe na koncentracijata na rastvorenata

supstnaca spored Beer's закон
37

Rastvorlivosta na lekovitata supstanca vo tekot na vremeto (t1, t2, t3,..) se

presmetuva spored slednite formuli:
o Q1= conc1 x razreduvawe x Vm

o Q2=(conc2 x razreduvawe x Vm) +( conc1 x razreduvawe x Va)
o Q3=(conc3 x razreduvawe x Vm) +( conc2 x razreduvawe x Va) +( conc1 x razreduvawe x Va)
o Q4=
o Q5=
o Q6=
 Vm=25 ml
 Va=5 ml
2.3.3.4. Rezultati
Табела 1. Стандардни раствори
Maksimalna
Standard apsorbansa pri
koncentracija
Salicilna kiselina definirana branova
dolìna
rN= 1.2
rN=6.2
Standard Maksimalna aprobansa

koncentracija pri definirana
Natrium salicilat branova dolìna
rN=1.2
38

Табела 2. Измерени абсорбанци на анализирани супстанции во зависност од времето
Salicilna Apsorbansa Apsorbansa Apsorbansa Apsorbansa Apsorbansa

kiselina 10 min 20 min 30 min 40 min 50 min
rN -1.2
4oS
37oS
rN-6.2
4oS
37oS
Natrium Apsorbansa Apsorbansa Apsorbansa Apsorbansa Apsorbansa

salicilat 10 min 20 min 30 min 40 min 50 min
rN -1.2
4oS
37oS
39

Табела 3. Концентразија на анализираните супстанции во зависнст од врем,ето
Salicilna Koncentracija Koncentracija Koncentracija Koncentracija Koncentracija

rN -1.2
4oS
37oS
rN-6.2
4oS
37oS
Natrium Koncentracija Koncentracija Koncentracija Koncentracija Koncentracija

rN -1.2
4oS
37oS
40

Табела 4. Растворливост на анализираните супстанции во зависност од времето на растварање
Salicilna Rastvorlivost Rastvorlivost Rastvorlivost Rastvorlivost Rastvorlivost

rN -1.2
4oS
37oS
rN-6.2
4oS
37oS
Natrium Rastvorlivost Rastvorlivost Rastvorlivost Rastvorlivost Rastvorlivost

rN -1.2
4oS
37oS
41

2.3.3.5. Zaklu~ok i komentar
Osvoeni bodovi: Asistent:
42

Ime i prezime _______________________________

Data: ___________
Dosie br: __________________ Grupa ____________

VE@BA BR 3
ВЛИЈАНИЕ НА рН НА СРЕДИНАТА И рКа НА ЛЕКОТ ВРЗ
ВКУПНАТА РАСТВОРЛИВОСТ И РАСТВОРЛИВОСТА ВО
(НЕ)ЈОНИЗИРАНА ФОРМА
(ОПРЕДЕЛУВАЊЕ НА рКа НА БРОМТИМОЛ СИНО)

3.1.1. Константи на дисоцијација
Според дефиницијата на Bronsted- Lowry, киселина е супстанција која јонизира и

донира протони. Во водени раствори ова се претставува на следниот начин:
HA + H2O ↔ H3O+ + A- (3.1)
HA претставува киселина која оддава протон,

H2O која го прифаќа оддадениот протон, претставува база,
H3O+ претставува конјугирана киселина на базата и
A- претставува анјон на киселината, односно нејзина конјугирана база.
Рамнотежната констата за оваа реакција е Ка-киселинска константа на дисоцијација,

која математички се претставува како:
Ка = [H3O+] [A-]/[ HA] (3.2)
Според Bronsted- Lowry, базата се дефинира како акцептор на протони.

Фармацевтската наука најмногу го разгледува однесувањето на лековитите супстанции во
водени системи, во кои еден лек ќе се однесува како база само доколку во себе содржи азотен
атом со неспарени електрони способни да реагираат со протоните донирани од киселината.
Основна класа на соединенија кои делуваат на ваков начин се амините. Однесувањето на еден
амин во воден раствор е претставено со следната равенка:
R3N + H2O ↔ R3NH+ + OH- (3.3)
R3N аминот кој го прифаќа оддадениот протон, претставува база,

H2О претставува киселина која оддава протон,
R3NH+ претставува конјугирана киселина на базата и
43

OH- претставува анјон на киселината, односно нејзина конјугирана база.
Водата во оваа реакција преставува донор на протони, односно киселина.

Рамнотежната константа за оваа реакција е дефинирана како Kb-базна константа на
дисоцијација, и колку е поголема нејзината вредност, толку е појака базата.
Kb= [R3NH+][ OH-]/[ R3N] (3.4)
Од равенката (3.2) може да се забележи дека Ка претставува едноставен однос, што

значи дека колку е поголема нејзината вредност, толку е појака киселината. Сепак, јачината на
најголемиот број на киселини се претставува со pKa, каде што
рКа= -log10 Ка (3.3)
Бидејќи pKa е негативен логаритам од Ка, колку е помала вредноста на рКа,

толку е појака киселината, така што на логаритамска скала разлика од една рКа
единица, претставува разлика од десет пати во киселинската јачина. Во литературата,
јачината на базата најчесто е дефинирана како pKa на конјугираната киселина на
базата [R3NH+], што значи дека колку е поголема вредноста на pKa, толку е поголема
јачината на базата.
Една супстанца е појака киселина доколку нејзината рКа вредност е пониска,

односно супстанцаијата е појака база доколку нејзината рКа е повисока.
Основно правило во определувањето на јачината на една киселина или база е:
pKa < 2 - јака киселина, нема базни особини во вода

pKa 4-6 - слаба киселина, многу слаба конјугирана база
pKa 8-10 - многу слаба киселина, слаба конјугирана база
pKa >12 - нема кисели особини во вода, јака конјугирана база
Константите на дисоцијација се единствени за секоја супстанца и се

определуваат преку мерење на спроводливоста, Тм, рН на раствор,
спектрофотометриски и др.
3.1.2. Степен на јонизација
Најголемиот број на лекови се слаби киселини или бази и во водена средина

релативно слабо јонизираат. Брзината на ресорпција на лекот не преставува функција
од неговата вкупна концентрација на местото на ресорпција, туку преставува функција
само од концентрацијата на неговиот облик којшто се ресорбира, а тоа е
44

липосолубилниот, нејонизиран облик. Концентрацијата на нејонизираниот облик

зависи од степенот на јонизација и рН на растворот на местото на ресорпција.
Степенот на јонизација (дисоцијација)- ( ) на една киселина односно база може да

се пресмета од нејзината константа на дисоцијација- Ка, која според равенката 3.2. преставува
однос помеѓу концентрацијата на јонизираниот и нејонизираниот дел на киселината, односно
базата. Степенот на јонизација ( ) покажува колкав дел од киселината или базата, во раствор
со определена рН, се наоѓа во јонизиран облик. Доколку =1 значи дека 100% од супстанцијата
е дисоцирана, а доколку =0.8, значи дека 80% е дисоцирана, а 20% не дисоцирана.
А= 1/1+10(рКа-рН) -за киселини (3.4)

(рН-рКа)
В=1/1+10 - за бази (3.5)
Односот помеѓу и рН не е линеарен туку е сигмоиден. Оттука, мала промена на

рН доведува до голема промена на степенот на јонизација, особено ако рН вредноста на
средината е слична вредност како и рКа на лекот. Како што е прикажано на слика 1,
степенот на јонизација на слабите киселини се зголемува со зголемување на рН вредноста на
растворот, а степенот на јонизација на слабите бази опаѓа со зголемување на рН на растворот.
Ако рКа= рН, степенот на јонизација како за киселини така и за бази е 0,5; 50% од молекулите
јонизирале, а 50% не јонизирале. Меѓутоа, мал број на лекови се однесуваат согласно
наведената хипотеза на рН распределба. Можно е лекот во јонизиран облик да биде доволно
липосолубилен и да ја мине бариерата, додека пак нејонизираниот лек да биде недоволно
липосолубилен и соодветно, да не може да ја мине мембраната. Дополнително, хипотезата на
рН распределба не е применлива за други механизми на апсорпција на лековите освен
пасивната дифузија (пр. активен транспорт).
Ка и рКа ја покажуваат способноста на супстанцијата да јонизира, а не да

ослободува хидрониум јони.
рН ја покажува концентрацијата на хидрониум јоните во раствор во кој знаеме

дека супстанцата јонизирала и на тој начин ни овозможува да одредиме дали
станува збор за киселина или база.
рН на растворот зависи од рКа.
Од табелата 3.1 се забележува дека киселите и базните супстанци може да имаат рКа
вредности во исти интервали.
45

Табела 3.1. Кисели лекови: Ка и рКа

Кa pКa
вредности на HA +H2O <==> H3O+ + A- некои
кисели и базни
лековити Пеницилин V 2.0x10-3 2.7 супстанции
Ацетилсалицилна киселина 3.3x10-4 3.5
Аскорбинска киселина 5.0x10-5 4.3
Фенобарбитал 3.9x10-8 7.4
Фенитоин 7.9x10-9 8.1
Борна киселина 5.8x10-10 9.2
Зидовудин 2.0x10-10 9.7
Базни лекови:
A + H2O <===> HA+ + OH-
Кофеин 2.5x10-4 3.6
Залцитабин 6.3x10-5 4.2
Теофилин 3.4x10-6 5.2
Морфин 7.4x10-7 7.9
Еритромицин 2.0x10-9 8.8
Амфетамин 1.6x10-10 9.8
Заради тоа, една од наважните работи кои треба да се запомнат за киселите и базните
лековити супстанции е дека вредностите на константата на дисоцијација (pKa) на
киселините односно базите воопшто не го дефинираат карактерот, кисел или базен, на
лековитата супстанција. pKa вредностите ја дефинираат само јачината на киселината односно
базата; ја дефинираат pH вредноста на која 50% од лекот е јонизиран, но не посочуваат дали
лекот се однесува како киселина или база во растворот. Така на пример, амините претставуваат
бази и имаат pKa вредност од приближно 9, додека пак фенолите се киселини со просечна pKa
=10.
46

Единствениот сигурен начин да се дознае дали лекот се однесува како база или како
киселина е да се познаваат функционалните групи кои ја дефинираат киселоста или
базноста на молекулите.
3.1.3. Функционални групи кои ја дефинираат киселоста/базноста на молекулите
3.1.3. а. Карбоксилни киселини
Најчеста функционална група која ја дефинира киселоста на лековитите

молекули е карбоксилната група чија јонизација се претставува според сликата (3.1).
Сл.3.1. Јонизација на карбоксилна киселина
Формираниот анјон на киселината се стабилизира со процесот на резонанција

(слика 3.2) заради што за карбоксилниот анјон се смета дека претставува резонантен
хибрид на вообичаените [a] и [b] облици. Резонантниот хибрид е генерално многу
постабилна структура од секоја од двете вообичаени форми, што значи дека многу
повеќе се среќава. Тоа всушност преставува доказ дека карбоксилната киселина
јонизира и влегува во групата на појаки киселини.
Сл. 3.2. Резонантна стабилизација на карбоксилен анјон
Резонантниот ефект може да се забележи кога киселоста на едноставна

карбоксилна киселина како оцетната ќе се спореди со киселоста на алкохол како
етанол. И двете соединенија јонизираат ослободувајќи протон, но формираниот анјон
на оцетната киселина е резонантно стабилизиран, додека пак етоксидниот анјон
формиран со јонизација на етанолот не е толку стабилен што влијае на киселоста (рКа)
на двете соединенија. Имено рКа на оцетната киселина изнесува 4.7, додека пак на
етанолот изнесува приближно 16, што значи дека оцетната киселина е за 10 11 појака
киселина од етанолот (слика 3.3). Алкохолите се многу послаби киселини од водата и
во биолошките системи се смета дека се неутрални. За да се предизвика јонизација на
алкохол, потребна е многу јака база ( пр. натриумова).
47

Сл.3.3.Јонизација на оцетна киселина и на етанол
Голем број на најчесто употребуваните лекови претставуваат деривати на

карбоксилната киселина. Тука се вбројуваат аспирин (рКа 3,5), метотрексат (рКа 3,5;
4,8; 5,6) и диуретикот фуросемид (рКа 3,9) (слика 3.4).
Аспирин Метотрексат Фуросемид
Сл.3.4. Структури на аспирин, метотрексат и фуросемид
3.1.3.б.Феноли
Друга најчеста кисело-функционална група која се среќава во лековитите

молекули е фенолната група или хидроксибензенот. Фенолите се слаби киселини кои
ослободуваат протони формирајќи феноксиден анјон. Овој анјон е резонантно
стабилизиран со помош на четири енантиомерни облици (слика 3.5). Како и кај
карбоксилните киселини, резонантниот ефект придонесува за распределба на
негативниот полнеж околу целиот анјон наместо негово концентрирање само околу
кислородниот атом. Фенолите имаат рКа од приближно 10, што значи дека се
приближно милион пати послаби киселини од карбоксилните киселини, но исто толку
пати се појаки киселини од простите алкохоли. Фенолите се послаби киселини од
јаглеродната (H2CO3), што значи дека не реагираат со натриум бикарбонатот и може да
бидат преципитирани од феноксидниот раствор преку заситување со јаглерод диоксид.
Најкарактеристични лекови кои поседуваат фенолна фукционална група се
парацетамол (рКа 9,5), морфин (рКа 9,9) и тироксин (рКа 10) ( слика 3.6).
48

Сл.3.5. Резонантна стабилизација на феноксиден анјон

Парацетамол Морфин Левотироксин
Сл.3.6. Структури на парацетамол, морфин и левотироксин
3.1.3.в. Варфарин
Варфаринот е антикоагулант кој ја инхибира коагулацијата
на крвта преку модификација на механизмот на делување на
факторите на коагулација поврзани со витаминот К.
Најчесто се пропишува кај постари пациенти кај кои е
дијагностицирана длабока венска тромбоза или пулмонарна
емболија. Варфаринот се употребува во облик на
натриумова сол, што сугерира дека, заради присуството на
киселиот водороден атом станува збор за кисела лековита
супстанција. Овој кисел водороден атом е лоциран помеѓу двете електрон–
привлекувачки карбонилни групи (слика 3.7). После јонизацијата, негативниот полнеж
може да биде делокализиран на било кој од двата електронегативни кислородни атоми
од дикарбонилната група што овозможува создавање на резонантно стабилизиран
анјон. Оваа потенцирана стабилност на анјонот овозможува варфаринот да се однесува
како протон донор што го дефинира киселиот карактер (рКа 5,0) на оваа супстанција.
Варфаринот, заради својата мала хидросолубилност се применува како натриумова
сол. Варфаринот преставува интересно соединение бидејќи дополнително на
јонизацијата манифестира и кето-енолен таутомеризам што значи дека постои во две
конституционално изомерни форми (таутомери) кои се во меѓусебна рамнотежа, иако
49

една од двете форми најчесто е застапена во многу поголеми количини во споредба со

другата (слика 3.8).
Таутомеријата и резонанцијата преставуваат два сосема различни ефекти кои не
смее да се поистоветуваат. Разликите се сумирани во табела 3.2. И покрај тоа што
енолниот таутомер на варфаринот е застапен во многу мал степен, може да се
разгледува и јонизацијата на соединението во негов енолен облик (слика 3.9).
Сл. 3.7. Јонизација на варфарин
Сл.3.8.Таутомерија кај варфарин
Сл.3.9. Јонизација на енолната форма на варфарин
Табела.3.2. Разлики помеѓу таутомеризам и резонанца
50

Резонантни форми на лекот Таутомерни форми на лекот
Исто соединение Различни соединенија

Се разликуваат само според позицијата Се разликуваат според позицијата на
на електроните атомите (најлесто водород)
Секоја вообичаена форма придонесува Секоја форма опстојува во рамнотежа
за единствена резонантна структура
Вообичаените форми не можат да се Секој таутомер може да се изолира
изолираат
3.1.3.г. Фенилбутазон
Фенилбутазонот е нестероиден анти-

инфламаторен лек (НСАИЛ) кој своето
антиинфламаторно дејство го манифестира
преку инхибиција на ензимот циклооксигеназа и
инхибиција на дејството на медијаторите на
воспаление како простагландините.
Фенилбутазонот, и покрај тоа што содржи азот,
преставува слаба киселина со pKa од 4.4.
Киселиот водороден атом е на позиција 4 од пиразолидиндионскиот прстен и после
јонизацијата, негативниот полнеж е делокализиран на карбонилните групи на сличен
начин како кај варфаринот (слика 3.10).
Сл.3.10. Јонизација на фенилбутазон
51

3.1.3.д. Индометацин
Индометацинот претставува друг НСАИЛ со сличен механизам на делување

како и фенилбутазонот. Тој поседува кисели особини кои се должат на јонизацијата на
карбоксилната група и има pKa = 4.5. Азотниот атом присутен во амидната група на
индометацнот е неутрален (слика 3.11)
Сл.3.11.Јонизација на индометацин
3.1.3.ѓ. Барбитурати
Барбитуратите се циклични имиди кои се користат како хипнотици и

антиконвулзиви. Сите преставуваат деривати на барбитурната киселина и се
разликуваат само по супституентите на петтата позиција од прстенот. Тие содржат
азотен атом, но електронскиот пар на азотот не реагира со протоните, заради што
барбитуратите не претставуваат бази. Имено, тие во водени раствори се однесуваат
како слаби киселини. Негативниот полнеж формиран при јонизацијата
(дипротонска) се делокализира околу двете карбонилни групи на сличен начин како и
кај варфаринот. pKa на барбитуратите изнесува најчесто 7-8 после првата јонизација
(слика 3.12), односно 11-12 после втората јонизација. Лековите, заради нивната слаба
хидросолубилност, најчесто се применуваат во облик на натриумови соли. Сулфурниот
аналог на пентобарбиталот, тиопентал, се користи за индукција на генерална анестезија
(слика 3.13). Тиобарбитуратите од овој тип имаат многу поголем коефициент на
распределба во однос на оксобарбитуратите.
52

Сл.3.12. Јонизација на барбитурати
Сл.3.13. Структура на тиопентал
3.1.3.е. Фенитоин
Фенитоинот претставува антиконвулзив, лек кој се користи во

третман на епилепсија. Неговите својства се слични со оние на
барбитуратите. Сртруктурно - хемиски претставува цикличен
имид со pKa 8,3. Резонантната стабилизација на анјонот е преку
распределба на негативниот полнеж на кислородот од
карбонилната група, и заради поголема хидросолубилност,
лекот се применува во облик на натриумова сол. Фенитоинот и
барбитуратите манифестираат таумеризам (слика 3.14).
53

Сл.3.14. Таутомеризам на фенитоинот
3.1.3.ж. Сулфонамиди
Сулфонамидите преставуваат класа на антибактериски соединенија кои содржат

сулфонамидна група- SO2NH. Нивната терапевтска употреба е намалена во поново
време заради новите класи на антибиотици- пеницилини и цефалоспорини.
Сулфонамидите претставуваат слаби киселини (рКа 5-8) заради високиот електронско
привлекувачки ефект на –SO2 супституентот и резонантната стабилизацијата на
добиениот анјон (слика 3.15).
Сл.3.15. Јонизација на
сулфонамидите
3.1.3.з. Базни лекови
Најголемата класа на соединенија кои покажуваат базни особини претставуваат

амините. Базните супстанции најчесто се применуваат како хидросолубилни соли
(хидрохлоридни соли). Мора да се внимава при истовремена примена со супстанции
кои ја зголемуваат рН вредноста на растворот на хидрохлоридната сол заради
можноста од преципитација на помалку растворливата слободна база.
Она што е важно да се запомни за базните лекови е фактот дека поседуваат
расположлив слободен пар на електрони на азотниот атом. Доколку овој пар влезе во
интеракција во било кој друг дел од молекулата, аминот нема да биде повеќе со базен
карактер. Оваа ситуација најлесно може да се илустрира кај прокаинот (Слика 3.16).
Азотот од диметил аминскиот дел на молекулата преставува дел од терциерен амин.
Слободниот електронски пар, расположлив за прифаќање на протони е лоциран на
азотниот атом, што значи дека алифатичниот азот може да јонизира при физиолошко
рH на плазмата ( рН 7.4) и да формира моно-катјонски прокаин. Спротивно пак,
слободниот електронски пар на амино групата врзана за бензеновиот прстен е помалку
расположлив за реакција со протони заради неговата делокализација во прстенот.
Делокализацијата на аминогрупата ја зголемува електронската густина во орто и пара
54

положба, што значи дека Ar-NH2 групата не може да јонизира во услови на

физиолошка рН на крвта.
Сл.3.16. Јонизација на прокаин
Постои погрешно мислење дека сите соединенија кои содржат азот, заради
фактот дека амините се базни и содржат азотен атом, ќе поседуваат базни особини.
Амидите поседуваат азот и се неутрални и неколку други лекови кои содржат азотни
атоми се всушност киселини. Супстанциите се базни само доколку слободниот
електронски пар на азотот може да реагира со протони. Во случајот со амидите, C-N
врската со процесот на резонантност се здобива со карактер на двојна врска (слика
3.17).
Сл. 3.17. Резонантен ефект на амидната група
Слободниот електронски пар на некои лековити молекули се целосно

недостапни за реакција со протони и овие супстанции се многу слаби бази што во
водени раствори всушност се однесуваат како киселини. Ваков е случајот со претходно
споменатите фенилбутазон, индометацин, барбитурати, сулфонамиди, фенитоин.
Кај алифатичните хетероциклични соединенија (3.18.), азотниот атом е дел од
заситениот хетероцикличен прстен, а слободниот електронски пар е расположлив за
реакција со протони. Соединенијата од овој тип (пр. пиперидин) се слични по својата
базна јачина со нивните сродни ациклични алифатични соединенија со pKa 8-9.
Кај ароматичните хетероциклични соединенија (3.18.) слободниот електронски
пар од азотните атоми влегува во интеракција со електроните од ароматичниот прстен.
Кај пиролот, слободниот електронски пар во одредна мера придонесува за
ароматичниот секстет и не е достапен за реакции со протони. Заради тоа пиролот е
многу слаба база со негативна pKa вредност.
Шестчлениот азотен хетероцикличен пиридин исто така претставува слаба база
(3.18.). Во овој случај, само еден електрон од азотот приднесува за формирањето на
ароматичниот секстет. На ваков начин останува еден пар на електрони кој може да
прифати протон што резултира со pKa на пиридинот од 5,2, вредност слична со онаа на
ароматичните амини како анилинот.
55

Сл. 3.18.Јонизација на некои азотни хетероциклични соединенија
3.1.4. Henderson-Hasselbach-ови равенки
Голем број од биолошките процеси во организмот се наоѓаат во меѓусебна

хомеостатска рамнотежа. Рамнотежните концентрации на H3O+ и OH- се многу мали
во чисто водени раствори. Честите и многубројни промени (предизвикани од на пр.,
внесување на одредени супстанции) доведуваат до нарушување на оваа хомеостаза.
Така, слабите киселина или бази кои до определен степен ќе дисоцираат во водена
средина ја менуваат рН средината на растворот при што рН на растворот ќе биде
определен директно од рКа на супстанцијата. Имено, лекот, внесен во организмот, при
процесот на јонизација (дисоцијација) отпушта или прима хидрониум јони менувајќи ја
на тој начин кисело-базната рамнотежа во организмот. Доколку внесеме лек во
организмот, а телесните течности преставуваат чиста вода драстично би ja нарушиле
кисело-базната рамнотежа (хомеостаза).
Сепак, организмот поседува одбранбени механизми со кои по секоја цена се
труди повторно да ја постигне првобитната рамнотежна состојба. Телесните течности
немаат карактер на чиста вода. Тие содржат слаби киселини или бази во релативно
високи концентрации кои овозможуваат одржување на рН вредноста во организмот во
рамнотежна состојба и покрај внесувањето на кисели или базни лековити супстанции.
Овие слаби киселини и бази во организмот се наречени пуфери.
Лековите внесени во човечкиот организам се изложени на дејството на
биолошките мембрани во органзмот. Само нејонизиран облик (липосолубилен) на
лековитата супстанца може да помине низ овие биолошки мембрани и во доволни
количини да стигне на местата на кои треба да го манифестира својот терапевтски
ефект. рН на телесните течности ја определува концентрацијата на Н 3О+ јоните, а со
тоа и директно го определува и односот меѓу јонизираниот и нејонизираниот дел на
лековитата супстанца. Висока рКа вредност оневозможува пенетрација на лековитата
56

супстанција во клетките и ја зголемува системската токсичност. рКа во интервал од 6-8

е оптимална за значајна мембранска пенетрација. Пуферите се раствори кои ја
стабилизираат и обезбедуваат соодветна рН вредност на средината која овозможува
оптимална дисоцијација на лековитата супстанца. Ваквата стабилизирана рН средина
го определува степенот на дисоцијација на лековитата супстанција во телесните
течности. Нормална рН на крвта е 7.4 и таа варира во организмот во зависност од видот
на телесните течности.
Физиолошки рН вредности во различни делови на организмот
- желудник - 2 - тенки црева - со храна - 5.0, без храна - 6.8
- дуоденум - 5.5 - бубрези - 4.2
Henderson-Hasselbach-овите равенки ни обезбедува поедноставно разбирање

на јонизацијата на лекот во пуферирани системи како што е човечкиот организам. Со
примена на овие равенки, при позната рН вредност на средината и рКа на лековитата
супстанција може да се пресмета односот помеѓу јонизираниот и нејонизираниот дел
на супстанцијата во различни делови во организмот, претпоставувајки дека рН
вредноста не се менува. Овој факт е основа за фармацевтите во понатамошното
предвидување на степенот на апсорпција на лековитата супстанца во ГИТ.
Истовремено, Henderson-Hasselbach-овите равенки овозможуваат да се
определи најниската рН вредност при која слабата киселина е се уште во растворлива
форма, односно највисоката рН вредност при која слабата база е се уште во
растворлива форма. Овој податок е значаен како за определување на местото на
оптимална апсорпција на лековите, така и за подготовка на лековитите форми во кои ќе
биде инкорпорана лековитата супстанција (на пр., кога се подготвува раствор на
лековитата супстанција за паренетерална примена).
Henderson-Hasselbach равенка за киселини (3.6)
Henderson-Hasselbach равенка за бази (3.7)
Henderson-Hasselbach-овите равенки покажуваат дека кога супстанцијата е

50% во јонизирана, а 50% во нејонизирана форма при одредена рН вредност на
средината, нејзината рКа вредност е еднаква на соодветната рН вредност. Со други
зборови, при рН вредност на средината еднаква на рКа вредноста на лековитата
супстанција, половина од вкупниот број на молекули на супстанцијата се јонизирани а
половината се во нејонизиран облик.
Не постои еден универзален метод за определување на рКа кај сите супстанци

поради варијациите во растворливоста на секоја компонента. Поради ова, рКа се
57

определува на супстанции кои се растворливи и стабилни заради обезбедување на

рамнотежа во хемискиот систем.
Кај слабо растворливите супстанции рКа се определува во водено-метанолни
раствори.

3.2.1 Потребна лабораториска опрема
- ерленмаерки
- пипети
- епрувети
- лакмусова хартија
- спектрофотометар
- кивети
3.2.2 Потребни реагенси
- 0.1% bromo-thymol blue

- 0.1M KH2PO4
- 0.1M Na2HPO4
3.2.3 Спектрофотометриско определување на pKa на Bromthymol Blue
Bromothymol Blue (B) е слаба киселина. И двата облика (јонизираниот и

нејонизираниот) на Bromthymol Blue апсорбираат во видливиот дел од спектарот, но
на различна бранова должина.
HB +H2O <==> H3O+ + B-

жолта, 550nm сина, 450nm
Го определуваме специфичниот апсорпциски максимум во високо кисела

средина во која е присутен само НВ и во високо базна средина каде доминира В -
обликот. Промената на рН средината се постигнува со помош на едно, односно
двопротонската натриумова односно калиумова фосфатна сол, соодветно.
Во идеални услови апсорбансата на супстанцијата е

пропорционална со нејзината моларна концентрација – Закон
на Beer
58

3.2.4. Принцип на вежбата
Доколку концентрациите на киселиот и базниот облик на лековитата супстанца се

еквивалентни, рКа на лекот ке биде еднаква на рН на растворот на лековитата супстанција.
Ако [ A-] = [HA] тогаш pH = pKa
Константата на дисоцијација на лековитата супстанција се определува преку

определување на точката во која концентрацијата на киселината и нејзината
конјугираната база се еквивалентни. Јонизираниот и нејонизираниот дел на лекот
имаат различна апсорбанса во видливиот дел од електромагнетниот спектар. Потоа се
определува рН вредноста при која двете форми се во еквивалентни концентрации во
растворот.
3.2.5. Техничка изведба на вежбата
1.Од основните раствори во ерленмаерки да се приготват работни раствори со волумен

од 25ml ,онака како што е дадено во табелата.
2.На секој од работните раствори се мери рН вредноста.
3.Се мери апсорбансата на јонизираниот облик на бранова должина од 450nm.
4.На бранова должина од 550 nm се мери апсорбансата на нејонизираниот облик.
5. Сите податоци се внесуваат во табелата.
Графички се прикажува апсорбансата на јонизираниот и нејонизираниот дел на

супстанцијата во однос на рН за секоја од двете бранови должини на кои се врши
мерењето во кисела и базна средина. Од графикот се определува рН вредноста при која
двата облици се еквивалентни. рН=рКа
Abs 550 nm
Abs 450 nm
pH=1 pH=14
59

3.2.5 Резултати
0.1% бромм 0.1M 0.1M

450 550
. тимол плаво KH2PO4 Na2HPO4 H20(ml) pH
A A
(ml) (ml) (ml)
1. 1.0 5.0 0.0 19.0
2. 1.0 5.0 1.0 18.0
3. 1.0 10.0 5.0 9.0
4. 1.0 5.0 10.0 9.0
5. 1.0 1.0 5.0 18.0
6. 1.0 1.0 10.0 13.0
7. 1.0 0.0 5.0 19.0
60

3.2.5.1.Графички приказ
61

3.2.6.Zaklu~ok i komentar
3.3.7.Задачи:
1. Соединение киселина/база рКа

Толуен -4-сулфонска киселина -1.3
киселина
Бензоева киселина Киселина 4.2
Тиопентал Киселина 7.6
Кодеин База 8.2
Атропин база 10
а) Која од супстанциите (табела) ќе се апсорбира во најголем обем при рН=2?
б) Која од супстанциите (табела) ќе се абсорбира во најголем обем во тенките црева при

рН=4.2?
в) Која од супстанциите (табела) најлесно ќе ја мине крвно-мозочната бариера при рН на

плазмата 7.4?
г) Која од супстанциите (табела) најдоцна ќе се елиминира од организмот преку

бубрезите при рН на урината од 4.2?
62

2. Каков е односот помеѓу ефедрин и ефедрин HCl (рКа=9,6) во интестиналниот тракт со

рН=8.0?
3. Колкав е процентот на јонизација на индометацин (рКа=4,5) во интестинален тракт со

рН=8,0?
4. Колкав е процентот на јонизација на ефедрин HCl (рКа=9,6) во интестинален тракт со

рН=8,0 ?
5. На слика 3.19. прикажани се структурните формули на сулфаниламидот и сулфацетамидот.

Објасни зошто двата лека во водени раствори се однесуваат како киселини и посочи ја појаката
киселина!
Сулфаниламид
Сулфацетамид
Сл. 3.19. Структура на сулфаниламид и сулфацетамид
6. На следната слика е прикажана структурата на никотин. Класифицирај го никотинот како

кисела, базна или неутрална супстанција, нацртај ја структурата на формата на никотинот која
ќе доминира при плазматска рН вредност и предложи го фармаколошки активниот облик на
никотинот!
Никотин
63

7. Користејќи ги подолунаведените структури, дефинирај го обликот на лекот кој доминира во

хуманата плазма при pH 7.4.
а) монокатјон
б) дикатјон
в) моноанјон
г) дианјон
д) неутрална молекула
64

Решение и одговори на поставените задачи:
65

Ime i prezime _______________________________

Data: ___________
Dosie br: __________________ Grupa ____________

VE@BA BR 4
ИНТЕРАКЦИЈА ЛЕК - МАКРОМОЛЕКУЛА
(ОПРЕДЕЛУВАЊЕ НА АФИНИТЕТОТ НА ХЛОРАМФЕНИКОЛ ЗА
АЛБУМИН ВО РАЗЛИЧНИ рН СРЕДИНИ)
Откако ќе се внесе во организмот лекот се распределува (дистрибуира), реверзибилно

или иреверзибилно, во еден или повеќе волумени или простори (компартменти) со кинетика од
прв ред. За разлика од дистрибуцијата, која ја го опфаќа реверзибилниот премин на лековите
од и кон другите делови на телото, диспозицијата на лековите ги опфаќа сите процеси и
фактори кои се врзани за лекот од моментот кога лекот ќе стигне во циркулацијата па до
моментот кога лекот или еден или повеќе негови метаболити го напуштаат организмот преку
урина, фецес, пот или издишување (експирација). Оттука, факторите кои влијаат на
распределбата, метаболизмот и/или излачувањето на лекот и/или неговите метаболити се
означени како фактори на диспозиција на лекот. Сепак, спротивно на ова, денес во научните
кругови се смета дека диспозицијата го преставува се она што му се случува на лекот од
моментот на негово внесување во организмот, па до почетокот на неговата елиминација,
односно дека диспозицијата ги опфаќа ослободувањето на лековитата супстанција,
ресорпцијата и дистрибуцијата.
Од физиолошки аспект, компартмент претставува секое ткиво или збир на ткива со

еднакви својства на распределба, оделни органи или телесни течности, додека пак од
фармакокинетска гледна точка, компартментот се дефинира како кинетско подрачје на влез и
излез од организмот кое се карактеризира со волумен (одредена зафатнина) и брзина на
распределба.
Од фармакокинетски аспект, значајни се следните три простори (компартменти) во

човечкиот организам: интравазалниот простор (крвотокот), интерстицијалниот простор
(меѓуклеточниот) и интрацелуларниот простор (клеточниот). И покрај тоа што овие простори
претставуваат анатомски и морфолошки целини, меѓу нив постои континуирана размена на
течности и растворени супстанции. Брзината на размена на лековите помеѓу два раствори
зависи од многу фактори од кои најважни се рКа на лекот, рН на просторот, коефициентот на
распределба на лекот, степенот на врзување на лекот за макромолекулите, најчесто
(глико)протеините, транспортниот механизам и брзината на проток на крвта.
66

Најголемиот дел од лековитите супстанции во крвта може да бидат:
Растворени во плазматска течност

Локализирани во крвните клетки
Врзани за плазматските протеини
Растворливоста на лековитите сустанции во плазмата е многу мала за голем број на
важни лекови. Пенетрацијата пак во крвните клетки е директно дефинирана од
липосолубилноста на лекот или од концентрацијата на нејонизираниот облик на лекот, додека
врзувањето на лековите за плазматските протеини претставува, иако исклучително важен, се
уште недоволно проучен процес.
4.2. Врзување на лековите за протеините (лек-протеин интеракција)
Крвната плазма содржи 93% вода (плазматска вода), а остатокот се разни соединенија,
пред се протеини. Главна протеинска фракција се албумините. Протеините не се среќаваат
само во плазмата, туку и во ткивата. Многу лекови се врзуваат за плазматските и ткивните
протеини. На степенот на врзување на лековите за протеините влијаат голем број фактори, но
во рамките на дефиниран режим на дозирање, врзувањето е пред се со константен карактер.
Хемиската структура на лекот на пример, влијае на степенот на неговото врзување за
протеините. Многу супстанции со мала молекулска маса се скоро целосно врзани за
протеините.
Во крвта, лековите најчесто се врзуваат за албуминот, иако може да се врзат и за многу

други протеини. Албуминот има способност реверзибилно да ги врзува молекулите на
лековите на својата површина. Човечкиот серумски албумин има молекулска маса од 67 500 Da
и е составен од 20 различни аминокиселини. Различните аминокиселини и нивната меѓусебна
положба во молекулот на протеините го дефинираат врзувањето на лековите. Базните групи на
аминокиселините аргинин, хистидин и лизин се одговорни за врзување на киселите лекови,
додека пак киселите групи на аспаргинската, глутаминската киселина и тирозинот, за врзување
на алкалните лекови. Лековите за албуминот се врзуваат, реверзибилно, со помош на van der
Waals- ови сили, водородни и јонски врски, и иако ретко иреверзибилно, со помош на
ковалентни врски. Сепак, ковалентното врзување може да вклучува различни видови врски,
што резултира со создавање на стабилни, но се уште реверзибилни лек-протеин комплекси.
Киселите лекови потентно се врзуваат за албуминот (1-2 молекули на една молекула

албумин), додека пак базните, позитивно наелектризирани лекови, слабо се врзуваат за
албуминот.
Врзувањето на лековите за плазматските протеини најчесто е неспецифично, односно

различни лекови се врзуваат за исти врзивни места на површината на протеинот, иако се смета
дека ова преставува функција од концентрацијата на лекот, при помали концентрации на лекот,
врзувањето е специфично, и обратно, при поголеми, лек-протеин врзувањето е неспецифично.
Лековите со повисок афинитет на врзување, може да го истиснат понискоафинитетниот лек од
неговото место на врзување, по пат на натпревар (компетиција). Бидејќи само неврзаната
фракција на лекот, протеински слободната фракција, е способна за фармакодинамско
делување, интензитетот на терапевтскиот одговор, како и несаканите ефекти и токсичноста, се
зголемуваат со дисоцијација на комплексот лек- протеин, односно со ослободување на лекот од
67

комплексот. Ова е клинички важно само доколку лекот во висок степен е врзан за протеинот,
како што е примерот со варфарин (98%), и доколку лекот има мала терапевтска широчина
(мала разлика помеѓу концентрацијата која предизвикува токсично дејство и терапевтски
ефект), како што е примерот со фенитоин.
Степенот на врзување на лекот за протеинот, кој ин витро се определува со метода на

дијализа, ултрацентрифугирање, ултрафилтрирање, хроматографија, се изразува во проценти.
Овој процент преставува функција од капацитетот на протеинот и концентрацијата на врзаниот
лек во таа средина.
4.2.1. Кинетичко значење на интеракциите лек-протеин
Заради компетитивната природа на овој процес, секое влијание кое ја менува природата
на системот за врзување, го менува и степенот на врзување на лекот за протеинот. Така, со
промена на рН вредноста на плазматската вода може да се промени и јонизациониот карактер
како на лекот, така и на протеинот, што може да има големо влијание на интеракцијата лек-
протеин во која учествуваат јонизирани, односно нејонизирани групи. Промената на рН
средината може да предизвика промена во изомерната форма на албуминот. Така на пример,
врзувањето на варфаринот за BSA се зголемува со зголемување на рН од 6.1 до 6.3, а
врзувањето на дијазепамот се зголемува при покачување на рН од 5.5 на 9.5. Ваквите промени
се делумно резултат на конформациските промени на самите протеини.
Слично, присуството на површински активни материи или липиди во плазмата, како и

промена на температурата, може да го променат степенот на врзување. При ниски
температури, афинитетот на лекот за врзување на протеинот е поголем, во однос на повисоки
температури, што исто така се должи на конформациските промени на самите протеини.
Врзувањето на лекот за протеинот е со ограничен капацитет, односно постои

сатурација на протеинот со лекот. Дополнително, одредени состојби на болест како
хипералбуминемија и хипоалбуминемија, го менуваат, намалуваат или зголемуваат врзувањето
на лекот за протеинот. Секоја промена на врзувањето на лекот за протеинот, влијае на
распределбата на лекот, а со тоа и на вкупниот фармаколошки ефект на тој лек.
Лекот врзан за протеинот е фармаколошки неактивен, не минува низ мембраните,

крвно мозочната бариера, плацентата, гломерулот или реналните тубули и не е достапен за
метаболизирање. Заради ова излачувањето на лекот е намалено, и заради тоа и заради
забавениот метаболизам, полувремето на елиминација може да биде зголемено. Меѓутоа,
заради лабилната врска помеѓу протеинот и лекот и реверзибилната реакција на врзување,
врзаниот лек е само депониран и во постојана рамнотежа со неврзаниот (причина зошто
одредени лекови, кои значајно се врзуваат за протеините, налагаат поголема иницијална доза, и
последователна пониска доза на одржување).
Врзувањето на лекот за протеинот, нема главно влијание на излачување на лекот. Тоа

може да ја зголеми или намали елиминацијата, но не и значајно да влијае на вкупната брзина
на елиминација на лекот. Заради тоа, лек-протеин интеракциите и комплексите преставуваат
значаен транспортен систем на лекот од местото на примена, односно ресорбција, до местотот
на делување, депонирање или елиминација.
68

4.2.2. Термодинамски фактори кои влијаат на лек рецептор интеракциите
Други фактори кои влијаат на степенот на врзување се и термодинамските фактори,

енталпија, ентропија и слободна енергија. Степенто на врзување може е експериментално да се
одреди при што треба да се земат предвид водородните врски, van der Waals-овите сили,
хидрофобните и електростатските сили. Кога енталпијата (Н) и ентропијата (S) се позитивни,
интеракциите кои учествуваат во лек-протеин врзувањето се хидрофобни. Ако Н и S се
негативни, тоа значи дека врзувањето настанува со посредство на van der Waals- ови сили и
водородни врски. За да се воспостават електронски интеракции, енталпијата трееба да биде
негативна или приближна на нула. Доколку промената на слободната енергија е негативна,
врзувањето е секогаш спонтано.
4.3. Експериментално определување na афинитетот na хлорамфеникол за

говедски серум албумин (BSA)
4.3.1. Princip
Interakcijata na lekovitata supstanca (S) so plazmatskiot protein (R), kako

ramnoteìna reakcija, podleì na zakonot za kineti~ko deluvawe na masa i moè da se
pretstavi kako:
K+1
(P) + (S) (PS)
K1
kade K+1 i K1 se mikrokonstanti na asocijacija i disocijacija na

kompleksot, soodvetno. Ovie procesi imaat poluvreme od nekolku milisekundi,
{to zna~i deka razmenata pome|u slobodniot i vrzaniot lek e mnogu brza. Za
opredeluvawe na vrzuvaweto na hloramfenikol za proteinite se koristi
metodot na ramnote`na dijaliza.
Afinitetot pome|u lekot i mestoto na vrzuvawe na proteinot se
izrazuva kako odnos pome|u koncentracijata na vrzaniot lek i proizvodot od
nevrzaniot lek i proteinot i se definira preku konstantata na asocijacija -Ka:
(PS) K+1
Ka (L/mol) = --------------- = -----
(P)(S) K1
69

êsto pati, afinitetot se izrazuva preku konstanta na disocijacija (Kd), koja e

obratno proporcionalna od konstantata na asocijacija (1/Ka).
K1 1
Kd (mol/L) = ----- = ------
K+1 Ka
Kd e koncentracijata na ligandot (lekot) koja zavzema 50% od

raspolo`livite receptori.
Vrednostite na konstantata na asocijacija i brojot na vrzivni mesta

moàt da se odredat so razli~ni grafi~ki metodi, dokolku e poznata
koncentracijata na proteinot.
molekuli na vrzana supstancija
r = ----------------------------------------------------------
vkupen broj molekuli na proteinot
(PS)
r = ---------------------------
(PS) + (P)
Доколку лекот се врзува за едно рецепторно место, тогаш:
Ka (P)(S) Ka(S) nKa(S)

r = -------------------------------; r = -----------------------------; r = ----------------------
Ka (P)(S) + (P) 1 + Ka(S) 1 + Ka(S)
Доколку лекот се врзува за повеќе од едно рецепторно место, тогаш:
n1Kа1(S) n2Kа2(S)
r = -----------------------+ --------------------------+ --------
1 + Kа1(S) 1 + Kа2(S)
kade:
(P) – koncentracija na proteinot;
(S) – koncentracija na aktivnata supstancija;
(PS) – koncentracija na vrzanoto soedinenie za proteinot;
Ka – konstanta na asocijacija na soedinenieto za proteinot vo sostojba na
ramnoteà;
70

r – frakcija na vrzanoto soedinenie;

n - broj na aktivni vrzivni mesta
Konstantite na asocijacija, К а 1 i К а 2, kako i brojot na vrzuva~ki mesta n1 i n2

se opredeluvaat grafi~ki, so koristewe na dvojniot recipro~en grafik i modelot na
Scatchard.
Dvoen recipro~en grafik:
1 1 1
--- = ------------- + -------
r nKa(S) n
Prikazot na 1/r nasproti 1/(S) dava prava ~ij agol so h-oskata e 1/nKa, a
interseptot 1/n.
Scatchard grafik:
r
------ = nKa – rKa
(S)
Prikazot na r/(S) nasproti r dava prava ~ij agol so h-oskata e –Ka, a

interseptot nKa.
4.3. Prakti~en del
- ~isti i suvi epruveti

- semipermeabilni membrani
- pipeti
- ~a{ki
- vodena bawa so me{alka na konstantna temperatura
- kiveti
- spektrofotometar
4.3.2 Potrebni reagensi
- BSA
- rastvor na hloramfenikol so osnovna koncentracija 14 x 10-6M so
pH = 6.4; 7.4 i 8.4
- puferi so pH = 6.4; 7.4; 8.4
71

4.3.3 Eksperimentalno odreduvawe na vrzuvaweto na хлорамфеникол za

говедски серум албумин (BSA)
1. Работните раствори на хлорамфеникол се подготвуваат од основен раствор на

хлорамфеникол со концентрација 14 x 10-6М.
2. Vo 9 suvi i ~isti epruveti se prigotvuvaa rabotni rastvori na

hloramfenikol so koncentracii:
1. 0,5 x 10-6M;
2. 1 x 10-6M;
3. 2 x 10-6M;
4. 4 x 10-6M;
5. 6 x 10-6M;
6. 8 x 10-6M;
7. 10 x 10-6M;
8. 12 x 10-6M;
9. 14 x 10-6M;
3. Od dobienite rabotni rastvori se odmeruvaat po 10 ml od sekoj i se

prenesuvaat vo 9 novi epruveti i vo sekoja od ovie epruveti se dodava 0.012g BSA, so
{to se postignuva konstantna koncentracija na BSA koja iznesuva 2 x 10-5M. Probite,
sekoja poodelno se vorteksiraat vo period od 5 min.
4.. 2 ml od sekoja epruveta se stavaat vo prethodno podgotveni semipermeabilni

membrani.
5. Membranite se potopuvaat vo flakoni koi sodràt 30 ml pufer so soodvetnа

pH.
6. Vaka prigotvenite membrani se postavuvaat na vodena bawa so me{alka eden
72

4.3.3.1 Presmetki za подготовка na rabotnite rastvori
73

4.3.3.2 Определување на слободната фракција на хлорамфеникол во пуферски раствор
Концентрација на раствори
Работни раствори Абсорбанца
rastvor 1
rastvor 2
rastvor 3
rastvor 4
rastvor 5
rastvor 6
rastvor 7
rastvor 8
rastvor 9
Стандардни раствори Абсорбанца
pH-6.4
pH-7.4
pH-8.4
Спектрофотометриско определување на концентрацијата на слободната (неврзана)

лековита супстанција според законот на Beer!
74

4.3.3.3 Opredeluvawe na frakcija na vrzaniot хлорамфеникол vо puferski
rastvor
Вкупна Слободна Слободна

Врзана
супстанција супстанција супстанција r 1/r 1/C
супстанција
(М) (С) (С)x2
р-ор 1
р-ор 2
р-ор 3
р-ор 4
р-ор 5
р-ор 6
р-ор 7
р-ор 8
р-ор 9
Фракцијата на врзаното соединение (r) се пресметува на следниот начин:
{Вкупна супстанција (М) – [Слободна супстанција (C) x2]}
r = ------------------------------------------------------------------------------
Концентрација на BSA
75

4.4 Zaklu~ok i komentar
Zada~i:
1. Da se odredi konstantata na asocijacija na lekovitata supstancija za
albuminot, dokolku pravata koja ja opi{uva zavisnosta na recipro~nite
vrednosti na vrzanata frakcija i slobodnata frakcija na lekovita
supstancija se opi{uva so slednava ravenka y = 1.4601x + 1.00.
2. Da se odredi brojot na vrzivni mesta za albuminot na lekovitata

supstancija, dokolku pravata koja ja opi{uva zavisnosta na slobodnata
frakcija od vrzanata frakcija na lekovita supstancija kaj Scatchard
grafikot se opi{uva so slednata ravenka: y = - 0.8706x + 0.6909.
76

Решение на задачи:
77

Име и Презиме _______________________________

Дата: ___________
Досие бр: __________________ Група
Работно место _____________
ВЕЖБА БР 5 и 6
Современ пристап во откривањето и развојот на нови лекови

– софтверска апликација за молекуларно моделирање,
откривање, визуелизација и оптимизација на водечки
соединенија
Современиот пристап во процесот на откривање на нови лекови е детерминиран

од брзиот напредок на технологијата, брзиот развој на молекуларната биологија,
генетика, геномика и протеомика со чија помош се открива молекулрната основа на
болеста. Тоа е причината зошто откривањето и развојот на новите лекови е ориентиран
кон ―болеста и нејзиниот причинител‖. Пристапот во дизајнирањето на новите лекови
и техниките кои при тоа се применуваат зависат од познавањата кои се достапни за
дадената болест. Според тоа може да биде базиран на лиганд (―ligand based drug
design‖), доколку е познат молекул со значајни биолошки карактеристики кој покажува
сакани дејства во третмaнот на болеста, или базиран на структурата на целта (―target‖)
доколку истата е позната (―structure based drug design‖). Причинителот на болеста е
најчесто некој патофизиолошки релевантна молекулска цел, ензим, јонски канал или
транспортер.
Дизајнирање на лекови базирано на лиганд Дизајнирање на лекови базирано на

структурата
Ligand based drug design (LBDD) Structure based drug design (SBDD)
без позната протеинска 3D структура, позната протеинска 3D структура,

без познат лиганд без познат лиганд
комбинаторна хемија, просејување со de novo дизајнирање
висок ефект (―high-throughput screening, HTS‖) (флексибилност на протеините)
виртуелен скрининг
без позната протеинска 3D структура, позната протеинска 3D структура,
со познат лиганд без познат лиганд
фармакофори структурно базирано дизајнирање
78

3D сличности 3D QSAR
Запомнете!!!
Критериуми кои треба да ги задоволува една супстанца за да биде лек
- Висок афинитет и селективност

- Можност за синтеза
- Орална биорасположливост
- ―Правилото на пет‖ на Lipinski: Mr<500; logP<5; водородни донори <5;
Водородни акцептори >10
- Добри фармакокинетски карактеристики
- Метаболизам (пр. first pass)
- Патишта на елиминација
- Отсуство на несакани елементи и токсичност
Успешен критериум во откривањето и испитувањето на нови лекови
Добивање на лек кој ќе биде прв или единстевен на пазарот за одредени

индикации како и лек со подобрени фармакокинетски или фармакодинамски
карактеристики, а не лек кој ќе биде сличен со веќе постоечките лекови на пазарот!!!
При откривањето на причинителот на болеста се врши детерминирање на ДНК

секвенцата, неговата протеинска структура, функција и механизам на дејство. Кога е
79

позната 3D структурата на рецепторот се применува дизајнирањето на лекови базирано

на структурата. Кристалографијата со X-зраци заедно со НМР ги откриваат
есенцијалните структурни карактеристики на активното место, кое потоа се користи
како извор на нови идеи за тоа како да се креира нов прототип на молекулот. Предност
на дизајнот базиран на рецептор е што овозможува визуелна конструкција на директен
дизајн на нови прототипови, како и детална 3D карактеризација на активното место.
Во случаи во кои рецепторот не е познат најчесто се пристапува кон

дизајнирање базирано на лиганд т.е. дизајнирање базирано на фармакофорот. Овој
дизајн се базира на стереохемиските и физичко-хемиските својства на познатите
лекови. Анализата на активните и неактивните молекули дава сознанија за тоа како
структурните варијации можат да ги променат биолошките својства на лекот и
овозможуваат создавање на хипотеза за интеракциите на лекот со рецепторот. Оваа
стратегија се состои од позиционирање на 3D релативната локација на структурните
елементи препознаени како неопходни во структурата на активниот молекул и со тоа
како неопходни во структурата на новите хемиски ентитети (молекуларна мимикрија).
Процесот на дизајнирање на лековите продолжува со идентификација на

неколку т.н hits (погодоци) кои потоа ќе доведат до наоѓање на едно или повеќе (leads)
водечки соединенија.Овие процеси вклучуваат примена на современи техники за брз и
масовен скрининг меѓу кои спаѓаат комбинаторната хемија, и биохемиски методи за
определување на афинитетот кон целта на веќе постоечките соединенија со сакани
биолошки својства кои се групирани во соодветни библиотеки. Сите овие техники
даваат можност за успешна идентификација, но во голема мерка успехот се темели на
интуиција, знаење и истражувачко искуство.
Следната фаза во развојот на лековите е оптимизација на водечкото соединение.

Пристапот во оптимизцијата може да опфаќа молекуларното моделирање и
дизајнирање на нови лиганди, подобрување на нивната селективност,
биорасположливост и фармакокинетика. Хемиската сличност и хемиската
модификација се основните постулати во процесот на дизајнирање на нови
оптимизирани аналози на активните водечки соединенија. Хемиската модификација
може да го подобри препознавањето на лекот-кандидат, односно на фармакофорот од
страна на рецепторите, да го оптимизира афинитетот на лекот-кандидат кон
рецепторите, да обезбеди негова дистрибуција до рецепторите, да ја оптимизира
стабилноста за време на неговата метаболичка разградба и со тоа да обезбеди добивање
на селективен, специфичен, ефикасен и безбеден лек. Процесот на откривање на лек е
цикличен, а фазата на оптимизација и модификација на соединението која води до
добивање на најдобриот кандидат за лек е повторлива.
Финалната фаза, фазата на развој на лековите, опфаќа избор на лекот кој ќе

влезе во претклиничките и клиничките испитувања. Целта на овие истражувања е да се
докаже ефикасноста на лекот, неговата безбедност, соодветниот квалитет и предност
над фармакотераписки сличните лекови. Во оваа фаза се оптимизира и методот на
80

добивање на лекот-кандидат, како и на соодветната лековита форма која внесена по

определен пат ќе создаде основни предуслови за дистрибуција на лекот до целното
место.
1.2 Практичен дел
Основната цел на практичниот дел на оваа вежба е студентите да се запознаат

со една од водечките компании во светот Schrödinger која е одговорна за иновациите и
развојот на компјутерското дизајнирање на лекови. Компанијата Schrödinger развива
различни софтверски апликации со кои се овозможува:
 Молекуларно моделирање и симулации на мали молекули

o Конформациско генерирање и групирање
o Генерирање на особини и филтрирање
o Генерирање на1D/2D во 3D структури
o Молекуларна механика
o Молекуларна динамика
o Квантна механика
 Молекуларно моделирање и симулации на макромолекули
o Структурно-биологија-кристалографија
o Протеинско моделирање и биоинформатика
o Молекуларна механика
o Молекуларна динамика
o Monte Carlo симулации
o QM/MM
 Окривање на водечки соединенија
o Cheminformatics
o Лиганд базирано откривање
o Фрагмент базирано откривање
o Структурно базирано откривање
 Оптимизирање на водечки соединенија
o Cheminformatics
o 2D/3D QSAR
o Комбинаторна хемија
o Фрагмент базиран дизајн
o Лиганд-базиран дизајн
o Структурно-базиран дизајн
o Предвидување на апсолутен и релативен афинитет за врзување
 Визуелизација и автоматизација
o Молекуларна визуелизациија
o Употреба на апликациски интерфејси
o Скриптирање, методи за развој и употреба
o Апликации во медицинска хемија
81

Со примена на водич прилагоден за студенти тие се запознаваат со можностите

на целиот софтверски ситем и практично ги работат следниве содржини:
1. Canvas: Сеопфатна компјутерска средина за cheminformatic (хемиска

информатика)
Техниките на Cheminformatic (хемиската информатика) даваат можност за

пребарување на сличност врз основа на отисок и постструктурно совпаѓање со што
може да изврши скенирање на милиони соединенија во една секунда; со групирање и
селекција на различните соединенија може да се анализира и да се подобри содржината
на библиотеките на виртуелни соединенија; анализите на основните компоненти и ја
намалуваат комплексноста, и сложените информации се претставуваат со мал број на
дескриптори; со оваа техниката на учење се обезбедуваат квантитативни модели кои ја
дефиниратт структура-активност врската и овозможуваат определување на активноста
на новите соединенија.
2. CombiGlide: Комбинаторна технологија и врзување со активното месо кое

води до откривање на водечки соединенија и нивна оптимизација
CombiGlide врши комбинирање на прецизно вреднување на врската лиганд-

рецептор, дава точни алгоритми за комбинаторно совпаѓање (―docking‖) и ефикасни
техники во определувањето на врзувачката способност за активното место при
дизајнирање на фокусирани библиотеки на потенцијални водечки соединенија и при
идентификувањето на нови карактериситики. Оваа техника значително помага при
откривањето на водечки соединенија и нивна оптимизација.
Виртуелниот хемиски простор за кој се заинтересирани хемичарите е премногу
голем за да биде синтетизиран и скениран, дури и со примена на модерни методи на
комбинаторна хемија и роботична синтеза. Затоа постои голема потреба за ефикасен и
доверлив метод за рационална селекција на оптимален број на соединенија од
библиотеките за нивна синтеза. Исто така при определувањето на ветувачко водечко
соединение мора да се изврши испитување и определување на различните
карактеристики на активното место како и супституентите на неговите странични
вериги за определување на релативниот врзувачки афинитет кон постоечката цел.
Прецизноста на вреднувањето на лиганд-рецептор врзувањето со рационалено и
ефикасен комбинаторен ―docking‖ може да ја забрзаат оптимизацијата на водечкото
соединение и може да помогнат во дизајнирањето на оптимална и фокусирана
библиотека на соединенија кои се вредни за синтеза.
3. ConfGen: Прецизно и ефикасно биоактивно конформациско пребарување

при компјутерски потпомогнато дизајнирање на лекови
Генерирањето на конформери е корисно од многу аспекти како за

молекуларното моделирање така и за откривањето на нови лекови. Релативните
енергии на конформациите на малите молекули играат критична улога во
определувањето на обликот, функцијата и активноста. Дополнително, способноста за
82

генерирање на биоактивен конформер е витален чекор пред започнување со

компјутерски потпомогнато дизајнирање на лекови.
Бидејќи е невозможно да се определи флексибилниот биоактивен конформер на
лигандот со апсолутна точност, внимателно детерминираните критериуми за
пребарување дозволуваат алгоритамски да се отфрлат конформерите кои се со висока
енергија или се неактивни. Така се креира ефикасен сет на конформери кој сепак
поседува разумно предвидување на биоактивната геометрија.
4. Core Hopping: Комплетно истражување на лиганд- и рецептор-базираните

карактеристики во процесот на оптимизација на водечкото соединение
Соединенијата може да не ги дадат очекуваните резулатати во развојот на лекот,

или уште полошо, комерцијално достапните лекови може да бидат повлечени како
резултат на токсичноста која не била забележана во развојниот процес, потоа поради
селективноста, потентноста и други несакани карактеристики. Core hopping
овозможува брз скрининг на новите врзувачки мееста за да помогне во надминувањето
на несаканите карактеристики со генерирање на водечки соединенија со подобрени
карактеристики на врзувачкото место при што се зачувуваат клучните интеракции со
супституентите од лигандот. Оваа техника може да помогне во генерирањето на нови
аналози на познат лек.
5. Desmond: Симулации на молекуларната динамка за биомолекуларните

системи со високи перформанси
Комбинирање на брзината и прецизноста со примена на Desmond овозможува

долгорочни симулации на молекуларна динамика, со што овозможува корисникот да ги
испита промените кои се од огромно билошко и фармацевтско значење.
Биолошките системи по својата природа се динамични; анализирањето на
нивната подвижност на молекуларно и атомско ниво е есенцијално за разбирањето на
клучните биолошки феномени. Неодамна, статичките структурно базирани пристапи,
како ―docking‖ и виртуелен скрининг, дале огромен придонес во напредното откривање
на лекови. Молекуларната динамика, особено кога се комбинира со овие компјутерски
алатки, ќе помогне во определувањето и решавањето на многу проблеми поврзани со
откривањето на лековите за кои не смее да се игнорира динамичната природа на
протеините, како и механизмите на високо мобилните мембрански протеини и кај
лиганд-индуцираните конформациски промени на активните места.
6. Epik: Брзо и робустно предвидување на pKa
Epikе програмот е избор за прецизно определување на лиганд-протонизирачките

места во биолошки услови и тој врши комбинирање на докажаните доверливи
Hammett-ови и Taft-ови методи со моќни тавтомеризирачки алатки.
Правилниот третман на протонизирачките места е есенцијален при наоѓањето
на водечко соединение. pKaвредностите на различни функционални групи играат
критична улога во детерминиарањето на нивната биорасположливост и фармаколошки
профил, бидејќи софтверот за виртуелен скрининг се заснова на точно протонизирани
стуктури со цел да се забележат и сепарираат интеракциите кои се клучни за
врзувањео на лигандот.
83

7. Glide: Целосно решение за “docking” на лигандот со рецепторот
Glide нуди цел можност за брз и прецизен виртуелен скрининг на милиони

соединенија со екстремно прецизно предвидување на начинот на врзување.
Широко распространетата употреба на комбинаторната хемија и high-throughput
screening (HTS) во фармацевтската и биотехнолошката индустрија значи дека голем
број на соединенија може да бидат рутински испитани за определување на ниваната
биоолошка активност. Сепак, скринингот на големи хемиски библотеки останува скап
и долготраен процес, со значителен број на лажно позитивни и лажно негативни
резултати.
Компјутерските методи денес може да ја зголемат фракцијата на соодветните
кандидати за водечки соедиенија од хемиските дата бази, со што формираат потенцијал
за значително зголемување на продуктивноста и намалување на трошоците при
развојот на лековите. Со се поголемиот број на проекти за откривање на лекови и
достапноста на кристалните структури на нивните таргети со висока резолуција,
лиганд-рецептор докингот кој е со високи перформаси е јасна компјутерска стратегија
од избор при структурно-базираното дијанирање на лековите.
8. Induced Fit: Нов метод за брзо и прецизно предвидување на лиганд

индуцираните конформациски промени на акивното место на рецепторот
Со обединување на моќта на предвидливост на Prime заедно со способноста за

―docking‖ и вреднување на Glide, Induced Fit е способен да изврши предвидување на
геометријата на активното место со значителен успех.
Геометријата на активното место на протеинскиот комплекс значително зависи
од конформациските промени индуцирани при врзувањето со лигандот. Сепак со
определувањето на кристалната структура на протеин-лиганд комплексот бара многу
време, и често е тежок или невозможен. Протоколот на Schrödinger за Induced Fit (IFD)
ги решава овие проблеми со примена на Glide и Prime и овозможува определување на
можните начини на врзување и конформациските промени кои настануваат на
активното место на рецепторот. Оваа уникатна процедура овозможува хемичарите брзо
да ја предвидат геометријата на активното место со минимален трошок.
Протоколот за Induced Fit започнува со докинг на активниот лиганд со Glide. Со
цел да се генерира диверзитет на поставеноста на лигандите, процедурата користи
редуцирани van der Waals-ови радиуси и зголемен пресек на Coulomb-vdW радуси и
може времено да ги отстрани високо флексибилните странични вериги за време на
―docking‖. За секоја позиција се користи Prime за да се присособи лигандот на
реорганизираните странични вериги кои се блиску поставени. Енергиите на овие
резидуи и лигандот потоа се минимизираат. На крај секој лиганд повторно е подложен
на ―docking‖ во неговата коренспондирачка протеинска структура со ниска енергија и
резултирачките комплекси потоа се рангираат според GlideScore. Прецизноста е
осигурана од супериорното вреднување со Glide и со конформациските поправки од
страна на Prime.
84

9. Jaguar: Брз ab initio пакет за електронска структура
Jaguar ab initio пакет за симулации и на гасна и на течна фаза со високи

перформанси, со значителен придонес во испитувањата на системите кои содржат
метал.
Значајни прашања во истражувачкиот процес може да останат без одговор
доколку отсуствува детално испитување на молекулската електронска структура.
Молекуларно механичките модели се лимитирани од нивната параметризација. На
пример, конвенционалните електронски полиња или не успеваат да ги третираат
системите кои содржат метал, или се појавуваат големи грешки во пресметаните
резултати. Квантната механика на високо ниво е се уште најпрецизниот и
најдиректниот начин да се проучат овие предизвикувачки системи, и покрај
зголемените трошоци за пресметување.
10. Liaison: Ефикасно и прецизно предвидување на слободната енергија на

врзувањето на лигандот со рецептор
Liaison применува линеарна апроксимација на прецизно пресметување на

врзувачките афинитети за серија на лиганди со слични начини на врзување, со што
претставува моќна алака за оптимизација на водечкото соединение.
Прецизно рангирање на врзувачките афинитети е неопходно при
оптимизацијата на водечкото соединение при фармацевтското истражување со цел да
се разие потентен и ефикасен кандидат за лек. За остварување на оваа цел биле
развиени неколку пристапи, рангирање од функции на брзо QSAR-базирано
вреднување до компјутерско пресметување на промената на интензивната слободна
енергија (―free energy perturbation‖ (FEP). Но, ниту ден од нив не ги задоволил
потребите на истражувачите. QSAR-пристапот, иако брз, вклучува многу
апроксимации и дава големи грешки при предвидувањето на врзувачката енергија. FEP
пристапите се попрецизни, но не може да се применат кога структурите на лигандите
значително се разликуваат.
Апроксимацијата на линеарните интеракции (―Linear interaction approximation‖,
LIA) е начин за комбинирање на пресметките од мoлекуларната механика со
експерименталните податоци за да се изгради функција на вредносен систем кој се
користи за евалуација на слободните енергии на лиганд-протеин врзувањето.
11. Ligand & Structure-Based Descriptors: Практично и ефикасно решение за

рангирање на соединенијата и предвидување на врзувачките афинитети
Рангирачките предвидувања на лиганд-врзувачките афинитети може да бидат

незначајни за откривањето на лековите, но создавањето на предвидувачки и доверлив
модел може да биде долготраен процес без гарантиран успех. Модулот на Schrödinger
за Ligand & Structure-Based Descriptors (LSBD) го поедноставува овој процес со
интегрирање на повеќе компјутерски апликации под еден заеднички интерфејс. Со оваа
мжност за пресметување на голем број на молекуларни дескриптори, LSBD
овозможува хемичарите да ја подобрат прецизноста на нивните предвидувачки модели
во однос на ефикасноста како и други карактеристики.
Само се едно испитување, истражувачите може да процесираат сет на лиганди
со примена на еден или повеќе од петте теоретски модели обединети со LSBD. Prime
MM-GBSA и MacroModel eMBrAcE може да ги рангираат лигандите, LiaisonScore
85

може да се користи за да се претпостави апсолутниот афинитет за врзување на

лигандот, додека дескрипторите може да бидат генерирани за предвидување на
линеарни интеракции (LIA) или за екстендиран линеарен одговор (―extended linear
response‖, ELR). Со помош на статистичкиот модул Strike, на Schrödinger,
дескрипторите брзо се корелираат со експерименталните вредности за да се предвиди
апсолутниот врзувачки афинитет.
Со примена на интерфејсот на LSBD прикажан погоре, истражувачите може лесно

да ги постават пресметките за да генерираат дескриптори со примена на следниве
програни:
MacroModel: Лиганд врзувачките афинитети може да бидат рангирани со

помош на MacroModeleMBrAсЕ пресметките.
Prime: LSBD обезбедува интуитивен интерфејс за спроведување на Prime MM-
GBSA пресметките.
Liaison: Дескрипторите за линеарни интеракции Linear interaction (LIA) може
да бидат пресметани со Liaison. Дополнително, емпириските вреднувачки
функции на LiaisonScore даваат предвидување на лиганд врзувачкиот
афинитет.
QikProp: Со способноста да предвиди над 35 фармацевтски релевантни ADME
карактеристики, QikProp може да се примени заедно со другите дескриптори
од LSBD за да се генерираат модели на екстендиран линеарен одговор extended
linear response (ELR) кои ги предвидуваат лиганд врзувачкките енергии.
12. LigPrep: Повеќенаменско генерирање на прецизни 3D молекуларни модели
LigPrep оди далеку понатаму од едноставна конверзија на 2D во 3D структури

вклучувајќи ги тука тавтомерните, стереохемиските и јонизираните верзии, како и
минимизирањето на енергијата и флексибилните филтри при генерирањето на целосно
обработени општи компјутерски анализи.
Компјутерските методи станаа неразделлив дел од напорите за идентификација на
водечките соединенија. Скоро сите методи бараат прецизни 3D молекуларни модели
како почетна точка при истражувањата. Затоа ефикасната и прецизната конверзија на
2D во 3D модели е клучен прекурсор за спроведување на компјутерските анализи.
86

13. MacroModel: Повеќенаменски, целосен програм за молекуларно

моделирање
MacroModel врши комбинирање на водечките електронски полиња (―force

fields‖), прецизни и ефикасни модели за решавање и напредни конформациски методи
за истражување со цел да обезбеди најкомплетен пакет за молекуларно моделирање за
широк опсег на истражувања.
Енергијата и карактеристиките на хемсикиот систем зависи од точната
тродимензионална структура на молекулата. Соодветни варијации на функционалните
групи може да резултираат со драматични разлики во однесувањето. Методите на
електронскки полиња (―force fields‖) ја претставуваат потенцијалната енергија на
молекулите како едноставна функција на растојанијата и аглите меѓу атомите и ова се
докажало како ефикасен пристап за обезбедување на ефикасни и точни пристапи при
обезбедувањето на прецизни релативни енергии на хемиските системи. Ефикасноста на
пресметките базирани на електронски полиња (―force fields‖) овозможува истражување
на големи делови на конформацискиот простор, со определување на деталната
поврзаност меѓу структурата и енергијата.
Молекуларното моделирање базирано на полиња на електрони (―force fields‖)
рутински се применува во испитувањето на молекуларните конформации,
молекуларните движења и интермолекуларните интеракции, како оние на лиганд-
рецептор комплексот.
14. Maestro: Моќна и сенаменска средина за молекуларно моделирање
Maestro е унфициран интерфејс за целиот софтвер на Schrödinger. Импресивните

способности за рендерирање, моќната селекција на алатките за анализа и дизајнот кој
овозможува лесна употреба го прават Maestro сенаменска средина за моделирање за
истражувачите.
Schrödinger развива извонреден софтвер за хемиски симулации за употреба во
фармацевтската, биотехнолошката наука и науката за материјалите. Се од неговото
основање во1990 година, Schrödinger добива репутација на водечка компанија во
научниот развој. Продуктите на Schrödinger офаќаат опсег од програми за молекуларно
моделирање се до комплетна целина на софтвер за дизајнирање на лекови вклучувајќи
ги тука и лиганд и структурно базираните методи.
Maestro е основата на компјутерската технологија на Schrödinger. Многу повеќе
од програм за визуелизација, Maestro исто така им помага на истражувачите во
организирањето и анализата на податоците. Интуитивниот интерфејс на Maestro ги
прави пресметките едноставни за спроведување. Пресметаните резултати автоматски
се инкорпорираат во проекти кои се користата во понатамошните испитувања.
Огромната моќност на Maestro за визуелизирачки опции прави возможно да се откријат
молекуларните карактеристики како и деталните интермолекуларни интеракции.
Maestro е моќна и повеќенаменска средина за молекуларно моделирање, и е дел од
најразвиената наука во компјутерската хемија.
15. Maestro Elements: Рационализирана верзија на Maestro интерфејсот со

интегрирани компјутерски анализи дизајнирани за медицинските
хемичари
87

Моделаторите во биофармацевтската индустрија го користат Maestro како

значајна средина за моделирање и примена на софтверот на Schrödinger за дизајнирање
на лекови, додека хемичарите вообичено ги гледаат нивните пресметани резултати во
омилениот графички интерфејс. Овој процес создава непотребна неефикасност и може
да бидат изгубени значајни информации. Понатаму, ги спречува хемичарите во
самостојното истаржување на дополнителни компјутерски анализи.
Maestro Elements биле развиени за да обезбедат соодветна комуникација меѓу
моделаторите и хемичарите. Maestro Elements е целосно компатибилен со Maestro, но
тој е дизајниран за медицинките хемичари за кои е потребно нешто што едноставно
―работи.‖ Интерфејсот ориентиран кон задачи на Maestro Elements го поедноставува
учењето, и им овозможува на хемичарите и биолозите да ги визуелизираат податоците
добиени од моделаторите и да спроведат едноставни ―што ако‖ експерименти за
пресметување на нивната минимална работа која им е потребна. Maestro Elements
работи и на компјутери со Windows.
16. Phase: Програм за лиганд (фрмакофор)-базирано дизајнирање на лекови
Phase е комплетен пакет со алатки за моделирање базирано на фармакофор кое

им овозможува на научниците еднакво ниво на контрола на секој од чекорите. Брз,
прецизен програм со висока способност за конфигурирање, Phase е моќна алатка за
генерирање на hit и откривање на водечко соединение.
Истражувачите продолжуваат со истражувањата за нови цели од терапевтски
интерес, при што трансмембрански и Г-поврзаните рецептори се постојано со растечки
интерес и значење. Сепак, кристалната структура за овие цели може да е нерешлива,
што претставува голем предизвик во рационалното дизајнирање на лековите.
Структурно-базираниот виртуелен скрининг не претставува опција кога не е позната
геометријата на активното место, но од друга страна испитувањето на цела библиотека
на соединенија е неефикасен и скап пристап.
Фармакофорното моделирање дава решение за овој проблем преку
детерминирање на просторната ориентација на хемиските карактеристики кои ја
определуваат активноста на лекот кон рецепторот. Со воспоставување на хемискиот
простор опфатен со активните лиганди, софтверот за фармакофорно моделирање му
дава можност на истражувачот да создаде 3D структура-активност врска, да изврши
скрининг на базата на податоци и да генерира hits без при тоа да ја познава структурата
на рецепторот.
17. Prime: Моќен и иновативен пакет за прецизно предвидување на

протеинската струкура
Prime е целосно интегриран програм за предвидување на структурата на

протеинот. Содржи лесен интерфејс кој го води корисникот од секвенцата па се до
поставеноста на рафинираната структура. Prime исто така дава можност за комплетна
контрола над пресметките за максимизирање на прецизноста на предвидувањата. Prime
е моќна и комплетна алатка за генерирање на прецизни модели на рецептори за
структурно-базирано дизајнирање на лекови.
Рационалното дизајнирање на лекови е докажано како ефикасен и штедлив
пристап во развојот на лекови. Откривањето на водечките соединенија со виртуелен
скрининг и негова отимизација преку детално разбирање на лиганд-рецептор
интеракциите се денес неопходен дел од фармацевтското истражување. Прецизниот
88

модел на рецептор, особено на неговото активно место, е клучна точка во напорите кај
сите структурно-базирани пристапи во дизајнирањето на лековите. Поради
неодамнешната експлозија на сознанија поврзани со геномот кој ја дефинираат
протеинската секвенца, остануваат бројни фамацевтско релевантни цели за кои се уште
не постои прецизен 3D модел.
Предвидувањето на прецизната протеинска структура не само што може да
обезбеди модел каде експерименталната структура е недостапна, туку исто така може
да ги рафинира експерименталните структури добиени до кристалографијата со Х
зраци или НМР, обезбедувајќи на тој начин дури и попрецизна и подетална почетна
позиција за последователни симулаци и компјутерски анализи.
18. PrimeX: Копмактен пакет за прецизни рафинирања на протеинската

кристална структура
PrimeX го користи OPLS-AA полето на електрони заедно со технологија за

рафинирање на протеинската кристална структура во процесот на компјутерско
откривање на лекови.
Две клучни карактеристики на протеинската кристална структура кои може да
имаат влијание врз прецизноста на последователното структурно базирано моделирање
се:
Високоенергетските врски имаат влијание врз пресемтките на компјутерската
хемија, и често се отстрануваат преку примена на минимизирање на енергијата
на кристалната структура; опасноста од оваа процедура е создавање на промени
во структурата кои не се во согласност со резултатите од Х-зрачењето.
Најголемиот број на кристални структури на вообичаена резолуција не ги
вклучуваат водородните атоми во моделот, па истите треба да бидат додадени
после завршувањето на рафинирањето за соодветно спроведување на
пресметките за бројни молекуларно механички пресметки.
PrimeXврши конфигурирање на протеинската геометрија со OPLS-AA (една од
најпрецизните и најрапространетите електронски полиња за проучување на протеин
/лиганд системите) за време на рафинирањето на податоците од зрачењето со X-зраци,
и со додавање на водородни атоми за време на рафинирањето и целосно земање
предвид на истите при сите енергетски пресметки.
Понатаму, како што воведувањето на водородните атоми обезбедува значајни
информации за структурната валидација на резултатите од рафинирањето, PrimeX исто
така поседува подобрено земање предвид на не-врзувачите интеракции за време на
рафинирањето, кои се основа за разбирање на врзувањето на лигандот. Значи, PrimeX
обезбедува комплетна средина која овозможува рафинирање и создава прецизни
структури соодветни за компјутерско моделирање.
19. Protein Preparation Wizard: Лесно употреблива алатка за поправање на

вообичаени структурни проблеми и создавање на доследни протеински
модели со сите атоми
Успешните проект за структурно-базирано моделирање зависат не само од

прецизните софтвери, туку и од прецизноста на почетните структури. Protein
Preparation Wizard на Schrödinger е дизајниран за да им помогне на истражувачите да ја
дизајнираат структурата правилно на самиот почеток на проектот, преку
89

овозможување на структура идеална за употреба со широк вариетет на моделирачки

апликации.
Искусните моделатори знаат дека прецизната почетна структура е
предиспозиција за успешно компјутерско дизајнирање на лекови. За жал дури и кога се
работи со кристалографска структура добиена со Х-зраци со висока резолуција,
истражувачите може да потрошат многу време и напор за поправање на вообичаените
проблеми, како недостаток на водородни атоми и резидуи со несоодветна поставеност.
The Protein Preparation Wizard ги соединува, автоматизира и интегрира, најчесто
употребуваните алатки и техники за подготовка на структури, без многу мака за
истражувачот. За време на приготвувањето, корисникот може да одбере дали да
употреби или не некоја операција, и бидејќи сите меѓу структури се интегрирани во
табелата на проектот, нема потреба од користење на други апликации.
Повеќе од корисна алатка за мали структурни корекции, Protein Preparation
Wizard е робустно решение за осигурување на потребна почетна позиција при
започнување со проекти на структурно-базирано дизајнирање на лекови, со што
станува атрактивна алатка за секој хемичар чија работа се заснова токму на
прецизноста на протеинските модели.
Со примената на Protein Preparation Wizard на Schrödinger, истражувачите може
да ја конвертираат суровата PDB структура во целосни-атоми, целосно подготвени
проетински модели за неколку минути, со што исто така се осигурува прецизноста и
едноставноста на моделирачките симулации.
The Protein Preparation Wizard ја овозможуваа оваа зголемена ефикасност во

подготовката на структурата преку постоење на алатки кои овозможуваат:
Автоматско импортирање на цели PDB фајлови — или било која верига од PDB фајлот
— од локалната база на податоци или од PDB website-от
Автоматско додавање на водородните атоми кои недостасуваат
Корекција на состојбите на јонизација на металите за да се осигура соодветен полнеж и
третман со електронски полиња
Набројување на поставеноста на врските во HET групи
Отстранување на ко-кристализираните водени молекули по желба на корисникот
Обележување на резидуи со отсуство на некои атоми или поголеми групи
Претходна подготовка на структурите за Prime, програма на Schrödinger за
предвидување на протеинска структура
Лесна навигација меѓу различни резидуи, HET групи и вериги со примена на
интуитивни графички алатки
Брзо и лесно предвидување на најверојатните места на лигандот за протонизирање како
и на енергетските проблеми поврзани со алтернативните протонизирани места
Определување на оптимални протонизирани места за хистидинските резидуи
Корекција на потенцијално преносливите тешки атоми кај аргининот, глутаминот и
хистидинот
Оптимизирање на протеинските водородни врски со системски и групирачки пристап,
кој значително го скратува времето на подготовка
Спроведување на контролирана минимизација која овозможува водородните атоми да
бидат слободно минимизирани, додека се обезбедува доволно движење на тешките
атоми за да се релаксираат врските, аглите и меѓусебните судири
90

20. PyMOL: Систем за молекуларна визуелизација
PyMOL e апликација за интерактивна визуелизација и презентација на

средината каде се одвива молекуларното моделирање кој се користи во светот.
21. QikProp: Брзи ADME предвидувања на кандидатите за лекови
QikProp врши ефикасна евалуација на фармацевтски релевантните

карактеристики за над пола милион соединенија на час, со што претставува неопходна
алатка за генерирање на водечки соединенија и нивна оптимизиација.
Скоро 40% од кандидатите за лекови не ги поминуваат клиничките студии како
резултат на слабите ADME (апсорпција, дистрибуција, метаболизам и елиминација)
карактеристики. Овие неуспеси во последните фази од развојот на лекот водат до
огромни трошоци за развојот на новите лекови. Способноста да се детектираат
проблематичните кандидати во раната фаза значително го намалува губењето на време
и средства и го поедноставува целосниот развоен процес на лекот.
Прецизното предвидување на ADME карактеристиките пред спроведување на
скапи експериментални процедури како HTS, може да го оневозможи непотребното
тестирање на соединенија кои се несоодветни; ADME предвидувањата исто така може
да бидат употребени за фокусирање на напорите за оптимизација на водечките
соединенија со цел да се подобрат саканите карактеристики на даденото соединение.
На крај, воведувањето на ADME предвидувањата како дел од развојниот процес може
да генерира водечко соединение кое е поверојатно дека ќе ги поседува
задоволителните ADME перформанси за време на клиничките студии.
22. (Квантно механички-поларизиран “docking” на лиганд) QM-Polarized

Ligand Docking: Ново решение во процесот на истражување кое ја
комбинира моќта на Glide со прецизноста наQSite
Прв таков тип на алгоритам, QM-Polarized Ligand Docking применува ab initio

методологија за да ги пресмета промените во полнежот на лигандите во средината на
протеините. Иновативниот практичен, QM-Polarized Ligand Docking нуди значително
поголема прецизност над чистите MM (молекуларна механика) ―docking‖ алгоритми.
Прецизниот третман на електростатските промени се круцијални за успехот на
секој ―docking‖ алгоритам. Иако модерните електронски полиња (force fields) се
способни за моделирање на парцијални атомски полнежи на лигандите со прифатлива
прецизност, тие генерално се неспособни за моделирање на парцијалните атомски
полнежи на лигандите со прифатлива прецизност, тие се генерално неспособни да го
земат предвид поларизациониот полнеж индуциран од протеинската средина. Колку
што игра поголема улога поларизацијата на полнежот во детерминирањето на
конформацијата при врзувањето со лигандите, толку ќе биде потешко за MM ―docking‖
алгоритмите да се определи правилниот начин на врзување. За истражувачите за кои е
неопходна поголема прецизност на ―docking‖, Schrödinger го создаде QM-Polarized
Ligand Docking (QPLD), кој користи ab inito пресметки на полнежот за да ги надмине
овие ограничувања.
QPLD ја комбинира моќта на Glide со прецизната на QSite, и затоа Schrödinger
го користи QM/MM софтверот. QPLD алгоритмот започнува со Glide докинг кој
генерира неколку генерално уникатни протеин-лиганд комплекси. QSite потоа прави
единечна пресметка на енергијата на секој комплекс, при што го третира лигандот со
91

ab initio методи и создава парцијален атомски полнеж со примена на електростатско

потенцијално прилагодување. Glide потоа врши повторен ―docking‖ на лигандот со
примена на секој од полнежите на лигандот пресметани од QSite, и QPLD алгоритамот
ја определува енергетски најприфатливата позиција на лигандот. Целосно
автоматизираниот алгоритам е калибриран за да обезбеди корисни основни
карактеристики кои може да бидат модифицирани од страна на корисникот. Сите
пресметки лесно се изведуваат преку бројни процесори и резултатите автоматски се
инкорпорираат во Maestro за визуелизација и анализа.
QPLD поседува значителни подобрувања во прецизноста на ―docking‖ во
споредба со MM методите. Преку тестирачки сет од 271 протеин-лиганд комплекси
преземени од PDB, QPLD успева ―docking‖ на лиганд со просечен RMSD со помалку
од еден ангстрем (доле).
Со валидациски експерименти кои вршат споредба

на QPLD наспроти методите на чистите
електронските полиња (force fields), лигандите
биле подложни на “docking” во нивните нативни
кристални структури со примена и на QPLD и на
Glide модот со стандардна прецизност (SP). Кај
сет тестот од 271 комплекси, QPLD обезбедил
супериорна прецизност на “docking”: просечниот
RMSD на QPLD-лигандите подложни на “docking”
била речиси половина од вредноста добиена со Glide SP. Горниот хистограм ја
илустрира дистрибуцијата на добиените вредности на RMSD за лигандите добиени
со QPLD и со “docking” на електронски полиња. QPLD обезбедува екстремно висока
прецизност на поставеноста на лигандите со (RMSD под 0.5 Å) за повеќе од 120
лиганди во тест сетот, додека вкупниот број на обезбедена поставеност на
лигандите со ниска (RMSD над 3.0 Å) за помалку од 20.
23. QSite: QM/MM програм со високи перформанси
QSite користи квантна механика врз активното место на протеинот и

молекуларните механизми на остатокот од системот. Неговата прецизност овозможува
детално разбирање на реакциите во кои учествуваат протеините, со што станува моќна
алатка за оптимизација на водечките соединенија.
Кај реактивната хемија критично е разбирањето на механизмот на интеракции
помеѓу лекот и рецепторот во системот кога лигандот ковалентно се врзува за
рецепторот. На пример, неопходно е да се проучат транзиционите состојби меѓу
врзаните и неврзаните форми во процесот на дизајнирање на антибиотици кои не се
предмет на инактивација со бета лактамазите. Класичните методи на молекуларна
механика (MM) не можат да ги објаснат електронските промени за време на реакцијата
и се слабо опремени за да ги посочат лиганд-рецептор интеракциите во системите кои
содржат метали.
Ab initio квантната механика (QM) е потребна за проучување на реактивната
хемија или интеракциите кои вклучуваат транзициони метали во протеинската
средина. Сепак, и покрај современата компјутерска технологија, целосите QM
пресметки на целиот протеин се непроценливи.
Мешаните QM/MM пресметки обезбедуваат идеално решение со оделување на
реактивното место кое може да биде опишано со QM, додека третирањето на остатокот
92

од комплексот е поефикасно при примена на MM. Бидејќи QM/MM може да не е

неопходно за секој проект за структурно базирано дизајнирање на лековите, многу
значајни системи не може да бидат ефикасно определени од било кои други
компјутерски аспекти. QM/MM затоа се смета за клучна компонента во арсеналот за
комјутерско откривање на лекови.
24. SiteMap: Брзо, прецизно и практично идентификување на врзувачкото

место
Комбинирање на нови алгоритми за брза идентификација на врзувачкото место

и евалуација со лесно применливи алатки за визуелизација, SiteMap им обезбедува на
истражувачите можност за полесно откривање и дефинирање на карактеристиките на
лиганд врзувачките места.
Определувањето на структурата и испитувањето на функцијата на протеин
активното место е основа во дизајнирањето на лековите. Затоа е неопходно хемичарите
да ја знаат позицијата на врзувачкото место, иако кај бројни проекти во дизајнирањето
на лековите локацијата на врзувачкото место за протеин-лиганд или за протеин-
протеин интеракции останува непознато. Еднакво е значајно да се идентификува
позицијата на било кое потенцијално алостеричко врзувачко место.
Докажаниот алгоритам на SiteMap за идентификување на врзувачкото место и
неговата евалуација може да им помогне не истражувачите да ги лоцираат врзувачките
места со висок степен на веројатност и да ја предвидат способноста за врзување со
лекови на овие места. Покрај откривањето на водечките соединенија, SiteMap помага и
во оптимизацијата на водечките соединенија преку обезбедување на информации за
лиганд-рецептор интеракциите со што сугерира ефикасни стратегии во
модифицирањето на водечките соединенија за да се зголеми нивната
комплементарност со рецепторите.
25. Strike: Моќен софтвер за статистичко моделирање и QSAR
Strike (Statistical tool for revealing insight and knowledge) е статистички пакет за
моделирање дизајниран специјално за хемичарите. Лесно употребливиот интерфејс и
големиот опсег на алатки за предвидување на карактеристиките го комбинираат и го
прават Strike пакетот моќен за одредување и развој на стуктура-активност врските.
Подготовката на виртуелни библиотеки богати со hit-соединенија може да е
долготраен процес и процес полн со предизвици. Неправилното дефинирање на
карактеристиките кои се значајни за една супстанца да биде лек ќе резултира со помала
HTS исплатливост и помалку ветувачки hits. Бидејќи вредностите на 2D и 3D
дескрипторите може да бидат брзо пресметани или предвидени, овие карактеристики
се со ограничена употреба освен ако се корелираат со дејство на лекот. Понатаму, со
цел да се спречи нераелното толкување на резултатите кои го предвидуваат
поврзувањето, сите предвидени врски мора да користат само рационален подсет на
дескриптори со минимална коваријанса.
Quantitative structure-activity relationships (QSAR) и статистичкото моделирање
може да се користат за развој на предвидливи врски, со што значително се подобрува
профилот на виртуелните библиотеки. Хемиски заснованиот статистички софтвер за
моделирање ги комбинира софистицираните аналитички алатки со способноста за
лесната визуелизација на структурите и карактеристиките кои се користат за да се
воспостави структура-активност врската. QSAR е еден од најзрелите техники за
93

рационално дизајнирање на лекови и брзо се истакна како ефтина инвестиција која

брзо се враќа со примената на истата.
1.3 Резултати
На крајот од вежбата секој студент има изработено сопствен проект за

структурно-базирано дизајнирање на лековите користејќи го водичот прилагоден за
академска работа и обезбеден од самата компанија Schrödinger.
94

Ime i prezime _______________________________

Data: ___________
Dosie br: __________________ Grupa ____________

VE@BA BR 7
Ин витро техники за проучување
на метаболизмот на лековите
7.1. Вовед
Примената на ин витро техниките за проучување на метаболизмот на лековите

овозможува проучување и споредување на метаболизмот на одреден лек на други животински
видови пред истиот да биде применет кај луѓе. Сепак, целосно релевантни информации за
метаболизмот на лековите се добиваат во тек на клиничките испитувања.
Хепарот претставува главен орган за биотрансформација на ксенобиотиците и поради

ова многу модели за метаболизмот на лековите примарно се фокусираат на хепарот и
ензимите кои ги има во хепарот. Проучувањето на метаболизмот на лековите ја вклучува
употребата на хепарните препарати кои можат да варираат во нивото на клеточен интегритет.
Системите се подредени од употреба на прочистени ензими ин витро до цели хепарни ткива
ин ситу.
Цитохром Р450 се голема суперфамилија на ензими кои се вклучени во метаболизмот

на голема група на структурно различни ксенобиотици. Цитохром Р450 ензимите се поврзани
за мембраната на ендоплазматскиот ретикулум. За следење на метаболизмот на лековите се
употребуваат препарати кои се добиваат со диференцијално центрифугирање на претходно
хомогенизиран хепар. Хомогенизираните субмитохондријални (Ѕ9) фракции се добиваат преку
седиментација на партикулите, вклучувајќи ги клеточните нуклеуси и митохондриите од
хомогенизираниот хепар на 9000 хg и претставуваат суров ткивен препарат. Така добиените
препарати се нечисти поради што може да предизвикаат аналитички грешки. Попрочистени
ензими можат да се добијат од суров хепар преку понатамошно центрифугирање.
Фрагментите на ендоплазматскиот ретикулум се преобразуваат во везикули познати како
микрозоми. Микрозомите се главен и збогатен извор на мембрански врзани ензими како
што се цитохром Р450 и како такви се најчесто применувани системи во фармацевтската
индустрија при проучување на ин витро цитохром Р450 посредуваниот метаболизам.
Хомогенизираните субмитохондријални (Ѕ9) фракции подеднакво како и микрозомите ја
задржуваат својата ензимска активност при чување на -80 С. Поради ова, Ѕ9 и микрозомалните
препарати можат да се приготват и зачуваат пред употреба, што е предност при проучување на
вкрстена споредба на метаболизмот помеѓу различни донори на хепар.
95

Паренхимските клетки на хепарот (хепатоцитите) се богат извор на цитохром Р450.

Како такви можат да бидат изолирани од хепарното ткиво преку ензимска дисоцијација
употребувајќи при тоа колагеназна перфузија. Еднаш изолирани, хепатоцитите можат да се
употребуваат во проучување на метаболизмот на лековите, како и во проучување на
индукцијата и инхибицијата на ензимите коишто се вклучени во метаболизмот на лековите.
Најголема предност на хепатоцитите во однос на микрозомите при проучувањето на

метаболизмот на лековите е во клеточниот систем. Хепатоцитите содржат многу ензими и
ензимски кофактори кои не се присутни во микрозомалните фракции. На пример, неколку од
ензимите кои се одговорни за коњугација на ксенобиотиците, како што се
сулфотрансферазите, се лоцирани во цитоплазмата на клетката. Исто така, некои од фаза 2
метаболчки патишта можат да бидат проучувани со помош на микрозомите само доколку им се
додадат соодветни кофактори (глукуронидација), додека истото проучување е многу полесно
доколку би користеле хепатоцити.
Хепатоцитите можат да се употребуваат во краткотрајна суспензиона култура (4 часа)

или пак можат да се стават на подлога и да се следи индукцијата или инхибицијата на ензимите
предизвикана од лек за што се потребни подолги периоди на изложеност на хепатоцитите на
испитуваната супстанца. Треба да се напомене дека при поставување на хепатоцитите на
соодветна подлога тие подлегнуваат на де-диференцијација, што значи дека е можно е да ја
изгубат специфичната клеточна карактеристика. Тоа понатаму резултира со забрзано
намалување на ензимите кои учествуваат во метаболизирањето на лековите, особено со губење
на цитохром Р450. Поради ова, примарните култури на хепатоцити рутински не се користат за
проучување на разликите во метаболизмот на лековите кои постојат меѓу различните видови,
но се користат при проучување на ензимската индукција или инхибиција предизвикана од лек.
Хепарните тенки исечоци претставуваат многу повисоко ниво на структурна целина

споредени со субклеточните фракции или хепатоцитите и можат да се приготват преку
употреба на инструменти како што е Krumdieck сечач на ткиво. Ткивните исечоци имаат
предност споредени со хепатоцитите поради зачуваната природна тридимензионална клеточна
структура, што овозможува да биде зачувана клеточната архитектура како и интрацелуларната
комуникација. Овој клетка-клетка контакт помеѓу различните хепарни клетки е важен во
одржувањето на клеточната диференцијација. Исечоците на хепар, како и хепатоцитите даваат
можност за изведување на фаза 1 и фаза 2 метаболичката биотрансформација.
7.2. Употреба на субклеточни фракции, хепатоцити и исечоци од хепар при

проучување на метаболизмот на лековите
7.2.1. Субклеточни фракции
Субклеточните фракции се најчесто применуван медиум за проучување на

метаболизмот на лековите супстанции. Квалитативното проучување на метаболичкиот профил
на потенцијалните лекови има за цел да го докаже присуството на одредени метаболити кај
животните и луѓето и со тоа да даде потврда на долготрајните и скапи претходно извршени
токсиколошки испитувања. За изведување на овој вид на експерименти потребен е систем кој
96

се состои од испитуваното соединение, пуфер, ензим и ензимски кофактори. Првиот процес кој
се одвива е инкубација после што следи прочистување кое се постигнува со додавање на
соодветен органски растворувач при што доаѓа до преципитација на протеините. На овој начин
добиените метаболити може да се анализираат со помош на различни инструментални техники
како на пример течна хроматографија под висок притисок (HPLC) во комбинација со масена
спектроскопија, или нуклеарна магнетна резонанса. На овој начин, може да се добијат
детални податоци за метаболичкиот профил на испитуваното соединение.
Квантитативниот метаболизам може да биде применуван во првичните стадиуми на

истражувањето за да се следат и потоа рангираат потенцијалните лекови-кандидати во однос
на нивната метаболичка стабилност. Најновите достигнувања во областа на комбинаторната
хемија им овозможуваат на хемичарите да создаваат голем број на нови синтетски
соединенија. Метаболичката (не)стабилност е круцијален фактор во развојот на било кој нов
лек. При овие истражувања се користат субклеточни фракции кои се создадени за да ја следат
метаболичката стабилност на голем број супстанции за релативно кратко време. Супстанциите
со несоодветна метаболичка стабилност можат на таков начин да бидат отстранети во раните
фази од истражувањето.
7.2.2. Хепатоцити
Хепатоцитите даваат можност да се проучи метаболизмот на потенцијалните лекови-

кандидати преку вклучување на цел клеточен систем. Овие клетки можат да се одржат во
суспензија и до 4 часа при испитување на метаболизмот на одредени соединенија. Најчест
медиум кој рутински се користи при одгледување на хепатоцити во лабораторија е William's
медиум Е што содржи 4мМ Л-глутамин.
Исечоци на хепар
Како цело ткиво, исечоците од хепар претставуваат добра алтернатива на хепатоцитите

и перфузиран хепар при проучување на метаболизмот. Исечоците од хепар имаат широка
примена при проучување на метаболизмот на лековите. Поради брзата и лесна подготовка, се
олеснува задржувањето на метаболичката активност и поради ова се корисни како
преведувачки алатки кога се проучува биотрансформацијата на лековите ин витро. Можат да
бидат користени како ―метаболички фабрики― за производство на значителни количества на
метаболит за карактеризација и идентификација. Бидејќи количеството на хепатално ткиво по
исечок од хепар секогаш е различно, постои можност за индивидуална варијабилност помеѓу
исечоците споредени со хепатоцитите кога се применува во квантитативните истражувања,
особено во студиите на интеракции помеѓу лековите.
Изборот на системот за инкубирање зависи од целите на експериментот. Може да

биде употребен динамичен систем на орган култура доколку исечокот од органот е поставен на
мрежа во вијала која го содржи медиумот и така поставен да се придвижува на температура од
37 оС , така што исечокот се движи во и надвор од течната фаза. Исто така исечокот може да
биде поставен во конусна колба и инкубиран на соодветна температура. Најчесто се применува
Whichever системот како начин на преинкубација на исечок свежо ткиво во свежа подлога во
период од 2 часа. На овој начин се овозможува клетките од пресечената страна на ткивото да
97

остварат хомеостаза. При краткотрајно инкубирање, вакви едноставни проучувања на

ксенобиотската биотрансформација е многу слична со употребата на хепатоцитната
суспензија. Овие парчиња можат да се инкубираат во медиум за ткивна култура како што е
William's медиум Е, обогатен со глутамин кој ја содржи и испитуваната супстанца. Генерално
кај краткотрајните култури, вишокот на кислород може да се постигне со доведување на
кислород директно во вијалата. Кај доготрајните инкубации, како што е проучувањето на
биотрансформацијата на споро метаболизирачки ксенобиотици или потенцијалот на лекот за
индукција на ензимите кои учесвуваат во метаболизмот на лековите, во медиумот најчесто се
додаваат и други адитиви како што се фетален серум од теле, хормони и антибиотици. При
долготрајните испитувања, подлогата мора да биде менувана редовно при што е потребна и
соодветна оксигенација која се постигнува преку додавање на кислород во инкубаторот со
ткивна култура. На крајот од инкубацијата, медиумот како и хепаталното ткиво треба да се
проанализираат, бидејќи метаболитите може да се задржани во самото ткиво.
7.3. Предности и недостатоци на ин витро системите употребувани за проучување на

метаболизмот на лековите
7.3.1. Субклеточни фрaкции
Ѕ9 претставува суров клеточен препарат и содржи голем број на цитозолни и

мембрански врзани ензими. Поради ова, ваквата фракција дава широк спектар на продукти на
биотрансформација. За разлика од Ѕ9 кој е сиров препарат, микорозомалниот препарат е
високо прочистен ензимски препарат кој ги содржи само оние ензими кои се врзуваат за
ендоплазматскиот ретикулум ин виво.
Постои исто така разлика во расположливоста на кофакторите за одредени ензимски

реакции помеѓу препаратите. Ѕ9, како сиров клеточен препарат би требало да ги содржи сите
неопходни кофактори потребни за ензимска активност. Сепак, искуството до сега покажало
дека додавањето на одредени кофактори како што е NADPH може да има клучна улога во
задржувањето на активноста на цитохром Р450. NADPH или NADP(H)- регенерирачкиот
систем мора да биде додаден во икубаторските мешавини за да процесот на
биотрансформација отпочне. Дополнително, иако микрозомите содржат мембрански врзана
глукоронил транфераза. потребно е додавање на кофакторот уридин дифосфат глукоронска
киселина (UDPGA) како и одредени детергенти како би отпочнала фазата 2- реакција на
глуклоронидација. Детергентите се додаваат за да ги ослободат ензимите од центарот на
микрозомалната везикула каде пристапот на супстратот е оневозможен.
Ѕ9 и микрозомите имаат предности бидејќи можат да се приготвуваат во големи

количества, подеднакво од замрзнато или свежо ткиво. Еднаш подготвени, препаратите можат
да се чуваат на -80 С без било каква промена на ензимската активност. Ова значи дека голем
број на експерименти можат да се изведуваат употребувајќи еднаш подготвен препарат, а со
ова се олеснува споредувањето помеѓу експериментите.
Недостатоците од употребата на субклеточни култури, вклучуваат интеракции поради

големи концентрации на неспецифични протеини во матриксот. Протеините можат да се врзат
98

и битно да го отстранат испитуваниот лекот од инкубацискиот медиум со тоа предизвикувајќи

погрешна проценка на стабилноста на лекот. Концентрациите на неспецифичните протеини се
многу поголеми кај S9 фркациите отколку кај микрозомалните фракции. Големи количества на
протеини можат да влијаат на метаболизмот директно или да ја попречат анализата на
експерименталните инкубати.
Метаболизмот исто така може да биде попречен во субклеточните фракции за време на

одвивањето на метаболичките трансформации од фаза 1. Ова може да доведе до погрешна
процена на метаболичкиот промет. Исто така, постои можност да се појави реакција помеѓу
ензимот и лекот при употреба на субклеточни фракции во тек на ин витро експериментите. На
пример, лек со мал волумен на дистрибуција можно е воопшто да не е достапен на клетките за
да извршат ензимска активност ин виво и поради ова метаболичката стабилност на лекот да
биде погрешно проценета. Дополнително, активноста на транспортерите на лековите низ
клеточната мембрана можат исто така да влијаат при регулацијата на интрацелуларното
количество на лекот ин виво. Ова, исто така, може да води до неправилна процена на
метаболичкиот клиренс. Активноста на субклеточните фракции е високо зависна од
пуферската концентрација и pH.
7.3.2. Хепатоцити
Хепатоцитите можат да се употребуваат во краткотрајни суспензирани инкубати,

слични на оние за субклеточните фркации или пак можат да се чуваат во долготрајни култури.
Овој дел се однесува на краткотрајните суспензии. Хепатоцитите се структурно непроменети
хепатални клетки и поради ова претставуваат чекор понапред во однос на ткивниот интегритет
за разлика од субклеточните фракции. Присуството на непроменета клеточна мембрана значи
дека пристапот на лекот до лек-метаболизирачките ензими е контролирано на сличен начин
како ин виво. Така на пример, пристапот на лекот во и надвор од клетката може да биде
контролиран од физичкото присуство на клеточната мембрана или од клеточните транспортери
(влезните и излезните) присутни на клеточната мембрана.
Хепатоцитите не само што го содржат целиот систем на активни ензими, воедно тие содржат и
кофактори потребни за одвивање на метаболичките процеси. Поради ова хепатоцитите имаат
предност пред употребата на субклеточни фракции. Дополнително, поради комплетниот
систем на ензими, метаболизмот може нормално да се одвива од фаза 1 во фаза 2, при што
метаболитите од фаза 1 (продуктните инхибитори) нема да влијаат на понатамошниот
метаболизам како кај микрозомите. Поради присуството на непроменета клеточна мембрана,
ензимската активност е помалку зависна од пуфери или подлогите на кои се чуваат споредено
со субклеточните фракции, исто така после лиза на клетките, хепатоцитните суспензии се
многу по чисти и поради ова полесни се за анализа во однос на субклеточните фракции.
7.4. Подготовка на хепарна микрозомална фракција
99

Хепарот неколку пати се промива со пуфер за хомогенизација. Изотоничниот растворот за

хомогенизација содржи пуфер (10-100 mM Tris, HEPES, или триетаноламин со pH 7.5-8.1),
хелирачки агенс и редуцирачки агенс (mM дитиотреитол-DTT). За поефикасна изолација на
микрозомите во растворот се додава и магнезиум (1-5 mM), и/или инхибитори на протеаза.
Хомогенизацијата се изведува со хомогенизатор на ладно (2-4ºC). Добиениот хомогенизат потоа се
подложува на серија последователни центрифугирања со цел да се отстранат фракциите на клетки,
јадра и митохондрии. Со центрифугирање на 600 x g и 10,000 x g се исталожуваат најпрво
клеточните јадра, а потоа и митохондриите. Микрозомите се таложат со центрифугирање од пост-
митохондријалниот супернатант во услови на 200,000 g (45,000 RPM) во тек на 30-90 минути.

Изолираната микрозомална фракција е сочинета од мазни и рапави микрозоми (последните на
својата површина имаат рибозоми). Понатамошната обработка на микрозомалната фракција
вклучува градиентно разделување на овие две подфракции (20%,30%, 40%, 50% (w/w) на глукоза).
7.5. Bradford постапка за одредување на протеини
Брадфорд постапката за одредување на протеини претставува прецизна метода која

најчесто се користи при одредување на протеинскиот состав на клеточните фракции, како и
одредување на протеинската концентрација при гел електрофореза. Аналитичката
чувствителност се движи во опсег од 5 до 200 микрограми на протеин, во зависност од
квалитетот на бојата која се употребува.
100

Анализата е базирана на регистрирање на максимумот на абсорбанца на кисел раствор

на Coomassie Brilliant Blue G-250 во опсег од 465 nm на 595 nm кога настанува врзување за
протеинот. Притоа хидрофобните и јонските интеракции ја стабилизираат анјонската форма
на бојата, предизвикувајќи видлива промена на боја.
Опрема
 спектрофотометар кој користи видлива светлина со максимум на трансмисија

во регион од 595 nm.
 кивети (заради употреба на обоен реагенс потребни се кивети за еднократна
примена).
Реагенси
 Брадфордов реагенс: се раствора 100mg Coomassie Brilliant Blue G-250 во 50ml

на 95% етанол. Се додава 100 ml 85% фосфорна киселина. Растворот се
разредува до 1 литар и откако бојата ќе биде комплетно растворена растворот се
филтрира.
 Доколку примероците не се потполно растворени во обоениот реагенс, се
користи 1M NaOH.
 Брадфордовиот реагенс треба да биде со светло кафеава боја. Филтрацијата
треба да се повтори за да се отстранат плавите компоненти на реагенсот.
Постапка
 Примерокот кој се анализира се разредува за да се постигне протеинска концентрација

во опсег од 5-100 µg.
 Доколку е потребно се додаваат еднакви волумен на 1 M NaOH на секој примерок.
 Се приготвуваат стандардни раствори со концентрација на протеини во опсег од 5-100
микрограми (албумин или глобулин) во 100 µl на раствор
 Се додава 5ml обоен реагенс и се инкубира 5мин
 Се одредува абсорбанцата на 595 nm. Врз основа на добиените раствори се изработува
стандардната крива на абсорбанца (абсорбанца/микрограми на протеин) и со помош на
таа крива потоа се одредуваат непознатите концентрации.
101

Rezultati
6.3.3.3 Zaklu~ok
Osvoeni krediti: Assistent:
102

Ime i prezime _______________________________

Data: ___________
Dosie br: __________________ Grupa ____________

VE@BA BR 8
In vitro анализа на мetabolizam na midazolam i
detekcija na неговите metaboliti so HPLC метода
7.1 Претходни предзнаења
- Хроматографија - аналитичка метода

- Принцип на хроматографија
- стационарна фаза
- мобилна фаза
- Поделба на хроматографијата според физичко-хемиските процеси кои се одвиваат
на допирната површина помеѓу две фази
- Хроматографски техники
- хроматографија на столб
- хроматографија на хартија
- хроматографија на тенок слој
- гасна хроматографија
- HPLC
- CE (капиларна електрофореза)
7.2. MIDAZOLAM C18H13ClFN3.
Chloro-6-(2-fluorophenyl)-1 methyl 4H imidazo (1.5-a)(1.4) benzodiazepine.
Мидазолам спаѓа во групата на депресанти на ЦНС. Според

својата хемиска структура мидазоламот припаѓа на групата на
бензодијазепински деривати. Неговите ефекти на ЦНС зависат од
применетата доза, од начинот на администрирање, дали се користи
самостојно или во комбинација со други лекови. Мидазоламот има
анксиолитичко, хипнотичко, антиконвулзивно дејство, делува како
мускулен релаксанс и има ефекти на антероградна амнезија.
103

Мидазоламот претставува бел или жолтеникав прашок. Практично е нерастворлив во

вода, делумно се раствора во алкохол и ацетон, лесно во метил алкохол. Растворливоста на
мидазоламот во вода е помала од 0.1 mg/ml при неутрална рН вредност а значително се
зголемува во кисела рН.
Сеаплицира интрамускулно и интравенски. Се применува како премедикација при

хируршки и дијагностички процедури, и како индукција на анестезија.
7.2.1. Метаболизам на мидазолам
Мидазоламот се хидрокслира под влијание на интестиналниот и хепаталниот цитохром P450

3A(CYP3A) на позиција 1 и 4 (-OHMDZ, 4-OHMDZ). 50-70% од метаболизмот на мидазоламот
отпаѓа на 1-OHMDZ кој е фармаколошки активен метаболит.
104

7.3.1 Потребни матрејали и лабораториска опрема
-Микрозомална фракцијаод хепар на лабараториско глувче

-HPLC апарат
-HPLC вијали
7.3.2. Експериментално одредување на метаболити на мидазолам
Метаболизмот на мидазолам во инвитро услови се одредува во 0.1М фосфатен пуфер со pH 7.4

кој содржи 50pmol на P45O од хепаталната микросомална фракција, мидазолам (2.5, 5,10, 25,
50, 100 и 150 М) и NADPH генерирачки систем. После 20 минути реакцијата се стопира со
додавање на 1мл метанол и концентрацијата на -хидроксимидазоламот се одредува на HPLC.
Аликвотен дел од филтратот (1-2ml) се пренесува во садот во автосмплерот и притоа се

подесуваат условите за работа на системот. Во резервоарот А се става ацетонитрил кој
учествува со 70% во мобилната фаза, а во резервоарот Б се става пуфер од калиумдихидроген
фосфат кој учествува со 30%. рН на пуферот изнесува 3.9. Протокот на мобилната фаза е
2.0ml/min, а брановата должина 275 nm. Се препорачува стабилизирање на колоната со
мобилната фаза околу 1 час пред да се почне со апликација на стандардните раствори.
105

7.3.4 Резултати
106

Ime i prezime _______________________________

Data: ___________
Dosie br: __________________ Grupa ____________

VE@BA BR 8
Detekcija na metaboliti na marihuana -kanabinoidi
so tenkoslojna hromatografija
8.1 Teoretski del
8.1.1Metabolizam na marihuana
Ha{i{ se dobiva od bilkata indiski konop t.e Canabis Sativa. i toa najmnogu
nejziniot varietet indica, koja raste vo predelite na Centralna Azija. Se upotrebuva
samo smolata od vrvovite na stebloto so cvetovi ili smolata od lisjata na ènskata
bilka. Se procenuva deka ha{i{ot ima deset pati pojako dejstvo od marihuanata.
Marihuana se dobiva od vrvot na cvetovite i gornite listovi na ènskoto
rastenie Canabis sativa. Po boja moè da bide od svetlo do temno kafejava, skoro do
crna. Se koristi kako isitneta, somelena droga i se aplicira inhalatorno vo oblik na
cigari, luli ili nargili. âdot od marihuanata se karakterizira so ostar miris i od
daleku moè da se zabeleì kako zavisnicite ja uìvaat ovaa droga. Farmakolo{koto
dejstvoto na marihuanata nastapuva za nekolku minuti, a se gubi za 2-4 ~asa.
Farmakolo{kite efekti na marihuanata se dolàt na edna
grupa soedinenija, nare~eni so zaedni~ko ime kanabinoidi,
OH od koi najva`ni se: kanabidiol(CBD), delta-9-
tetrahidrocannabinol(THC), kanabidiolna kiselina i delta-9-
tetrahidrokanabinolna kiselina. Istraùvawata pokaàle deka
biolo{kite efekti od pu{ewe marihuana se udvojuvaat
O zaradi prisustvoto na THC, {to sugerira deka ova soedinenie
e vsu{nost aktiven kanabinoid na drogata.
9
-Tetrahydrocannabinol
107

6.1.1.a. Struktura-aktivnost vrska za kanabinoidite(SAR)
R'11
9
8 OH
7 1
2
6
3
O 4
R
1. Supstitucijata na 1-ON-benzopiranskoto jadro so 3-alkil ili alkoksil

supstituent e neophodna za aktivnosta;
2. Esterifikacijata na fenolnata ON-grupa ili nejzina zamena so NH2 ne ja menuva
aktivnosta, dodeka pak esterifikacijata ili zamena so SH-grupa doveduva do
inaktivacija;
3. Supstitucija vo aromati~niot prsten so alkil ili ON-grupa ne ja menuva
aktivnosta, no taa potpolno se gubi pri supstitucija so elektro-negativni grupi
kako COOH;
4. Za da se zadrì aktivnosta na kanabinoidot, strani~niot lanec na S-3 ne smee da
bide pokratok od tri S-atomi, a istata se zgolemuva so razgranuvawe na lanecot;
5. 6-gem-dimetil supstituentot e optimalen za aktivnosta na piranskiot prsten, no
moè istiot da se prodolì za edna metilenska grupa -SN2- ili da se zameni so
azoten izoster, bez da se zagubi aktivnosta. Otvarawe na piranskiot prsten ja
namaluva aktivnosta;
6. Alicikli~niot prsten moè da bide nezasiten na poziciite S-8, S-9 ili S-10;
7. Alicikli~niot prsten moè da bide supstituiran so vmetnuvawe na N ili S na
mestoto na S-9 ili S-7. Metil-supstituentot na S-9 ja zgolemuva aktivnosta;
8. Planarnosta na alicikli~niot prsten ne e neophodna za aktivnosta.
Koplanarnosta na site tri prsteni se smeta deka e pri~ina za niskata aktivnost na
9(11)
-derivatot.
8.1.1.b.Mehanizam na dejstvo
Istraùvawata pokaàle deka vo ~ove~koto telo postojat visoko-specifi~ni
receptori koi se vrzuvaat za kanabinoidite so {to se ostvaruva nivniot efekt.
Imeno, otkrieni se i klonirani dva tipa kanabinoidni receptori-CB1 i CB2, od koi
samo CB1 e najden vo mozokot. Vrzuvaweto na ligandite za receptorot e reverzibilno i
stereoselektivno.
SV1 receptorite se mnogu rasprostraneti vo mozokot. (Kolku za sporedba gi

ima deset pati pove}e od -opioidnite receptori, koi se odgovorni za efektot na
morfinot.)
SV2 receptorite gi ima nadvor od nervniot sistem, a osobeno na kletkite na
imuniot sistem.
108

Faktot deka vo ~ove~koto telo postojat kanabinoidni receptori, ukaùva deka toa
mora da producira nekoja endogena supstanca koja bi se vrzuvala so niv. Ova e
potvrdeno, a najzastapen endogen ligand odgovoren za vrzuvawe so kanabinoidnite
receptori e anandamidot (arahidonil-etanolamin).
8.1.1.v. Efekti od vrzuvaweto na THC so receptorite(efekti od

marihuanata)
Motorni efekti: marihuanata gi namaluva psihomotornite sposobnosti na
korisnikot, doveduvj}i do dezorientacija vo prostorot (sli~no na sostojba
na pijanstvo-marihuanata ima najsli~ni efekti so alkoholot).
Efekti vrz memorijata: marihuanata prvo ja naru{uva kratkotrajnata
memorija, a potoa predizvikuva nemo`nost da se sledikontinuitetot na
mislite. (Kako rezultat na vrzuvawe na THC so SV1 vo hipokampus, regija vo
mozokot odgovorna za memorijata).
Bolka: marihuanata ja ublaùva bolkata.
Ostanati efekti: veselo raspoloènie, govorlivost i relaksacija,
vodlesti o~i, zgolemen apetit, zaboravenost.
Vo princip, farmakolo{kite efekti od marihuanata variraat vo zavisnost od dozata i

na~inot na administracijata. Intoksikacijata so marihuanata predizvikuva negativni
efekti kako: ma~nina, ka{lica, astma, zabrzana srceva rabota, anksioznost, paranoja,
vrtoglavica i sl. Osobeno treba da se istaknat negativnite efekti na marihuanata vrz
endokriniot sistem (poremetena funkcija na gonadite). Denes, me|u drugoto, ima
ubedlivi podatoci deka taa doveduva do totalna disfunkcija na imunolo{kiot sistem.
Hroni~ni efekti od THC

Mnogu supstancii {to se zloupotrebuvaat produciraat: tolerancija, fizi~ka
zavisnost i apstinencijalen sindrom. Tolerancija e naj~est odgovor po podolga
kontinuirana upotreba na drogata, a se manifestira so potrebata na korisnikot da ja
zgolemuva dozata za da gi postigne istite efekti. Zavisnost nastapuva kako rezultat
na "bri{ewe" na homeostatskite mehanizmi pri odgovorot kon drogata.
Tolerancija- Hroni~na administracija na kanabinoidi rezltira so

tolerancija vklu~uvaj}i : naru{ena memorija, namalena lokomotornost,
hipotermija, analgezija, razni neuroendokrini efekti i sl.
Zavisnost- Glavni efekti na zavisnost od marihuana se : tahikardija,

dilatacija na o~nite kapaci, zgolemuvawe na apetitot, muskulna slabost i
tremor. Marihuanata ne predizvikuva fizi~ka zavisnost.*
109

Apstinencijalen sindrom od marihuana - Se karakterizira so: zamorenost,

iritabilnost, nesonica, EEG-naru{uvawa, gadewe i povra}awe.
8.1.1.g.Metabolizam na marihuana
Vo Canabis sativa ima okolu 400 hemiski supstanci od koi najgolemo

zna~ewe imaat kanabinoidite. Nivnata koncentracija varira od rastenie do
rastenie. Vo ~adot od Canabis Sativa se nao|aat mnogu sostojki, vklu~uvaj}i i 61
razli~ni kanabinoidi dosega izolirani i identifikuvani.
Eden od niv -9-tetrahydrocannabinol ( -9-THC) e glavniot psihoaktiven
kanabinoid. Pokraj nego odgovorni za biolo{kata aktivnost se i :
 cannabidiol;
 cannabidiolna kiselina;
 delta-9- tetrahydrocannabinolna kiselina.
Farmakolo{kite efekti na -9-THC kako glaven aktiven princip variraat vo

zavisnost od dozata, na~inot na administracija, iskustvoto na korisnikot, osetlivost
na psihoaktivni efekti itn.
ADME
1. Absorpcija
a) Oralna administracija- 6-20 %;
b) Aktivna inhalacija- 18 %;
c) Pasivna inhalacija- minimalna.
2. Distribucija
a) Mesta na distribucija
- THC i negovite metaboliti se vrzani za plazma proteinite 90-99%. Glavno se
vrzani za albuminite i lipoproteinite.
- Lesno se deponira vo tkivata, zatoa {to THC e liposolubilen i e distribuiran do
mnogu telesni organi.
b) Distribuciona kinetika
- Volumen na distribucija na THC e 10 L/kg.
- Postojat dokazi deka -9-THC preferirano se prevzema od masno tkivo od kade
poleka se osloboden vo krvotokot. So ova se objasnuva i postoeweto na nekoi
metaboliti na THC vo krvta i po 3 dena po vnesuvaweto.
-
3. Metabolizam
Glavniot psihoaktiven konstituent na marihuanata, delta-1- tetrahydrokanabinolot
( 1-THC) pretstavuva lipofilna molekula (oktanol/voda particionen koeficient-
6000) koja podleì na alilna hidroksilacija do 7-hydroxy- 1-THC kaj lu|eto. Ovoj
metabolit kako popolaren od roditelskoto soedinenie natamu se oksidira do
soodvetnata 1-THC-7- karboksilna kiselina koja se nao|a kako jonizirana na
fiziolo{ko pH (pKa COOH-5).
110

Posledovatelna konjugacija na ovoj metabolit (bilo na COOH ili fenolnata OH

grupa) so glukuronskata kiselina vodi do hidrosolubilni produkti koi brzo se
eliminiraat vo urinata.
Vo natamo{nite serii na biotransformacija, roditelskata molekula 1-THC

stanuva mnogu popolarna, jonizirana i hidrofilna. Povrzuvaweto na
glukuronskiot ostatok (so negovata karboksilna grupa i tri polarni hidroksilni
grupi ), so 1-THC metabolitite zna~itelno odi vo prilog na particionirawe na
konjugiranite metaboliti vo voden medium.
a) Mesta na metabolizirawe i kinetika
- THC e podloèn na ekstenziven metabolizam vo heparot

Posle oralna administracija, tetrahidrokanabinol e intenzivno hidroksiliran vo 11-
hydroxy- delta-9- tetrahydrocannabinol.
11 7
9 1
8 10
OH 6 2
OH
7 1 5 3 2`
4 1`
2 3`
9
3 6` 4`
6 8
O 4 10 O 5`
9 1
- tetrahydrocannabinol e isto {to i (-) - - trans- Tetrahydrocannabinol, no imaat
razli~na numeracija, pa spored toa....
CH2OH
OH
O
O C5H11
C5H11
9 9
- THC 11- hydroxy - THC
ili ili
111

1 1
-THC 7 – hydroxy - THC
- Osven vo hepar, metabolizirawe se odviva i vo belite drobovi;

- THC e pronajden i vo plunkata;
- Ispituvawa pokaàle deka postojat sli~ni metaboliti na THC vo krvnata plazma
posle i. v. administracija i posle pu{ewe;
- Ispituvawa na dobrovolci koi konsumirale marihuana pokaàle deka
metabolitite se javuvaat prvite 10 minuti po konsumacijata.
b) Metaboliti
 11-hydroxy-delta-9- tetrahydrocannabinol e najzna~ajniot aktiven i glaven plazma
metabolit kaj ~ovekot. Toj pri i.v. aplikacija brzo penetrira vo CNS i doveduva do
tahikardija i psiholo{ki efekti.
 11-hydroxy-tetrahydrocannabinol e natamu oksidiran do popolarni soedinenija i
glukuronidni konjugati.
 Glavnite raspadni produkti na THC se 11- hidroksiliranite metaboliti, od koi
najmalku 50 se identifikuvani.
v) Metabolni pati{ta
 Oksidacija na bezilniot jagleroden atom
 Oksidacija na alilniot jagleroden atom
 Oksidativna aromatizacija
4.Ekskrecija
Izla~uvaweto odi preku:
a) Maj~ino mleko
b) Bubrezi
c) Feces
d) Urina- Prisustvo na metaboliti vo urina indicira na neodamne{no
izloùvawe na marihuana. Najvisoki plazma koncentracii na metaboliti od
marihuana vo urina se javuvat okolu 5 ~asa posle dozata i vaka ne se korisni za
odreduvawe na stepenot na intoksikacija, t.e. nivota vo urina ne korelirat so
psihofarmakolo{kiot odgovor. Pasivna absorpcija na THC najverojatno nema
da producira pozitivni test rezultati.
8.3. Detekcija na kanabinoidi si tenkoslojna hromatografija
Hromatografijata pretstavuva edna od osnovnite i najmnogu koristeite analiti~ka

metoda za oddeluvawe na supstanciite od sme{ite vo koi se sre’avaat.
Hromatografskoto razdeluvawe se zasnova na razli~nite migracii na rastvorenite
112

supstancii niz hromatografskiot sistem so~inet od dve fazi, ednata e mobilna

(podvi`na) a drugata e stacionarna (nepodvi`na). Primerokot se stave na edniot kraj
na stacionarnata faza i kontinuirno se ispira so sveà mobilna faza koja minuva niz
nepodfi`nata faza. Vo zavisnost od interakcijata na razli~nite komponenti na
primerokot za analiza so adsorbensot, doa]a do nivno razli~no zadrùvawe vo
stacionarnata faza i do raspredelba na primerokot pome|u dvete fazi. Moè da se
smeta deka do odvojuvaweto I {ireweto na hromatografskite zoni doa|a zaradi
postojanoto poremetuvawe na ramnoteàt ana raspredelba na rastvorenata supstanca
pome{u fazite I istovremeno nadomestuvawe na gubitokot, {to se vr{I so difuzija.
Hromatografskite sistemi se klasificirani spored:
Agregatnata sostojba na fazite

Fizi~kata podgotovka na fazite
Mehanizmot koj e pri~ina za razdvojuvawe na fazite
Bidejki moè da se kombiniraat gasni, te~ni i cvrsti fazi, mo`ni se pet
hromatografski sistemi:
Cvrsto- te~ni sistemi

Te~no -te~ni sistemi
Te~no-cvrsti sistemi
Gasno -te~ni sistemi
Gasno-cvrsti sistemi
Sistemot so te~na mobilna faza e tipi~en za te~nata hromatografija (te~no -te~na,
te~no-cvrsta, jonoizmenuva~ka, gel, afinitetna, ekstrakciona hromatografija, i te~na
hromatografija pod visok pritisok (HPLC)) dodeka pak so gasna, za gasnata ( gasno -
cvrsta) hromatografija.
Vo odnos na fizi~kata podgotovka na fazite, hromatografskite sistemi se delat na

sistemi so koloni i planarni sistemi
Vo odnos na mehanizmot na razdvojuvawe razlikuvame hromatografija koja se zasnova na

fizi~ka interakcija so molekulite na rastvoruva~ot, sozdavawe na hemiski vrski me|u
analiziranata supstanca i rastvoruva~ot ili spre~uvawe na difuzija na molekulite na
kompionentite vo matricata na adsorbensot.
Vo zavisnost od prirodata na sistemot, interakcijata pome|u analiziranata supstanca

i rastvoruva~ot moè da se odviva vo dve ili tri dimenzii pa spored toa se razlikuva
adsorbciona i particiona hromatografija.
8.4. Tenkoslojna hromatografija( TSH)
Princip-idntifikacijata na soedinenijata se bazira na principot na

karketrizacija spored polo`bata na damkata na nepoznatoto soedinenie so onaa na
113

standardnite rastvori na hromatografskata plo~a. Razvivaweto se vr{i vo tesni S-

komori (sendvi~), koi ovozmoùvaat podobra reproduktivnost na rezultatite
zaradi brzoto vospostavuvawe na ramnoteà pome|u te~nata i gasnata faza. Dobri
razdvojuvawa se dobivaat i pri upotreba na otvorena S komora, koja se koristi vo
ova ve`ba. Komorite moè da bidat zasiteni, ili nezasiteni komori. Vo vtoriot
slu~aj doa|a do pobrzo razdvojuvawe na damkite, no postoi rizik od pojava na ivi~en
efekt, zaradi brzoto isparuvawe na te~nosta po ivicite na hromatogramot.
Pri identifikacija se koristat Rf vrednostite dobieni od literaturnite podatoci
so onie dobieni od analiziranata supstanca.
Za poto~no, se spreduvaat Rf vrednostite na analiziranata so Rf vrednostitena

standardnata supstanca. Dokolku istite se poklopuvaat (so odredeni
dozvoleni odstapuvawa), stanuva zbor za identi~ni soupstancii, vo sprotivno,
analizata se prodolùva so koristewe na drugi standardni rastvori.
Rf =pominat pat na rastvorenata supstanca / pominat pat na mobilnata faza
Adsorbensi (stacionarna faza)- kako adsorbensi se koristat golem broj na

organski i neorganski soedinenija. Od neorganskite adsorbensi naj~esto se
koristat silica gel i aluminium oksid, zaradi nivnoto ednostavno nanesuvawe na
plo~I (stakleni nosa~i), i sposobnosta za razdvojuvawe na golem broj na razli~ni
supstancii. Dopolnitelno, moè da se koristat magnesium i calcium silikat,
fosfati, sulfati, staklen pra{ok i dr.Od organskite se koristat celuloza
inejzinite derivati, skrob, celuloza, manitol i dr.
Mobilna faza - vo zavisnost od soedinenijata koi se razdvojuvaat se koristat
razli~ni rastvoruva~i.
o Soedinenija so pov}e -ON, -SOON ili NH2 grupi, se razdvojuvaat so
razviva~I koi sodràt pove}e voda
o Slabo polarni soedinenija se razdvojuvaat so razviva~I koi sodràt
pomalku voda
o Nepolarni soedinenija se razdvojuvaat so razviva~I kbez voda ili drugi
polarni rastvoruva~i.
Otkrivawe na hromatogramot- najgolemiot del od supstanciite so TCX se
neoboeni, pa zatoa po razvivaweto na hromatogramot, treba istite da se otkrijat
yt.e detektiraat. Prvata detekcija e obi~no vizuelna so nabquduvawe na
hromatogramot na obi~na ili UV svetlina. Otkrivaweto moè da bide:
o So prskawe ( hemisko) - so soodveten reagens, pri {to zaradi hemiska
reakcijadoa|a do boewe na supstancata za identifikacija koja fluorescira
na UV svetlo
o So greewe ( fizi~ka) - po {to se aktiviraat supstancite i istite
fluoresciraat na UV svetlina
o So inhibicija ( mikrobiolo{ka)- preku deluvawe na supstanciite na
razvojot na mikrobiolo{kite kulturi
Detekcija- moè da bide vizuelna i instrumentalna so primena na
spektrofotometriska metoda ( UV spektroskopija).
114

8.4. Prakti~en del
- Hromatografski otvoren sistem ( hromatografska plo~a i pokrovno staklo)

- kadi~ka
- fen
- {tipki
- prskalka
- UV-komora
8.4.2. Eksperimentalno odreduvawe na prisustvo na kanabinoidi vo urina so TSH
8.4.2.1 Princip na postapkata

Okolu 80% od metaboliziranite kanainoidi vo urinata se nao|aat vo oblik na
glukuroniden kowugat na 11-karboksi THC. Za da se oslobodi od ovoj oblik, pred da se
detektira, treba da se izvr{i hidroliza na urinata (alkalna ili enzimska). Alkalnata
hidroliza e poefikasna i poreproducibilna sporedeno so bilo koja druga kisela ili
enzimska hidroliza.
8.4.2.2. Izveduvawe na postapkata
10 ml urina, 2 ml KOH (c = 10mol/cm3) i 8 ml metanol se zagrevaat na 50*C vo

vremetraewe od 15 min. Posle ladeweto na hidrolizatot se dodava 2 ml koncentrirana
HCl (kisela sredina) i se estrahira so 15 ml smesa od n-heksan: etilacetat(7:1).
Organskata faza se odvojuva, uparuva pod vakum do suvo. Suviot ostatok se rastvora vo
50 ml metanol i se aplicira na plo~a za tenkoslojna hromatografija. Istovremeno se
aplicira i kontrola, koja sodrì kanabinoidi.
Plo~ata se vronuva vo kadi~ka vo koja predhodno sme ja stavile mobilnata faza koja e
smesa od n-heksan: dioksan: metanol (35:10:5). Po zavr{uvaweto na iska~uvawe na
mobilnata faza, se vadi plo~ata od kadi~kata se su{i i se vizuelizira vo UV komora i
so prskawe na damkite. Plo~ata se prska so sveò prigotven rastvor na Fast blue BB.
Damkite se obojuvaat roze ili rezenikavo crveno.
115

8.5. Rezultati( prikaz na hromatografskata plo~a)
Rf ( standard)=
Rf ( analiza)=
116

8.6. Zaklu~ok
Osvoeni krediti: Assistent:
117

Име и Презиме _______________________________ Дата: ___________

Досие бр: __________________ Група
Работно место____________
ВЕЖБА БР 9
Метаболички трансформации на лековите
-метаболички реакции од прва и втора фаза-
9.1. Претходни предзнаења

Метаболички трансформации на лековите и сродните органски
соединенија
Метаболизмот игра централна улога во елиминација на лековите и
соединенијата туѓи за организмот (ксенобиотици) и претставува доминантен пат на
елиминација на липофилните активни супстанци кои се реапсорбираат во реналните
тубули. Лековите или ксенобиотиците се метаболизираат во поларни, хидросолубилни
продукти кои лесно се екскретираат.
Со метаболичките трансформации:
Настанува детоксикација - добивање на хидросолубилни метаболити кои се
генерално фармаколошки неактивни и релативно нетоксични;
Се добиваат фармаколошки активни метаболити (кои го поддржуваат дејството
на оригиналната активна супстанција);
Се добиваат фармаколошки активни метаболити од оригинално неактивни
супстанци;
Се формираат токсични метаболити (носители на тератогени, карциногени,
некротични ефекти).
Главни патишта на метаболизмот на лековите
Фаза I – функционализација - (воведување на поларни функционални групи, пр.
ОH, CООH, NH2, SH со директен пристап, пр. алифатична и ароматична
хидроксилација или со модифицирање на постоечките групи). На пр., редукција на
118

алдехиди и кетони до алкохоли, оксидација на алкохоли до киселини, хидролиза на

естри и амиди до ОH, CООH, NH2 соединенија, редукција на азо и нитро соединенија
до NH2соединија, оксидативна N-, О-, S- деалкилација до NH2, SH, OH гр.
Фаза II (реакции на коњугација) - конјугирање на поларните ендогени
супстанци (глукуронска киселина, сулфати, глицин и др. амино киселини) со
продуктите на I-та фаза или со активни соединeнија со поларни групи. На пример,
елиминација на конјугираните продукти со урина, прекин или модифицирање на
биолошката активност (метилирање, ацетилирање), заштита од токсичните ефекти
(коњугација со глутатион).
Преглед на Фаза I и Фаза II на метаболички патишта

Фаза I –реакции на функционализација
Реакции на оксидација
Оксидација на ароматични соединенија
Оксидација на олефини
Оксидација на бензилен, алилен јаглероден атом и јаглероден атом во α јаглероден
атом до карбонил и имини
Оксидација на алифатичи и алициклични јаглеродни атоми
Оксидација на системот јаглерод-хетероатом
Јаглерод-азот систем (алифатични и ароматични амини; вклучува N-
деалкилација, оксидативна деаминација, формирање на N-оксид, N-
хидроксилација)
Јаглерод-кислород систем (О-деалкилација)
Јаглерод-сулфур систем (Ѕ-деалкилација, Ѕ-оксидација и десулфурација)
Оксидација на алкохоли и алдехиди
Останати оксидативни реакции
Реакции на редукција
Редукција на алдехиди и кетони
Редукција на нитро и азо соединенија
Останати реакции на редукција
Реакции на хидролиза
Хидролиза на естри и амиди
119

Хидратација на епоксиди и арен оксиди со епоксид хидраза
Фаза II –реакции на коњугација

Коњугација со глукуронска киселина
Сулфатна коњугација
Коњугација со глицин, глутаминска киселина и други амино киселини
Коњугација со глутатион или меркаптурна киселина
Ацетилација
Метилација
Места на биотрансформација на лековите
Хепар
Хепарот е најзначаен орган на метаболизмот на лекови кој содржи ензими кои
учествуваат во метаболизмот на лековите (фаза 1 и 2) и тоа доминантно
монооксигеназите. Тој е добро прокрвен орган и во него се одвива детоксикација и
метаболички трансформации на ендогени и егзогени соединенија присутни во
крвотокот. Во хепарот може да настане ефект на прв премин на орално применетите
активни супстанции (изопротеренол, лидокаин, меперидин, морфин, нитроглицерин,
пентазоцин) кој може во значителна мера да ја намали биорасположливоста на
активната супсттанца или да ја деактивира. Хепаталните паренхимски клетки ги
содржат монооксигеназите во ендоплазматскиот ретикулум (мрежа на липопротеински
мембрани во цитоплазмата која продолжува со клeточните и нуклеарните мембрани).
Со фрагментација и диференцијално центрифугирање на овие клетки се добива
микрозомна фракција од постмитохондријален супернатант. Мешаната фракција на
моноксигенази ја сочинуваат структурни ензими, оксидази, кои сочинуваат
електронски транспортен систем на кој му се потребни: редуциран NADPH2,
молекуларен кислород, CYP450, NADPH-CYP450 редуктаза, фосфолипид.
Црева
Цревата играат значајна улога во екстрахепатичниот метаболизам и тоа во:
процеси на коњугација (пр. изопротеренол со сулфат во интестиналниот ѕид), ензимска
хидролиза (пр. естерази и липази, хидролиза на естерски пролекови), бактериска
деградација во горен и долен интестинум (пр. редукција на ароматични азо и нитро
лекови, пр. сулфасалазин), хидролиза на глукурониди со β-глукуронидази и
120

ослободување. За одредени лекови улогата на интестиналниот метаболизам на

лековите е квантитативно еднаква или поголема од соодветната на хепаталниот
метаболизам во севкупниот ефект на прв премин (пр. нифедипин). Квалитативниот
состав на ензимите во интестинумот е сличен на оној во хепарот, но квантитативно
активноста е пониска. Брзината на интестиналниот метаболизам е дефинирана со
содржината и локализацијата на ензимите, перфузијата, врзувањето на лековите за
плазматските протеини и времето на престој на лекот во цревата. Крвта која протекува
низ горниот интестинум навлегува веднаш во хепарот преку порталната вена. Во
хепарот поминува низ хепатоцитите и го напушта хепарот преку хепаталните вени кои
се празнат во вена кава на централната циркулација. Интестиналните вили се
снабдуваат со крв преку артериолоти кои на врвот на вилите се разгрануваат на многу
мали капилари кои се дренираат во венулите локализирани во вилите. Заради
близината на артериолоите и венулите во интестиналните вили, можно е одредени
лекови со мала молекулската маса да дифундираат надвор од асцедентните артериоли
директно во блиските десцедентни венули без да бидат доведени до врвот на вилите
каде се локализирани најголемиот дел од интестиналните ензими. Овој феномен на
измена условува фракцијата на лекот која се метаболзира во интестинумот да биде
помалку важна кога лекот излегува од системската циркулација после и.в. примена или
апсорпција во однос на фракцијата која се метаболизира за време на апсорпцијата.
Бубрези
Во бубрезите метаболичката трансформација се одвива и во надворешниот
кортикален регион и во внатрешниот медуларен регион. Се одвиваат реакции од фаза
1 и 2, а метаболните продукти формирани во бубрезите можат да предизвикаат и
значајни токсични ефекти кои зависат од: крвотекот низ бубрезите, киселоста на
урината и концентрирањето на урината
Бели дробови
Белите дробови се целни органи за инхалациски токсични материи чија
биотрансформација често резултира со токсични метаболити (пр. бензо(α)пиренот се
оксидира до бензо(α)пирен 4,5 оксид кој е силен елктрофил (мутаген)
Кожа
Најчести супстрати на кожата се селективни (стероиди, полициклични
ароматични јаглеводороди) и истите се ограничени на одреден тип реакции од фаза 1 и
121

2; метаболниот капацитет е инфериорен во однос на соодветниот на хепарот про mg, но

кожата е еден од најголемите органи; ензимите се локализирани во епидермисот и
дермисот и таа претставува важен метаболен орган и за локални и за трансдермално
применетите лекови
Плацента
Плацентален метаболизам претставува навлегување на метаболити во феталната
циркулација после метаболичката трансформација во плацентата; количеството на
ензими варира во зависност од гестациската фаза, здравствената состојба и
изложеноста на мајката на надворешна средина. Исто така одредени ензими не се
присутни во феталниот хепар (пр. UGT-уридин 5‘дифосфат глукуронил трансфераза -
неонатална жолтица), а се присутни во плацентата и имаат заштитна улога т.е. ја
фаворизираат коњугацијата и елиминацијата на токсичните метаболити наспроти
хидролизата на глукуронидите со посредство на бета глукуронидазата. Aктивноста на
бета глукуронидазата во плацентата е приближно 10 000 пати помала во однос на
активноста на UGT.
Адренални жлезди, мозок
Се карактеризираат со низок степен на метаболичка активност со супстрат
селективни биотрансформациски процеси ограничени на одреден тип реакција.
I. Метаболички трансформации - фаза 1

1. Оксидација на ароматични структури
Ароматичната хидроксилација се однесува на оксидација на ароматичните
компоненти (арени) на нивните аналогно фенолни метаболите (ареноли). Скоро сите
реакции на ароматична хидроксилација се изведуваат преку еден епоксиден
интермедиер наречен арен оксид, кој во повеќето случаи спонтано и брзо се преведува
до аренол продукт. Голем број на ксенобиотици кои содржат ароматична структура се
чуствителни на ароматична оксидација. Ароматичната хидроксилација кај човекот е
главен пат на метаболичка трансформација на голем број лековити структури кои
содржат фенолна група (пр. пропранолол, фенобарбитал, фенитоин).
Кај најголемиот број од споменатите лекови, хидроксилацијата се врши во пара
позиција. Супституентите кои се врзани со ароматичниот прстен влијаат на процесот
на хидроксилација. Имено во присуството на супституенти кои се донори на електрони
122

(активиран прстен), оксидацијата се врши побрзо за разлика од деактивираните

ароматични прстени т.е. прстени кои содржат групи кои привлекуваат електрони на пр.
Cl, -N+R3, -COOH, SO2NHR, каде реакцијата се одвива споро или воопшто не се
случува. Во структури каде постои присуство на два ароматични прстени,
хидроксилацијата се одвива на прстенот кој е побогат со електрони.
2. Оксидација на олефини
Метаболичката оксидација на двојната врска меѓу два јаглеродни атоми води
кон создавање на соодветен епоксид (оксиран). Епоксидните деривати се постабилни
во споредба со аренските оксиди формирани од ароматичните соединенија. Поседуваат
доволна стабилност, што овозможува директно мерење во биолoшките течности
(пр.плазма, урина). Одредени епоксиди поседуваат активност соодветна на
оригиналната активна супстанција (пр. 10,11-епоксидот на карбамазепин) или
токсичност. Подлежат на ензимска хидратација под дејство на епоксид хидрази и
формираат транс-1,2-дихидродиоли (1,2-диоли или 1,2-дихидро соединенија).
Подлежат на реакции на конјугација со глутатион. Епоксидите покажуваат хемиска
реактивност кон нуклеофилни групи што резултира со карциноген ефект (пр.
ковалентно врзување на афлатоксин В1, винил хлорид, стилбен, диетилстилбестрол за
ДНК, РНК, протеини).
3. Оксидација на бензилен јаглероден атом
Јаглеродните атоми врзани за ароматичен прстен (бензилна положба) се
погодни за оксидација, формирајќи соодветни алкохолни метаболити (карбиноли).
Примарните алкохолни метаболити често пати подлежат на понатамошна оксидација и
даваат алдехиди и карбоксилни киселини (CH2ОH CHO CООH), додека
секундарните алкохоли се трансформираат во кетони. Исто така, алкохолот може
директно да се конјугира со глукуронска киселина.
4. Оксидација на алилниот јаглероден атом
Реакцијата на алилна хидроксилација резултира со добивање на нереактивни
интермедиери. Добиените метаболити можат да бидат фармаколошки активни (пр. 7-
1 1
хидрокси –THC со психомиметски ефект идентичен на –ТHC).
5. Оксидација на α-јаглеродниот атом до карбонили и имини
123

Предмет на оксидацијата е јаглеродниот атом кој е во алфа позиција во однос на

карбонилна или имино група. Оксидацијата најчесто резултира со добивање на
нереактивни метаболити.
6. Оксидација на алифатични и алициклични јаглеродни атоми
Предмет на оксидација е алкилниот / алифатичниот јаглероден центар.
Метаболичката оксидација на терминалната метилна група често се нарекува омега (ώ)
- оксидација, додека оксидацијата на претпоследниот С-атом се нарекува ώ - 1
оксидација. Алкохолните метаболити, формирани под дејство на ензимските
оксидации (ώ и ώ - 1) подлежат на понатамошна оксидација при што се добиваат
алдехиди, кетони или карбоксилни киселини. Алтернативно, алкохолните метаболити
може да подлежат на глукоронидна конјугација.
7. Оксидација на системот јаглерод-хетероатом
Метаболичката оксидација на C-N, C-О, C-S системите вклучува два основни
типа на биотрансформациски процеси:
Хидроксилација на α-јаглеродниот атом директно поврзан за хетероатомот
(N,О,S). Добиениот интермедиер е често нестабилен и се распаѓа со кинење на
врската јаглерод-хетероатом. Оксидативната N-, О-, S- деалкилација и
реакцијата на оксидативна деаминација се одвиваат по овој механизам.
Хидроксилација или оксидација на хетероатомот (N и S): N-хидроксилација,
формирање на N-оксиди, сулфоксиди и сулфон структури.
8. Оксидација на алкохоли и алдехиди
Многу оксидативни процеси (бензилна, алилна, алициклична или алифатична
хидроксилација резултираат со алкохолни/карбинолни интермедиери/метаболити.
Доколку не се коњугираат, алкохолните продукти оксидираат до алдехиди (примарни
алкохоли) или до кетони (секундарни алкохоли). Алдехидните метаболити (добиени со
оксидација на примарни алкохоли или при оксидативна деаминација на примарни
алифатични амини) се оксидираат до карбоксилни киселини. Биоконверзијата е
катализирана со растворливи алкохол дехидрогенази во присуство на коензимите
NAD+ и NADH. Процесот е ревезибилен, но претежно се одвива во правец на
создавање на киселина. Генерално правило: (а) примарните алкохолни групи и
алдехидните функционални групи се исклучително чувствителни на оксидација; (б)
оксидацијата на секундарните алкохоли до кетони најчесто е реверзибилна реакција;
124

(в) секундарните алкохоли се поподложни на коњугација (пополарни) во однос на кето

групите.
9. Останати оксидативни биотрансформациски процеси
Оксидативна ароматизација/дегидрогенација
Оксидативна дехалогенизација (најчесто резултира со токсични и или активни
ацил халид интермедиери)
10. Реакции на редукција

Редуктивните реакции имаат значајна улога во метаболизмот на лековите кои
содржат карбонилна (кето и алдехидна), нитро и азо групи. Карбонилните соединенија
се редуцираат до алкохолни деривати, а нитро и азо соединенија до амино деривати.
Добиените хидроксилни и амино метаболити се многу подложни на реакции на
коњугација во споредба со функционалните групи од структурата на лековитото
соединение. Најзастапени се реакциите на редукција на N-оксиди до нивни соодветни
терциерни амини, редукција на сулфоксиди до сулфиди, редуктивно кинење на S=S
врските, редукција на карбонилни соединенија, редукција на нитро и азо соединенија.
11. Реакции на хидролиза
Метаболичките трансформации на естерските и амидните врски во структурите
на лековите се катализирани од страна на хидролитичките ензими присутни во разни
ткива и плазмата, при што како продукти се добиваат карбоксилни киселини,
алкохоли, феноли и амини. Овие метаболички продукти се поларни, подлежат на
реакција на коњугација и лесно се излачуваат од организмот.
II. Фаза II - реакции на коњугација

Поврзување на мали, поларни јонизирани ендогени молекули (глукуронска
киселина, сулфати, глицин и глутамин) со метаболити добиени од фаза I или
ксенобиотици до добивање на поларни, хидросолубилните продукти кои се најчесто
биолошки неактивни, нетоксични и лесно се елиминираат. Други метаболички реакции
на фаза II се метилирање и ацетилирање (генерално не ја зголемуваат
хидросолубилноста, туку предизвикуваат прекинување или ослабнување на
фармаколошката активност), коњугацијата со GSH (глутатион) (има за цел да го спречи
врзувањето за специфични ДНК, РНК и протеински молекули т.е. да го минимизира
125

цитотоксичниот ефект). Повеќето реакции на фаза II, помеѓу кои коњугација (со
глукуронска киселина, сулфати), метилирање и ацетилирање иницијално се одвиваат
со активирање на коњугирачката група во форма на коензим пред нејзиниот трансфер
т.е. соединување со супстратот со посредство на соодветни трансферази. Коњугацијата
со глицин и глутамин се одвива со иницијална активација на супстратот. Коњугацијата
со глутатион (GSH) не бара активација ниту на коњугирачката група, ниту на
супстратот. Голем број ендогени соединенија (пр. билирубин, стероиди, катехоламини,
хистамин), исто така, подлежат на реакции на коњугација и ги користат истите
коензими со посредство на поспецифични трансферази. Постојат и други механизми на
коњугација (со глукозиди, фосфати, други амино киселини, конверзија на цијаниди во
тиоцијанати) со минорно значење за метаболизмот на лекови.

Да се претстави првата и втората фаза на метаболичка трансформација на
следниве соединенија:
1.
126

3.
4.
5.
6.
127

7.
8.
9.
10.
128

11.
12.
13.
129

14.
15.
16.
130

17.
18.
19.
20.
131

21.
22.
23.
132

24.
25.
26
133

27.
II.Да се образложат следниве метаболни трансформации
1.
134

2,
135

3,
136

4.
5.
137

6.
7.
138

8.
139

9.
140

10.
141


Фармацевтска хемија 1 практикум PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Фармацевтска хемија 1 практикум PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

„ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

Проф. Д-р . Кристина Младеновска

Во рамките на фармацевтските науки, фармацевтската хемија, чиј синоним е

Во раните фази од својот развој фармацевтската хемија била насочена кон

Идеалниот лек мора да е ефикасен и безбеден за употреба, хемиски стабилен,

Процесот на дизајнирање на лековите започнува со откривање на лековите што

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

Следната фаза, фазата на оптимизација, опфаќа понатамошна хемиска

Финалната фаза, фазата на развој на лековите, опфаќа избор на лекот кој ќе

Овој Водич низ практичната настава по предметот фармацевтска хемија 1,

Првиот блок на вежби има за цел на студентот да му го предочи значењето на

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

органските соединенија се функција на нивните структурни (конформациски)

За еден лек да биде ефикасен, не е доволно само да се ресорбира и да покажува

Во случаи во кои рецепторот не е познат најчесто се пристапува кон индиректно

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

на рецепторот се применува кога е позната 3D структурата на рецепторот кој може да

Голем број од проблемите во текот на развојот на лековите се должат на

Како заклучок, големиот напредок во медицината и фармакотерапијата налага

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

фармацевтите кои во текот на своето образование се стекнуваат со знаења од

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

Име и Презиме _______________________________

Работно место _____________

1.1 Претходни предзнаења

Хидрофобност-соединување на неполарни групи или молекули во водено опкружување кое

Липофилност-афинитет на молекулата или соединението за липофилно опкружување (IUPAC)

Р-Реален коефициент; Вистински партиционен коефициент; Внатрешна липофилност

D- Привиден партиционен коефициент, Коефициент на дистрибуција

1.2 Теоретски дел

За да биде апсорбирана лековитата супстанца треба да се ослободи од лековитиот

- растворливост во поларни растворувачи и брзина на раставарање

- образување на соли, естри

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

- меѓусебно влијание на лековитата супстанца и другите активни и помошни

1.2.1 Коефициент на липидно-водено распределба (партиционен коефициент)

Партициониот коефициент (Р) претставува значајна физичка величина која се користи

Историски, партициониот коефициент бил прв пат корелиран со биолошкта активност

Mayer и Overton ја поставиле теоријата за влијание на коефициентот на распределба

Во хемијата познато е својството на хемиските супстанции да се двојно растворливи,

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

концентрации‖. Овој константен однос се вика коефициент на липидно-водена распределба на

Пример, дистрибуција на 100мг лек poмеѓу 50мл органски растворувач (етер,

Масата на лекот која се наоѓа во водената фаза = 100-66,7мг = 33,3мг; концентрацијата

Партициониот коефициент претставува однос на концентрациите и претставува

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

Процентот на лекот кој е екстрахиран во органската фаза во претходниот пример е

Оваа едноставна равенака на пресметување на партициониот коефициент е применлива

порастворливи во вода од нејонизираните киселини или бази, па горенаведениот однос ќе се

Привидниот партиционен коефоциент (Рпри) зависи од делот на супстанцата присутен

Рпри (D)=Рхf нејонизира

За илустрирање на овој ефект на јонизација ќе го земеме повторно претходниот

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО

Слика1.2 Партиционирање на јонизираниот лек

Масата на лекот во водената фаза = 100 – 40 = 60мг.

Масата на нејонизираниот лек во водената фаза = 60 х 0,333 = 20мг.

Концентрацијата на лекот во органската фаза = 40/50 = 0,8мг/мл.

Концентрацијата на нејонизираниот лек во водената фаза = 20/50 = 0,4мг/мл.

Концентрацијата на вкупниот лек во водената фаза=60/50=1.2 мг/мл.

Партициониот коефициент на нејонизираниот лек (вистинскиот партиционен коефициент) би

Р = (лек) во органска фаза/ (нејонизиран лек) во вода

Р = 0,8 мг/мл/0,4 мг/мл = 2

ПРИРАЧНИК ЗА ПРАКТИЧНА НАСТАВА ПО