‫جامعة البصرة‬

‫كلية الزراعة‬

‫قسم علوم األغذية‬

‫محاضرات تحليل الي عملي‬

‫دراسات عليا ‪ /‬ماجستير‬

‫استاذ المادة ‪:‬أ‪.‬م‪.‬د‪ .‬سوسن علي حميد الحلفي‬

 ‫تجربة رقم (‪)1‬‬

‫اسم التجربة ‪ :‬كروموتوغرافيا الورق ‪Paper chromatography‬‬

‫‪/ /‬‬ ‫تاريخ اجراء التجربة ‪:‬‬

‫األساس النظري ‪:‬‬

‫الكروموتوغرافبا بصورة عامة هي طريقة تستعمل خاصة لفصل خليط من المواد الى مكونات نقية اعتمادا على‬
‫اختالف ذوبان تلك المواد في مذيب معين وعلى درجة ادمصاصها فوق سطح معين والذي يكون شريحة من‬
‫ورق ترشيح او طبقة خفيفة من جالتين السليكا او حبيبات ناعمة من الفحم ‪ .‬ان هذه الطريقة (كرموتوغرافيا‬
‫الورق ) تستعمل لفصل المواد والتعرف عليها اذا كانت موجودة بكميات ضئيلة جدا ال تتجاوز مئة ميكروغرام‬
‫في النموذج الذي يوضع قرب نهاية شريحة ورق الترشيح وبعدها تغمس نهاية الورقة بصورة عامة في مذيب‬
‫معين حيث سيرفع ذلك المذيب على تلك الشريحة بواسطة الخاصية الشعرية حامال معه المحتويات الى األعلى‬
‫الى مسافة تعتمد على درجة ذوبانها في ذلك المذيب وقدرتها على االمتصاص على الشريحة ‪ .‬ويستمر المذيب‬
‫في مساره الى اعلى من المسافة التي سارها المذاب فمن قياس المسافة التي سارها المذاب (سم) والمسافة التي‬
‫سارها المذيب (سم) يمكن حساب قيمة االعاقة ‪Rf‬‬

‫‪=Rf‬المسافة التي يقطعها المذاب ‪ /‬المسافة التي يقطعها المذيب‬

‫حيث ان لكل مادة معينة قيمة معينة من ‪ Rf‬تختلف عنها لمادة اخرى تحت نفس الظروف لطريقة التحليل‬

‫المواد واألجهزة المستخدمة ‪:‬‬

‫مذيب المزيج ‪ Elute solvent‬ويتكون من ايثانول ‪ :2‬ماء ‪3‬‬ ‫‪-1‬‬

‫العينات صبغات غذائية –‬
‫‪ -2‬شرائح من ورق الترشيح‬
‫‪ -3‬مسطرة‬
‫‪-4‬انابيب شعرية‬
‫طريقة العمل ‪:‬‬
 ‫حضر ورقة الترشيح لتكون بقياس مناسب‬ ‫‪-1‬‬
‫خط بقلم الرصاص على مسافة ‪2‬سم من احد نهايته الورق‬ ‫‪-2‬‬
‫ضع قطرة من الصبغات اعاله بواسط األنبوبة الشعرية على خط قلم الرصاص بحيث التتجاوز القطرة اسم‬ ‫‪-3‬‬
‫واتركها تجف‬
‫ضع المذيب في جار او بيكر ثم ضع ورقة الترشيح دون غمر بقع النماذج ودع المذيب يرتفع لمدة ‪-11‬‬ ‫‪-4‬‬
‫‪ 22‬دقيقة ثم ارفع الشريحة وتركها تجف قس المسافة التي قطعها المذاب والمسافة التي قطعتها النماذج ‪.‬‬
‫ثم احسب قيم ‪ Rf‬لكل من النماذج اعاله‪.‬‬ ‫‪-1‬‬
‫مالحظات‪:‬‬
‫*تظهر البقع بواسطة بخار االمونيا في الوسط القاعدي او حامض ‪ HCL‬في الوسط الحامضي‪.‬‬
‫* بعض األلوان قد يفتح لونها بسرعة مثل الفينونفثالين وعليه يتوجب في هذه الحالة قياس المسافة حال ظهور‬
‫الون ‪.‬‬
‫*في حالة تداخل االلوان على بعضها في محلول ما يمكن التعرف على محتويات ذلك المجهول في اختالف‬
‫اللون بالوسط الحامضي عنه في الوسط القاعدي ‪.‬‬

‫لون المركب‬ ‫المسافة التي قطعها‬ ‫المسافة التي قطعها‬

‫‪Rf‬‬ ‫الصبغة‬ ‫ت‬
‫المفصول‬ ‫المذاب‬ ‫المذيب‬
 ‫تجربة رقم (‪)2‬‬

‫اسم التجربة ‪ :‬الكشف عن مكونات مزيج من األحماض األمينية بطريقة الكورماتوغرافيا الورقية‬

‫مالحظة ‪:‬تفاعل األحماض االمينية مع الننهيدرين‬

‫المرحلة األولى ‪:‬الننيهيدرين مؤكسد قوي يؤدي عن طريق نزع مجموعة األمين التأكسدية ( ‪dissemination‬‬
‫‪ )oxidative‬وتحرير النشادر وغاز ثاني اوكسيد الكاربون وفقا للتفاعل االتي‬

‫المرحلة الثانية ‪ :‬يتفاعل غاز االمونيا مع الننيه يدرين المتبقي ليعطي مركب ازرق بنفسجي يدعى ارجوان الرمان‬
‫‪ pourper ruhmann‬ويستغل هذا التفاعل في الفصل الكرموتوغرافيا والمعايرات اللونية لألحماض األمينية ‪.‬‬
 ‫الهدف من التجربة ‪ :‬الكشف على األحماض األمينية بالفصل الكرموتوغرافيا‬

‫االساس العلمي ‪ :‬كرموتوغرافيا الورق تستعمل بكثرة من اجل فصل األحماض األمينية وتعتمد على اختالف‬
‫هجرة المكونات بين طور ثابت وهو الورقة وطور متحرك عبارة عن مزيج من المذيبات العضوية يوضع المزيج‬
‫المراد فصلة على الورقة (ورق ‪ Watchman‬او ورق السليلوز )ثم يغمس طرفها في المذيب بعد مدة يصعد‬
‫المذيب ويحرك معه مكونات الخليط لتنتقل على مسافات مختلفة حسب نوع كل مكون وقابلية ذوبانه في المذيب‬

‫المواد الالزمة ‪:‬‬

‫‪ -‬مذيب يتكون من (‪1‬مل بيوتانول ‪1,‬مل حامض الخليك الثلجي ‪1 ,‬مل ماء مقطر)‬
‫‪ -‬محلول العينة يحضر مائيا من االحماض االمينية المتوفرة‬
‫‪ -‬كاشف ننهيدرين يحضر بتركيز ‪ g2.1‬في ‪12‬مل ماء مقطر‬
‫‪ -‬ورق ترشيح ‪.‬انابيب شعرية‪ ,‬وعاء الفصل‬
‫خطوات العمل ‪:‬‬
‫ضع المذيب داخل وعاء الفصل قبل ‪ 24‬ساعة من بداء التجربة ‪ ,‬قطع الورق بالحجم المناسب‬
‫ارسم خط البداية في اسفل الورقة بقلم الرصاص يبعد ‪2‬سم عن الحافة‬
‫ضع قطرات من محاليل العينات في االماكن المخصص لها‬
‫ضع الورقة في وعاء الفصل واتركها لمدة حدوث الهجرة‬
‫جفف الورقة ثم رشها بالكاشف ثم جففها لحين ظهور بقع ملونه‬

‫وتستخدم في عمليات الفصل السريع و في تحليل الكميات القليلة من المواد و يعود ذلك لألسباب التالية ‪:‬‬
‫‪ -1‬بساطة الطريقة و عدم الحاجة الى اجهزة معقدة ‪.‬‬
‫‪ -2‬إمكانية الوصول الى جودة الفصل نفسها التي تعطيها الطرق الكروماتوغرافيا االخرى ‪.‬‬
‫‪ -3‬إمكانية الوصول الى فصل انتقائي باستخدام كواشف خاصة ‪.‬‬
‫و تتم عملية الفصل على طبقة رقيقة من مادة الوسط الثابت المفروشة على الواح مصنوعة من الزجاج او‬
‫البالستيك او االلمنيوم ‪ .‬و يعتمد الفصل في هذه الطرق اما على ظاهرة االدمصاص او ظاهرة االستبدال‬
‫االيوني ‪.‬و هذه الظاهر تعتمد على تركيب كل طبقة من الوسط الثابت و الوسط المتحرك ‪ .‬اال ان تطبيقاتها‬
‫المعتمدة على ظاهرة االدمصاص هي الشائعة حيث ينظر الى كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة على انها‬
‫كروماتوغرافيا ادمصاص ‪.‬‬
 ‫التجربة رقم (‪)3‬‬
‫اسم التجربة‪ :‬الكشف عن الصبغات الطبيعية في اوراق النبات بكروماتوغرافيا الورق‬
‫الكلوروفيل‬
‫الكلوروفيل كلمة مشتقة من كلمة يونانية حيث" كلوروس "تعني اخضر و" فيلون "تعني ورقة ‪.‬وهو مادة صبغية‬
‫خضراء ملونة للنبات باللون األخضر‪ ,‬تتواجد عند النباتات الخضراء و تنعدم عند الفطريات ‪.‬يوجد اليخضور‬
‫داخل الخاليا النباتية في األغشية على هيئة أقراص تسمى تالكويدات‪.‬‬
‫اهمية الكلوروفيل‬
‫ال تكمن أهمية الكلوروفيل في إعطاء اللون األخضر للنبتة‪ ,‬إنما يلعب دو ار هاما في عملية التركيب‬
‫الضوئي حيث تتولى البالستيدات الخضراء القيام بهذه العملية داخل أوراق النبات حيث توجه الطاقة الضوئية‬
‫التي يتم امتصاصها الى مراكز تفاعل خاصة في التيالكويدات وتتولى هذه المراكز و معها الجزيئات حاملة‬
‫االلكترونات تحويل الطاقة الضوئية للحصول غاز ثاني أكسيد الكربون من الهواء و في نهايتها تؤدي إلى إنتاج‬
‫المواد السكرية و غيرها من المواد الغذائية كالنشاء الدهن و البروتين و الفيتامينات ‪.‬‬
‫اشكال الكلوروفيل‬
‫يوجد الكلوروفيل في عدة أشكال وهي ذات تركيبات كيميائية متقاربة‪ .‬الكلوروفيل ‪A ,B‬يتواجد عند النباتات‬
‫الراقية و الطحالب الخضراء بنسب متباينة وذلك حسب النوع النباتي ‪.‬‬

‫الكلوروفيل ‪C, D‬متوفر عند الطحالب البنية و البكتيريا الزرقاء‪ .‬وصبغتا كلوروفيل‪ A‬و‪ B‬تمتصان بشده في‬
‫األشعة البنفسجية والزرقاء وفي األشعة البرتقالية والحمراء وال تمتصان األشعة الخضراء اال بكفاه منخفضه‬
‫بل تقوم بعكس او انفاذ هذه األشعة‪.‬‬
 ‫الوان الصبغات المفصولة‬
‫‪Pigment‬‬ ‫‪Color‬‬
‫‪Xanthophyll‬‬ ‫‪Yellow‬‬
‫‪Carotene‬‬ ‫‪Yellow orange‬‬
‫‪Chlorophyll a‬‬ ‫‪Dark green‬‬
‫‪Chlorophyll b‬‬ ‫‪Yellow green‬‬
‫المواد المستعملة في التجربة‬
‫اوراق نباتية او ازهار ‪ ,‬أسيتون ‪ ,‬ورق تشريح ‪ ,‬انابيب شعرية ‪.‬‬
‫طريقة العمل ‪:‬‬
‫‪ -1‬تؤخذ اوراق النبات وتوضع في هاون خزفي ويضاف لها القليل من االسيتون وتهرس جيدا‬
‫‪ -2‬تجهز ورقة الترشيح بعمل شريحة منها ويرسم عند احد طرفيها خط بقلم الرصاص بارتفاع ‪ 2-1‬سم‬
‫‪ -3‬يسحب من المستخلص النباتي بضع قطرات بواسطة انبوبة شعرية وتوضع على الورقة على شكل‬
‫‪ spot‬وتترك لتجف وتعاد العملية مرة اخرى‬
‫‪ -4‬يوضع مذيب الترحيل في جار الفصل والمتكون من اسيتون ‪ :1‬ايثر‪1‬‬
‫‪ -5‬تجرى عملية الترحيل وعند نهايتها تجفف الورقة وتسجل قيم ‪ Rf‬للبقع المفصولة‬
‫المسافة التي يقطعها المذاب ‪ /‬المسافة التي يقطعها المذيب =‪Rf‬‬
‫سجل جميع المالحظ على ضوء الجدول االتي‬
‫لون المركب‬ ‫المسافة التي قطعها‬ ‫المسافة التي قطعها‬
‫‪Rf‬‬ ‫الصبغة‬ ‫ت‬
‫المفصول‬ ‫المذاب‬ ‫المذيب‬
 ‫تجربة رقم (‪)4‬‬

‫اسم التجربة ‪ :‬كروموتوغرافيا الورق ‪Paper chromatography‬‬

‫‪/‬‬ ‫‪/‬‬ ‫تاريخ اجراء التجربة ‪:‬‬

‫التحليل الكروموتوغرافي ‪chromatographic‬‬

‫يعتمد هذا النوع من التحليل على اختالف المواد بعضها عن البعض في ميلها لالمتزاز ‪ Adsorption‬او‬
‫التجزئة ‪ Exchange‬خالل سطح مغلف بمذيب مناسب او خالل مادة كيميائية ومن ثم يمكن ان تنفصل‬
‫تلك المواد وتنقسم طرق التحليل الكروماتوغرافي الى ‪:‬‬

‫‪ -1‬االدمصاص ‪ : Adsorption‬ويقصد به التحليل عن طريق االدمصاص على السطح‬

‫‪ -2‬التبادل االيوني ‪ : Ion- exchange‬ويقصد به التحليل عن طريق تبادل االيونات بين مادة‬
‫التقدير وبين ايونات السطح الذي يحدث عليه التبادل وهي مادة كيميائية راتنجية ‪.‬‬
‫‪ -3‬التجزئة ‪ :Partition‬ويقصد به الفصل عن طريق التجزيئي لمخلوط من عدة مواد تنقسم الى‬
‫كروماتوغرافي العمود وفيه يتم التحليل على عمود معباة بمادة معينة ‪.‬‬
‫‪ -4‬الطبقة الرقيقة ‪ :Thin layer‬وفيه يتم التحليل باالدمصاص او التوزيع على الواح زجاجية تنثر عليها‬
‫مادة مسامية يجري عليها الفصل والتحليل ‪.‬‬
‫‪ -1‬كروماتوغرافيا الغاز‪ : Gas chromatography‬يتضمن الفصل هنا استخدام غاز ناقل يقوم بحمل‬
‫ابخرة المواد المحللة فيتم انفصال هذه المواد تبعا لدرجات غليانها أي تظهر اوال المواد ذات درجات‬
‫الغليان المنخفضة يتبعها ذات الدرجات الغليان المرتفعة ‪.‬‬
‫وتعد طريقة الفصل بالورقة طريقة لفصل مكونات المخلوط كالحبر السائل باالعتماد على قابلية‬
‫انجذاب كل مكون من مكونات المخلوط لسطح مادة اخرى ( الطور الثابت )كورق الترشيح ‪.‬‬
‫ح يث يتباعد اوال مكون المخلوط الذي جاذبيته اقل على الورقة ثم يلية المكون الذي جاذبيته اكثر‬
‫فأكثر‪.‬‬
‫الهدف من هذه التجربة ‪ :‬فصل االصباغ المختلفة من قلم الحبر‬
‫المواد واالدوات ‪:‬‬
 ‫ورقة ترشيح ‪ ,‬قلم حبر ‪ , marker‬مذيب مناسب كااليثانول‬
‫طريقة العمل‪:‬‬
‫عمل خط بقلم الرصاص عند حافة الورقة‬
‫وضع نقطة بواسطة قلم الحبر‬
‫وضع االيثانول في جار الفصل ثم وضع الورقة داخل الجار ومراقبة عملية الفصل‬
‫تسجيل النتائج بعد انتهاء عملية الفصل‬
‫تحليل النتائج بقياس المسافة التي قطعتها البقع المفصولة وكاالتي ‪:‬‬
‫المسافة التي يقطعها المذاب ‪ /‬المسافة التي يقطعها المذيب =‪Rf‬‬
‫سجل جميع المالحظ على ضوء الجدول االتي‬
‫لون المركب‬ ‫المسافة التي قطعها‬ ‫المسافة التي قطعها‬
‫‪Rf‬‬ ‫الصبغة‬ ‫ت‬
‫المفصول‬ ‫المذاب‬ ‫المذيب‬
 ‫اسم التجربة التحليل الكروماتوغرافيا ذو الطبقة الرقيقة ‪Thin layer chromatography‬‬
‫تاريخ التجربة ‪/ / :‬‬
‫هذا النظام من التحليل الكرموتوغرافي تابع لتحليل كروموتوغرافيا األدمصاص ويعتبر النظام الثابت‬
‫‪ Stationary phase‬عبارة عن مادة ادمصاص مثل ثاني اوكسيد األلمونيوم السيلكا جيل مخلوط بمادة الصقة‬
‫يتم فرد مادة األدمصاص على طبقة رقيقة على شريحة زجاجية مقاس ‪21*|22‬سم اماالنظام المتحرك ‪mobile‬‬
‫‪ phase‬عبارة عن مذيب مناسب او مخلوط من المذيبات المناسبة قبل استعمال الشرائح يتم وضعها في فرن‬
‫للتخلص من الرطوبة ولتنشيط مادة األدمصاص ‪ .‬يتم وضع العينة التي يراد فصلها بواسطة انبوبة شعرية‬
‫مايكروبايبيت على هيئة بقع وعلى احد اطراف الشريحة ويوضع خط ويسمى نقطة البداية على بعد ‪2‬سم وقبا‬
‫انتهاء الشريحة بمسافة ‪2‬سم يرسم خط يسمى خط النهاية ‪.‬‬
‫التعرف او الكشف على اماكن الفصل ‪:‬‬
‫ترش الشرائح بكواشف لظهور المركبات المختلفة وبقياس المسافة التي سارها المذيب والمسافة التي سارتها‬
‫المكونات يمكن حساب عامل اإلعاقة ‪Rf‬‬
‫التقدير الكمي بعد االستخالص ‪:‬‬
‫تقشط كل منطقة ‪ Zone‬وتوضع في انبوبة اختبار وتذاب في مذيب مناسب وترشح للتخلص من مادة‬
‫األدمصاص ثم يحري عليها التقديرات األتية ‪:‬‬
‫‪ ‬استخدام األشعة فوق البنفسجية ‪uv‬‬
‫‪ ‬استخدام الكواشف وقياس كثافة الضوء المار باستخدام ‪Spectrophotometer‬‬
‫ممي ازت ‪TLC‬عن كرموتوغرافي الورق ‪Paper chromatography‬‬
‫‪ -1‬الوقت الذي يأخذه بواسطة ‪ TLC‬سريع جدا اليحتاج الى اكثر من نصف ساعة‬
‫‪ -2‬تكون البقع مندمجة ‪ Compact‬في الورق‬
‫‪ -3‬تستعمل مواد ادمصاص اكثر مثل السيليلوز او السيليلوز المحور او مواد غير عضوية مثل السليكاجيل‬
‫اما في الورق يكون معتمد فقط على الطبقة الرقيقة السيليلوزية‪.‬‬
‫‪ -4‬تستعمل كميات قليلة من المواد المراد تعينها كما انها تستخلص كل مكونات العينة ‪.‬‬
‫‪ -1‬تستعمل مواد لتعين موضع المركبات المفصولة مثل حمض الكبريتيك وترش على السيلكا جيل او‬
‫الومنيوم دون ان تتأثر على العكس التحليل الكرموتوغرفي الورق ‪.‬‬
‫حجم المذيب الذي يستخدم في ‪ * 2.1 =slurry‬عدد األلواح *سمك اللوح سم *بعد اللوح (سم)‪.‬‬
‫‪ ‬النسبة بين الماء والسليكا جيل =‪2:1‬‬
‫‪ ‬السليكا تحتوي على كبريتات الكالسيوم ‪%12‬من وزنها ‪.‬‬

‫خطوات العمل‬
 ‫‪ -1‬تجهيز الواح الطبقة الرقيقة ‪.‬‬
‫‪-2‬اختيار الوسط المتحرك المناسب‪.‬‬
‫‪ -3‬وضع عينة على لوح الطبقة الرقيقة ‪.‬‬
‫‪ -4‬تظهير البقع المفصولة و التعرف على مكوناتها‪.‬‬
‫‪ -1‬حساب معامل االعاقة )‪Rf (Refractive index‬‬
‫(‪ )1‬تجهيز الواح الطبقة الرقيقة ( الوسط الثابت) ‪:‬‬
‫ان المواد المدمصة في ‪ TLC‬هي نفسها المدمصة في كروماتوغرافيا االعمدة ‪.‬‬
‫هذه االلواح تكون مصنوعة و مجهزة لالستخدام مباشرة ‪.‬‬

‫(‪ )2‬اختيار المذيب المناسب (الوسط المتحرك)‬

‫يعتمد اختيار المذيب على نوع المادة المراد فصلها و قد يكون ضروريا اختيار عدد من المذيبات ألجراء عملية‬
‫الفصل و يكون االختيار التقريبي سهال ‪.‬فالمذيب الذي له قطبية عالية يؤدي الى تحريك البقع مع جبهة‬
‫المذيب‪ ,‬في حين ان المذيب غير القطبي ال يؤدي الى تحريك البقع مع المذيب ‪ ,‬و يعتبر الكلوروفورم و البنزين‬
‫من المذيبات المتوسطة القطبية التي تستخدم بصورة واسعة لفصل العديد من المركبات ‪.‬‬
‫(‪ )3‬وضع العينة‬
‫يتم وضع حجم معين في حدود ‪ 22-1‬ميكرو لتر من العينة التي تركيزها ‪ %1-2.1‬بواسطة ماصة دقيقة او‬
‫محقن دقيق على خط نقطة البداة الذي يبعد ‪ 2‬سم من احد اضالع اللوح ‪.‬‬
‫و ينبغي اال يزيد قطر البقعة عن ‪1‬سم ‪ .‬و للمحافظة على بقاء البقعة صغيرة توضع العينة بأحجام صغيرة عدة‬
‫مرات مع التجفيف بعد كل اضافة‪.‬‬

‫(‪ )4‬طرق تظهير البقع المفصولة (‪)Visualization Method‬‬

‫طرق الفصل سهلة في حالة المواد المفصولة ملونة ‪ ,‬اال انه في اغلب الحاالت تكون المواد المفصولة عديمة‬
‫اللون و يجب جعلها في هذه الحالة ملونة باستعمال بعض الكواشف ‪ ,‬و تسمى هذه بكواشف التظهير يعتبر اليود‬
‫من اكثر كواشف التظهير استخداما حيث يتفاعل مع اغلب المواد العضوية معطيا متراكبات لها الوان اما بنية او‬
‫صفراء ‪ .‬و هناك طرق اخرى مثل تظهير هاليدات المالكي برش لوح الطبقة الرقيقة بمحلول مخفف من نترات‬
‫الفضة حيث تتكون هاليدات الفضة التي تتفكك بتأثير الضوء معطية بقع سوداء من رقائق الفضة على الطبقة‬
‫الرقيقة ‪ .‬ايضا هناك استخدام مصباح االشعة فوق البنفسجية و هي غالبا ما تظهر المركبات المفصولة على‬
‫شكل بقع براقة ساطعة على الطبقة الرقيقة و بعضها يظهر عليه فقط خاصية التألق(‪. )Fluorescence‬‬
‫و هناك ايضا اضافة مادة متألقة الى الوسط الثابت في الطبقة الرقيقة مثل خليط من كبريتات الزنك و‬
‫الكادميوم ‪ .‬و اذا كانت المركبات المفصولة تسبب اخماد التألق (‪ )quenching fluorescence‬فأنها ستظهر‬
‫على هيئة بقع سوداء على الصفيحة عند تعرضها لألشعة فوق البنفسجية ‪.‬‬

‫(‪ )5‬معامل االعاقة‬

‫عند تثبيت كل الظروف على الطبقة الرقيقة و التي تشمل ‪:‬‬
‫‪-1‬المذيب المستخدم‪.‬‬
‫‪ -2‬المادة المدمصة المستخدمة كوسط ثابت ‪.‬‬
‫‪ -3‬سمك الطبقة الرقيقة‬
‫‪ - 4‬كمية العينة‪.‬‬
‫فإن اي مركب سيقطع مسافة ثابتة بالنسبة الى المسافة التي تقطعها جبهة المذيب ‪ .‬و تعرف النسبة بين‬
‫المسافة التي تقطعها المادة المفصولة و المسافة التي تقطعها الجبهة المذيب بمعامل االعاقة و يرمز لها بالرمز‬
‫‪ Rf‬و معامل االعاقة = المسافة التي تقطعها المادة \المسافة التي تقطعها جبهة المذيب و يكون معامل االعاقة‬
‫ثابتا للمركب المعطى عندما تكون كل ظروف التجربة هي نفسها و هو يمثل احد الصفات الفيزيائية لهذا‬
‫المركب ‪ .‬و يمكن التعرف الى المادة المجهولة عن طريق حساب تلك المسافات من نقطة البداية الى مركز‬
‫القطعة‬
‫تقنية الفصل‪:‬‬
‫يتم الفصل بهذه الطريقة بوضع قطرة من المحلول الذي يحتوي على الخليط المراد فصل مكوناته على بعد‬
‫‪2‬سم من احد اضالع اللوح ‪ .‬ثم يوضع اللوح في وعاء مغطى يحتوي على كمية من المذيب المستخدم بحيث ال‬
‫يزيد ارتفاع المذيب في الوعاء عن ‪1‬سم ‪ .‬و بعد وقت قصير يبدأ المذيب في التحرك الى اعلى ما ار بالبقعة التي‬
‫تحتوي على الخليط و يبدا فصل مكوناته حسب قوة ادمصاص كل منها على سطح الوسط الثابت ‪ ,‬و ينتج عن‬
‫ذلك فصل بقعة الخليط الى عدة بقع ‪ .‬و عندما تقترب جبهة المذيب من نهاية اللوح نخرج اللوح من الوعاء و‬
‫نقوم بتحديد المكان الذي وصلت اليه جبهة المذيب لمعرفة المسافة التي قطعها المذيب ‪ .‬ثم نحدد مواقع البقع‬
‫المفصولة ‪ .‬و تقاس المسافة التي قطعتها البقع مباشرة اذا كانت هذه المواد المفصولة ملونة اما اذا كانت غير‬
‫ملونة فالبد من اتباع احد الطرق المذكورة سابقا لتظهير البقع ‪.‬‬
 ‫فصل مكونات نبات السبانخ االخضر بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة‬

‫تعتمد طريقة فصل مكونات النبات االخضر على اختالف ادمصاص المادة الخضراء على سطح هالم‬
‫السليكا الموجودة على شكل طبقة رقيقة ‪ .‬و تشبه هذه الطريقة الى حد كبير طريقة الفصل الكروماتوغرافي‬
‫بواسطة العمود ‪.‬‬
‫المواد المطلوبة و تحضير المحاليل ‪:‬‬
‫‪-1‬هالم السليكا‬
‫‪-2‬كلوروفورم‬
‫‪-3‬اسيتون‬
‫‪-4‬بنزين‬
‫‪-1‬حضر ‪21‬مل من كل من الكلوروفورم و الكروتين و الكزاينوفيل في الكلوروفورم بتركيز ‪ %12‬وزن لوزن‬
‫‪. w/w‬‬
‫خطوات العمل‬
‫(‪)3‬ضع على لوح الطبقة الرقيقة و على مسافة ‪ 2‬سم من حافتها مستخلص السبانخ على شكل قطرات متتالية‪.‬‬
‫(‪)4‬ضع على لوح الطبقة الرقيقة نفس وعلى بعد ‪ 2‬سم من حافة محاليل كل من الكلوروفيل و الكاروتين و‬
‫الكازاينوفيل على شكل قطرات متتالية بحيث تكون المسافة ما بين البقع الناتجة عن المكونات بحدود ‪ 2‬سم ‪.‬‬
‫(‪ )1‬ضع لوح الطبقة الرقيقة في الخزان الكروماتوج ارفي الذي يحوي المذيب المكون من البنزين واالستون‬
‫‪ 9 : 1‬على التوالي ‪ .‬وينبغي أال يصل مستوى سطح المذيب في الخزان الى بقعة العينة المراد فصل مكوناتها‬
‫‪.‬‬

‫(‪)6‬اترك لوح الطبقة الرقيقة في الخزان حتى تصل جبهة المذيب الى ما قبل نهاية الطرف العلوي ‪.‬‬
‫(‪)7‬أخرج لوح الطبقة الرقيقة والحظ انفصال مكونات العينة إلى عدة بقع ملونة ‪ ,‬رتب هذه البقع حسب قوة‬
‫ادمصاصها و احسب معامل االعاقة لكل منها ‪ .‬وتعرف على مل مكون تم فصله من السبانخ بمقارنة لونه و‬
‫معامل إعاقة بلون و معامل االعاقة لكل من الكلوروفيل و الكروتين و الكزاينوفيل ‪.‬‬
 ‫تجربة رقم (‪)6‬‬

‫اسم التجربة ‪ :‬فصل الكاربوهيدرات باستخدام الطبقة الرقية‬

‫تاريخ التجربة ‪/ / :‬‬

‫تستخدم الواح السليكا جيل بنجاح في فصل مزيج من الكاربوهيدرات وعملية الفصل والتظهير ال تستغرق‬
‫سوى ‪ 42‬دقيقة‬

‫المحاليل والكواشف‬

‫محلو مزيج يحوي كل ‪1‬مل منه على ‪1‬ملغم من الكاربوهيرات التالية‪:‬‬ ‫‪-1‬‬
‫كلوكوز ‪ Glucose ,‬فركتوز ‪ Fructose ,‬سكروز ‪Sucrose‬‬
‫لوحة جاهزة مغطاة بطبقة رقيقة من السليكا جيل‬ ‫‪-2‬‬
‫‪ -3‬مذيب مكون من المزيج التالي ( ‪9‬مل بيوتانول ‪6 +‬مل حامض خليك ‪ 3 +‬مل ايثر اثيلي ‪ 1 +‬مل‬
‫ماء مقطر )‪.‬‬
‫كاشف رش مكون من ( ‪ 11‬مل ايثانول ‪1 +‬مل حامض كبريتك ‪ 1 +‬مل ‪anisaldehyde p-‬‬ ‫‪-4‬‬
‫‪methoxybenzaldehyde‬‬
‫طريقة العمل‬
‫‪ ‬يوضع النموذج على شكل قطرات في نقطة مؤشرة على بعد ‪2‬سم من احدى نهايتي اللوح كما في التجارب‬
‫السابقة‬
‫‪ ‬يوضع المذيب في قعر الحوض الفصل ثم يوضع اللوح الجاهز فيه ‪.‬‬
‫‪ ‬يترك اللوح لمدة ‪ 62-42‬دقيقة ‪.‬‬
‫‪ ‬يرفع اللوح من الحامض ويجفف لمدة ‪ 12-1‬دقائق‬
‫‪ ‬يرش اللوح بكاشف الرش حيث تظهر البقع الملونة كاالتي ‪:‬‬
‫‪Rf‬‬ ‫لون البقعة‬ ‫المركب‬
‫‪2.11‬‬ ‫ازرق خفيف‬ ‫كلوكوز‬
‫‪2.41‬‬ ‫بنفسجي‬ ‫فركتوز‬
‫‪2.31‬‬ ‫بنفسجي‬ ‫سكروز‬
 ‫تجربة رقم (‪)7‬‬
‫) لمحلول برمنغنات البوتاسيوم‬ ‫اسم التجربة‪ :‬تعيين الطول الموجي االكبر المتصاص ( ‪max‬‬
‫(‪)KMno4‬‬
‫تاريخ التجربة ‪/ / :‬‬
‫الهدف من التجربة ‪ :‬قياس الطول الموجي االعلى امتصاص لمحلول برمنغنات البوتاسيوم لمدى من‬
‫االطوال الموجية يتراوح بين (‪)112- 412‬‬
‫االساس العلمي ‪:‬‬
‫أن االجزاء الرئيسية المكونة لجهاز قياس االمتصاص الكهروضوئي ‪ Spectrophotometer‬هي مصدر‬
‫الضوء المرشح ألعطاء ضوء احادي اللون ‪ ,‬خاليا زجاجية للمحاليل او المذيب وخلية كهروضوئية مربوطة‬
‫الى جهاز القياس وعلية يقاس الكهروضوئي الناتج من قبل الضوء بعد مروه خالل المذيب او المحلول‬
‫ويجب اجراء عملية المعايرة ‪ calibration‬للتاكد من ان قياس الجهاز يعمل بصورة صحيحة ‪ .‬يحدث‬
‫االمتصاص لالشعاع من قبل المادة المار خاللها عندما يكون تردد األشعاع مكافئا للطاقة إليصال النظام‬
‫اإللكتروني للمادة الى مستوى عالي مسموح به حيث يقصد باألمتصاص ازالة ترددات معينة من األشعاع‬
‫الكهرومغناطيسي خالل نفاذه من طبقة شفافة الى صلبة او سائلة او غازية لقد تبين ان شدة االشعاع‬
‫تتناقض مع تركيز المادة المار خاللها ‪ .‬اي كلما زاد عدد دقائق الماصة لالشعاع كما عبر عنها قانون بير‬
‫– المبرت اذ يتناسب االمتصاص ‪ A‬طرديا مع التركيز وكمايلي ‪:‬‬

‫=‪A‬‬ ‫‪. C.‬‬ ‫‪X‬‬

 ‫األجهزة والمواد الكيميائية ‪:‬‬
‫جهاز المطياف الضوئي ‪ ,‬دورق ‪122‬مل ‪ ,‬برمنغنات البوتاسيوم ‪ ,‬ماصة ‪ 12‬مل ‪ ,‬ماصة ‪ 1‬مل‬
‫طريقة العمل ‪:‬‬
‫‪ -1‬يحضر محلول مائي من برمنغنات البوتاسيوم باذابة ‪2.213‬غم في ‪ 122‬مل ماء مقطر ثم يجري‬
‫سحب ‪1‬مل منه ويخفف لحد العالمة ‪.‬‬
‫‪ -2‬يتم تهيئة الجهاز‬
‫‪ -3‬نمال احدى الخليتين بالماء المقطر للتصفير (بالنك ) ‪.‬‬
‫‪ -4‬نقوم بوضع الخلية االخرى الحاوية على محلول برمنغنات في الجهاز ونقيس االمتصاصية على مدى‬
‫من االطوال الموجية يتراوح بين (‪nm )112-412‬‬
 ‫تجربة رقم (‪)8‬‬
‫اسم التجربة ‪ :‬ايضاح قانون بير – المبرت‬
‫تاريخ التجربة ‪/ / :‬‬
‫الهدف من التجربة ‪ :‬تطبيق قانون بير –المبرت باستخدام برمنغنات البوتاسيوم‬
‫األساس العلمي ‪:‬‬
‫يعتبر قانون بير –المبرت من اهم القوانين الرياضية التي تتضمن معالجة الكمية المتصاص الطاقة‬
‫األشعاعية من قبل المادة فعندما نوجه شعاع احادي اللون ‪ monochromatic‬شدته (‪ )IO‬بصورة عمودية‬
‫على خلية من الزجاج او الكوارتز وبعد مرور مسافة ‪ b‬خالل العينة التي تحتوي على ‪ N‬من الدقائق‬
‫الماصة لالشعاع تقل شدة األشعاع النافذ من الجهة األخرى الى ‪ I‬حيث ان النقصان في شدة الشعاع‬
‫يتناسب طرديا مع عدد الدقائق الممتصة الموجودة في المحلول والتي تعترض طريق الشعاع ‪.‬‬
‫ينص القانون على ‪ :‬ان الزيادة المتتابعة في عدد الجزيئات المتماثلة الماصة لالشعاع والواقعة في طريق‬
‫حزمة من اشعاع احادي اللون تمتص اجزاء متساوية من الطاقة األشعاعية التي تمر بها ‪ .‬ويعبر عنه‬
‫رياضيا بالصيغة التالية ‪:‬‬

‫‪Log IO/I= a=€bc‬‬

‫‪A=abc‬‬ ‫او‬
‫حيث ان ‪:‬‬
‫شدة الضوء الساقط على المحلول‬ ‫‪IO‬‬
‫‪ I‬شدة الضوء النافذ‬
‫‪ €‬ثابت التناسب ويسمى باالمتصاصية المولية ‪Molar Absorptivity‬‬
‫‪ a‬ثابت التناسب ويسمى باالمتصاصية النوعية ‪Specific Absorptivity‬‬
‫‪ B‬طول ممر الضوء خالل المحلول‬
‫‪ C‬تركيز المحلول‬
‫النسبة ‪ I/IO‬تعرف بالنفاذية ‪ Transmittance‬ويرمز لها ب‪ T‬اما ‪ Log‬تعرف باالمتصاصية‬
‫‪ Absorbance‬ويرمز لها بالرمز ب‪A‬نظريا فان رسم العالقة بين ‪A‬و‪ C‬يجب ان تكون عالقة خطية تمر‬
 ‫بنقطة االصل وعمليا وجد ان العالقة بين األمتصاص والتركيز يمكن حصول انحراف مع ثبات مسار‬
‫األشعاع بما يعني عدم مطاوعة قانون بير او األنحراف عنه وحينئذ تنحرف القيمة الحقيقية انحرافا موجبا‬
‫او انحرافنا سالبا ‪.‬‬
‫طريقة العمل‬
‫‪ -1‬يتم تحضير عدد من المحاليل القياسية من مادة برمنغنات البوتاسيوم والتي تركيزها ‪2.222‬موالري وذلك‬
‫بسحب ‪ ......1,2,3,4,1‬مل بواسطة الماصة ووضعها في قنينة حجكية سعة ‪ 21‬مل ونكمل الحجم‬
‫للعالمة ‪.‬‬
‫‪ -2‬يشغل الجهاز ويثبت على طول موجي ‪520nm‬‬
‫‪ -3‬يصفر الجهاز بالماء المقطر‬
‫‪ -4‬نمال الخلية بالمحلول االول المحضر في الخطوة االولى ونسجل االمتصاصية ‪A‬‬
‫‪ -1‬نعيد الخطوة السابقة على المحاليل‬
‫‪ -6‬ناخذ المحلول المجهول ونكمل الحجم للعالمة ويتم قياس االمتصاص له‬
‫‪ -7‬نرسم بيانيا العالقة بين قيم االمتصاص ومقابلها تركيزها‬
‫‪ -1‬نستخرج تركيز المحلول المجهول من الرسم البياني‬
‫يتم حساب تراكيز المحايل المحضرة من خالل العالقة‬
‫‪C1V1=C2V2‬‬
‫وإليجاد تركيز المجهول ‪ Unknown‬نرسم العالقة بين االمتصاصية ‪ 122‬مقابل التركيز‬
‫االمتصاصية‬ ‫التركيز‬