Machine Translated by Google

TỪ SỞ LAO ĐỘNG
THUỐC
PHÂN BIỆT DƯỢC LÂM SÀNG

Viện Karolinska, Stockholm, Thụy Điển

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH VỀ

MORPHINE VÀ LIÊN QUAN

CÁC CHẤT SỬ DỤNG LC-MS / MS

Maria Andersson

Stockholm 2014
Machine Translated by Google

TRỪU TƯỢNG

Morphine được coi là chuyển hóa theo ba con đường chuyển hóa riêng biệt; glucuronid hóa,

sulfation và N-demetylation. Tuy nhiên, việc xác định morphin-3-sulfat (M3S) và morphin-6-

sulfat (M6S) là chất chuyển hóa của morphin chưa thuyết phục theo các tài liệu trước đây do

thiếu tài liệu tham khảo đáng tin cậy và việc xác định dựa trên sắc ký lớp mỏng. Trong luận

án này, tài liệu tham khảo cho M3S và M6S đã được phát triển, đồng thời phát triển một

phương pháp phân tích nhạy để định lượng M3S và M6S trong nước tiểu và huyết tương bằng khối

phổ. Nước tiểu và huyết tương được phân tích từ các nhóm nghiên cứu khác nhau; trẻ sơ sinh,

người nghiện heroin và bệnh nhân ung thư giai đoạn cuối. M3S hiện diện trong cả nước tiểu và

huyết tương của tất cả các nhóm nghiên cứu. Tỷ lệ M3S / morphin-3-glucuronid trong huyết tương

được phát hiện ở trẻ sơ sinh cao hơn 30 lần so với người lớn. Có bằng chứng yếu cho thấy M6S

thực sự hình thành in-vivo vì chỉ có hai mẫu có thể phát hiện được

nồng độ của M6S. Nó đã được chứng minh rằng cả M3S và M6S đã được hình thành

in-vitro bởi gan người đồng nhất nhưng với một lượng nhỏ. Tuy nhiên, chúng tôi đã chứng minh

rằng cả M3S và M6S đều là chất chuyển hóa morphin ở người.

Heroin là một dẫn xuất morphin gây nghiện cao có mặt trên thị trường thuốc bất hợp pháp. Một

trong những lợi ích chính trong việc kiểm tra thuốc pháp y và lâm sàng là xác định / xác định

lượng heroin. Trong luận điểm này, một điều mới được xác nhận

Phương pháp LC-MS / MS thường quy để xét nghiệm chất dạng thuốc phiện trong nước tiểu đã

được đánh giá dẫn đến tăng độ chọn lọc và khả năng phân tách so với các phương pháp GC MS

trước đó. Đánh giá cho thấy rằng dấu ấn sinh học 6 giờ sáng là một tiêu chí tốt và đáng tin

cậy cho việc tiêu thụ heroin. Ngoài ra, chúng tôi cũng đã chứng minh rằng phương pháp này có

thể giảm số lượng chất phân tích.

Trong 11,5% mẫu nước tiểu dương tính lúc 6 giờ sáng (n = 693), mô hình chuyển hóa không điển

hình của morphin và 6 giờ sáng đã được quan sát thấy sau khi uống heroin. Kiểu hình không

điển hình dường như không liên quan đến tính đa hình di truyền trong các enzym liên quan vì

cùng một cá thể có thể tạo ra cả kiểu hình “bình thường” và không điển hình. Nghiên cứu in

vitro sử dụng chất đồng nhất ở gan cho thấy ức chế mạnh sự hình thành 6-AM đối với sản phẩm

sắp xếp lại của thebaine (hợp chất 3).

tôi
Machine Translated by Google

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3 giờ sáng
3-Acetylmorphin

6 giờ sáng
6-Acetylmorphin

APCI Áp suất khí quyển ion hóa hóa học

NHƯ MỘT Axit acetylsalicylic

CEDIA Xét nghiệm miễn dịch người hiến tặng enzym nhân bản

CES Carboxyesterase

CG Codein-6-glucuronid

ESI sự ion hóa tia điện

EtG Etyl glucuronid

EtOH Rượu etylic

GC-MS Sắc ký khí khối phổ

LC-MS / MS Sắc ký lỏng khối phổ

M3G Morphine-3- glucuronide

M6G Morphine-6- glucuronid

M3S Morphine-3- sulfat

M6S Morphine-6- sulfat

SA Axit salicylic

PAPS 3'-phosphoadenosine-5 'phosphosulfate

photphosulfat

UPLC Sắc ký lỏng siêu áp

vii
Machine Translated by Google

1. BỐI CẢNH

1.1 OPIUM VÀ MORPHINE

Thuốc phiện đã được sử dụng trong suốt lịch sử như một loại cây thuốc. Nó là nước cô

đặc của quả nang chưa chín của cây thuốc phiện, Papaver somniferum. Cây cao tới 1-1,5

mét với hoa màu trắng, tím hoặc tím (1).

Rất khó để xác định nguồn gốc của loài thực vật này nhưng thông tin chỉ ra rằng khu

vực Địa Trung Hải của Tiểu Á. Thuốc phiện chủ yếu được sử dụng cho mục đích y tế do

tác dụng giảm đau và an thần của nó, nhưng cũng như một loại thuốc tiêu khiển.

Nghiện thuốc phiện lần đầu tiên được mô tả vào năm 1000 bởi Biruni, một bác sĩ

người Iran. Khi việc sử dụng và nhu cầu sử dụng thuốc phiện gia tăng, cây thuốc

phiện bắt đầu được trồng và chế biến ở nhiều nước (2).

Cây thuốc phiện chứa một số lượng lớn ancaloit (1). Bốn trong số họ đã được tìm thấy

sử dụng làm thuốc và được phân lập từ thuốc phiện như các sản phẩm tự nhiên. Morphine

là alkaloid chính (10-20%) và những loại khác là codeine (0,8-2,5%), noscapine

(4-8%), và papaverine (~ 1%). Morphine tương đối dễ tách khỏi các alkaloid khác do

tính chất phenol của nó (1). Morphine lần đầu tiên được phân lập vào năm 1817 từ

thuốc phiện bởi bác sĩ bào chế người Đức Friedrich Sertürner, người đã đặt tên cho

nó là “morphium”. Một cấu trúc lần đầu tiên được đề xuất 100 năm sau đó. Vào cuối

thế kỷ 19, “morphium” đã có sẵn và được sử dụng để điều trị cơn đau (3).

1.2 HEROIN

Heroin (3,6-diacetylmorphine, diamorphine) được một công ty dược phẩm của

Đức (Farbenfabriken vorm) giới thiệu như một loại thuốc ho vào năm 1898.

Friedrich Bayer & Co., nay là Bayer AG) và được bán không cần kê đơn. Heroin là

một loại thuốc gây nghiện cao (4). Và do dịch bệnh lạm dụng heroin, nó đã bị

cấm sử dụng trong y tế ở Mỹ vào năm 1924. Tuy nhiên, ở Anh, heroin vẫn được sử

dụng như một loại thuốc giảm đau (5).

Hêrôin bất hợp pháp được sản xuất từ thuốc phiện thô bằng cách acetyl hóa với anhydrit

axit axetic và đun nóng, dẫn đến sản phẩm không tinh khiết về mặt hóa học. Tạp chất là

1
Machine Translated by Google

còn lại của các ancaloit trong thuốc phiện như morphin, codein, papaverine và

noscapine, nhưng heroin bất hợp pháp cũng chứa các tạp chất do kết quả của quá trình sản

xuất (6). Các dẫn xuất acetyl hóa bổ sung được tìm thấy trong heroin là acetylcodeine O

acetyl hóa, 6-acetylmorphine và N-acetylated acetylcodamine, acetylnarcotine và các sản

phẩm sắp xếp lại hợp chất 3 và 4 từ thecain (7, 8).

Heroin cũng được trộn nhiều với các chất tạp nhiễm và / hoặc chất pha loãng để tăng

lượng sản phẩm (9). Một số chất ngoại tình như caffeine và procaine có vị đắng tương

tự như heroin (10). Các vụ thu giữ được thực hiện tại Đan Mạch đã cho thấy các mẫu

chất pha loãng và chất pha loãng liên tục thay đổi. Trong một nghiên cứu, lượng tương

đối của 3,6-diacetylmorphine trong các vụ thu giữ sản phẩm heroin đường phố khác nhau (n

= 146, trong các năm 2002-2003) là từ 3-51% với hàm lượng trung bình là 23%. Caffeine và

paracetamol là hai loại phổ biến nhất. Các chất tạp nhiễm đã biết khác là procaine,

paracetamol, chì, strychnine (11) griseofulvin, diazepam, phenobarbital, piracetam,

methaqualone, barbital, axit ascorbic, axit salicylic, mannitol, sucrose, glucose,

lactos / maltose. (9).

Heroin dễ tan hơn morphin làm tăng khả năng vượt qua hàng rào máu não. Tuy nhiên, heroin

được coi là tiền chất và tác dụng dược lý được thực hiện bởi các chất chuyển hóa của nó,

6-acetylmorphine (6- AM) và morphine. Gốc 3-acetyl trong heroin cản trở sự liên kết với

các thụ thể đặc hiệu âm thanh nổi, do đó heroin thể hiện ái lực thấp với các thụ thể

opioid. Sự liên hợp ở vị trí 6-hydroxyl không ngăn cản sự liên kết với thụ thể opioid và

do đó các dẫn xuất này có hoạt tính dược lý (12).

Ở người, heroin được chuyển hóa bởi các carboxyesterase ở gan và các esterase

pseudocholine trong huyết thanh thành 6-AM và xa hơn nữa thành morphin (Hình 1) (12). Quá

trình chuyển hóa heroin thành 6 giờ sáng cũng có thể xảy ra không cần enzym (13, 14)

Heroin có thời gian bán hủy trong máu ngắn và ước tính khoảng 5-7 phút (15).

2
Machine Translated by Google

3,6-diacetylmorphin 6-acetylmorphin
Heroin 6 giờ sáng

H3C H3C
N N
H H
Xóa
Không có enzym
H H

O O HO O
O O
O O O
H3C CH3 CH3

không xác định

Xóa

H3C
N H3C
H
N
H
H
H

O OH
O
O HO OH
O
H3C

Morphine
3-acetylmorphin
3 giờ sáng

Hình 1 Sự chuyển hóa Heroin.

6-AM trung gian được hình thành gần như ngay lập tức sau khi uống heroin và có thời gian

bán hủy khoảng 20 phút trong huyết tương (16, 12). Điều này dẫn đến thời gian phát hiện

ngắn (1-2 giờ) của 6-AM trong huyết tương. Trong nước tiểu, 6 giờ sáng duy trì lâu hơn dẫn

đến thời gian phát hiện lâu hơn một chút là 2-8 giờ (15).

Heroin là loại thuốc thường liên quan đến việc sử dụng ma túy quá liều dẫn đến tử vong ở

châu Âu (17). Người ta ước tính rằng có 12-20 triệu người lạm dụng heroin (15-64 tuổi)

trên khắp thế giới (18). Nguy cơ tử vong đối với người nghiện heroin cao hơn 20-30 lần so

với người không sử dụng ma túy (19). Có khoảng 100 ca tử vong liên quan đến heroin ở Thụy

Điển mỗi năm (20).

Heroin tạo ra trạng thái hưng phấn, ấm áp và khỏe mạnh, co đồng tử, buồn nôn và ức chế

hô hấp. Suy hô hấp thường là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến tử vong sau khi dùng quá liều

heroin. Việc sử dụng heroin liên tục là

đặc trưng bởi cảm giác thèm ăn dai dẳng, phát triển khả năng chịu đựng và nguy hiểm

3
Machine Translated by Google

và các triệu chứng cai nghiện đau đớn. Nguy cơ quá liều ma túy / heroin có liên quan

đến một số yếu tố như sử dụng nhiều thuốc, rượu và benzodiazepine. Độ tinh khiết của

heroin ăn vào cũng đã được thảo luận như một yếu tố. Một số cuộc điều tra đã kết luận

rằng độ tinh khiết của heroin không liên quan gì đến những ca tử vong do heroin trong

khi một số ấn phẩm ngụ ý rằng những ca tử vong do heroin đã giảm xuống khi mức độ tinh

khiết của heroin trên đường phố giảm xuống (21). Một yếu tố khác là thời gian kiêng

heroin và các yếu tố liên quan đến tình trạng sức khỏe cá nhân (22).

1.3 CƠ SỞ YÊU CẦU CỦA CON NGƯỜI

Các enzym carboxylesterase (CES) là một họ các enzym pha I. Có

ba CES chính của con người: s CES1, CES2 của con người (còn được gọi là con người

ruột CES, hiCES) và CES3 ở người. Nhưng CES4 và CES7 cũng xảy ra trong

con người. Ba CES: s chính hiển thị nhiều loại xenobiotics làm chất nền;

axit acetyl salicylic, heroin, cocaine, metylphenidate và oseltamivir cũng như

este và amit nội sinh (23). CES1 được biểu hiện nhiều ở gan nhưng nó

cũng có trong các mô khác như biểu mô phổi và tim. CES2 hiện diện trong

ruột non, chẳng hạn như thận, gan, tim, não. CES3 đã được thể hiện trong

gan và đường tiêu hóa với số lượng thấp so với CES1 và CES2.

Không có hoạt động CES: s nào được phát hiện trong máu của người (24).

Việc chuyển đổi heroin thành 6 giờ sáng chỉ được coi là có sự xúc tác của cả hai

CES1 và CES2 trong gan và bởi pseudocholinesterase trong huyết thanh, cũng như

phi enzym. Sự hình thành morphin từ 6 giờ sáng chỉ được xúc tác bởi

CES2 (13, 14, 25) và CES2 hoạt động gấp 1000 lần CES1 (25, 26).

1,4 MORPHINE METABOLISM

Morphine có trong tự nhiên ở dạng đồng phân (-) (3). Morphine được coi là chuyển

hóa theo ba con đường chuyển hóa riêng biệt không phụ thuộc vào đường dùng: glucuronid

hóa (60-70%), sulfat hóa (5-10%) và N demethyl hóa (1-6%) (3) (Hình 2). Theo đánh giá

của Milne morphin-3-sulfat (M3S) tạo thành 5% chất chuyển hóa sau khi dùng một liều

morphin nhất định (3). Tuy nhiên, khi xem xét kỹ các tài liệu, việc xác định M3S là

chất chuyển hóa morphin là không thuyết phục theo

4
Machine Translated by Google

tiêu chuẩn ngày nay do thiếu tài liệu đối chiếu và nhận dạng dựa trên sắc ký lớp mỏng (TLC).

Trong nghiên cứu ban đầu của Yeh 1975, họ không kết luận về sự hiện diện của M3S, nhưng

trong nghiên cứu sau đó từ năm 1977 sự hiện diện của nó được báo cáo và số lượng ước tính

là khoảng 1% so với M3G (27, 28)

Normorphine

H
N
H

HO OH
O

CYP3A H3C
H C3
CYP2C8
N N
H H

H H
H3C
O
O COOH
N
HO S H 16 OH
O OH HO O HO
O UGT2B7 O OH
O 10
9
1 14 Morphine-6-Glucuronide
Morphine-3-Sulfate 11 H
số 8

(M6G)
(M3S) 2
13
15 7
12
Sulfotransferase
3 6
4 5
HO OH
O

H C3 Morfin UGT2B7
N UGT1A
H

S OH
HO O
O O

Morphine-3-Glucuronide
Morphine-6-Sulfate
(M6S) (M3G)

Hình 2 Chuyển hóa morphin.

Trong một nghiên cứu lâm sàng ở trẻ sinh non và trẻ sơ sinh, M3S đã được xác định sau

khi tiêm một liều morphin bằng LC có phát hiện tia cực tím. Chất chuyển hóa M6S không được

phát hiện (29). Sulfation là một con đường chuyển hóa quan trọng trong cuộc sống của thai

nhi, trong khi glucuronid hóa trở nên quan trọng hơn ở người lớn (30). Quá trình glucuronid

hóa ở gan ở trẻ sơ sinh được mô tả là chưa trưởng thành khi mới sinh so với quá trình

sulfat hóa ở gan ở trẻ sơ sinh trưởng thành hơn. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng trẻ

sơ sinh có thể chuyển hóa đáng kể xenobiotics, tuy nhiên, độ thanh thải là

5
Machine Translated by Google

ít hơn đáng kể so với trẻ sơ sinh lớn hơn và người lớn (31). Các kết quả do Choonara

thu được cho thấy rằng hoạt tính sulfat hóa của morphin giảm dần theo tuổi tác (29).

Glucuronid hóa là một cơ chế thanh thải quan trọng đối với nhiều loại thuốc và nó

được xúc tác bởi các enzym UDP- glucuronosyl transferase (UGT) (32). Hai nhóm

hydroxyl của morphin khác nhau về bản chất hóa học. Hydroxyl ở vị trí 3 là một

phenol trong khi nhóm hydroxyl khác ở vị trí 6 là một rượu allylic bậc hai. Sự hình

thành M3G và M6G đều được xúc tác bởi enzym UGT2B7. Subenzyme UGT1A cũng góp phần hình

thành M3G, nhưng ở mức độ thấp hơn. M3G không liên kết với các thụ thể opioid và không

có hoạt tính dược lý (32). M6G có ái lực cao với các thụ thể opioid dẫn đến tác dụng

giảm đau lớn hơn bản thân morphin (29). M6G đã được đề xuất là một loại thuốc có thể

thay thế cho morphin (3).

Quá trình khử methyl N của morphin thành Normorphin được xúc tác bởi các enzym

cytocrom P450 (CYP), chủ yếu là CYP3A4 (~ 60%) và CYP2C8 (~ 30%) (33).

1.4.1 Sulfotransferase

Sự sulfat hóa ở gan là một cơ chế chuyển hóa phổ biến ở giai đoạn II để tăng khả

năng hòa tan trong nước và giảm hoạt tính sinh học. Sulfation được coi là một con

đường giải độc. Phản ứng sulfat hóa được xúc tác bởi các sulfotransferase (SULTs)

chuyển ion sulfonat (SO3-) thành hydroxyl hoặc chức amin trong phân tử (34, 35). Sự

chuyển sulfonat có thể đến các phân tử chất nhận khác nhau. Nếu nhóm sulfonat được

chuyển sang một nguyên tử oxy thì phản ứng này được gọi là sulfat hóa, nếu không thì

nó được gọi là sulfonation (36).

Các enzym SULT liên kết với màng xúc tác quá trình sulfat hóa peptit, protein,

lipid và carbohydrate. Các enzym SULT trong tế bào xúc tác quá trình sulfat hóa

xenobiotics và các hợp chất nội sinh nhỏ như axit mật, steroid và chất dẫn truyền

thần kinh (35). SULT chuyển một nhóm sulfonate từ 3'- phosphoadenosine-5

'phosphosulfate (PAPS) (34). Quá trình sulfat hóa là một phản ứng giai đoạn II,

thường hoạt động song song với quá trình glucuronid hóa trên các chất nền giống nhau.

Người ta không biết isoenzyme nào trong số này là quan trọng đối với quá trình sulfat

hóa morphin (34).

6
Machine Translated by Google

1.5 KIỂM TRA THUỐC URINE

Phát hiện ma túy trong nước tiểu là một cuộc điều tra thông thường trong phòng

thí nghiệm có các ứng dụng pháp y và lâm sàng quan trọng. Yêu cầu là các phương

pháp phân tích cho phép xác định và định lượng chính xác và đáng tin cậy của thuốc gốc

và các chất chuyển hóa của chúng trong nước tiểu. Chiến lược phổ biến để xét nghiệm ma

túy trong nước tiểu là thực hiện hai cuộc điều tra phân tích để tìm mẫu nước tiểu dương tính.

Điều tra đầu tiên được thực hiện với phương pháp sàng lọc hóa chất miễn dịch, phương

pháp này nhanh, đơn giản và tương đối rẻ tiền, nhưng ít đặc hiệu hơn. Điều tra thứ hai

được thực hiện dựa trên các kết quả tích cực giả định và là một phương pháp xác nhận

có tính chọn lọc, nhạy cảm và đắt tiền hơn. Các phương pháp xác nhận thường sử dụng

khối phổ (37, 38). Sự kết hợp giữa xét nghiệm miễn dịch như một phương pháp sàng lọc

và khối phổ làm phương pháp xác nhận cung cấp kết quả phân tích đáp ứng các tiêu chuẩn

pháp y (38) . Độ đặc hiệu và độ nhạy cao là một yêu cầu trong độc chất học lâm sàng và

pháp y, và việc kiểm soát doping do các chất phân tích thường không được biết đến và các

hợp chất nội sinh khác hoặc xenobiotics có thể gây trở ngại cho việc phân tích (40).

Mục đích của việc kiểm tra ma túy dạng thuốc phiện là để xác định xem có tiếp nhận ma túy

hay không. Vì morphin là chất phân tích đích trong quá trình sàng lọc nên một trong những

nhiệm vụ chính là xác định loại opiate đã xảy ra. Heroin, morphin, codein, ethylmorphin,

thuốc phiện và hạt anh túc có thể dẫn đến sự hiện diện của morphin trong nước tiểu, xem

Bảng 1. Do đó, điều quan trọng là có thể phân biệt các khả năng khác nhau bằng cách phân

tích các dấu ấn sinh học khác nhau và tỷ lệ tương đối của chúng (15) . Một cách để xác

định lượng heroin sử dụng là sử dụng tỷ lệ morphine codeine và một cách khác là sử dụng 6-

AM làm dấu ấn sinh học heroin. Trong một số trường hợp, mô hình chuyển hóa không điển

hình của 6-AM so với morphin đã được quan sát thấy (Hình 3) (41-45).

7
Machine Translated by Google

Bảng 1 Trình bày các nguồn có thể dẫn đến morphin và các chất phân tích liên quan khác trong

nước tiểu.

Đầu vào Phân tích

Heroin 6 giờ sáng, morphin, M3G, M6G, codeine và CG

Codeine Codein, CG, morphin, M3G và M6G

Hạt cây anh túc Morphine, M3G, M6G, codeine và CG

Morphine Morphine, M3G và M6G

Bình thường Khác biệt

Heroin Heroin

CES1 và CES2

6-Acetylmorphin 6-Acetylmorphin

CES2
× x Hệ số không xác định

Morphine Morphine

Hình 1 Trình bày đơn giản về chuyển hóa heroin cho thấy mô hình chuyển
hóa bình thường và không điển hình. Bước đầu tiên từ heroin thành 6-
acetylmorphine (6-AM) có thể được xúc tác bởi cả CES1 và CES2
và bởi các esterase khác. Quá trình chuyển đổi thứ hai của 6-AM thành
morphin chủ yếu được xúc tác bởi CES2. Ở các đối tượng có mô hình chuyển
hóa heroin không điển hình, một yếu tố không xác định đang ức chế chuyển
đổi enzym thứ hai từ 6-AM thành morphin.

số 8
Machine Translated by Google

Trong thập kỷ qua, sự phát triển của các phương pháp phân tích ít tốn thời gian và chọn lọc hơn

dựa trên khối phổ đã diễn ra (46). Tiêu chuẩn vàng là sắc ký lỏng hoặc khí được nối với khối

phổ để phân tích độc chất. Nhu cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu cao do các chất nền sinh học phức

tạp đạt được bằng khối phổ (47).

Theo truyền thống, xét nghiệm ma túy được thực hiện bằng cách sử dụng mẫu nước tiểu. Tuy

nhiên, các chất nền sinh học khác như dịch miệng, hơi thở, tóc và máu cũng có thể được sử dụng.

Các ma trận khác nhau có thời gian phát hiện khác nhau và nên được chọn

tùy thuộc vào yêu cầu lâm sàng (47, 48).

1.5.1 Xét nghiệm miễn dịch

Kỹ thuật sàng lọc ma túy được sử dụng phổ biến nhất là xét nghiệm miễn dịch lần đầu tiên

được sử dụng thương mại để thử nghiệm thuốc vào những năm 1970: s (38, 49). Các thử nghiệm

thương mại khác nhau là EIA (Enzym Immunoassay), EMIT (Enzyme Mediated Immunoassay Techniques),

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), KIMS (Kinetic Interaction of Microparticles in

Solution) và CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay). Chúng sử dụng cùng một nguyên tắc cơ

bản; cạnh tranh để liên kết với một kháng thể liên kết thuốc đã chọn. Nếu chất phân tích có

trong mẫu, nó sẽ liên kết với kháng thể (49). Sự liên kết của kháng thể / chất phân tích

phức tạp sẽ dẫn đến chất đánh dấu tự do tỷ lệ với nồng độ thuốc trong mẫu. Vị trí liên kết

của kháng thể không đặc hiệu cho một chất hóa học nhưng sẽ cho thấy phản ứng chéo với các hợp

chất có cấu trúc tương tự.

Trong xét nghiệm CEDIA đối với các chất dạng thuốc phiện, chất phân tích đích là morphin

nhưng phản ứng chéo đối với 6-AM và M3G là 81% và đối với M6G là 47%. Phản ứng chéo với thuốc

không phải thuốc phiện cũng xảy ra dẫn đến kết quả dương tính giả. Việc sàng lọc thuốc phiện

CEDIA cho kết quả 13% dương tính giả (48). Tính đặc hiệu hạn chế làm cho các xét nghiệm miễn

dịch chỉ thích hợp để sàng lọc định tính và cần có một phương pháp xác nhận chọn lọc và đáng

tin cậy hơn để đạt được kết quả cuối cùng chính xác (38, 49).

9
Machine Translated by Google

1.5.2 GC-MS

Vào những năm 1980: s GC-MS đã trở thành phương pháp được lựa chọn trong

phân tích độc chất học, cung cấp yêu cầu về độ chọn lọc và độ nhạy để phát

hiện và định lượng tổng nồng độ morphin và tổng nồng độ codein. Việc chuẩn

bị mẫu thường bao gồm thủy phân, chiết xuất và tạo dẫn xuất (37, 50).

Phương pháp sắc ký khí tách các thành phần mẫu nước tiểu dựa trên độ

bay hơi và độ phân cực của các thành phần. Sự phân tách các hợp chất xảy ra

do thời gian lưu khác nhau giữa các chất phân tích. Để có được một nhận

dạng chính xác, ba ion đặc trưng được theo dõi (51). Khi thủy phân các chất

chuyển hóa morphin liên hợp (3 - và 6-morphinglucuronid và 3 - và 6-

morphin sulfat) cũng như 6-AM sẽ chuyển đổi thành morphin để đo tổng nồng

độ morphin và codein (37).

Phương pháp GC-MS an toàn và đáng tin cậy nhưng có một số nhược điểm như cần

thời gian chuẩn bị mẫu và thời gian chạy tương đối lâu. Việc xác nhận với GC-

MS cũng dẫn đến việc thiếu thông tin quan trọng liên quan đến các chất

chuyển hóa morphin riêng lẻ.

1.5.3 Từ HPLC sang LC-MS / MS

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), các chất phân tích được phân tách

giữa pha văn phòng phẩm rắn và pha động bao gồm dung môi đệm và dung môi hữu

cơ. Sắc ký pha đảo thường được sử dụng khi pha tĩnh là chất béo và pha động

là loại ưa nước hơn (52).

Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng với khối phổ (LC-MS) đã cung cấp một kỹ thuật

có độ nhạy và độ chọn lọc độc đáo. Sự kết hợp của hai công nghệ này dựa

trên sự phát triển của giao diện tia điện tử. Khó khăn trong việc kết hợp

LC với MS là do pha động lỏng cần hóa hơi trong nguồn ion và đi vào hệ

thống MS chân không cao. Bước đột phá đã nảy sinh khi giao diện của ion

hóa tia điện (ESI) và ion hóa hóa học áp suất khí quyển (APCI) được giới

thiệu (37, 53). Năm 2002, giáo sư John Fenn, người đã phát minh ra giao diện

tia điện tử, đã được trao giải thưởng cao quý về hóa học vì “sự phát triển

của

10
Machine Translated by Google

các phương pháp xác định và phân tích cấu trúc của các đại phân tử sinh học ”

(54).

Nguồn ion (Hình 4) là mặt phân cách giữa LC và khối phổ kế.

Dòng pha động từ LC được phun vào nguồn ion qua một kim mao quản. Nhiệt độ cao và

khí làm khô được áp dụng trong nguồn ion sẽ làm cho pha động bay hơi và các ion

trong pha khí được hình thành. Một gradient điện được hình thành giữa kim mao quản

và lối vào của máy phân tích khối lượng sẽ làm cho các ion đi vào khối phổ kế (55).

Sự chuyển đổi của các ion từ pha lỏng sang pha khí cũng như sự di chuyển của các

ion từ áp suất khí quyển đến chân không cao, là những bước quan trọng.

Một nhược điểm của LC-MS là sự xuất hiện của các hiệu ứng ma trận. Hiệu ứng ma trận phát sinh

khi các chất phân tích quan tâm đồng thời rửa giải với các thành phần nền. Các

hợp chất ít bay hơi làm thay đổi sự hình thành các giọt hoặc sự bay hơi của các

giọt. Hiện tượng này sẽ ảnh hưởng đến lượng ion tích điện trong pha khí đến máy dò

(56). Điều này sẽ dẫn đến triệt tiêu hoặc tăng cường phản ứng của máy dò. Sự ức chế

ion đã được chứng minh là nổi bật hơn khi sử dụng ESI so với APCI. Mặc dù vậy, việc

lựa chọn cách chuẩn bị mẫu cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu ứng chất nền (37, 53). Có hai

cách tiếp cận phổ biến để nghiên cứu hiệu ứng ma trận. Đầu tiên là truyền chất phân

tích quan tâm sau cột trong khi tiêm mẫu nền trắng. Điều này sẽ dẫn đến một tín

hiệu không đổi. trong máy dò nếu không có bất kỳ hợp chất rửa giải nào có thể ngăn

chặn hoặc tăng cường sự ion hóa (57). Cách tiếp cận thứ hai là quyết tâm và

so sánh diện tích pic trong các tập mẫu khác nhau. Chất phân tích được tăng đột biến

trong dung dịch nhỏ gọn, chất phân tích được tăng đột biến trước khi chiết trong chất nền

trắng và chất phân tích được tăng đột biến sau khi chiết trong chất nền trắng (58). Các thí

nghiệm này sau đó sẽ được sử dụng để tính toán hiệu ứng ma trận cũng như hiệu suất thu hồi và

quá trình (59).

Việc xác định chất phân tích chưa biết được bảo đảm dựa trên dữ liệu phổ khối và

thời gian lưu chính xác. Một lợi thế với khối phổ để phân tích sinh học định lượng

là khả năng sử dụng các chất tương tự được đánh dấu đồng vị làm chất chuẩn nội.

Các chất tương tự deuterated có các tính chất hóa học giống hệt nhau như

11
Machine Translated by Google

chất phân tích và sẽ bù đắp cho những tổn thất có thể xảy ra trong quá trình chuẩn bị mẫu và /

hoặc những thay đổi trong phản ứng của máy dò. Điều này dẫn đến tăng độ chính xác và độ chính

xác (60).

Máy khối phổ bao gồm một bộ lọc khối lượng tứ cực (Hình 4), được cấu tạo

bởi bốn thanh song song có đặt hiệu điện thế xoay chiều. Tính phí
các ion từ nguồn ion được tập trung và chuyển giữa các thanh vào

máy dò. Các ion sẽ bị ảnh hưởng bởi điện trường và chỉ các ion có tỷ lệ m /

z chính xác mới đi qua và đi vào máy dò. Các ion có tỷ lệ m / z sai sẽ đập

vào một trong các thanh do biên độ không chính xác (61).

Khối phổ song song (MS / MS) bao gồm ba tứ cực liên kết với nhau. Tứ cực

thứ hai (Q2) sẽ hoạt động như một ô va chạm. Một ion tiền thân, thường là

ion phân tử, được chọn trong Q1 và sau đó bị phân mảnh trong Q2 bằng cách

sử dụng năng lượng cao và va chạm với N2 hoặc Ar. Một mảnh nhỏ hơn được

chọn trong Q3, được gọi là sản phẩm hoặc ion con, và đang đi vào máy dò.

Loại giám sát này được gọi là giám sát phản ứng chọn lọc (SRM) (62).

Hình 4 Một LC được kết nối với một khối phổ kế song song, bao gồm 3 qudropoles. Q1 và Q3 hoạt

động như bộ lọc khối lượng và Q2 hoạt động như một ô va chạm.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cực cao (UHPLC) hiện đại hơn được sử

dụng rộng rãi từ vài năm trước. Máy bơm được thiết kế để hoạt động ở áp

suất cao hơn HPLC thông thường dẫn đến khả năng hoạt động với

12
Machine Translated by Google

pha tĩnh của các hạt nhỏ 2µm. Các hệ thống này làm tăng khả năng phân tách và giảm thời

gian lưu (47).

Phương pháp xác nhận độc lập là một phần quan trọng của chiến lược thử nghiệm thuốc,

xác nhận kết quả sàng lọc. SIM hoặc SRM thường được sử dụng. Để đảm bảo tính chọn lọc,

hai quá trình chuyển đổi SRM được theo dõi. Tiêu chí nhận dạng là thời gian lưu sắc ký

chính xác và tỷ lệ tương đối chính xác giữa các ion được theo dõi (56).

Vào đầu những năm 1980: một HPLC với phát hiện tia cực tím (UV) được phát triển để

xác định morphin và các chất chuyển hóa trong nước tiểu và huyết tương (3, 63). Phương

pháp này rất quan trọng đối với việc nghiên cứu dược động học của morphin (3)

Phương pháp này là phương pháp đầu tiên xác định morphin, M3G và M6G trong nước tiểu

và huyết tương và dựa trên việc chuẩn bị mẫu bằng cách chiết pha rắn (63).

LC được gạch nối với MS vào những năm 1990: s (56). Vào giữa những năm 1990: sự bắt đầu

của việc sử dụng LC-MS để phân tích opiate trong huyết tương và ở một mức độ nào đó đã

được đưa vào nước tiểu (46, 64, 65). Cả giao diện ESI và APCI đều đã được sử dụng để

phân tích thuốc phiện (37, 53, 66, 67).

Sự ra đời của phân tích LC-MS / MS làm tăng độ chọn lọc và độ nhạy hơn nữa. Độ chọn lọc

được cải thiện sẽ cho phép ít mẫu tinh lọc hơn. Điều này không nhất thiết sẽ thúc đẩy sự

gia tăng sự triệt tiêu ion hiệu ứng nền (37). Việc sử dụng LC-MS / MS trở nên phổ biến

hơn để xác định morphin và các chất chuyển hóa của nó trong huyết tương. Việc chuẩn bị

mẫu được lựa chọn vẫn là chiết pha rắn mặc dù đã có một số nghiên cứu liên quan đến sự

kết tủa protein (53, 68-70). Một vài năm sau đó, tiêm trực tiếp hoặc pha loãng và bắn đã

được phát triển để phân tích thuốc phiện trong nước tiểu (53, 65).

Để chứng minh rằng các phương pháp phân tích sinh học là đáng tin cậy và có thể tái lập

cho mục đích sử dụng đã định, cần phải có sự xác nhận. Các hướng dẫn từ Cơ quan Dược

phẩm Châu Âu (EMA) (71) và Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) (72) đã được

đề xuất để xác nhận phương pháp liên quan đến; độ chọn lọc, độ nhạy, độ tái lập, hiệu

ứng mang lại, hiệu chuẩn, độ chính xác và độ chụm, tính toàn vẹn của dung dịch pha loãng,

hiệu ứng nền và độ ổn định (59).

13
Machine Translated by Google

2 AIMS
Mục đích chung của luận án này là thu thập thêm kiến thức về chuyển hóa morphin và heroin bằng

cách tập trung vào 6-acetylmorphin, morphin-3-

sulfat và morphin-6-sulfat. Cả hai khía cạnh phân tích sinh học và lâm sàng đều là

quan tâm.

Các mục tiêu cụ thể là:

Nghiên cứu tôi

x Chuẩn bị chất đối chiếu cho morphin-3-sulfat và morphin-6-sulfat

vì chúng không có giá trị thương mại hoặc không có sẵn.

x Phát triển phương pháp LC-MS / MS cho nước tiểu và huyết tương. x Ứng dụng

trong một nghiên cứu sơ bộ để xác nhận các chất chuyển hóa trong huyết tương

và nước tiểu.

Nghiên cứu II

x Xác thực phương pháp thử thuốc trong nước tiểu LC-MS / MS thông thường cho các chất dạng thuốc phiện

liên quan đến độ tin cậy và dấu ấn sinh học.

x Để nghiên cứu xem số lượng chất phân tích có thể giảm đi hay không và để đánh giá xem điều này sẽ

ảnh hưởng như thế nào đến việc giải thích lượng chất có thể đưa vào.

Nghiên cứu III

x Điều tra kỹ lưỡng morphin-3-sulfat và morphin-6-sulfat và

sự hiện diện và hình thành của chúng in-vivo và in-vitro.

Nghiên cứu IV

x Nghiên cứu sự tương tác chuyển hóa của quá trình chuyển hóa heroin. Nghiên

cứu lý do tại sao morphin không được hình thành sau khi uống / uống heroin ở

một số cá nhân.

x Điều tra và xác nhận sự ức chế này cả in-vivo và in-vitro.

14
Machine Translated by Google

3 PHƯƠNG PHÁP

3.1 MẪU LÂM SÀNG

3.1.1 Nghiên cứu I

Các mẫu nước tiểu và huyết tương dư thừa đã được khử mã hóa từ dòng chảy thông thường

gửi đến phòng thí nghiệm để phân tích đã được sử dụng. Các mẫu nước tiểu được chọn dựa

trên sự hiện diện của chất chuyển hóa heroin 6-AM (> 2 ng / ml). Giấy phép đạo đức Dnr

2008 / 1087-32.

3.1.2 Nghiên cứu II

Các mẫu nước tiểu được nghiên cứu đã được gửi đến phòng thí nghiệm để kiểm tra chất gây

nghiện. Tất cả các mẫu nước tiểu dương tính với thuốc phiện được xác nhận trong khoảng thời

gian bốn năm đều được bao gồm (n = 3155). Ngoài ra, 199 mẫu nước tiểu thặng dư đã được khử mã từ

dòng chảy thông thường được phân tích để so sánh phương pháp với GC-MS. Giấy phép đạo đức Dnr

2008 / 1087-32.

3.1.3 Nghiên cứu III

Các mẫu được thu thập từ 11 bệnh nhân ung thư được điều trị bằng morphin

(Dolcontin) mỗi lần tiêm hoặc truyền liên tục dưới da. Từ mỗi bệnh nhân, một mẫu máu và

nước tiểu được lấy tại cùng một thời điểm. Các mẫu được thu thập hai lần từ cùng một bệnh

nhân khi có thể, kết quả là thu được 13 mẫu huyết tương và 12 mẫu nước tiểu. Giấy phép đạo

đức Dnr 2010 / 570-32; 2012 / 1839-

31/4.

Ngoài ra, 62 mẫu máu được phân tích từ 21 trẻ sơ sinh được điều trị bằng morphin bằng

cách truyền liên tục trong khuôn khổ dự án FP7 NeoOpioid của Châu Âu. Tối đa bốn mẫu

có tổng lượng máu nhỏ hơn 0,8 ml được lấy từ một ống thông hiện có từ mỗi bệnh nhân. Giấy

phép đạo đức Dnr

2010 / 570-32.

15
Machine Translated by Google

Hơn nữa, 196 mẫu nước tiểu dư thừa đã được khử mã của những người nghiện ma túy heroin

đã được phân tích. Các mẫu được chọn dựa trên kết quả dương tính được xác nhận với 6-

AM (> 2 ng / ml). Giấy phép đạo đức Dnr 2008 / 1087-32.

3.1.4 Nghiên cứu IV

Các mẫu nước tiểu dư thừa đã được khử mã hóa từ dòng chảy thông thường được gửi đến phòng

thí nghiệm để phân tích chất dạng thuốc phiện. Lựa chọn đầu tiên dựa trên kết quả sàng lọc

dương tính (cắt> 300 ng / ml) và lựa chọn thứ hai dựa trên kết quả xác nhận dương tính (6-

AM> 2 ng / ml). Tổng số 693 mẫu nước tiểu đã được đánh giá.

Giấy phép đạo đức Dnr 2008 / 1087-32.

3.2 LIVER TISSUE VÀ CYTOSOL

3.2.1 Nghiên cứu III và IV

Các nghiên cứu trong ống nghiệm được thực hiện trên gan người và một bể chứa tế bào thai

nhi Giấy phép đạo đức Dnr 429/01; 280/00.

3.3 CÁC THỦ TỤC CHUẨN BỊ MẪU

3.3.1 Huyết tương; Nghiên cứu I và III

Việc chuẩn bị mẫu huyết tương bao gồm kết tủa protein với

axetonitril. 50 microlit huyết tương với 100 µl acetonitril chứa

tiêu chuẩn nội bộ không bão hòa (M-d3, M3G-d3 và M6G-d3) được trộn xoáy cho

~ 10 giây. Hỗn hợp được ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng / phút. Các

phần nổi phía trên được làm bay hơi bằng N2 ở 40 ºC cho đến khi khô và hơn nữa

hoàn nguyên bằng 30 µl axit formic 0,1% trong nước.

3.3.2 Nước tiểu; Nghiên cứu I-IV

Các mẫu nước tiểu được pha loãng gấp 5 lần với nước. Một lượng nước 125 µl

có chứa chất chuẩn nội không bão hòa được thêm vào 25 µl nước tiểu trong

lọ lấy mẫu tự động.

16
Machine Translated by Google

3.3.3 Tế bào gan; Nghiên cứu III

Bể chứa tế bào gan người được ủ với 100 µM morphin trong dung dịch đệm TRIS HCl

(0,05 M với 0,25 M MgCl2) pH 7,4 và 0,05 M PAPS. Thời gian ủ là 25 phút ở 37 ºC,

tổng thể tích là 125 µl. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 125 µl axetonitril

làm lạnh bằng nước đá. Phần nổi phía trên được loại bỏ và bảo quản ở -20 ºC phân

tích trước sau khi ly tâm ở 4000 × g trong 15 phút ở 4 ºC.

3.3.4 Đồng nhất hóa gan; Nghiên cứu IV

Các mảnh mô gan người được đồng nhất trong dung dịch đệm TRIS-HCl 0,05 M, pH ~ 7,5.

Một thể tích 10 µl chất đồng nhất ở gan, tương đương protein 0,385 mg / mL và đệm

TRIS-HCL được trộn với ~ 4 µl; acetylcodeine, acetyl salicylic

axit, caffein, cocaine, hợp chất 3, hợp chất 4 EtOH, lidocain, loperamide hoặc

procaine với nồng độ từ 6,1-61 µM. Hỗn hợp này (tổng thể tích 0,2 ml) được ủ trước

ở 37 ºC trong 5 phút. Thêm 4 µl dung dịch 6-AM (6,1 µM) và tiếp tục ủ trong 15

phút ở 37ºC. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 200 µl axetonitril nước đá

lạnh và đặt các ống nghiệm trên nước đá. Chất chuẩn nội, codeine-d3, được thêm (10

µl) cùng với 10 µl dung dịch mẫu và 80 µl axit formic 0,1% trong một lọ lấy mẫu

tự động trước khi phân tích.

3.4 PHÂN TÍCH SINH HỌC

3.4.1 Nghiên cứu LC-MS / MS I-IV

Định lượng opiates được thực hiện với LC-MS / MS. Hệ thống LC

bao gồm một hệ thống AQUITY UPLC được kết nối với Quattro Premiere XE hoặc một

Máy khối phổ XEVO TQ (Waters, Milford, MA, USA). Khối lượng song song

quang phổ kế được vận hành ở chế độ tia điện cực dương sử dụng phản ứng đã chọn

giám sát (SRM). Các quá trình chuyển đổi cụ thể được theo dõi được trình bày trong mỗi

giấy. Sự phân tách đạt được bằng sắc ký pha đảo ngược sử dụng

AQUITY UPLC HSS T3 2,1 × 100 mm, 1,8 µm hoặc AQUITY UPLC BEH C18

2,1 × 100 mm, 1,7 µm. Pha động A gồm 0,1%; dung dịch nước

axit và pha động B; metanol hoặc axetonitril. Rửa giải Gradient đã được sử dụng

17
Machine Translated by Google

với tốc độ dòng 0,2 ml / phút hoặc 0,35 ml / phút. Cột phân tích luôn được giữ

ở 60 ºC. Các hệ thống sắc ký khác nhau đã được phát triển để có được sự lưu giữ

và phân tách tối ưu cho các chất phân tích quan tâm.

3.4.2 LC-HRMS

Hệ thống LC bao gồm Dionex Ultima 3000 được kết hợp với máy đo khối

phổ Thermo Scientific Q Exactive (Fremont, CA, USA) hoạt động ở chế độ

tích cực, quét toàn bộ dao động trong phạm vi 90-1.350 m / z và công suất

phân giải 70 000. Quá trình phân tách đạt được trên AQUITY UPLC HSS T3 2,1

× 100 mm, 1,8 µm với pha động bao gồm 2 mM amoni fomat và dung dịch amoniac

0,2% (25%). Pha động B gồm 100% metanol với cùng một lượng amoni fomat và

amoniac. Cột được giữ ở mức 50

ºC và tốc độ dòng chảy là 0,3 ml / phút với tổng thời gian chạy là 18 phút.

3.4.3 Xét nghiệm miễn dịch CEDIA cho các chất dạng thuốc phiện

Thử nghiệm sàng lọc được áp dụng trên Olympus AU 640 (Beckman Coulter,

Indianapolis, IN, Hoa Kỳ) sử dụng thuốc thử CEDIA opiate (Thermo Fisher

Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Cắt ở 300 ng / ml và dải đo từ 0-2000 ng /

ml, 5,4% CV ở 390 ng / ml (n = 212) và 6,7% CV ở 190 ng / ml (n = 214).

3.4.4 DRI Ethyl Glucuronide và Ethyl Alcohol

Xét nghiệm sàng lọc Ethyl glucuronide (EtG) và Ethyl alcohol (EtOH) được thực

hiện trên Olympus AU 640 sử dụng xét nghiệm enzyme EtOH của DRI và xét nghiệm

miễn dịch DRI EtG của Thermo Fisher Scientific. Mức cắt đối với EtG là 500

ng / ml và 5 mM đối với EtOH. Khoảng đo cho EtG là 0-2,0 µg / ml, 4,5% CV ở

0,375 µg / ml (n = 211) và 3,2% CV ở 0,625 µg / ml (n = 209). Phạm vi đo cho

EtOH là 0-20,83, 6,1% CV (n = 210) ở 2,55 mM và 4,2% CV (n = 210) ở 7,5 mM.

18
Machine Translated by Google

3.4.5 GC-MS cho thuốc phiện

Hệ thống GC-MS được sử dụng là hệ thống Thermo Finnigan Voyager Toxlab (Thermo

Electron Co, Waltham, MA, USA). Máy khối phổ được vận hành ở chế độ ion hóa điện

tử bằng cách sử dụng giám sát ion đã chọn (73).

Cột được sử dụng là J&W DB-1701 (độ dày màng 30 mx 0,25 mm x 0,25)

(Agilent Technologies Inc., St. Clara, CA, Hoa Kỳ). Khí mang được sử dụng là He.

Tổng thời gian chạy khoảng 20 phút. Việc chuẩn bị mẫu bao gồm thủy phân bằng

axit clohydric, chiết pha rắn tự động bằng cách sử dụng Bond Elut Certify LRC 130mg từ

Agilent Technologies và hình thành các dẫn xuất silyl. Mức cắt giảm là 150 ng / ml đối

với morphin và codein toàn phần.

Đối với 6 giờ sáng, mức cắt là 10 ng / ml. Đối với phân tích 6-AM, bước thủy phân đã

được bỏ qua. Tỷ lệ không chính xác giữa các thử nghiệm (11) là dưới 10%.

19
Machine Translated by Google

4 KẾT QUẢ

4.1 NGHIÊN CỨU I

Đánh giá tổng hợp và phân tích sinh học của morphin-3-O-sulfat và

morphin-6-O-sulfat trong nước tiểu và huyết tương người bằng LC-MS / MS

4.1.1 Tổng hợp M3S và M6S

Một lộ trình tổng hợp mới đã được phát triển để tổng hợp M6S và M3S.

Khi tuân theo các quy trình được báo cáo trước đó, sản phẩm của M6S không tinh

khiết như đã được tiết lộ qua phân tích LC-MS cẩn thận. Sản phẩm thu được bị

nhiễm dư lượng morphin. Nhận xét này được thực hiện khi nghiên cứu sản phẩm

trung gian 3-acetylmorphine (3-AM). Quá trình acetyl hóa của Welsh dẫn đến 3-

AM chứa cả heroin sản phẩm phụ cũng như morphin chưa phản ứng (74). Ngoài ra,

3-AM tinh khiết không ổn định dẫn đến sự suy thoái trong vài ngày khi bảo quản

trong bóng tối và lạnh (-20 ºC) trong bóng tối. Điều này dẫn đến một hỗn hợp

có chứa 3-AM, heroin và morphin.

Đối với M3S, vấn đề là thu được 6-AM trung gian ở dạng tinh khiết.

Các thủ tục được công bố trước đó phải được cải thiện. Điều này được thực hiện bằng

cách sử dụng một nhóm silyl bảo vệ ở vị trí 6.

Giá trị của việc sử dụng phân tích LC-MS cẩn thận để mô tả đặc tính của sản

phẩm đã được chứng minh trong công trình này. Ví dụ, việc xác định đặc tính về

độ tinh khiết của sản phẩm trung gian morphin-3-axetat-6-sulfat trở nên quan

trọng do tạo ra sản phẩm cuối cùng tinh khiết M6S. Một số lô chứa tạp chất còn

lại, heroin và 6-AM (Hình 5).

20
Machine Translated by Google

Morphine-3-Acetat-6-Sulfate
1,5e6
15000000

m / z 408,4

m / z 328,5

m / z 370,4

6 giờ sáng

Heroin
0

3.0
3 3.5
3.5
4
4.0
4,5
4,5 5.0
5

Thời gian (phút)

Hình 5 Một sắc ký đồ trong quá trình mô tả đặc điểm của

morphin-3-axetat-6-sulfat trung gian lô 1878 với LC-MS

sử dụng giám sát ion đã chọn. Lô hàng này cũng chứa tạp chất
6 giờ sáng và heroin.

Những phát hiện này đã dẫn đến các quy trình mới được phát triển để tổng hợp M3S và

M6S dưới dạng dihydrat. Dẫn đến độ tinh khiết của sản phẩm cao> 99,5 cho M6S với

tổng năng suất 41%. Đối với M3S, độ tinh khiết là> 98% và năng suất tổng thể là 39

%. Để xác định danh tính sản phẩm chính xác, phân tích tia X đơn lẻ là

đã sử dụng.

4.1.2 Phát triển và xác nhận phương pháp

Các hệ thống sắc ký khác nhau được đánh giá dẫn đến việc sử dụng

ACQUITY HSS T3 2,1 × 100 mm, 1,8 µM với pha động A chứa 0,1

% axit fomic và pha động B gồm metanol. Các

sắc ký được chọn dựa trên sự phân tách giữa M3S và M6S và

sự tách biệt so với các chất chuyển hóa khác của morphin; M3G, M6G và

chính morphin. Chỉ có một quá trình chuyển đổi SRM có thể sử dụng được đối với các sulfat morphin

và chúng giống nhau. Vì lý do đó, việc xác định được thiết lập bởi

giám sát các chất phân tích cũng ở chế độ âm tính. Morphine-d3 được chọn làm

tiêu chuẩn nội bộ cho cả sulfat

21
Machine Translated by Google

Phạm vi đo huyết tương là 5-500 ng / ml đối với M3S và 4,5-454 ng / ml đối với

M6S. Trong nước tiểu, khoảng đo là 50-5000 ng / ml đối với M3S và đối với M6S là

45,4-4544 ng / ml. Đáp ứng là tuyến tính trong phạm vi đo. Trong Hình 6, một sắc ký

đồ của một chất hiệu chuẩn nước tiểu được hiển thị. Xét nghiệm trong và tổng số lần

cắt bao quy đầu có CV: s nhỏ hơn 11% với độ chính xác từ 98-111% đối với cả chất phân

tích trong nước tiểu và huyết tương. Hiệu ứng ma trận có ý nghĩa đối với cả M3S và

M6S trong huyết tương, cho thấy mức độ triệt tiêu tín hiệu trung bình là 37% đối với

M6S và 48% đối với M3S. Trong nước tiểu, sự ức chế tín hiệu là <15% đối với cả hai

chất phân tích.

45000 M-d3

M6S
M3S
m / z 289,35 201,35

m / z 366,15 286.40

0 1,5 2 2,5 3

Thời gian (phút)

Hình 6 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nước tiểu chứa 500 ng / ml M3S và 454

ng / ml M6S.

22
Machine Translated by Google

4.1.3 Ứng dụng

Chín mẫu huyết tương được lấy từ bệnh nhân dùng morphin và 8 trong số các mẫu

có chứa 5,8-12,9 ng / ml M3S. Trong 18 mẫu nước tiểu, có thể là từ lượng heroin,

tất cả đều chứa M3S có thể phát hiện được và 13 mẫu có thể định lượng được với

nồng độ từ 69-1500 ng / ml. Không có mẫu nước tiểu hoặc huyết tương nào chứa nồng

độ M6S có thể phát hiện được. LOD cho M6S là 4 ng / ml trong nước tiểu và 0,3

ng / ml trong huyết tương. Trong Bảng 2, kết quả được tóm tắt.

Bảng 2 Nồng độ M3S và M6S cho các mẫu bệnh phẩm được điều tra

Nghiên cứu M3S M6S

N ng / ml N ng / ml

6-13 0 -
Mẫu huyết tương (n = 9) số 8

18 70-1500 0 -
Mẫu nước tiểu (n = 18)

23
Machine Translated by Google

4.2 NGHIÊN CỨU II

Phương pháp khối phổ song song sắc ký lỏng trực tiếp và hiệu quả cho các chất dạng

thuốc phiện trong thử nghiệm ma túy trong nước tiểu – Tầm quan trọng của 6-acetylmorphine và

giảm các chất phân tích

4.2.1 Thiết kế và xác nhận phương pháp

Phương pháp này được thiết kế theo công trình trước đây của chúng tôi (75) nhưng được

sửa đổi bằng cách sử dụng hệ thống Waters UPLC và một khối phổ kế hiện đại hơn.

Khoảng đo đối với morphin và codein là 150-1 000 000 ng / ml đối với M3G 150-600 000

ng / ml, đối với codein glucuronid (CG) 150-400 000 ng / ml, đối với M6G 150-50 000 ng / ml

và trong 6 giờ sáng 2-30 000 ng / ml. Giá trị CV cho tổng số lần không chính xác nhỏ hơn

16% và độ chính xác nằm trong khoảng 96-106%.

Các kiểm soát chất lượng bên ngoài từ chương trình thông thạo Cao đẳng Bệnh học Hoa Kỳ

cho thấy sự đồng ý tốt đối với morphin toàn phần, codein và 6-AM với độ chính xác trong

khoảng 87-110%. Hiệu ứng ma trận là rất lớn đối với hợp chất rửa giải đầu tiên M3G, hiển thị

mức triệt tiêu tín hiệu trung bình là 78% trong thí nghiệm bổ sung. Khi khảo sát hiệu ứng

nền với thí nghiệm truyền dịch, M3G sẽ rửa giải trong quá trình phục hồi tín hiệu (Hình 7).

100%

M3G m / z 462 286

Thời gian (phút)

Hình 7 Đường màu xanh lam hiển thị sắc ký đồ của việc truyền M3G (9500 ng / ml)

ở 10 µl / phút trong khi tiêm mẫu nước tiểu trắng theo dõi quá trình chuyển đổi

SRM m / z 462 đến 286. Đường màu xanh lá cây là sắc đồ của M3G rửa giải ở 1,4

phút.

24
Machine Translated by Google

Việc xác định dựa trên thời gian lưu tương đối chính xác và tỷ lệ ion cho

hai sản phẩm SRM. Hình 8 cho thấy một mẫu sắc ký thu được từ một mẫu thu được sau khi uống

heroin.

CG
M3G-d3 M3G M6G
100%
3250000 CG-d3

M6G-d3
6 giờ sáng

Morphine 6 giờ sáng-3 giờ sáng

Codeine

M-d3 C-d3

0
1,25 2 2,75 3.5

Thời gian (phút)

Hình 8 Một sắc đồ sau khi uống heroin có chứa 14 ng / ml 6-AM, 4590
ng / ml M3G, 965 ng / ml M6G, 340 ng / ml morphin, 225 ng / ml CG.
Codeine ở dưới ngưỡng giới hạn.

25
Machine Translated by Google

So sánh phương pháp định tính với phương pháp GC-MS tham chiếu cho thấy sự

thống nhất tốt. Một số 199 mẫu nước tiểu được phát hiện dương tính khi sàng

lọc chất dạng thuốc phiện CEDIA đã được phân tích bằng phương pháp GC-MS và

phương pháp LC MS / MS. So sánh morphin toàn phần và codein được thể hiện

trong Hình 9. Đối với morphin tổng số, chỉ có hai mẫu bị sai lệch và có nồng

độ gần với mức cắt. Đối với tổng số codeine, một mẫu đơn lẻ bị sai lệch là

một mẫu dương tính giả. Các kết quả sai lệch nằm trong độ không đảm bảo của
đo đạc.

Hình 9 So sánh phương pháp sử dụng GC-MS làm phương pháp tham chiếu (n = 199)

cho thấy 2 mẫu âm tính giả đối với morphin toàn phần và một mẫu dương tính giả
cho tổng số codeine.

26
Machine Translated by Google

4.2.2 Chiến lược diễn giải

Sau khi phương pháp này được sử dụng thường xuyên trong 3 năm, việc đánh giá dữ

liệu đã được thực hiện. Đánh giá được thực hiện bằng cách sử dụng nhóm dữ liệu

của chúng tôi chứa 3155 mẫu (Hình 10) được vẽ biểu đồ theo tổng hàm lượng

morphin và tổng hàm lượng codein. Tổng morphin bao gồm M3G, M6G và morphin.

Tổng số codeine bao gồm codeine và CG. Bốn cụm được tiết lộ trong cốt truyện.

Hai loại chỉ chứa morphin toàn phần hoặc codein và hai loại còn lại chứa các tỷ

lệ morphin và codein khác nhau.

6-Acetylmorphin
Nơi làm việc
Chăm sóc y tế

Cắt 150 ng / ml

3155 mẫu nước tiểu

0
0

Tổng số codeine (ng / ml)

Hình 10 Kết quả từ 3155 mẫu nước tiểu đích thực. Chấm màu đỏ là các mẫu chứa 6 giờ

sáng, các chấm màu xanh dương đại diện cho các mẫu từ chăm sóc y tế và các mẫu màu

xanh lá cây là từ nơi làm việc tất cả đều âm tính với 6 giờ sáng. Các giá trị bị cắt

bên dưới được mô tả bằng 0.

27
Machine Translated by Google

4.2.2.1 Lượng Heroin

Các chất phân tích mong đợi sau khi uống heroin chủ yếu là morphin và các

chất chuyển hóa của nó, ngoài ra còn có 6-AM, codeine và CG. Một tiêu chí an

toàn cho lượng heroin là sự hiện diện của chất chuyển hóa heroin 6-AM. Một

số 365 mẫu chứa 6-AM. Trong số này có 95 mẫu (26%) có tổng morphin <2500 ng / ml.

Lượng heroin cũng có thể được xác định bằng tỷ lệ tổng morphin trên codein

mà không có 6-AM. Các mẫu chứa 6-AM và nồng độ có thể định lượng của tổng

morphin và codein được sử dụng làm tham chiếu để tính toán khoảng thời gian

dự đoán 95%. Biểu đồ tần suất được hiển thị trong Hình 11 về tỷ lệ morphin

tổng số so với codein đối với các mẫu chứa 6-AM. Khoảng thời gian dự đoán được

tính là 4,4-28,4.

200
166
150

100

53
50

4 4 6 12 12 5
0
0-2 2-4 4-6 6-8 8-10 10-20 20-30 30-50

Tổng morphin / Tổng số codein

Hình 11 Biểu đồ tần số cho các mẫu chứa 6-AM và nồng độ có thể

định lượng của tổng morphin trên codein (n = 262). Tỷ lệ trung bình

là 11,5 và khoảng thời gian dự đoán 95% được tính là 4,4-28 đối với

morphin toàn phần> 2500 ng / ml.

28
Machine Translated by Google

Khi áp dụng khoảng tỷ lệ và tiêu chí 6 giờ sáng, chúng tôi nhận được tổng số

444 mẫu. Thêm 78 mẫu đáp ứng tiêu chí khoảng tỷ lệ (Hình 12).

6-Acetylmorphin
Nơi làm việc
Chăm sóc y tế

10 ^ 6

10 ^ 5

10 ^ 4

10 ^ 3

10 ^ 2

Cắt 150 ng / ml

10 ^ 1

0
10 ^

0
10 ^ 10 ^ 1 10 ^ 2 10 ^ 3 10 ^ 4 10 ^ 5 10 ^ 6

Tổng số codeine (ng / ml)

Hình 12 Các mẫu đáp ứng các tiêu chí của heroin. Các chấm màu đỏ là các

mẫu chứa 6-AM và các chấm xanh lam và xanh lá cây là các mẫu đáp ứng tỷ lệ

morphin / codein tổng số 4,4-28.

29
Machine Translated by Google

4.2.2.2 Hạt anh túc

Nồng độ morphin thấp có thể bắt nguồn từ chế độ ăn uống có hạt anh túc vì lý do này phải

đặt giới hạn thấp hơn. Trong nghiên cứu này, giới hạn dưới được đặt là 2500 ng / ml đối với

morphin toàn phần. Mặc dù việc hấp thụ codeine cũng có thể dẫn đến nồng độ morphin toàn phần

thấp, do đó phải thực hiện các mẫu có tỷ lệ morphin toàn phần trên codein> 2. Do đó, lượng hạt

anh túc ăn vào trong nghiên cứu của chúng tôi được định nghĩa là morphin tổng số <2500 ng / ml

với tỷ lệ> 2 đối với morphin tổng số trên

codeine.

4.2.2.3 Codeine

Để thiết lập tiêu chí cho lượng codeine, chúng tôi đã sử dụng các mẫu từ nơi làm việc làm dân

số tham chiếu để tính toán khoảng thời gian dự đoán 95% (màu xanh lục trong Hình 10). Khoảng

thời gian được tính là 0,009-2,58 cho một lượng codeine.

Một tiêu chí khác cho việc tiêu thụ codeine là các mẫu chỉ chứa codeine.

Do đó, lượng codeine tiêu thụ trong nghiên cứu của chúng tôi được xác định là tỷ lệ <2,58

đối với morphin toàn phần so với codeine hoặc các mẫu chỉ chứa codeine.

4.2.2.4 Morphine

Các mẫu chỉ chứa morphin tổng số trên 2500 ng / ml và không có codein hoặc 6-AM có thể phát

hiện được được hiểu là có thể sử dụng morphin hoặc có thể là hêrôin.

30
Machine Translated by Google

4.2.2.5 Chiến lược diễn giải đề xuất

Chúng tôi đã đề xuất một chiến lược giải thích khả thi trên cơ sở tính toán thống

kê. Chiến lược diễn giải được nêu trong Hình 13 và đang phân loại tất cả các mẫu

nước tiểu trong kho dữ liệu của chúng tôi.

Chiến lược phiên dịch

1. Lượng Heroin (n = 365, 11,7 %)
-các ví dụ có chứa 6 giờ sáng

2. Có thể ăn morphin, codein hoặc hạt anh túc (n = 862, 27,3 %)

-tổng morphin <2500 ng / ml và morphin / codein toàn phần> 2

3. Lượng heroin có thể có (n = 78, 2,5 %)

-tổng tỷ lệ morphin / codein khoảng 4,4-28,4 không tính 6 giờ sáng

4. Lượng codeine (n = 1600, 50,7 %)

- tổng khoảng tỷ lệ morphin / codein
<2,58 cho tổng số codeine

-các ví dụ chỉ chứa codeine

5. Lượng Heroin / morphin (n = 213, 6,7 %)

- mẫu chỉ chứa morphin> 2500 ng / ml

6. Dư lượng (n = 37, 1,2 %)

Hình 13 Chiến lược diễn giải được đề xuất

31