Machine Translated by Google

Tác động khác biệt của sự ức chế HIF-1 bởi YC-1 đối với
Kết quả tổng thể và Thiệt hại Rào cản Máu-Não trong một
Mô hình chuột đột quỵ do thiếu máu cục bộ

Jingqi Yan1., Bo Zhou1.¤ , Saeid Taheri2 , Honglian Shi1 *

1 Khoa Dược lý và Độc chất, Đại học Kansas, Lawrence, Kansas, Hoa Kỳ, 2 Khoa Thần kinh, Đại học South

Carolina, Columbia, Nam Carolina, Hợp chủng quốc Hoa Kỳ

trừu tượng

Yếu tố gây giảm oxy máu 1 (HIF-1) là một chất điều hòa chính của sự thích ứng của tế bào với tình trạng thiếu oxy máu và đã được đề xuất như một mục tiêu
điều trị mạnh trong bệnh thiếu máu não. Ở đây chúng tôi cho thấy trong một mô hình đột quỵ do thiếu máu cục bộ của chuột ức chế HIF-1 và các gen hạ lưu của

nó bởi 3- (5'-hydroxymethyl-2'-furyl) -1-benzylindazole (YC-1) làm tăng đáng kể tỷ lệ tử vong và mở rộng thể tích nhồi máu được đánh giá bằng MRI và nhuộm

mô học. Điều thú vị là sự ức chế HIF-1 cải thiện đáng kể sự gián đoạn hàng rào máu não do thiếu máu cục bộ (BBB) gây ra bởi sự rò rỉ màu xanh Evans mặc dù

nó không ảnh hưởng đến phù não. Kết quả chứng minh rằng sự ức chế HIF-1 có tác động khác nhau đến kết cục thiếu máu cục bộ và tính thấm BBB. Nó chỉ ra rằng

HIF-1 có thể có các chức năng khác nhau trong các tế bào não khác nhau. Các phân tích sâu hơn cho thấy thiếu máu cục bộ điều chỉnh HIF-1 và các gen hạ lưu

của nó là erythropoietin (EPO), yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) và chất vận chuyển glucose (Glut) trong tế bào thần kinh và tế bào nội mô não và

YC-1 ức chế sự biểu hiện của chúng. Chúng tôi cho rằng VEGF do HIF-1 gây ra làm tăng tính thấm BBB trong khi một số protein khác được mã hóa bởi các gen hạ
lưu của HIF-1 như epo và glut cung cấp bảo vệ thần kinh trong não thiếu máu cục bộ. Kết quả chỉ ra rằng YC-1 không có tiềm năng như một phương pháp điều

trị thiếu máu não mặc dù nó mang lại sự bảo vệ nhất định cho hệ thống mạch máu não.

Trích dẫn: Yan J, Zhou B, Taheri S, Shi H (2011) Ảnh hưởng khác biệt của sự ức chế HIF-1 bởi YC-1 đối với kết quả tổng thể và thiệt hại rào cản máu-não ở mô hình chuột bị đột quỵ do
thiếu máu cục bộ. PLoS ONE 6 (11): e27798. doi: 10.1371 / journal.pone.0027798

Biên tập viên: Christoph Kleinschnitz, Julius-Maximilians-Universita¨t Wu¨rzburg, Đức

Nhận ngày 7 tháng 9 năm 2011; Được chấp nhận ngày 25 tháng 10 năm 2011; Xuất bản ngày 16 tháng 11 năm 2011

Bản quyền: 2011 Yan et al. Đây là một bài báo truy cập mở được phân phối theo các điều khoản của Giấy phép Ghi nhận tác giả Creative Commons, cho phép sử dụng, phân phối và tái sản
xuất không hạn chế ở bất kỳ phương tiện nào, miễn là tác giả và nguồn gốc được ghi công.

Kinh phí: Nghiên cứu này được hỗ trợ một phần bởi khoản tài trợ từ Viện Y tế Quốc gia (R01NS058807) và quỹ khởi nghiệp của Trung tâm Nghiên cứu Đại học Kansas từ Đại học Kansas.
Không có thêm tài trợ bên ngoài nào được nhận cho nghiên cứu này. Các nhà tài trợ không có vai trò gì trong việc thiết kế nghiên cứu, thu thập và phân tích dữ liệu, quyết định xuất
bản hoặc chuẩn bị bản thảo.

Các lợi ích cạnh tranh: Các tác giả đã tuyên bố rằng không có lợi ích cạnh tranh nào tồn tại.

* E-mail: hshi@ku.edu

. Các tác giả này đã đóng góp như nhau cho công việc này.

¤ Địa chỉ hiện tại: Khoa Phẫu thuật Thần kinh, Bệnh viện Tây Trung Quốc, Đại học Tứ Xuyên, Tứ Xuyên, Trung Quốc

Giới thiệu để bảo vệ tế bào thần kinh khỏi quá trình chết rụng do stress oxy hóa [9] và

thiếu máu cục bộ não khu trú [10–12]. Hơn nữa, sự đánh sập tế bào thần kinh đặc

Kể từ khi yếu tố cảm ứng giảm oxy 1 (HIF-1) được phát hiện như một chất điều hiệu của HIF-1a làm tăng tổn thương mô và giảm tỷ lệ sống sót của chuột bị tắc

chỉnh chính trong tình trạng thiếu oxy cách đây khoảng hai mươi năm, nghiên cứu động mạch não giữa (MCAO) [4]. Mặt khác, một số nhóm đã báo cáo tác dụng ngược

sâu rộng đã tiết lộ rằng HIF-1a, tiểu đơn vị điều hòa của HIF 1, được tạo ra lại của HIF-1 trong chứng thiếu máu não. Ví dụ, Halterman et al. báo cáo rằng

trong não trong điều kiện thiếu oxy / thiếu máu cục bộ [ 1]. HIF-1a điều phối hoạt động của p53 trong việc thúc đẩy quá trình chết tế bào

Ví dụ, tình trạng thiếu oxy toàn thân, bất kể thời gian của nó (1, 3 hoặc 6 giờ thần kinh chậm do thiếu máu cục bộ gây ra thay vì cung cấp sự bảo vệ thần kinh

(giờ)), đã làm tăng hàm lượng hạt nhân của HIF-1a trong não chuột [2]. HIF-1a [13]. Sử dụng chuột loại HIF-1a dành riêng cho tế bào thần kinh tương tự như

được gây ra đáng kể trong vỏ não chuột sau 1 giờ phục hồi sau khi ngừng tim và trong nghiên cứu trước đây của Baranova et al.

vẫn tăng trong hơn 12 giờ [3]. Một nghiên cứu gần đây hơn cho thấy sự kích hoạt

hai pha của HIF-1 sau đột quỵ kéo dài đến 10 ngày [4]. [4], Helton và cộng sự. quan sát thấy rằng việc loại bỏ HIF-1a làm giảm tổn

thương do thiếu máu cục bộ [14].

Hơn nữa, HIF-1a dường như chủ yếu được tạo ra trong vùng đệm, mô có thể cứu Là một yếu tố phiên mã, HIF-1 phát huy tác dụng thông qua các protein được

được, trong não thiếu máu cục bộ [5]. mã hóa bởi các gen hạ lưu của nó như erythropoietin (epo), yếu tố tăng trưởng

Mặc dù người ta kết luận rằng thiếu máu cục bộ gây ra sự biểu hiện của HIF-1, nội mô mạch máu (vegf) và chất vận chuyển glucose (glut), v.v.

vai trò của HIF-1 trong não thiếu máu cục bộ vẫn còn gây tranh cãi. Các gen hạ nguồn này có thể biểu hiện khác nhau và thực hiện các chức năng khác

Một mặt, HIF-1 điều chỉnh sự biểu hiện của một loạt các gen tạo điều kiện cho tế nhau trong các loại tế bào khác nhau. Ví dụ, VEGF đã được báo cáo là có các tác

bào thích nghi với điều kiện oxy thấp. Mục tiêu của nó bao gồm các gen mã hóa động khác nhau đến các tổn thương tế bào và mô. Một mặt, nó có thể trực tiếp

các phân tử tham gia vào quá trình tạo hồng cầu, tăng sinh tế bào và chuyển hóa chống lại các tác động thần kinh có hại liên quan đến đột quỵ [15,16].

năng lượng [6–8]. Mỗi chức năng này đều có khả năng đóng góp vào sự sống còn của

tế bào thần kinh trong bệnh thiếu máu cục bộ. Thật vậy, HIF-1 đã được báo cáo VEGF hỗ trợ sự tồn tại của các tế bào thần kinh vận động chính khỏi quá trình

chết tế bào do thiếu oxy gây ra bằng cách liên kết với neuropilin-1, a

PLoS MỘT | www.plosone.org 1 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798

Machine Translated by Google
thụ thể được biết là có liên quan đến hướng dẫn sợi trục trong quá
trình phát triển [17]. Mặt khác, VEGF thúc đẩy tính thẩm thấu của hàng
rào máu não (BBB) bằng cách thay đổi các điểm nối chặt chẽ trong điều
kiện thiếu máu cục bộ và viêm [18,19]. Ức chế VEGF bằng chất ức chế
HIF-1 cải thiện tính thấm BBB theo quan sát của Yeh và cộng sự [18].
Hiểu được tác dụng phụ thuộc vào loại tế bào của HIF-1 chắc chắn sẽ
làm sáng tỏ vai trò của nó trong bệnh thiếu máu não và cung cấp các
phương pháp tiếp cận tiềm năng để phát huy tác dụng có lợi và giảm
chức năng bất lợi của nó.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định tác dụng của việc ức
chế HIF-1 bởi YC-1 (3- (5'-hydroxymethyl-2'-furyl) -1-benzylindazole,
Hình 1), một chất ức chế HIF-1 đã được thành lập, trên kết cục thiếu
máu cục bộ ở mô hình chuột bị thiếu máu não thoáng qua với các thông
số sau: thể tích nhồi máu và tính thấm BBB. Hơn nữa, chúng tôi đã
nghiên cứu tác động của YC-1 lên sự biểu hiện của các gen hạ lưu HIF-1
vegf, epo và glut-1, 3 trong tế bào thần kinh và tế bào nội mô não sau
khi thiếu máu não. Các thí nghiệm nhằm tiết lộ các tác động khác biệt
của HIF-1 trong các tế bào não khác nhau trong
Thiếu máu cục bộ. Điều này sẽ cung cấp bằng chứng thực nghiệm để hiểu
những tác động hấp dẫn của HIF-1 trong đột quỵ do thiếu máu cục bộ.
Nguyên liệu và phương pháp
Mô hình động vật
Tất cả các thủ tục sử dụng động vật đã được Tổ chức phê duyệt
Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Đại học New Mexico (giao thức
05HSC045) và Đại học Kansas (giao thức 192–01) và tuân thủ Hướng dẫn
NIH về sử dụng động vật trong
nghiên cứu. Chuột Sprague-Dawley đực, 280–310 g, là từ Phòng thí nghiệm
sông Charles (Wilmington, MA). Các loài động vật được duy trì trong
một trại vivarium được kiểm soát khí hậu với chu kỳ sáng tối kéo dài
12 giờ và được tiếp cận miễn phí thức ăn và nước uống. Chuột đã được
làm quen với môi trường trong 7 ngày trước khi thí nghiệm.
Đối với tất cả các quy trình phẫu thuật và quét MRI, 4,0% isoflurane
trong N2O: O2 (70%: 30%) được sử dụng để gây mê và 2,0% để duy trì
gây mê. Các thông số sinh lý (ví dụ: nhịp tim, nhịp hô hấp và huyết
áp) được theo dõi trong suốt quá trình bằng Hệ thống Giám sát SAII
(Tương thích với MRI
Hình 1. Cấu trúc hóa học của chất ức chế HIF-1 YC-1. doi:
10.1371 / journal.pone.0027798.g001
PLoS MỘT | www.plosone.org
Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não
Model 1025, Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY).
Nhiệt độ lõi (trực tràng) được duy trì ở 37.560,5uC bằng cách sử dụng
miếng đệm làm nóng. Cảm biến sợi quang siêu nhỏ được sử dụng để theo
dõi huyết áp và nhịp tim liên tục, xâm lấn tối thiểu bằng cách đưa
đầu sợi quang vào động mạch đùi trái.
Tắc động mạch não giữa (MCAO) sau đó là phản ứng tổng hợp reper
được tiến hành bằng cách sử dụng mô hình nội tủy như đã mô tả trước
đây [20]. Một cách ngắn gọn, động mạch cảnh ngoài (ECA), động mạch
cảnh trong (ICA) và động mạch mộng thịt của ICA được tiếp xúc. Một
chỉ khâu nylon monofilament phủ cao su silicone được đưa vào ICA qua
một khe trên ECA. Đường khâu đã được cải tiến dọc theo ICA trong phạm
vi 18 đến 19 mm từ vết nứt. Tái tưới máu được tạo ra bằng cách nhẹ
nhàng rút chỉ khâu cho đến khi mũi khâu chạm đến chỗ phân đôi và vết
mổ đóng lại. Sau khi phẫu thuật, các con vật được phép hồi phục sau
khi gây mê trong khi được cung cấp thức ăn và nước uống.
Buprenorphine được dùng làm thuốc giảm đau sau phẫu thuật. Đối với
tất cả các động vật được sử dụng trong nghiên cứu này, MCAO thành công
đã được xác nhận bằng phương pháp đo lưu lượng Doppler laser (LDF)
(Moor Instruments, Wilmington, DE) như được mô tả trong tài liệu
[21]. Trong giai đoạn thiếu máu cục bộ, lưu lượng máu vùng não giảm
xuống còn 16,261,7% mức trước thiếu máu cục bộ; và sau khi tái tưới
máu, lưu lượng máu được phục hồi đến 89,564,0% mức trước thiếu máu
cục bộ. Động vật chết trong quá trình tái tưới máu không được đo kích
thước ổ nhồi máu, tính thấm BBB và biểu hiện HIF-1a. Tỷ lệ tử vong
được xác định theo từng nhóm và được sử dụng như một thông số quan
trọng cho tác dụng bất lợi của chất ức chế HIF-1a.
Các nhóm thí nghiệm Tổng
cộng 90 con chuột đực Sprague-Dawley (SD) được phân ngẫu nhiên vào
ba nhóm sau: YC-1 (không có MCAO, n = 5), MCAO (n = 40), và MCAO được
xử lý trước với YC-1 (n = 45). Trong nhóm MCAO (nhóm chứng) và MCAO +
YC-1, 15 con chuột được sử dụng để đo kích thước ổ nhồi máu bằng
phương pháp nhuộm MRI và TTC; 15 con chuột để đánh giá độ thấm BBB;
và 10-15 con chuột cho phương pháp nhuộm thấm và nhuộm bằng phương
pháp Western (Bảng 1).
Sử dụng chất ức chế HIF-1 YC-1
YC-1 (Công ty Hóa chất Cayman, Ann Arbor, MI), được hòa tan trong
dung dịch 1% dimethyl sulfoxide (DMSO), được sử dụng với liều lượng
2 mg / kg thể trọng qua tĩnh mạch đùi lúc 24 giờ 30 phút trước khi
bắt đầu thiếu máu cục bộ. Chuột trong nhóm đối chứng đã được tiêm
dung dịch DMSO tương đương. Để ức chế HIF-1, các nhà nghiên cứu đã sử
dụng các liều lượng khác nhau của YC-1, từ 1 đến 30 mg / kg BW
[18,22,23]. Chúng tôi đã chọn cách tiêm kép với liều lượng 2 mg / kg
dựa trên các phân tích sơ bộ của chúng tôi về sự biểu hiện HIF 1a sau
các lần điều trị. Như thể hiện trong Hình 2, thiếu máu cục bộ (MCAO
90 phút với tái tưới máu 24 giờ) gây ra sự điều hòa mạnh mẽ của HIF-1a
trong vỏ não bên và các tiền xử lý YC-1 ức chế rõ rệt sự biểu hiện của
HIF-1a.
Phân tích Western blot Các
mẫu được lấy từ vỏ não lãnh thổ MCA ở các bên thiếu máu cục bộ (bên
cạnh) và bên không thiếu máu cục bộ (bên cạnh) bằng cách sử dụng thể
tích làm mốc bụng. Các mô được đồng nhất trong dung dịch đệm RIPA
lạnh đá với 1 mg / ml của một loại cocktail ức chế protease (Thermo
Scientific, Rockford, IL, USA).
Các chất đồng nhất được ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng / phút trong 15
phút ở 4uC; và các chất nổi phía trên đã được thu thập. Các xét nghiệm
để xác định nồng độ protein của chất nổi sau đó được thực hiện với bộ
BCA (Micro BCA, Pierce). Phần nổi phía trên được phân đoạn trong gel
8% SDS-polyacrylamide và chuyển sang màng nitrocellulose. Các màng bị
chặn trong PBS chứa 5% sữa khô không béo và 0,01% Tween
2 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798
Machine Translated by Google
Bảng 1. Tỷ lệ chết của chuột MCAO do YC-1 gây ra và quy mô nhóm cho các phân tích cuối cùng.
Các nhóm Quy mô nhóm ban đầu
MCAO MRI 15
BBB 15
HIF 10
Tổng cộng 40
YC-1 + MCAO MRI 15
BBB 15
HIF 15
Tổng cộng 45
một
b Trong nhóm MCAO này, bốn con vật bị loại do không có thiếu hụt thần kinh rõ ràng và một con do chảy máu trong quá trình làm thủ thuật. một người bị
c
loại do thiếu các khuyết tật thần kinh rõ ràng. doi: 10.1371 / journal.pone.0027798.t001
Tỷ lệ tử vong sau khi hoàn thành MCAO thành công.
20. Các màng sau đó được ủ với các kháng thể khác nhau
qua đêm ở 4uC. Các kháng thể chính cho phương pháp thấm tây
là HIF-1a (Novus Biologicals, Littleton, CO), VEGF (sc-507,
Santa Cruz, Santa Cruz, CA), EPO (sc-7956, Santa Cruz) và
GLUT-3 (ab53095, Abcam, Cambridge, MA, Hoa Kỳ). Của chúng
kháng thể thứ cấp là IgG-HRP của dê chống thỏ (đến năm 2030,
Santa Cruz). Là một kiểm soát nội bộ, cùng một màng
được ủ với kháng thể đặc biệt cho b-actin (Santa Cruz,
1: 1000) sau khi bị tước. Kháng thể thứ cấp cho actin cũng là
dê chống thỏ IgG-HRP (sc-2030, Santa Cruz). Các đốm
được phát hiện bằng cách phát quang hóa học với thuốc thử phát quang hóa
học tăng cường (ECL; Amersham Pharmacia Biotech).
Đo kích thước ổ nhồi máu bằng cộng hưởng từ
hình ảnh và nhuộm TTC
Những con chuột được vận chuyển đến phòng chụp cộng hưởng từ bên cạnh cuộc phẫu thuật
phòng vào cuối 24 giờ tái tưới máu và được đặt ở trung tâm của
nam châm trước khi phiên chụp ảnh. MRI được thực hiện trên một
Máy quét 4,7 T Biospecs MR (Bruker Biospin, Billerica, MA). Một
cuộn dây gradient được che chắn tích cực với đường kính bên trong 120 cm là
đã sử dụng. Các con vật được giữ ở cùng một vị trí trong suốt
hình ảnh. Đối với mỗi con vật, chúng tôi thực hiện MRI có trọng số T2 bằng cách
sử dụng thu nhận nhanh chóng với chuỗi tiếng vọng tái tập trung. Hình ảnh
dữ liệu sau đó được chuyển đến một máy trạm chạy Linux cho
tiếp tục xử lý. Từ cộng hưởng từ trọng số T2
hình ảnh, chúng tôi tính toán thể tích nhồi máu bằng ImageJ.
Sau khi quét MRI, não được cắt bỏ và phân thành
2 mm lát. Các lát được ủ trong dung dịch TTC 2% trong
0,1 M PBS (pH 7,4) ở 37uC trong 30 phút và cố định ở 10%
formalin. Nhuộm TTC đã được sử dụng rộng rãi để phản ánh chính xác
mức độ tổn thương do thiếu máu cục bộ không thể phục hồi trong các mô não ở
chuột [24]. Các phần não nhuộm TTC được chụp bằng cách sử dụng
máy ảnh kỹ thuật số (máy ảnh kỹ thuật số Powershot 400, Canon). Nhồi máu
kích thước được tính toán bởi nhà nghiên cứu (Saeid Taheri) mù với
các phương pháp điều trị được đưa ra; và tỷ lệ phần trăm của khu vực nhồi máu với
so với tổng diện tích đã được ImageJ định lượng kỹ thuật số. Đến
bù đắp cho hiệu ứng của phù não, nhồi máu được điều chỉnh
diện tích đã được tính toán như đã mô tả trước đây [25]. Phù nề
khối lượng được tính toán bằng cách đo khối lượng của
(VIpsi) và bán cầu bên cạnh (VContra) và sử dụng
công thức: thể tích phù = VIpsi2VContra [26].
Nhuộm hóa mô miễn dịch
Sau khi tái tưới máu 24 giờ, chuột được truyền dịch qua tim với
PBS lạnh bằng đá dưới gây mê và sau đó với 4% paraformalde
PLoS MỘT | www.plosone.org
Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não
MCAO không thành công Cái chết sau khi MCAO thành công Kích thước nhóm cho các phân tích cuối cùng
2 1 12
3 0 12
0 0 10
5a 1 (2,9%) c
1 5 9
0 6 9
0 5 10
1b 16 (36,4%) c
Trong nhóm YC-1 + MCAO,
hyde. Não được cô lập và cố định qua đêm trong 4% paraformal dehyde. Các
bộ não sau đó được nhúng vào hợp chất OCT
(Sakura Finetek Hoa Kỳ, Torrance, CA) và được chia thành từng phần tại
Độ dày 10 mm sử dụng microtome rung (Leica Microsystems,
Bannockburn, IL). Sau khi chúng được rửa sạch và không đặc hiệu
các vị trí liên kết bị chặn bằng PBS chứa 0,05% triton X100 và 0,25% BSA
trong 45 phút, các lát não được ủ
với các kháng thể chính chống lại HIF-1a (04–1006, Millipore,
Billerica, MA), VEGF (sc-507, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), EPO
(sc-7956, Santa Cruz), GLUT-3 (ab53095, Abcam, Cambridge,
MA, USA) và GLUT-1 (ab652, Abcam, Cambridge, MA)
cùng với các kháng thể chính chống lại NEUronal Nuclei
(NeuN, MAB377, Millipore) và kết dính tế bào nội mô tiểu cầu
phân tử-1 (PECAM-1, CBL468, Millipore) trong khối
dung dịch ở 4uC qua đêm. Sau ba lần rửa, các lát được
được ủ với kháng thể thứ cấp phát huỳnh quang (lừa chống thỏ Alexa 488 và
dê chống chuột Alexa 488, phân tử
Đầu dò, Carlsbad, CA). Sau khi rửa, các lát được gắn kết
với phương tiện Vectashield (H-1000, Phòng thí nghiệm Vector, trò chơi
Burlin). Hình ảnh được chụp dưới Leica DMI 4000B
kính hiển vi huỳnh quang.
Xác định tính thấm hàng rào máu não
Thuốc nhuộm màu xanh Evans (100 mg / kg, Sigma) được tiêm vào xương đùi
tĩnh mạch 2 giờ sau khi bắt đầu tái tưới máu theo một
báo cáo [18]. Vào cuối giờ tái tưới máu, những con chuột được truyền dịch
muối qua tâm thất trái cho đến khi dịch truyền không màu là
thu được từ tâm nhĩ phải. Sau khi bị chặt đầu, bộ não đã
lấy ra khỏi hộp sọ; và vỏ não từ mỗi bán cầu
đã được đem ra mổ xẻ. Cân và ngâm mẫu trong ml 50%
dung dịch axit tricloaxetic. Sau khi đồng nhất và gation ly tâm, thuốc
nhuộm màu xanh Evans chiết xuất được pha loãng với etanol
(1: 3); và cường độ huỳnh quang được đo ở bước sóng 620 nm và
680 nm đối với kích thích và phát xạ, tương ứng, sử dụng
máy đọc huỳnh quang. Nội dung mô của thuốc nhuộm màu xanh Evans là
được định lượng từ một đường cong chuẩn tuyến tính suy ra từ
lượng thuốc nhuộm và được biểu thị bằng microgam trên gam
khăn giấy.
Phân tích thống kê
Các kết quả được trình bày dưới dạng trung bình với sai số tiêu chuẩn là
bần tiện. Sự khác biệt giữa các nhóm được thiết lập bằng cách sử dụng
kiểm tra sự khác biệt ít nhất có ý nghĩa (LSD) hoặc ANOVA. Ý nghĩa là
được đánh giá ở mức p, 0,05.
3 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798
Machine Translated by Google

Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não

Hình 2. Ảnh hưởng của YC-1 đến sự biểu hiện của HIF-1 trong não thiếu máu cục bộ. Mức độ protein HIF-1a và các protein dòng chảy của nó EPO, VEGF
và GLUT-3 đã được phân tích bằng phương pháp thấm phương tây trong não của những con chuột bị thiếu máu cục bộ trong 90 phút và tái tưới máu
trong 24 giờ. Chuột được nhận YC-1 (2 mg / kg, iv) vào 24 giờ 30 phút trước khi bắt đầu thiếu máu cục bộ. (A) Các khối Tây đại diện của HIF-1a và
các protein dòng chảy của nó. (B) Định lượng mức protein HIF-1a. (C) Định lượng mức protein VEGF. (D) Định lượng mức protein EPO. (E) Định lượng
mức protein GLUT-3. Giá trị được chuẩn hóa cho b-actin và bán cầu bên cạnh của động vật đối chứng. Giá trị có nghĩa là 6 SEM, n = 5. # p, 0,05 so
với bán cầu bên cạnh của động vật đối chứng, * p, 0,05 so với bán cầu bên ngoài của động vật đối chứng. doi: 10.1371 / journal.pone.0027798.g002

Kết quả
YC-1 ngăn chặn sự biểu hiện của HIF-1a và các gen dòng chảy của nó
trong não thiếu máu cục bộ
Để xác minh rằng liều YC-1 được sử dụng cho chuột có hiệu quả trong
việc ức chế HIF-1, mức độ protein của HIF-1a và các gen hạ lưu của nó,
epo, vegf và glut-3, ở bán cầu bên và bán cầu bên của não thiếu máu cục
bộ. được phân tích bằng phương pháp thấm phương tây sau khi các con
vật được MCAO 90 phút và tái tưới máu 24 giờ. Như được hiển thị trong
Hình 2A và 2B, thiếu máu cục bộ làm tăng đáng kể mức HIF 1a ở bán cầu
bên cạnh, so với bán cầu bên cạnh. Sự gia tăng đã bị ức chế đáng kể
bởi YC-1 ở cả bán cầu bên và bán cầu bên. Tương tự, sự gia tăng biểu
hiện của VEGF, EPO và GLUT-3 trong não thiếu máu cục bộ đã bị ngăn chặn
bởi phương pháp điều trị YC-1 (Hình 2C-E). Những kết quả này chỉ ra
rằng liều lượng sử dụng YC-1 đã ngăn chặn hiệu quả sự biểu hiện của
chứng thiếu máu cục bộ gây ra sự biểu hiện của HIF-1a và các gen dòng
chảy của nó trong mô hình chuột bị đột quỵ do thiếu máu cục bộ.

PLoS MỘT | www.plosone.org 4 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798

Machine Translated by Google
Tiền xử lý YC-1 làm tăng tỷ lệ chết của chuột sau khi thiếu
máu cục bộ YC-1 ở mức 2 mg / kg không gây chết ở năm động vật
đối chứng âm tính (không có MCAO). Như được liệt kê trong Bảng
1, YC-1 làm tăng đáng kể tỷ lệ tử vong của chuột MCAO. Có 16
trường hợp tử vong ở những con chuột được điều trị bằng YC-1
được MCAO thành công, cho thấy tỷ lệ tử vong là 36,4% (16/44). Chỉ
có một con chết trong số những con chuột MCAO mà không có phương
pháp điều trị YC-1, cho thấy tỷ lệ tử vong là 2,9% (1/35).
YC-1 làm tăng tổn thương mô não sau khi thiếu máu cục bộ
MRI có trọng số T2 được sử dụng để xác định sự tiến triển của tổn thương
mô não của chuột MCAO. Hình ảnh quét có trọng số T2 cho thấy sự thay đổi và
tổn thương trong các mô não [27]. Điểm đáng khen của MRI là hình ảnh của
não phản ánh các điều kiện thời gian thực và cho phép chúng tôi theo dõi sự
tiến triển của nhồi máu ở cùng một con vật. Để tiết lộ sự tiến triển của
nhồi máu ở chuột MCAO, trước tiên, chúng tôi thu thập một loạt hình ảnh T2
phụ thuộc thời gian trên các con vật giống nhau (Hình 3A).
Tại mỗi thời điểm, vùng nhồi máu của động vật được điều trị bằng YC-1 lớn
hơn đáng kể so với vùng đối chứng (tức là MCAO không có YC-1). Hình 3B cho
thấy hình ảnh T2 của một loạt các phần não sau khi tái tưới máu trong 24
giờ. Trong mỗi phần não, YC-1 tăng diện tích nhồi máu. Thể tích ổ nhồi máu
được tính toán dựa trên diện tích tăng cường trong các hình ảnh T2W này.
Tổng thể tích nhồi máu thể tích, thể tích vân và nhồi máu vỏ não của chuột
MCAO được điều trị bằng YC-1 lần lượt là 557.4661.0, 172.2625.2 và 385.26
43.0 mm3 (Hình 3C). Trong
163.4637,5, nhóm đốivàchứng,
68,7624,9 các thể
94,6627,4 mm3 tích
. này lần lượt là
,
Chúng tôi cũng thực hiện phương pháp nhuộm TTC, một phương pháp cổ điển
trong nghiên cứu đột quỵ, để đánh giá tổn thương não do MCAO và YC-1 gây ra.
Một loạt quá trình nhuộm TTC của các phần não được thể hiện trong Hình 3B.
Thể tích nhồi máu được đo bằng phương pháp nhuộm TTC chứng minh rằng YC-1
gây nhồi máu nặng hơn. Khối lượng nhồi máu trong YC
1 nhóm được xử lý trước là 492.8667,3 mm3 so với 131,6647,4 mm3 ở nhóm đối
chứng. Như thể hiện trong Hình 3D, tỷ lệ phần trăm thể tích nhồi máu từ
toàn bộ thể tích não ở nhóm YC-1 và nhóm chứng lần lượt là 43,565,6% và
15,161,4%. Phù não cũng được tính toán sau MCAO và 24 giờ tái tưới máu
(Hình 3E).
Không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm YC-1 và nhóm chứng về thể tích
phù (62,0622,3 mm3 ở nhóm YC-1 so với 56,7626,8 mm3 ở nhóm chứng).
YC-1 ức chế sự gia tăng tính thấm BBB do thiếu máu cục bộ gây ra
Thuốc nhuộm màu xanh Evans được sử dụng như một dấu hiệu của sự
thoát mạch albumin trong việc đánh giá ảnh hưởng của YC-1 đối với chứng
ngứa thấm BBB. Hình ảnh đại diện của thuốc nhuộm xanh Evans trong các mô não
ướt được thể hiện trong Hình 4A. Rò rỉ màu xanh da trời Evans tăng đáng kể
ở bán cầu bên (20.062,0 mg / g) của não của những con chuột bị MCAO 90 phút
và tái tưới máu 24 giờ, so với bên cạnh (0,760,3 mg / g). Việc quản lý YC-1
đã giảm đáng kể sự rò rỉ màu xanh Evans ở cạnh bên xuống còn 6,064,0 mg /
g, cho thấy mức giảm 70% (Hình 4B). Những dữ liệu này gợi ý rằng YC-1 đã bảo
vệ BBB khỏi hiện tượng tăng siêu nhạy do MCAO gây ra và sự tái tưới máu.
YC-1 ức chế sự biểu hiện của HIF-1a trong tế bào thần kinh
trong não thiếu máu cục bộ Kết quả trên cho thấy rõ ràng rằng
việc ức chế HIF-1 bởi YC-1 gây ra tác động gây tổn thương mô
não (nhồi máu mở rộng) và tác dụng bảo vệ BBB (cải thiện tính thấm)
xác định bởi Evans blue rò rỉ. Để hiểu các cơ chế chịu trách nhiệm
PLoS MỘT | www.plosone.org
Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não
đối với các tác động phân biệt của YC-1, chúng tôi đã phân tích sự biểu hiện
của HIF-1a và các gen dòng chảy của nó epo, vegf và glut-3 trong tế bào thần
kinh và tế bào nội mô trong não thiếu máu cục bộ. Để khám phá biểu hiện đặc
hiệu của tế bào thần kinh của HIF-1a và các gen khác sau MCAO có hoặc không
có sự hiện diện của YC-1, phương pháp nhuộm mô miễn dịch kép được thực hiện
với chỉ thị tế bào thần kinh NeuN. Hình 5A là một lát não nhuộm TTC điển
hình và cho thấy các vị trí được chọn cho
hình ảnh. Như thể hiện trong Hình 5B, mức HIF-1a được điều chỉnh mạnh mẽ
trong các tế bào thần kinh ở bán cầu bên trái 24 giờ sau MCAO. YC-1 làm giảm
đáng kể biểu hiện HIF-1a trong tế bào thần kinh thiếu máu cục bộ. Sự biểu
hiện của VEGF, EPO và GLUT-3, được kích hoạt phiên mã bởi HIF-1, cũng tăng
lên đáng kể trong các tế bào thần kinh ở bán cầu bên trái, so với ở bán cầu
bên cạnh (Hình 5C-E). Sự nhuộm màu của ba loại protein trong tế bào thần
kinh của bán cầu não bên đã giảm đáng kể nhờ điều trị YC-1. Kết quả từ
phương pháp nhuộm miễn dịch này chỉ ra rằng YC-1 ức chế sự biểu hiện của
HIF-1a và các gen mục tiêu của nó trong tế bào thần kinh, có thể góp phần
gây ra nhồi máu não mở rộng trong MCAO được điều trị bằng YC-1
chuột cống.
YC-1 ức chế sự biểu hiện của HIF-1a và VEGF trong các tế bào
nội mô não Để khám phá sự biểu hiện của HIF-1a và các gen hạ
lưu của nó sau MCAO trong các tế bào nội mô não, việc đưa vào
cơ thể miễn dịch kép với chất đánh dấu nội mô PECAM-1. Như thể
hiện trong Hình 6A, HIF-1a đã được điều chỉnh tăng trong các tế
bào ở bán cầu bên trái sau 90 phút MCAO và 24 giờ tái tưới máu.
Một số tế bào dương tính với HIF-1a được đồng khu trú với PECAM 1, cho
thấy biểu hiện HIF-1a tăng cao trong tế bào nội mô.
YC-1 làm giảm đáng kể biểu hiện HIF-1a nội mô.
Hình 6B chứng minh rằng biểu hiện VEGF tăng lên một cách ngẫu nhiên và đồng
khu trú cao với các tế bào nội mô ở bán cầu não bên. YC-1 làm giảm sự nhuộm
màu tổng thể của VEGF ở cả bán cầu bên và bán cầu bên cạnh. Biểu hiện của
EPO dường như không tăng lên trong các tế bào nội mô của não thiếu máu cục
bộ (Hình 6C). Ngoài ra, sự biểu hiện của chất vận chuyển glucose 1 tăng lên
đáng kể khi thiếu máu cục bộ và đồng khu trú với các tế bào nội mô. YC-1
ngăn chặn sự biểu hiện của chất vận chuyển glucose một cách hiệu quả. Những
kết quả này chỉ ra rằng thiếu máu cục bộ làm tăng biểu hiện nội mô của
HIF-1a, dường như làm tăng biểu hiện của VEGF và GLUT-1 nhưng không làm
tăng biểu hiện của EPO trong tế bào nội mô.
Thảo luận
Ở đây chúng tôi cho thấy rằng thiếu máu cục bộ gây ra sự biểu hiện của
HIF-1 và các protein được mã hóa bởi các gen hạ lưu của nó epo, vegf và
glut trong cả tế bào thần kinh và tế bào nội mô não. YC-1 có thể ngăn chặn
biểu thức. Đáng chú ý nhất, chúng tôi chứng minh rằng sự ức chế HIF-1 bởi
YC-1 có tác dụng khác biệt đối với tổn thương não trong đột quỵ do thiếu
máu cục bộ (tức là, thể tích nhồi máu mở rộng và cải thiện tính thấm BBB).
VEGF là protein tốt nhất được xác định là hạ lưu của HIF-1 trong sinh
học mạch máu [28]. Bên cạnh việc là thành viên nổi bật nhất của gia đình yếu
tố tăng trưởng tạo mạch, VEGF đã được biết đến từ những năm 1980 như một
yếu tố thấm thành mạch làm tăng tính thấm thành mạch [29]. Nhiều nghiên cứu
gần đây đã chỉ ra rằng VEGF gây rò rỉ mạch máu não trong các tình trạng bệnh
lý như thiếu oxy và thiếu máu cục bộ [18,30,31], có thể bằng cách điều
chỉnh các protein nối chặt chẽ như zona tắc 1, claudin-5 [32,33] và tắc
mạch. [34]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng
đáng kể biểu hiện VEGF trong tế bào thần kinh và vi mạch trong não thiếu máu
cục bộ. Như trong Hình 6B, sự liên kết
5 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798
Machine Translated by Google

Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não

Hình 3. Ảnh hưởng của YC-1 đến tổn thương mô não của chuột MCAO. Tổn thương của Brian được ước tính bằng phương pháp nhuộm MRI và TTC sau khi chuột bị
thiếu máu cục bộ trong 90 phút và tái tưới máu trong 24 giờ. Động vật nhận được YC-1 (2 mg / kg, iv) ở 24 giờ và 30 phút trước khi bắt đầu thiếu máu cục
bộ. (A) Hình ảnh MRI đại diện cho thấy sự tiến triển phụ thuộc vào thời gian của thể tích nhồi máu. Hình ảnh MRI có trọng số T2 được thu thập ở 0, 3, 6, 12
và 24 giờ sau MCAO với vùng màu trắng đại diện cho vùng nhồi máu. (B) Hình ảnh nhuộm TTC đại diện (bảng dưới) và T2 (bảng trên) của các phần não của chuột MCAO.
Não được cắt ra từ vị trí 4 mm tính từ cực trước và tiếp tục trong khoảng 2 mm đến 10 mm. (C) Định lượng thể tích ổ nhồi máu bằng hình ảnh MRI T2W của não
chuột (n = 12 (đối chứng), 9 (YC-1)). (D) Định lượng tổn thương não ước tính bằng các phần nhuộm màu TTC (n = 12 (đối chứng), 9 (YC-1)). (E) Định lượng
thể tích phù não ước tính bằng các mặt cắt nhuộm TTC (n = 12 (đối chứng), 9 (YC-1)). Giá trị là trung bình 6 SEM. * p, 0,05 so với đối chứng. # p, 0,05 so
với thể vân kiểm soát. % P, 0,05 so với vỏ não kiểm soát. doi: 10.1371 / journal.pone.0027798.g003

biểu hiện của VEGF rất khớp với biểu hiện của tế bào nội mô.
Việc ức chế HIF-1 bởi YC-1 làm giảm đáng kể sự biểu hiện VEGF
trong các vi mạch não được điều hòa bởi thiếu máu cục bộ và sau
đó cải thiện tính thấm của BBB. Nhận định này phù hợp với báo
cáo trước đó của Yeh et al. ngăn chặn HIF-1
ngăn ngừa thiệt hại BBB [18]. Những kết quả này rất vững chắc
trong việc ủng hộ khái niệm rằng HIF-1 thúc đẩy tổn thương BBB
trong quá trình thiếu máu cục bộ não, có thể thông qua việc điều
chỉnh biểu hiện VEGF. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng biểu
thức của EPO không cùng bản địa hóa với biểu thức của PECAM-1. Thiếu EPO

PLoS MỘT | www.plosone.org 6 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798

Machine Translated by Google

Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não

Hình 4. Ảnh hưởng của YC-1 đến tính thấm BBB của chuột MCAO. Độ thấm BBB được ước tính bằng sự rò rỉ màu xanh Evans sau khi chuột bị thiếu máu cục
bộ trong 90 phút và tái tưới máu trong 24 giờ. Động vật nhận được YC-1 (2 mg / kg, iv) ở 24 giờ và 30 phút trước khi bắt đầu thiếu máu cục bộ. (MỘT)
Hình ảnh đại diện của sự thoát mạch màu xanh Evans trong toàn bộ não và phần hậu môn (bregma +0,70 mm). (B) Định lượng rò rỉ màu xanh Evens ở bán
cầu bên và bán cầu bên của chuột MCAO (n = 12 (đối chứng), 9 (YC-1)). Giá trị có nghĩa là 6 SEM. * p, 0,05 so với đối chứng. doi: 10.1371 /
journal.pone.0027798.g004

biểu hiện cũng có thể góp phần làm suy giảm các tế bào nội mô. chẳng hạn như nước. Người ta đã báo cáo rằng một chất ức chế HIF-1 khác,
2ME2, có thể ức chế thành công tính thấm của BBB đối với một protein hòa

Tuy nhiên, sự bảo vệ BBB này do sự ức chế HIF-1 của YC-1 góp phần nhỏ vào tan IgG sau MCAO và tái tưới máu ở chuột, nhưng chỉ gây ra sự thay đổi 1%

tổn thương mô não tổng thể do thiếu máu cục bộ não gây ra. Kết quả của hàm lượng nước trong não [42]. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng việc ức

chúng tôi chứng minh rõ ràng rằng YC-1 làm tăng đáng kể thể tích nhồi máu chế HIF-1 bằng YC-1 làm giảm tính thấm đối với albumin, nhưng nó không làm

não và tỷ lệ tử vong trong mô hình đột quỵ do thiếu máu cục bộ. Điều này cho thay đổi tính thấm đối với nước và không thể ức chế sự hình thành phù não

thấy rằng sự hiện diện của HIF 1 rất quan trọng trong việc thúc đẩy sự sống sau đột quỵ.

còn của tế bào thần kinh trong thời gian thiếu máu cục bộ và tái tưới máu.

Trong số các gen được điều chỉnh bởi HIF-1, epo và glut đã được nghiên cứu Mang lại những tác dụng tiềm tàng trong bệnh thiếu máu cục bộ, HIF-1 đã
rộng rãi; và vai trò bảo vệ thần kinh của chúng đã được thống nhất trong trở thành mục tiêu để tìm hiểu các cơ chế gây chết tế bào và phát triển các

tài liệu [9,11,35–38]. Đồng ý với các báo cáo trước đây, chúng tôi quan sát phương pháp điều trị mới trong đột quỵ. Nó rất được quan tâm trong việc thử
thấy sự điều tiết đáng kể của EPO và GLUT-3 trong tế bào thần kinh sau khi nghiệm tác dụng của sự ức chế và điều chỉnh HIF-1 đối với các chấn thương

thiếu máu cục bộ, bị ức chế bởi YC-1. não do thiếu máu cục bộ gây ra. Một ví dụ về chất ức chế HIF-1 là YC-1. Ngày
Kết quả này cho thấy rằng giảm EPO và GLUT-3 là nguyên nhân dẫn đến sự phóng càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng YC-1 có tác dụng ức chế sự tích tụ

đại qua trung gian YC-1 của tổn thương não do thiếu máu cục bộ gây ra. HIF-1a do thiếu oxy, thải sắt và ức chế proteasomal [43–45]. YC-1 có thể
Hơn nữa, VEGF cũng được điều chỉnh trong các tế bào thần kinh của não thiếu phân hủy trực tiếp protein HIF 1a bằng cách gây ra sự phân hủy đầu C của

máu cục bộ và có thể chống lại các tổn thương thiếu máu cục bộ bất lợi protein HIF-1a [46]. Nó cũng có thể ngăn chặn sự dịch HIF-1a thông qua con
[15,16], cho thấy vai trò phức tạp của VEGF trong các loại tế bào khác nhau. đường PI3K / Akt / mTOR / 4E-BP [47]. YC-1 đã được báo cáo là ức chế sự

Thể tích phù nề có tác động có hại đến tỷ lệ mắc bệnh và tử vong sau đột biểu hiện của các gen hạ nguồn HIF-1 như epo và vegf [43]. YC-1 đã được sử

quỵ do tăng áp lực nội sọ và làm suy giảm tưới máu não và oxy trong quá dụng rộng rãi như một chất chặn HIF-1 trong nghiên cứu. Người ta đã chứng

trình tái tưới máu [39]. Một bằng chứng khác chỉ ra rằng YC-1 không thể cải minh rằng YC-1 ức chế hiệu quả sự biểu hiện HIF-1 ở tim [48], thận [49] và

thiện chấn thương não sau đột quỵ là YC-1 không làm thay đổi đáng kể thể não [18]. YC-1 đã được chứng minh là làm giảm rối loạn tính thấm BBB do

tích phù nề sau MCAO và tái tưới máu (Hình 3E). Điều này có vẻ mâu thuẫn thiếu máu cục bộ gây ra bằng cách ức chế biểu hiện HIF-1 và được đề xuất

với kết quả rằng YC-1 làm giảm tính thấm BBB được xác định bằng sự thoát như một tác nhân điều trị đột quỵ tiềm năng [18]. Tuy nhiên, ảnh hưởng của

mạch của màu xanh Evens (albumin). Sau đây có thể giải thích các kết quả có YC-1 đến kết quả của thiếu máu não như thể tích nhồi máu

vẻ mâu thuẫn. Thể tích phù nề (sưng não) sau đột quỵ chủ yếu được xác định
bởi sự thoát mạch của nước và các chất hòa tan khỏi huyết tương do tăng

tính thấm BBB, được gọi là phù mạch máu [40]. Tuy nhiên, BBB có tính thấm chưa được thử nghiệm trước đây. Dữ liệu của chúng tôi chứng minh rằng mặc

khác nhau đối với nước và các chất hòa tan có trọng lượng phân tử khác nhau dù nó cải thiện các rối loạn thẩm thấu BBB do thiếu máu cục bộ gây ra, YC-1

[41]. Khả năng thẩm thấu đối với các phân tử lớn hơn (ví dụ albumin) dễ dàng làm tăng các tổn thương não do thiếu máu cục bộ về thể tích và tỷ lệ tử

được duy trì hơn so với các chất có phân tử nhỏ hơn (ví dụ như sucrose và vong của ổ nhồi máu. Quan sát này cung cấp bằng chứng mới về tác dụng dược

nước) trong quá trình tổn thương BBB [41]. Sự gia tăng tính thấm của thiếu lý của YC-1 trong đột quỵ do thiếu máu cục bộ và chỉ ra rằng YC-1 không có

máu cục bộ gây ra đối với các phân tử lớn hơn có thể là kết quả của những tiềm năng như một phương pháp điều trị thiếu máu não mặc dù nó bảo vệ hệ

thay đổi phân tử khác nhau, so với sự gia tăng đối với các phân tử nhỏ thống mạch máu não.

Cần phải chỉ ra rằng mặc dù đã được chấp nhận tốt rằng YC-1 là một chất

ức chế HIF-1 hiệu quả, nhưng nó không phải là một HIF-1 cụ thể

PLoS MỘT | www.plosone.org 7 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798

Machine Translated by Google
Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não

Hình 5. Ảnh hưởng của YC-1 đến biểu hiện HIF-1 trong tế bào thần kinh trong não thiếu máu cục bộ. Mức độ protein của HIF-1a và các gen dòng chảy của nó được phân tích bằng phương pháp nhuộm miễn dịch

kép với chất đánh dấu tế bào thần kinh NeuN sau khi chuột bị thiếu máu cục bộ trong 90 phút và tái tưới máu trong 24 giờ. Chuột được nhận YC-1 (2 mg / kg, iv) vào 24 giờ 30 phút trước khi bắt đầu

thiếu máu cục bộ. (A) Phần thân não chuột nhuộm TTC. Các khu vực hình vuông được gắn nhãn đại diện cho các vị trí của hình ảnh miễn dịch. (B) Nhuộm miễn dịch kép HIF-1a (xanh lục) và NeuN (đỏ). (C)

Nhuộm miễn dịch kép EPO (xanh lá cây) và NeuN (đỏ). (D) Nhuộm miễn dịch kép VEGF (xanh lục) và NeuN (đỏ). (E) Nhuộm miễn dịch kép GLUT-3 (xanh lục) và NeuN (đỏ). Thanh chia độ, 53 mm. doi: 10.1371 /

journal.pone.0027798.g005

người đàn áp. Bên cạnh tác dụng đối với HIF-1, YC-1 điều chỉnh nồng độ
nội bào của cGMP mặc dù tăng cường hoạt động của guanylate cyclase hòa
tan [50]. Tuy nhiên, sự ức chế guanylate cyclase hòa tan không làm thay
đổi ảnh hưởng của YC-1 đến tính thấm máu não [18]. Hơn nữa, người ta đã
báo cáo rằng không có độc tính nghiêm trọng nào được quan sát thấy ở
những con chuột khỏa thân được điều trị bằng YC-1 trong khoảng thời gian
2 tuần và YC-1 không có tác dụng độc đối với sự phát triển bình thường
của dây thần kinh thị giác chuột và tế bào PC12 trong ống nghiệm [44 , 51].
Bộ điều chỉnh gây ra tình trạng thiếu oxy, đã được thảo luận về vai trò
của nó đối với các mô não trong thời gian thiếu máu cục bộ. Mặc dù các
tác dụng bất lợi của HIF-1 đã được quan sát thấy ở não thiếu máu cục bộ,
điều chỉnh cảm ứng HIF 1a và các gen gây ra bởi HIF-1 là một chiến lược
điều trị có triển vọng cao đối với bệnh thiếu máu não [6,52-54] do phản
ứng thích ứng nội sinh của chúng với tình trạng thiếu oxy. và thiếu máu cục bộ.
HIF-1 gây ra sự biểu hiện của nhiều loại gen; và sự cảm ứng và chức năng
của các gen này có thể phụ thuộc vào các loại tế bào cụ thể. Như đã chứng

Trọng tâm đáng kể của nghiên cứu đột quỵ là phát triển các chiến lược minh trong nghiên cứu này, HIF-1 có thể hoạt động khác nhau trong các tế

điều trị nhằm ngăn ngừa sự chết của tế bào thần kinh và cải thiện khả bào khác nhau. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào các loại

năng phục hồi. Tuy nhiên, cho đến nay, rất ít chiến lược trình diễn thera tế bào cụ thể và mục tiêu tế bào để hiểu rõ hơn về vai trò của HIF-1 trong

thành công đã xuất hiện. HIF-1, dưới dạng phiên mã gen đột quỵ cũng như các tình trạng bệnh lý khác.

PLoS MỘT | www.plosone.org số 8

Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798
Machine Translated by Google
Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não

Hình 6. Ảnh hưởng của YC-1 đến sự biểu hiện HIF-1 trong tế bào nội mô ở não thiếu máu cục bộ. Mức độ protein của HIF-1a và các gen dòng chảy của nó được
phân tích bằng phương pháp nhuộm miễn dịch kép với chất đánh dấu nội mô PECAM-1 sau khi chuột bị thiếu máu cục bộ trong 90 phút và tái tưới máu trong 24 giờ.
Chuột được nhận YC-1 (2 mg / kg, iv) vào 24 giờ 30 phút trước khi bắt đầu thiếu máu cục bộ. Vùng não quan tâm giống như trong Hình 4. (A) Nhuộm miễn dịch
kép HIF-1a (xanh lục) và PECAM-1 (đỏ). (B) Nhuộm miễn dịch kép VEGF (xanh lá cây) và PECAM-1 (đỏ). (C) Nhuộm miễn dịch kép EPO (xanh lá cây) và PECAM-1
(đỏ). (D) Nhuộm miễn dịch kép GLUT-1 (xanh lục) và PECAM-1 (đỏ). Thanh chia độ, 50 mm. doi: 10.1371 / journal.pone.0027798.g006

Tóm lại, kết quả của chúng tôi cung cấp bằng chứng mới cho thấy Sự nhìn nhận
HIF-1 hoạt động khác nhau trong các tế bào khác nhau tùy thuộc vào
Chúng tôi mang ơn Nathan Scalia vì đã đọc và chỉnh sửa bản thảo.
chức năng của các protein được mã hóa bởi các gen hạ lưu của nó
trong loại tế bào cụ thể. Kết quả cũng chỉ ra rằng YC-1 không có
Sự đóng góp của tác giả
tiềm năng như một phương pháp điều trị thiếu máu não mặc dù nó
bảo vệ hệ thống mạch máu não. Lên ý tưởng và thiết kế các thí nghiệm: JY HS. Thực hiện các thí nghiệm:
JY BZ ST. Đã phân tích dữ liệu: JY BZ ST HS. Viết bài: JY HS.

Người giới thiệu

1. Bernaudin M, Tang Y, Reilly M, Petit E, Sharp FR (2002) Phản ứng của hệ gen não sau
tình trạng thiếu oxy và tái oxy ở chuột sơ sinh. Xác định các gen có thể góp phần vào
khả năng dung nạp thiếu máu cục bộ do thiếu oxy. J Biol Chem 277: 39728–39738.
2. Bernaudin M, Nedelec AS, Divoux D, MacKenzie ET, Petit E, et al. (2002)
Tình trạng thiếu oxy thường xuyên gây ra khả năng chịu đựng được chứng thiếu máu não
vĩnh viễn khu trú liên quan đến sự gia tăng biểu hiện của yếu tố gây giảm oxy-1 và
các gen mục tiêu của nó, erythropoietin và VEGF, trong não chuột trưởng thành. J
Cereb Blood Flow Metab 22: 393–403.
3. Pichiule P, Agani F, Chavez JC, Xu K, LaManna JC (2003) Biểu hiện HIF-1 alpha và VEGF
4. Baranova O, Miranda LF, Pichiule P, Dragatsis I, Johnson RS, et al. (2007) Sự bất hoạt
đặc hiệu của nơron đối với yếu tố cảm ứng 1alpha thiếu oxy làm tăng tổn thương não
trên mô hình chuột bị thiếu máu não khu trú thoáng qua. J Neurosci 27: 6320–6332.
5. Bergeron M, Yu AY, Solway KE, Semenza GL, Sharp FR (1999) Cảm ứng yếu tố gây giảm oxy-1
(HIF-1) và các gen mục tiêu của nó theo sau chứng thiếu máu cục bộ trong não chuột.
Eu J Neurosci 11: 4159–4170.
6. Sharp FR, Bernaudin M (2004) HIF-I và cảm nhận oxy trong não. Thiên nhiên
Rev Neurosci 5: 437–448.
7. Semenza GL (2003) Nhắm mục tiêu HIF-1 trong điều trị ung thư. Nature Rev Cancer 3:
721–732.

sau cơn thiếu máu não cục bộ thoáng qua. Adv Exp Med Biol 530: 611–617. 8. Semenza GL (2003) Tạo mạch trong rối loạn thiếu máu cục bộ và ung thư. Ann Rev Med
54: 17–28.

PLoS MỘT | www.plosone.org 9 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798

Machine Translated by Google
9. Zaman K, Ryu H, Hall D, O'Donovan K, Lin KI, et al. (1999) Bảo vệ khỏi quá trình chết rụng do
stress oxy hóa trong nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não bằng thuốc thải sắt có liên quan đến
việc tăng cường liên kết DNA của yếu tố gây thiếu oxy-1 và ATF-1 / CREB và tăng biểu hiện
của các enzym đường phân, p21 (waf1 / cip1), và erythropoietin. J Neurosci 19: 9821–9830.
10. Freret T, Valable S, Chazalviel L, Saulnier R, Mackenzie ET, et al. (2006)
Sử dụng chậm trễ deferoxamine làm giảm tổn thương não và thúc đẩy phục hồi chức năng sau cơn
thiếu máu não cục bộ thoáng qua ở chuột.
Eur J Neurosci 23: 1757–1765.
11. Prass K, Ruscher K, Karsch M, Isaev N, Megow D, et al. (2002)
Desferrioxamine gây ra sự dung nạp chậm chống thiếu máu cục bộ não in vivo và in vitro. J
Cereb Blood Flow Metab 22: 520–525.
12. Siddiq A, Ayoub IA, Chavez JC, Aminova L, Shah S, và cộng sự. (2005) Yếu tố cảm ứng giảm oxy
ức chế prolyl 4-hydroxylase. Một mục tiêu để bảo vệ thần kinh trong hệ thống thần kinh trung
ương. J Biol Chem 280: 41732–41743.
13. Halterman MW, Federoff HJ (1999) HIF-1alpha và p53 thúc đẩy tình trạng thiếu oxy gây chết tế
bào thần kinh chậm trong các mô hình thiếu máu cục bộ thần kinh trung ương. Kinh nghiệm Neurol
159: 65–72.
14. Helton R, Cui J, Scheel JR, Ellison JA, Ames C, et al. (2005) Loại trừ đặc hiệu của não do yếu
tố cảm ứng-1alpha thiếu oxy làm giảm hơn là làm tăng tổn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục
bộ. Tế bào thần kinh J 25: 4099–4107.
15. Marti HJ, Bernaudin M, Bellail A, Schoch H, Euler M, và cộng sự. (2000) Thiếu oxy gây ra biểu
hiện yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu trước neovasculariza tion sau thiếu máu não. Am J
Pathol 156: 965–976.
16. Jin KL, Mao XO, Greenberg DA (2000) Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu: tác dụng bảo vệ thần
kinh trực tiếp trong bệnh thiếu máu cục bộ in vitro. Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ 97: 10242–
10247.
17. Oosthuyse B, Moons L, Storkebaum E, Beck H, Nuyens D, và cộng sự. (2001) Loại bỏ yếu tố đáp
ứng thiếu oxy trong yếu tố thúc đẩy tăng trưởng nội mô mạch máu gây ra thoái hóa tế bào thần
kinh vận động. Nat Genet 28: 131–138.
18. Yeh WL, Lu DY, Lin CJ, Liou HC, Fu WM (2007) Ức chế tình trạng thiếu oxy gây tăng tính thấm
hàng rào máu não bởi YC-1 thông qua sự đối kháng của sự tích tụ HIF-1alpha và biểu hiện VEGF.
Mol Pharmacol 72: 440–449.
19. Argaw AT, Gurfein BT, Zhang Y, Zameer A, John GR (2009) Sự phá vỡ nội mô CLN-5 qua trung gian
VEGF thúc đẩy sự phá vỡ hàng rào máu não. Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ 106: 1977–1982.
20. Liu S, Shi H, Liu W, Furuichi T, Timmins GS, et al. (2004) PO2 kẽ trong tiểu não và lõi thiếu
máu cục bộ bị ảnh hưởng khác nhau sau khi thiếu máu não khu trú thoáng qua ở chuột. J Cerebr
Blood Flow Metab 24: 343–349.
21. Takagi K, Ginsberg MD, Globus MY, Busto R, Dietrich WD (1994) Tác dụng của ritanserin, một
chất đối kháng thụ thể 5-HT2, trên lưu lượng máu não do thiếu máu cục bộ và thể tích nhồi
máu trong tắc động mạch não giữa ở chuột. Cú đánh 25: 481–485.
22. Liu Y, Kudo K, Abe Y, Hu DL, Kijima H, et al. (2009) Sự ức chế chuyển đổi yếu tố tăng trưởng-
beta, yếu tố gây giảm oxy-1alpha và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu làm giảm tổn thương
hậu môn trực tràng do chiếu xạ.
J Radiat Res (Tokyo) 50: 233–239.
23. Hsiao G, Huang HY, Fong TH, Shen MY, Lin CH, et al. (2004) Cơ chế ức chế của YC-1 và PMC trong
việc cảm ứng biểu hiện iNOS bởi axit lipoteichoic trong đại thực bào RAW 264.7. Biochem
Pharmacol 67: 1411–1419.
24. Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, et al. (1986)
Đánh giá 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride làm chất nhuộm màu để phát hiện và định lượng
nhồi máu não thực nghiệm trên chuột cống. Cú đánh 17: 1304–1308.
25. Schabitz WR, Li F, Irie K, Sandage BW, Jr., Locke KW, et al. (1999) Tác dụng hiệp đồng của sự
kết hợp giữa yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản liều thấp và citicoline sau khi thực
nghiệm tạm thời thiếu máu cục bộ khu trú. Cú đánh 30: 427–431.
26. Campos F, Sobrino T, Ramos-Cabrer P, Argibay B, Agulla J, et al. (2011)
Bảo vệ thần kinh bằng glutamate oxaloacetate transaminase trong đột quỵ do thiếu máu cục bộ:
một nghiên cứu thử nghiệm. J Cereb Blood Flow Metab 31: 1378–1386.
27. Heiland S, Sartor K (1999) Chụp cắt lớp cộng hưởng từ trong đột quỵ - của nó
cơ sở phương pháp luận và sử dụng lâm sàng. Rofo 171: 3–14.
28. Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, Agani F, Leung SW, et al. (1996) Kích hoạt phiên mã gen yếu tố
tăng trưởng nội mô mạch máu bằng yếu tố cảm ứng giảm oxy 1. Mol Cell Biol 16: 4604–4613.
29. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VS, et al. (1983) Các tế bào khối u tiết
ra một yếu tố thấm thành mạch thúc đẩy sự tích tụ dịch cổ trướng. Khoa học 219: 983–985.
30. Schoch HJ, Fischer S, Marti HH (2002) Biểu hiện yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu do thiếu
oxy gây ra rò rỉ mạch máu trong não. Bộ não 125: 2549–2557.
PLoS MỘT | www.plosone.org
Tác dụng khác biệt của HIF-1 trong chứng thiếu máu cục bộ não
31. Fischer S, Wobben M, Marti HH, Renz D, Schaper W (2002) Tăng khả năng tăng tiết do thiếu oxy
trong tế bào nội mô vi ống não liên quan đến những thay đổi qua trung gian VEGF trong biểu
hiện của zonula tắc-1. Microvasc Res 63: 70–80.
32. Ohtsuki S, Sato S, Yamaguchi H, Kamoi M, Asashima T, et al. (2007)
Sự biểu hiện ngoại sinh của claudin-5 gây ra các đặc tính rào cản trong tế bào nội mô mao
mạch não chuột được nuôi cấy. J Cell Physiol 210: 81–86.
33. Morita K, Sasaki H, Furuse M, Tsukita S (1999) Claudin nội mô: claudin-5 / TMVCF tạo thành các
sợi nối chặt chẽ trong tế bào nội mô. J Cell Biol 147:
185–194.
34. Bamforth SD, Kniesel U, Wolburg H, Engelhardt B, Risau W (1999) Một thể đột biến trội của chất
gây tắc mạch làm phá vỡ cấu trúc và chức năng của mối nối chặt chẽ. J Cell Sci 112 (Pt 12):
1879–1888.
35. Ehrenreich H, Hasselblatt M, Dembowski C, Cepek L, Lewczuk P, et al. (2002)
Liệu pháp erythropoietin cho đột quỵ cấp tính vừa an toàn vừa có lợi. Mol Med 8: 495–505.
36. Bernaudin M, Marti HH, Roussel S, Divoux D, Nouvelot A, et al. (1999) Một vai trò tiềm năng
của erythropoietin trong bệnh thiếu máu não cục bộ vĩnh viễn ở chuột.
J Cereb Blood Flow Metab 19: 643–651.
37. Siren AL, Fratelli M, Brines M, Goemans C, Casagrande S, et al. (2001)
Erythropoietin ngăn chặn quá trình chết rụng tế bào thần kinh sau thiếu máu cục bộ não và
căng thẳng chuyển hóa. Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ 98: 4044–4049.
38. Lawrence MS, Sun GH, Kunis DM, Saydam TC, Dash R, et al. (1996)
Sự biểu hiện quá mức của gen vận chuyển glucose với vector virus herpes simplex bảo vệ tế
bào thần kinh thể vân chống lại đột quỵ. J Cereb Blood Flow Metab 16: 181–185.
39. Unterberg AW, Stover J, Kress B, Kiening KL (2004) Phù và chấn thương não.
Khoa học thần kinh 129: 1021–1029.
40. Loubinoux I, Volk A, Borredon J, Guirimand S, Tiffon B, et al. (1997)
Độ lan tỏa của phù mạch và phù do nhiễm độc tế bào được đánh giá bằng định lượng khuếch tán
và chụp cộng hưởng từ T2. Cú đánh 28: 419–426. ; thảo luận 426-417.
41. Huber JD, VanGilder RL, Houser KA (2006) Bệnh tiểu đường do Streptozotocin gây ra tăng dần
tính thấm hàng rào máu não trong các vùng não cụ thể ở chuột. Am J Physiol Heart Circ Physiol
291: H2660–2668.
42. Chen W, Jadhav V, Tang J, Zhang JH (2008) Ức chế HIF-1alpha cải thiện tình trạng chấn thương
sọ não ở trẻ sơ sinh trong mô hình thiếu máu cục bộ thiếu oxy trên chuột cống. Neurobiol Dis
31: 433–441.
43. Chun YS, Yeo EJ, Choi E, Teng CM, Bae JM, et al. (2001) Tác dụng ức chế của YC-1 trên cảm ứng
giảm oxy của erythropoietin và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu trong tế bào Hep3B. Biochem
Pharmacol 61: 947–954.
44. Yeo EJ, Chun YS, Cho YS, Kim J, Lee JC, et al. (2003) YC-1: một loại thuốc chống ung thư tiềm
năng nhắm vào yếu tố gây thiếu oxy 1. J Natl Cancer Inst 95:
516–525.
45. Yeo EJ, Chun YS, Park JW (2004) Các chiến lược chống ung thư mới nhắm mục tiêu HIF-1.
Biochem Pharmacol 68: 1061–1069.
46. Kim HL, Yeo EJ, Chun YS, Park JW (2006) Một miền chịu trách nhiệm về sự suy thoái HIF 1alpha
bởi YC-1, một chất chống ung thư mới. Int J Oncol 29: 255–260.
47. Sun HL, Liu YN, Huang YT, Pan SL, Huang DY, et al. (2007) YC-1 ức chế sự biểu hiện HIF-1 trong
tế bào ung thư tuyến tiền liệt: đóng góp của tín hiệu Akt / NF-kappaB vào sự tích tụ
HIF-1alpha trong quá trình thiếu oxy. Gen ung thư 26: 3941–3951.
48. Nickel EA, Hsieh CH, Chen JG, Schwacha MG, Chaudry IH (2009) Estrogen ức chế IL-6 tim sau chấn
thương-xuất huyết thông qua con đường trung gian alpha 1 yếu tố gây thiếu oxy. Sốc 31: 354–
358.
49. Kimura K, Iwano M, Higgins DF, Yamaguchi Y, Nakatani K, et al. (2008)
Sự biểu hiện ổn định của HIF-1alpha trong tế bào biểu mô ống thúc đẩy quá trình xơ hóa mô
kẽ. Am J Physiol Renal Physiol 295: F1023–1029.
50. Teng CM, Wu CC, Ko FN, Lee FY, Kuo SC (1997) YC-1, một chất hoạt hóa độc lập oxit nitric của
guanylate cyclase hòa tan, ức chế huyết khối giàu tiểu cầu ở chuột. Eur J Pharmacol 320: 161–
166.
51. Yang X, Wang Y, Luo J, Liu S, Yang Z (2011) Tác dụng bảo vệ của YC-1 chống lại quá trình chết
rụng tế bào PC12 do glutamate gây ra. Tế bào Mol Neurobiol 31: 303–311.
52. Giaccia A, Siim BG, Johnson RS (2003) HIF-1 làm mục tiêu phát triển thuốc.
Nat Rev Drug Discov 2: 803–811.
53. Bergeron M, Gidday JM, Yu AY, Semenza GL, Ferriero DM, et al. (2000) Vai trò của yếu tố gây
thiếu oxy-1 trong khả năng dung nạp thiếu máu cục bộ do thiếu oxy ở não chuột sơ sinh. Ann
Neurol 48: 285–296.
54. Ralph GS, Parham S, Lee SR, Beard GL, Craigon MH, et al. (2004)
Xác định các mục tiêu đột quỵ tiềm năng bằng vectơ ngoại vi trung gian biểu hiện quá mức của
HIF-1 alpha và HIF-2 alpha trong mô hình tế bào thần kinh sơ cấp của tình trạng thiếu oxy. J
Cereb Blood Flow Metab 24: 245–258.
10 Tháng 11 năm 2011 | Tập 6 | Vấn đề 11 | e27798