Drejtimi laborant mjekësorë

Biokimi Mjekësore III

Mr.sci. Islam Zeqiri

biokimist
 KROMATOGRAFIA

KSHTH-ne shtrese te holle

K.Ne kolone Kromatogarfi per matjen e nderrimit te joneve Ndarja e komponenteve ne kolone
 Historiku i kromatografise
• I pari kromatografine e perdori shkenctari Rus
Miahil Cvet ne vitin 1900 gjate analizave te
klorofilit.
• Ka perdore kolona te qelqit te mbushura me
karbonat kalciumi qe te ndahen pigmentet
bimore.
 Termet ne kromatografi
• Analit-eshte substanca e cila ndahet ne
kromatografi
• Kromatografija analitike perdoret per
percaktimin e perqendrimit dhe prezencen e
analitit ne moster.
Kromatografi i gaste mjafte i sofistikuar
1.Metodat kromatografike
1.1 ndarja sipas gjendjes agrgate te fazes
1.2 ndarja sipas formes se sitemit
1.3 ndarja sipas mekanizmit te veprimit

2.Teknikat
2.1Kromatografija e gazte
2.2Kromatografija e lengte
2.3 Kromatografija ne shtrese te holle
2.4 Kromatogarfija me nderrim te joneve
2.5 Kromatografi ekskluzive
2.6 Kromatografija e lenget superkritike
Kromatografija ekskluzive
Kromatografij ekskluzive

-është një metodë në të cilën ndarja e komponenteve

është bërë në bazë të madhësisë së grimcave.
Si faza stacionare e përdorur materiale poroze (silikat
ose rrëshirë polimer).
Grimca të vogla mund të hyjë në poret e fazës
stacionare dhe është mbajtur më gjatë. Grimcat më
të mëdha janë të pranishme në mostër nuk mund të
hyjë në poret e lejuara më parë. Ky lloj i
kromatografise është quajtur edhe-xhel i filtrimit
kromatografik ose sieves molekulare. Titulli anglisht i
kromatografise per përjashtimit madhësinë, dhe
përdoret KSHZ akronim. Kjo metodë është
përshtatshëme për ndarjen e proteinave.
 SKEMA E HPLC

A.Rezevari i fazes mobile G.Kolona

B.Ventili per perzierje dhe pumpa H.HPLC komponentet
C.Ventili drain I.Detektori
D.Paisja per kontrollim te presionit J.Kontrollori
E.Komora per perzierje (mikseri) K.Kompjuteri
F.Injektori L.Shtpesi(printeri).
HPLC
Kromatografija lëngshme (LC), është ndarja e substancave në bazë të shpërndarjes në mes
të fazës stacionare të ngurta dhe të fazës së lëngshme celular.
Ka dy lloje të KL: klasike dhe me performancë të lartë KL(HPLC). Klasike KL përdor kolona të
mëdha gjatë deri në 50 cm, e mbushur material poroz, dhe faza e lëvizshme kalon graviteti,
kështu që rrjedhin ulët dhe metodë nuk është efektive.
HPLC është një teknikë moderne analitike, në të cilën fazë celulare çon duke përdorur një
pompë.
Mostra është injektuar duke përdorur një manual ose injeksion automatike. HPLC kolona
janë të mbushura me silicë ose polimer materiale.
Ka disa lloje të detektorë për HPLC. Përdoren zakonisht UV-VIS detektor, dhe përveç tij dhe
fotodiodni, fluoreshente, dhe elekrokimike të tjera.
Në bazë të polarizimit të KL të ndryshme në faza normale dhe të përmbyset.
Ndarja e fazës normale nënkupton se faza e polare stacionare (silicë p.sh.), një fazë jo-
polare mobile (hexane p.sh.).
Për ndarje në faza faza stacionare e kundërt është jo-polare (p.sh., C-18 hidrokarbureve), një
fazë polare celular (p.sh. uji dhe Methanol). [5]
 KROMATOGRAFIA
• Kromatografia permbledh nje grup te metodave te ndarjes , te cilat
perdoren per percaktimin e lendeve , qe ndodhen ne perzierje shpeshhere
te nderlikuara (zakonisht me natyre organike).
• Parmet teorike ku bazohen metodat kromatografike dhe teknika analitike
qe perdoren ne to jane mjaft te larmishme.
• Veqorite karakteristike me te rendesishme te metodave kromatografike
jane dy:
• Ndarja e perberesve te mostres ndodh permes dy fazave: nje faze te
levizshme , e cila mund te jete e lenget ose e gazte dhe nje faze te pa
levizshme , e cila mund te jete ne gjendje te ngurtye ose te lenget;
proceset e shperndarjes se perberesve te bmostres ndermjet dy fazave ,
qe pesojne zhvendosje relative ndaj njera tjeteres zhvillohen ne menyre
te panderprere ne nje numer shum te madh hapash te njepas njeshem.
• Mostra leviz neper fazen e pa levizshme per shkak te transportit te saj
nga faza e levizshme.
 KROMATOGRAFIA

• Kromatografia paraqet nje nder teknikat me te

rendesishme separative dhe analitike, e cila
shfrytezohet per separacionin e komponenteve dhe
substancave te tretura nga ndonje perzierje.
Kromatografia paraqet metode te shumeaneshme me
te cilen mund te separohen shume perzierje
komplekse, per te cilet nuk eshte e nevojshme
paraprakisht te dihet numri, natyra dhe sasia relative e
substancave qe jane prezente ne perzierje.
• Fjala kromatografi ka prejardhje nga gjuha greke me
domethenie ngjyre dhe shkruan.
 KROMATOGRAFIA

• Principi i perbashket i te gjithe teknikave

kromatografike eshte: separacioni (ndarja) e
komponentave ose substancave te tretura ne
perzierje ne baze te afinitetit te ndryshem
per distribuim ne mes dy fazave (mobile dhe
stacionare) te cilat jane ne kontakt, por
fizikisht nuk perzihen.
 KROMATOGRAFIA

• Zakonisht, faza stacionare eshte substance e

forte poroze (qelq siliciumi, aluminium) ose
eshte nje shtrese e holle e filmit te lengshem,
e cila eshte e paketuar ne nje gyp (kolone) te
qelqte ose metalik ose eshte e vendosur ne
pllake te rrafshe metalike.
 Teknika e ndarjes kromatografike-
Analiza me shperlarje ( me eluim).
• Ne ndarjet kromatografike mund te perdoren
tri metoda:
• Analiza me shperlarje (eluim),
• Analiza frontale dhe
• Analiza me zhvendosje.
 KROMATOGRAFIA
• Faza mobile sipas gjendjes agregate mund te jete gas ose
leng.
• Perzierja aplikohet ne njerin skaj te kolones dhe bartet
nepermjet sistemit me fazen mobile.
• Gjate udhetimit, komponentat e ndryshme nga perzierja
shperndahen ne baze te afinitetit te tyre relative qe kane ndaj
te dy fazave.
• Shpejtesia e udhetimit mvaret nga vlerat e koeficientit
shperndares (a). P.sh. komponentat te cilet reagojne me
fuqishem me fazen stacionare (kane afinitet me te madh ndaj
saj) kohe me te gjate mbeten ne sistem, qe dmth. se ju duhet
periudhe me e gjate kohore qe te paraqiten nga sistemi dmth.
te eluohen.
• Nese disa prej komponentave, gjate distribuimit e favorizojne
(fazen mobile), atehere ato duke udhetuar permes sistemit do
te mbeten per kohe me te shkurter dhe me shpejte do te
eluohen.
 KROMATOGRAFIA

• Per substance te caktuar raporti I kohes se kaluar

ne fazen stacionare dhe mobile eshte I barabarte
me raportin e koncentrimit te presences se saj ne
te dy fazat. Ky raport eshte I njohur si koeficienti
shperndares (α) dhe eshte I barabarte me
• C1 – koncentrimi I komponentes ne fazen
stacionare
• C2 – koncentrimi I komponentes ne fazen mobile
•
 KROMATOGRAFIA-BAZAT TEORIKE TE
PERGJITHSHME
• Kromatogramet perdoren si per analiza cilesore ashtu edhe
per analiza sasiore.
• Cdo pik qe del ne kromatogram I takon nje perberesi te
vequar,
• Koha qe nga qasti zero deri ne pozicionin e maksimumit te
pikut quhet koha e mbajtjes dhe eshte karakteristike per
cdo substance ( ne kushtet e dhena te kromatogramit).
• Koha e mbajtjes perdoret per analiza cilsore ne tekniken e
analizes me shperlarje.
• Ndersa analiza sasiore me kete teknike bazohet ne matjen
e siperfaqes se pikut qe I takon secilit perberes.
• Analiza me shperlarje dallohet me efikasitet shume te larte
te ndarjes.
 KROMATOGRAFIA-BAZAT TEORIKE TE
PERGJITHSHME
• Kromatografia paraqet nje nder teknikat me te
rendesishme separative dhe analitike, e cila
shfrytezohet per separacionin e komponenteve dhe
substancave te tretura nga ndonje perzierje.
Kromatografia paraqet metode te shumeaneshme me
te cilen mund te separohen shume perzierje
komplekse, per te cilet nuk eshte e nevojshme
paraprakisht te dihet numri, natyra dhe sasia relative e
substancave qe jane prezente ne perzierje.
• Fjala kromatografi ka prejardhje nga gjuha greke me
domethenie ngjyre dhe shkruan.
 KROMATOGRAFIA-BAZAT TEORIKE TE PERGJITHSHME
• Principi I perbashket I te gjithe teknikave kromatografike eshte:
separacioni (ndarja) e komponentave ose substancave te tretura ne
perzierje ne baze te afinitetit te ndryshem per distribuim ne mes dy
fazave (mobile dhe stacionare) te cilat jane ne kontakt, por fizikisht nuk
perzihen.
• Zakonisht, faza stacionare eshte substance e forte poroze (qelq siliciumi,
aluminium) ose eshte nje shtrese e holle e filmit te lengshem, e cila eshte
e paketuar ne nje gyp (kolone) te qelqte ose metalik ose eshte e vendosur
ne pllake te rrafshe metalike.
• Faza mobile sipas gjendjes agregate mund te jete gas ose leng. Perzierja
aplikohet ne njerin skaj te kolones dhe bartet nepermjet sistemit me
fazen mobile. Gjate udhetimit, komponentat e ndryshme nga perzierja
shperndahen ne baze te afinitetit te tyre relative qe kane ndaj te dy
fazave. Shpejtesia e udhetimit mvaret nga vlerat e koeficientit
shperndares (a). P.sh. komponentat te cilet reagojne me fuqishem me
fazen stacionare (kane afinitet me te madh ndaj saj) kohe me te gjate
mbeten ne sistem, qe dmth. se ju duhet periudhe me e gjate kohore qe te
paraqiten nga sistemi dmth. te eluohen. Nese disa prej komponentave,
gjate distribuimit e favorizojne (fazen mobile), atehere ato duke udhetuar
permes sistemit do te mbeten per kohe me te shkurter dhe me shpejte do
 KROMATOGRAFIA-BAZAT TEORIKE TE
PERGJITHSHME
• Per substance te caktuar raporti I kohes se kaluar
ne fazen stacionare dhe mobile eshte I barabarte
me raportin e koncentrimit te presences se saj ne
te dy fazat. Ky raport eshte I njohur si koeficienti
shperndares (α) dhe eshte I barabarte me
• C1 – koncentrimi I komponentes ne fazen
stacionare
• C2 – koncentrimi I komponentes ne fazen mobile
 KROMATOGRAFIA-BAZAT TEORIKE TE
PERGJITHSHME
• Sipas kesaj, separacioni bazohet ne dallimin e kohes se
qendrimit te komponentave ne te dy fazat, dhe reflektohet
ndaj kohes se ndryshme te migrimit neper kolona.
• Pas separacionit komponentat identifikohen individualisht
me metoda perkatese mvaresisht nga natyra e tyre.
• Metodat kromatografike ndahen ne baze te disa kritereve:
• gjeometrise se sistemit
• gjendjes agregate te fazave
• mekanizmit te mbajtjes (qendrimit) se komponentave
• modelit te procesimit
•
Sipas gjeometrise se sistemit kromatografia ndahet ne:
• kromatografia ne kolona – faza stacionare eshte e
paketuar ne gypa te holle te qelqit ose metalit te
ashtu quajtura kolona
• kromatografia planare (e rrafshe) – faza stacionare
ka konfiguracionin e pllakes dydimenzionale. Ketu
bejne pjese kromatografia ne leter dhe
kromatografia ne shtrese te holle.
•
• Sipas gjendjes agregate te fazave, para se gjithash te
fazes mobile te kromatografise ndahet ne dy grupe:
kromatografia gazore dhe e lenget, ndersa ne baze te
gjendjes aggregate te fazes stacionare ndahet edhe
ne disa nengrupe psh. gazore-e ngurte, ose gazore-e
lenget.
 kromatografia gazore
• – shfrytezon gazin si faze mobile dhe
karakterizohet me shpejtesi te madhe te
procesimit dhe ndjeshmerise se detektimit.
Me kete teknike percaktohen materiet qe
avullojne, mirepo gjate asaj metode mos te
ndryshoje perberja e tyre. Kjo teknike
shfrytezohet per detektimin e sasive
mikrogramore te karbohidrateve.
 Kromatografia e lengshme
• – eshte metode me praktike. Si faze mobile shfrytezohet
lengu dhe procesi mund te rrjedhe ne kolona ose ne baze
te rrafshe. Gjen perdorim te gjere gjate separacionit dhe
analizimit te joneve inorganike, aminoacideve, barnave,
sheqernave, oligonukleotideve dhe proteineve. Ekzistojne
me shume varianta qe dallohen sipas llojit te fazes
stacionare ose mekanizmit te separacionit. Ashtuqe mund
te flasim per: kromatografine e lenget-e ngurte,
kromatografine ne shtrese te holle. Nenlloji me I njohur I
kromatografise leng-leng eshte kromatografia e lenget nen
ndikim te shtypjes se larte (high-performance liquid
chromatography- HPLC).
•
Klasifikimi I metodave kromatografike
• sipas mekanizmit te mbajtjes (qendrimit) te
komponentave, mundet me qene e perafert,
sepse qendrimi I komponentave nga perzierja
midis fazave, paraqet kompleks te mekanizmave.
Sipas ketij mekanizmi kromatografia ndahet ne:
• a) absorbuese;
• b)distribuuese;
• c)gel-filtrimi dhe
• d) kromatografia sipas afinitetit.
 kromatografia absorbuese
• Te kromatografia absorbuese molekulat e
tretura nga perzierja lidhen drejtpersedrejti
me siperfaqen e fazes stacionare.
• Faza stacionare permban vende te ndryshme
absorbuese te cilet me intensitet te ndryshem
I lidhin molekulat e tretura nga perzierja.
• Efekti I rrjetit te fazes stacionare e determinon
aktivitetin absorbues te saj
 Kromatografia distribuuese
• Kromatografia distribuuese si edhe faza
stacionare shfrytezon lengun qe eshte I
imbibuar ne bartesin e kromatografise.
• Bartesi I kromatografise ne kushte ideale
eshte inaktiv ne qendrimin e komponentave.
• Shperndarja realizohet midis fazes mobile dhe
fazes stacionare te lenget.
 Gel-filtrimi
• Gel-filtrimi eshte lloj I vecante I
kromatografise e cila bazohet ne ndarjen e
molekulave ne baze te madhesise se tyre.
• Ne biokimi eshte i njohur reaksioni specific
intermolecular I quajtur “celsi dhe brava”.
Kromatografia sipas afinitetit e shfrytezon kete
mekanizem ashtuqe ne mbajtesin (gelin)
vendosen ligandet.
• Ligandi I mban dhe I lidh te gjitha molekulat qe
kane structure kompatibile me enzimin, ndersa I
leshon te gjitha molekulat tjera nga perzierja.
•
Sipas menyres se procesimit kromatografia ndahet ne dy
grupe:

• Kromatografia zhvilluese (development) –

rrjedha e fazes mobile nderpritet para se te
arrin komponentat e tretura deri ne skajin
tjeter te fazes stacionare.
• Pas perfundimit te procesit, zonat e vecanta
identifikohen ose me leshimin e rrezeve te
drites, ose me sterpikje te kromatogramit me
ngjyre.
• Kromatografia eluuese – rrjedh ne kolona dhe
nenkupton levizjen e fazes mobile dhe
perzierjes neper sistem dhe eliminimi komplet
I tyre nga sistemi.
•
• Aplikimi I kromatografise: me kromatografi
separohen dhe analizohen substanca te rendesishme
biologjike, sic jane: aminoacidet, steroidet,
karbohidratet, pigmentet biliare dhe fragmente te
proteineve.
• Disa teknika kromatografike kane afinitet te
detektojne prezencen e substancave ne perzierje te
ndryshme edhe ne sasi te pikogrameve (10-12
gram), kjo metode prandaj eshte shume sensitive.
• Kjo metode shfrytezohet ne detektimin e pesticideve
klorure ne materialin biologjik dhe ne ambientin
jetesor, gjen aplikim ne mjekesine ligjore, per
detektimin e medikamenteve, per qellime
terapeutike etj.
• Kromatografia ne leter
• Kromatografia ne leter ben pjese ne grupin e kromatografise
distributive, planare, leng-leng gjate se ciles substancat ne mostren e
aplikuar ndahen si rezultat I tretshmerise dhe shperndarjes se
ndryshme midis fazes stacionare dhe mobile.
• Kjo eshte metode e lire, por metode e fuqishme analitike. Kjo teknike
paraqet metode standarde per separacionin e aminoacideve,
peptideve, karbohidrateve, steroideve dhe substancave te ndryshme
organike.
• Faza stacionare paraqet ujin, I cili 6% eshte kimikisht I lidhur dhe
10-16% eshte I absorbuar ne letren filtruese. Faza mobile paraqet
tretes organic (butanol I ngopur). Bartes I kromatografise eshte letra
filtruese e cila duhet te kete pasterti te caktuar, trashesi,
homogjenitet dhe afinitet per shperndarje. Me shpesh shfrytezohet
letra e Whatman-it numer 1 ose 3.
•
– Mvaresisht nga drejtimi I levizjes se fazes mobile, kromatografia
ne leter ndahet ne:
– kromatografia ascendente – mostra aplikohet ne pjesen e
poshtme te letres; letra njomet ne rezervoar I cili eshte I mbushur
me fazen mobile te lenshme e cila me forcen kapilare ngjitet larte;
– kromatografia descendente – pjesa e siperme e letres filtruese ku
aplikohet mostra njomet ne fazen mobile dhe ajo udheton nga
lart-poshte.
– Kromatografia dy-dimenzionale – aplikohet per perfitimin e
separacionit me te mire te komponentave ne mostren e aplikuar.
Mostra aplikohet ne forme te njolles ne njerin skaj te letres
filtruese dhe procesi rrjedh ne nje drejtim ne njeren faze mobile
te caktuar. Pastaj letra filtruese thahet, rrotullohet per 90°, njomet
me tjeter faze mobile dhe rrjedh ne drejtim te ndryshem.
Kromatografia radiale (rrethore) – letra filtruese
eshte e shtrire horizontalisht, gjate se ciles faza
mobile levizen radialisht prej qendres kah periferia
ne letren filtruese te cilen e kemi prere radialisht.
o Rrjedhja e kromatografise nderpritet para se te
arrije faza mobile deri ne skajin tjeter te
kromatogramit.
 HPLC-metoda e se
ardhmes

Ju falem nderit
Mr.sci. Islam zeqiri
biokimist