..

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH

BAN CHẤP HÀNH TP. HỒ CHÍ MINH
----------------------

CÔNG TRÌNH DỰ THI

GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC – EURÉKA
LẦN THỨ XIX NĂM 2017

TÊN CÔNG TRÌNH:

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

QUÁ TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU
KHÔNG (PIPER BETLE L.) VÀ KHẢO SÁT HOẠT
TÍNH KHÁNG KHUẨN

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU : Công nghệ Hóa – Dược

CHUYÊN NGÀNH : Công nghệ hóa học

Mã số công trình: ....................................................

 i

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................................................v
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................6
1.1. Giới thiệu về Trầu Không ..............................................................................6
1.1.1. Vị trí phân loại................................................................................................6
1.1.2. Khái quát về họ hồ tiêu ..................................................................................7
1.1.3. Sơ lược về chi hồ tiêu .....................................................................................8
1.1.4. Nguồn gốc ......................................................................................................8
1.1.5. Đặc điểm thực vật ..........................................................................................8
1.1.6. Thành phần hóa học .......................................................................................9
1.2. Giới thiệu về tinh dầu ...................................................................................11
1.2.1. Khái niệm tinh dầu .......................................................................................11
1.2.2. Phân bố tinh dầu trong tự nhiên ...................................................................12
1.2.3. Quá trình tích lũy tinh dầu............................................................................12
1.2.4. Tính chất vật lý của tinh dầu ........................................................................13
1.2.5. Tính chất hoá học của tinh dầu ....................................................................14
1.2.6. Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất
của tinh dầu trầu không ................................................................................14
1.2.7. Ứng dụng của tinh dầu trầu không ...............................................................15
1.2.8. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên ............................15
1.2.9. Nguyên tắc trích ly tinh dầu .........................................................................15
1.2.10. Các phương pháp trích ly tinh dầu .............................................................16
1.3. Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ..........................21
1.3.1. Nguyên lý hoạt động của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .........21
1.4. Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất
kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật ...........................................................22
 ii

1.4.1. Khái niệm .....................................................................................................22

1.4.2. Các cơ chế kháng khuẩn ...............................................................................22
1.5. Giới thiệu về các chủng vi khuẩn gây bệnh ...............................................29
1.5.1. Staphylococcus aureus .................................................................................29
1.5.2. Escherichia coli (E.coli) ...............................................................................31
1.5.3. Salmonella ....................................................................................................32
1.5.4. Bacillus subtillis ...........................................................................................34
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................36
2.1. Thời gian thực hiện đề tài ............................................................................36
2.2. Vật liệu ...........................................................................................................36
2.2.1. Nguyên liệu ..................................................................................................36
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị ...........................................................................................36
2.2.3. Hóa chất........................................................................................................37
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................38
2.3.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng .....................40
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu trầu không
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...........................44
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (cắt
nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng thu được bằng phương pháp chưng
cất lôi cuốn hơi nước ....................................................................................44
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá
bánh tẻ, lá già) đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...................................................44
2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung
vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...................................................44
2.3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm muối NaCl
đến hàm lượng thu hồi tinh dầu....................................................................45
 iii

2.3.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm
lượng tinh dầu trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước ...............................................................................................45
2.3.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến
hàm lượng tinh dầu trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất
lôi cuốn hơi nước ..........................................................................................45
2.3.3. Xác định chỉ số vật lý, hoá học của tinh dầu trầu không .............................46
2.3.3.1. Đánh giá cảm quan .....................................................................................46
2.3.3.2. Xác định chỉ số vật lý .................................................................................47
2.3.3.3. Xác định chỉ số hoá học .............................................................................48
2.3.3.4. Xác định thành phần hoá học của tinh dầu ................................................50
2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn ..............................................51
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................54
3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .............................54
3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng
tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực
tiếp ................................................................................................................54
3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá
già) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước. ..............................................................................................56
3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lượng nước đến hàm lượng tinh dầu
trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ........58
3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào
nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp
chưng cất lôi cuốn hơi nước .........................................................................60
3.1.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng
tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .............62
 iv

3.1.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh
dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nuớc ....................64
3.2. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu trầu không ..........................66
3.2.1. Đánh giá cảm quan .......................................................................................66
3.2.2. Định lượng tinh dầu trầu không ...................................................................66
3.2.3. Kết quả đo tỷ trọng tinh dầu trầu không ......................................................66
3.2.4. Kết quả xác định độ hoà tan của tinh dầu trầu không trong ethanol ............67
3.2.5. Chỉ số hóa học của tinh dầu trầu không .......................................................68
3.3. Kết quả xác định thành phần hoá học tinh dầu ........................................68
3.4. Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trầu không thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .......................................70
3.4.1. Hoạt tính kháng Salmonella của tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...................................................70
3.4.2. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu trầu không thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................73
3.4.3. Hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu trầu không thu được bằng phương
pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ................................................................75
3.4.4. Hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis của tinh dầu trầu không thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................77
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................81
4.1. Kết luận .........................................................................................................81
4.2. Kiến nghị .......................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................83
PHỤ LỤC
 v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN : Dược điển Việt Nam

DMSO : Dimethyl sulfoxyde
DNA : Deoxyribonucleic Acid
ĐC : Đối chứng
E.Coli : Escherichia coli
GC : Gas chromatography
IA : Index acid
IE : Index Ester
IS : Index Savon
MS : Mass spectrometry
NA : Nutrient Agar
NB : Nutrient Broth
NXB : Nhà xuất bản
RNA : Ribonucleic Acid
TB : Trung bình
TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam
TCVS : Tiêu chuẩn vệ sinh
TSA : Trypticase Soy Agar
TSB : Trypticase Soy Broth
 vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ....................54
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá già, lá bánh tẻ, lá non) đến
hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp lôi cuốn hơi
nước .......................................................................................................56
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của lượng nước đến hàm lượng tinh dầu thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...................................58
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ..........................60
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ..........................62
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nuớc...........................64
Bảng 3.7. Kết quả định lượng tinh dầu trầu không ................................................66
Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ trọng tinh dầu trầu không .......................................67
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ hoà tan tinh dầu trầu không bằng phương
pháp chưng cất hơi nước trong ethanol .................................................67
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát chỉ số hóa học của tinh dầu trầu không ....................68
Bảng 3.11. Kết quả phân tích thành phần và hàm lượng tương đối các hợp
chất trong mẫu tinh dầu trầu không bằng phương pháp GC – MS ........69
Bảng 3.12. Kết quả kháng Salmonella của tinh dầu trầu không thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...................................71
Bảng 3.13. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu trầu không
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ....................73
Bảng 3.14. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............................................75
 vii

Bảng 3.15. Kết quả kháng Bacillus subtilis của tinh dầu trầu không thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ...................................78
 viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu..............................................................7

Hình 1.2. Hình 3-Allyl-6 methoxyphenyl acetate .................................................11
Hình 1.3. Hệ thống chưng cất hơi nước ...............................................................16
Hình 1.4. Máy ép tinh dầu .....................................................................................17
Hình 1.5. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng .....................19
Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi hợp chất thực vật ................23
Hình 1.7. Cấu trúc của Morphine ..........................................................................24
Hình 1.8. Quinine trích ly từ cây Cinchona officinalis ........................................25
Hình 1.9. Sơ đồ phân loại saponin .........................................................................27
Hình 1.10. Vi khuẩn Staphylococcus aureus .........................................................30
Hình 1.11. Vi khuẩn E.coli ....................................................................................31
Hình 1.12. Vi khuẩn Salmonella ...........................................................................33
Hình 1.13. Vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................................35
Hình 2.1. Lá trầu Piper betle L. .............................................................................36
Hình 2.2. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu trầu
không bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ........................39
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình chưng cất và thu nhận tinh dầu trầu không ..................40
Hình 2.4. Hình dạng lá trầu không (Piper betle) ...................................................41
Hình 2.5. Lá trầu không sau khi xay nhuyễn và chuyển vào bình cầu ..................42
Hình 2.6. Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước sử dụng để trích ly tinh dầu trầu ........43
Hình 2.7. Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của tinh dầu trầu không.......51
Hình 3.1. Đồ thị ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh
dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .............55
Hình 3.2. Đồ thị ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu
trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước .......................................................................................................57
 ix

Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của lượng nước đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ..........................59
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ..........................61
Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian ngâm NaCl mẫu đến hàm lượng tinh
dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .............63
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nuớc...........................65
Hình 3.7. Kết quả kháng Salmonella của tinh dầu trầu không ..............................72
Hình 3.8. Kết quả kháng Salmonella của thuốc kháng sinh ..................................72
Hình 3.9. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu trầu không ...........75
Hình 3.10. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của thuốc kháng sinh .............75
Hình 3.11. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu trầu không.....................................77
Hình 3.12. Kết quả kháng E.coli của thuốc kháng sinh ........................................77
Hình 3.13. Kết quả kháng Bacillus subtilis của tinh dầu trầu không ....................79
Hình 3.14. Kết quả kháng Bacillus subtilis của thuốc kháng sinh ........................79
 1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Từ lâu con người đã biết sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh. Kháng sinh
thường là thuốc tổng hợp, nếu chúng ta dùng không đúng sẽ gây nhiều tác hại như
có tác dụng phụ, dễ kháng thuốc, lệ thuộc vào thuốc,...
Nền y học dân gian dùng cây cỏ để trị bệnh là hình thức trị bệnh cổ nhất của
nhân loại, đã có nhiều ngàn năm về trước. Trên thế giới, xu hướng nhân loại ngày
càng ưa thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Việt
Nam là nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm ướt nên hệ thực vật rất phong phú và đa
dạng, nó là nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được,
nhiều cây thuốc quý với đầy đủ chủng loại và số lượng lớn. Vậy một câu hỏi đặt ra
là: “Tại sao chúng ta không sử dụng chúng để chữa bệnh?”
Trong quá trình nghiên cứu kháng sinh thực vật, người ta đặc biệt quan tâm
đến tinh dầu. Tinh dầu có nhiều đặc tính dược học, có khả năng kháng khuẩn, kháng
nấm.
Trầu không là một nguồn nguyên liệu sẵn có, dễ tìm, dễ trồng, thu hoạch
quanh năm và có tiềm năng to lớn để sản xuất tinh dầu và kháng sinh.
Cây trầu còn có tên là trầu không và có tên khoa học là Piper betle L. Theo
Đông y, lá trầu có vị cay nồng, tính ấm, có tác dụng chữa ho, trị các bệnh đường
tiêu hóa, đau bụng hoặc sa dạ con sau sinh,... Lá trầu có chất tinh dầu giúp ngăn
ngừa phát sinh ưng thư gan, thực quản, đại tràng, da,... Các nhà khoa học Ấn Độ
cho biết trong lá trầu có carotenoid, chất xơ rất có lợi cho tiêu hóa, chống lão hóa và
hạ cholesterol, làm vững chắc thành mạch, chữa bệnh tăng huyết áp,...
Đặc biệt việc nghiên cứu tách chiết các hợp chất có dược tính cao ngoài tinh
dầu từ lá trầu không là vấn đề mới mẻ, chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Việc
nghiên cứu tách chiết tinh dầu và các hợp chất ngoài tinh dầu có dược tính cao đồng
thời thử hoạt tính sinh học của tinh dầu trầu không là việc làm cần thiết góp phần
vào việc đánh giá hiệu quả và áp dụng các hợp chất thiên nhiên trong các lĩnh vực
như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Nghiên cứu của đề tài sẽ làm tăng giá trị
 2

kinh tế của trầu không ở khu vực miền Nam nói riêng và ở Việt Nam nói chung. Vì
thế, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
trích ly tinh dầu từ lá Trầu không (Piper betle L.) và khảo sát hoạt tính kháng
khuẩn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng thu nhận tinh dầu trầu
không bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
 Định danh và định lượng thành phần hoá học tinh dầu trầu không bằng
phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS).
 Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu trầu không bằng phương
pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Nghiên cứu cơ sở lý luận và thực tiễn của đề tài.
 Tiến hành thực nghiệm ly trích tinh dầu từ các lá trầu không bằng phương
pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
 Định danh và định lượng các thành phần hoá học của tinh dầu trầu không
bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS).
 Thử hoạt tính sinh học về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu trầu không thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp.
4. Các phương pháp nghiên cứu
 Nghiên cứu lý thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu.
 Thực nghiệm:
 Các phương pháp tách chiết tinh dầu: phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước trực tiếp sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger.
 Phương pháp sinh hóa: thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trầu không
trên các chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, E.coli,
Salmonella.
 Xử lý số liệu bằng phần mềm SAS 9.1 và Excel 2016 ®.
5. Đối tượng nghiên cứu
 3

 Lá trầu không được trồng ở xã Long Kiến, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang.
6. Lịch sử của vấn đề nghiên cứu
Các công trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về tinh dầu lá trầu cụ
thể là:
 Năm 2003, Hoàng Văn Lựu đã nghiên cứu “Thành phần hóa học của tinh
dầu cây Hồ tiêu Piper nigrum L. và tinh dầu cây trầu không Piper bette L. ở
Nghệ An”, Tạp chí Dược học, 43(11), trang 15-17.
 Menon và cộng sự (2003), “Thành phần tinh dầu thiết yếu của 4 chi tiêu đen
(Piper nigrum L.) III”, Journal Of Essential Oil Research, 15(3), pp. 155-
157.
 Năm 2009, Phạm Thế Chính đã nghiên cứu “Thành phần hóa học của tinh
dầu lá Trầu (Piper betle L.) trồng tại Hải Dương – Trường Đại Học Khoa
Học – Đại Học Thái Nguyên.
 Năm 2011, Nguyễn Nho Dũng đã tiến hành “Nghiên cứu chiết tách, xác định
thành phần hoá học tinh dầu và dịch chiết từ lá trầu không”. Chuyên nghành
Hoá Hữu Cơ – Đại học Đà Nẵng – năm 2011.
 Năm 2016, Nguyễn Thiện Chí và cộng sự đã tiến hành “Khảo sát thành phần
hoá học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không” (Nguyễn
Thiện Chí và cộng sự, 2016). Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ.
7. Những đóng góp mới của đề tài
 So sánh hàm lượng tinh dầu của 3 loại lá trầu non, lá trầu bánh tẻ và lá
trầu già.
 Xác định các điều kiện trích ly tinh dầu tối ưu đối với trầu không (Piper
betle L.) trồng ở xã Long Kiến, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang.
 Xác định thành phần hoá học của tinh dầu trầu không thu được từ nguồn
trầu không trồng ở xã Long Kiến, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang bằng
phương pháp lôi cuốn hơi nước trực tiếp.
a. Ý nghĩa về mặt kinh tế của đề tài
 4

Nâng cao giá trị của cây trầu không, có thể tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị
cao từ tinh dầu trầu, có giá thành rẻ, mà lại có ứng dụng nhiều trong đời sống, an
toàn, giúp cải thiện nguồn kinh tế cho người dân trồng trầu.
b. Ý nghĩa về mặt xã hội
Tạo ra nhiều sản phẩm có chứa tinh dầu trầu trên thị trường chưa có.
c. Ý nghĩa về mặt sức khỏe
Đối với Tây y
Các lá trầu không cũng được sử dụng như là chất kích thích, chất khử
trùng và chất làm sạch hơi thở. Trong y học Ayurveda, chúng còn được sử dụng
như là thuốc kích dục. Tại Malaysia chúng được sử dụng để điều trị chứng đau
đầu, viêm khớp và các thương tổn khớp. Tại Thái Lan và Trung Quốc chúng được
dùng để làm dịu bệnh đau răng. Tại Indonesia chúng được uống như một loại trà và
sử dụng như là thuốc kháng sinh. Chúng cũng được sử dụng trong trà để điều
trị chứng khó tiêu, cũng như trong thuốc mỡ hay thuốc hít để điều trị đau đầu, cũng
như trong điều trị chứng táo bón, cũng như có tác dụng thông mũi và hỗ trợ tiết sữa.
Đối với Đông y
Trầu Không có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm có tác dụng trừ
phòng thấp, hạ khí, tiêu đờm, sát trùng. Y học dân gian nhiều nước có kinh nghiệm
dùng nước sắc lá trầu không để rửa vết thương và những chỗ lở loét ngoài da. Tại
Malaysia, lá trầu không được dùng để chữa đau đầu, viêm khớp. Ở Thái Lan, lá trầu
dùng để chữa đau răng. Ở Indonesia, dùng lá trầu để làm thuốc kháng sinh, kháng
khuẩn, diệt nấm. Lá trầu có thể dùng để thông hơi, hít qua mũi để trị nhức đầu, làm
thông mũi hoặc sát trùng đường hô hấp. Ở Ấn Độ, lá và tinh dầu trầu không được
dùng để điều trị bệnh phổi. Còn ở Việt Nam, ngoài dùng để ăn trầu (nhai với cau và
vôi) cho ấm người, chống lạnh trừ sốt ngã nước và phòng bệnh, còn dùng lá trầu giã
nhỏ, cho thêm nước sôi vào rồi dùng rửa vết thương, mẩn ngứa, hạch sưng đau, tắm
cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ để trị hăm da, rôm, sảy.
Nước pha lá trầu không còn được dùng để làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết
mạc, chữa bệnh chàm mặt ở trẻ nhỏ.
 5

Có nơi còn giã nhỏ đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để cho
sữa không ra nữa.
d. Ý nghĩa trong công nghệ thực phẩm
Dùng ăn kèm chung với vôi và cau trong tục ăn trầu, hương liệu cho các loại
gia vị như ngũ vị hương,...
8. Kết cấu của đề tài
Kết cấu của đề tài gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
 6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Trầu Không

1.1.1. Vị trí phân loại
Cây trầu không (Piper betle L.) thuộc:
Giới (regnum) : Plantae
Ngành (divisio) : Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp (class) : Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp (sublass) : Ngọc lan (Magnoliidae)
Bộ (ordo) : Piperales
Họ (familia) : Piperaceae
Chi (genus) : Piper
Loài (species) : Piper Betle L.

Trầu không có tên khoa học: Piper betle L. Ngoài ra trầu không còn có tên
khác là: Pipe siriboa L.
Tên thông thường: trầu, thược tượng, betel Baum (Đức), árbol de betel (Tây
Ban Nha), arbre de betel (Pháp), pokok sirih (Malaisia), Betel Boom (Hà Lan),...
 7

Trầu không Hồ tiêu

Tiêu rừng Lá lốt

Hình 1.1. Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu
1.1.2. Khái quát về họ hồ tiêu
Trên thế giới, họ Hồ tiêu (Piperaceae) có khoảng 2.000 – 3.000 loài. Sự phân
nhóm đối với các loài và chi của họ này cho đến nay vẫn chưa đạt được sự thống
nhất. Theo hai tác giả Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Kim Đào (1991), họ Hồ tiêu
phân bố ở Việt Nam có 5 chi gồm: Peperomia, Zippelis, Circaeocarpus, Piper,
Lepianthes, trong đó, chi Piper có 46 loài.
Các thành viên của Piperaceae là những cây nhỏ, những cây bụi, hoặc các
loại thảo mộc. Thân cỏ hay dây leo nhờ rễ bám. Lá: đơn, nguyên, mọc cách, có hay
không có lá kèm, phiến lá hình tim hay hình trứng, gân lá hình chân vịt hay lông
chim. Cụm hoa: không phân nhánh mọc ở nách lá hay đối diện với lá. Các loài của
 8

họ này được chia thành chuỗi, thông thường có mùi thơm rất mạnh, cay nồng. Quan
trọng nhất về mặt kinh tế trong họ này bao gồm các loại cây như tiêu, trầu, lá lốt,...
Các cây tiêu biểu trong họ:
 Rau càng cua (Piperomia pellucida): dùng làm rau ăn.
 Trầu không (Piper betel L.): thân, lá chữa nhức mỏi, ăn không tiêu.
 Lá lốt (Piper lolot C.DC): toàn cây chữa phong hàn, rối loạn tiêu hoá.
 Tiêu (Piper nigrum L.): dùng làm gia vị.
1.1.3. Sơ lược về chi hồ tiêu
Chi Hồ Tiêu (Piper) là một chi lớn, gồm khoảng 1.200 loài, phân bố chủ yếu
ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới điển hình. Trong vùng Đông Nam Á có khoảng
400 loài. Ở nước ta, theo Phạm Hoàng Hộ (1991) chi hồ tiêu có khoảng 40 loài,
thường là những cây thân bụi, thân thảo và cây dây leo. Lá mọc so le, nguyên hay
chẻ ba. Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, không có bao hoa, xếp thành bông dày đặc và
dài, hoa có hai nhị đứng tròn trục hay ở gốc bầu. Quả mọng không có cuống hoặc
có cuống.
1.1.4. Nguồn gốc
Loài này có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á và được trồng ở Ấn Độ,
Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam, Malaysia. Lá trầu loại tốt nhất thuộc về giống
"Magahi" (từ vùng Magadha) sinh trưởng ở gần Patna tại Bihar, Ấn Độ. Ở nước ta,
cây trầu được trồng khắp các vùng miền với quy mô lớn nhỏ khác nhau. Có thể
trồng từng cây riêng lẻ ở từng hộ gia đình hoặc trồng thành vườn.
1.1.5. Đặc điểm thực vật
Cây trầ u hay trầ u không là một cây gia vi,̣ cây thuố c. Đây là loa ̣i cây thường
có màu xanh, dây leo, số ng lâu năm.
Lá có cuống có bẹ, dài 1,5 – 3,5 cm; phiến hình trái xoan, dài 10 – 13 cm,
rộng 4,5 – 9 cm.
Có gốc hơi không cân.
 9

Lá hình tim có mặt bóng, có mũi nhọn ở chóp, có dạng màng và cứng, có các
điểm tuyến trong suốt rất mịn; gân gốc thường là 5. Hoa khác gốc, mọc thành bông,
đuôi sóc, màu trắng.
Theo phân tích dinh dưỡng, cứ 100 gram lá trầu không thì có đến 85,4% độ
ẩm, 3,1% protein, 0,8% chất béo, 2,3% muối khoáng, 2,3% chất xơ và 6,1%
carbohydrate. Hàm lượng khoáng chất và vitamin chủ yếu là calcium, caroten,
thiamin và vitamin C. Riêng giá trị calo lên tới 44. Ngoài ra, trầu không còn chứa
một dạng phenol có tên là chavicol có đặc tính khử trùng rất tốt. Chính vì vậy trầu
không hữu ích đối với sức khoẻ con người.
1.1.6. Thành phần hóa học
a. Nghiên cứu trên thế giới
Chi Piper là chi lớn nhất trong họ Hồ tiêu và là một trong những chi có số
lượng loài lớn nhất trong ngành thực vật hạt kín. Vì thế, đã có khá nhiều những
nghiên cứu về thành phần hóa học của chi này được thực hiện. Theo Parmar và
cộng sự (1996) có 85 loài trên tổng số hơn 1.000 loài thuộc chi Piper được nghiên
cứu về thành phần hóa học và có 555 chất được công bố phân lập từ chi này. Tùy
mục đích của từng nghiên cứu, những bộ phận của chi Piper được chọn làm đối
tượng nghiên cứu về thành phần hóa học có thể là thân, lá, rễ, quả hoặc hạt. Những
hợp chất phân lập được có cấu trúc hóa học rất đa dạng và nằm trong những nhóm
chính sau: alkaloid, tinh dầu, flavonoid, propenylbenzen, lignan, neolignan,… Cũng
theo nghiên cứu này, alkaloid là nhóm hợp chất phong phú nhất với 145 chất được
liệt kê. Trong đó, piperin là hợp chất đầu tiên của nhóm alkaloid được phân lập và
cũng là alkaloid phổ biến nhất có mặt trong chi Piper (Parmar, 1996). Từ năm 1996
đến nay, đã có thêm nhiều hợp chất mới được phân lập từ những loài đã nghiên cứu
cũng như từ một số loài mới được nghiên cứu của chi này, trong đó, riêng nhóm
hợp chất alkaloid cũng đã có thêm khoảng 135 chất được công bố bởi Gutierrez và
cộng sự (2013).
 Nhóm hợp chất alkaloid
 10

Alkaloid là nhóm hợp chất được quan tâm nhất trong số các nhóm hợp chất
có mặt trong chi Piper không những bởi hàm lượng cao mà còn bởi những tác dụng
sinh học mà chúng đem lại như: độc tính tế bào, chống kết tập tiểu cầu, kháng
khuẩn, kháng nấm,... Đặc điểm của alkaloid phân lập được từ chi này là có nguyên
tử nitrogen nằm ở mạch thẳng (ngoài vòng) hoặc là dị tố của vòng 5 hoặc 6 cạnh
(piperidin, pyrrolidin,…). Qua tham khảo tài liệu, đã thống kê được 280 alkaloid
phân lập từ 61 loài thuộc chi Piper (Nascimento, 2012).
 Nhóm tinh dầu
Tinh dầu là nhóm hợp chất điển hình của chi Piper và được thể hiện ở mùi
thơm đặc trưng của các cây trong chi. Hai bộ phận của các loài thuộc chi Piper
được nghiên cứu nhiều về thành phần tinh dầu là lá và quả. Đây cũng là hai bộ phận
chứa hàm lượng tinh dầu cao nhất trong cây. Ngoài ra, ở chi Piper, tinh dầu còn
xuất hiện ở thân và rễ của cây. Một số cấu tử có mặt khá phổ biến trong thành phần
tinh dầu của nhiều loài thuộc chi Piper như: α-pinen, camphen, 1,8-cineol, myrcen,
γ-cardinen,… (Parmar, 1996).
 Nhóm hợp chất flavonoid
Từ một số loài thuộc chi Piper, đã có 61 hợp chất flavonoid được phân lập và
công bố. Những hợp chất thuộc nhóm này sở hữu một số tác dụng sinh học đáng
quan tâm như: độc tính tế bào, chống oxy hóa, kháng nấm. Dựa vào công thức cấu
tạo, hầu hết những hợp chất này đều thuộc nhóm euflavonoid và nằm trong 4 phân
nhóm gồm: chalcon, dihydrochalcon, flavanon và flavon (Parmar, 1996).
b. Nghiên cứu trong nước
Các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy trong lá trầu chứa các thành
phần sau: lá trầu chứa tinh dầu gồm 23 thành phần, trong đó chủ yếu: 3-Allyl- 6
methoxyphenyl acetate (14,95%); 4-Allyl-1,2 diacetoxybenzene (8,98%); Chvicol
(4,57%); Eugenol (9,03%); Beta-caryophyllene (7,06%); linalol (1,55%). Tinh dầu
của nó có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, khi nếm có vị nóng và cay.
 11

Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho biết lá trầu còn chứa cả chất tanin, đường khử,
pectin 10%, flavonoid, alkaloid, phytosterol, steroid, acid hữu cơ (Nguyễn Nho
Dũng, 2011).

Hình 1.2. 3-Allyl- 6 methoxyphenyl acetate

1.2. Giới thiệu về tinh dầu
1.2.1. Khái niệm tinh dầu
Tinh dầu gồm nhiều hợp chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào
nguồn gốc cung cấp nguyên liệu tinh dầu. Phần lớn tinh dầu có nguồn gốc từ thực
vật và số ít từ động vật. Hệ thực vật có tinh dầu khoảng 3.000 loài, trong đó có 150
– 200 loài có ý nghĩa công nghiệp.
Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng. Ở
nhiệt độ thường hầu hết tinh dầu ở thể lỏng, có khối lượng riêng bé hơn 1 (trừ một
vài tinh dầu như quế, đinh hương,...), không tan trong nước hoặc tan rất ít, nhưng lại
hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ như alcohol, eter, chất béo,… Tinh dầu bay hơi
với hơi nước, có vị cay và ngọt, nóng bỏng và có tính sát trùng mạnh (Lê Ngọc
Thạch, 2003).
Trong thiên nhiên tinh dầu ở trạng thái tự do, chỉ có một số ít ở trạng thái
tiềm tàng, nghĩa là tinh dầu không có sẵn trong nguyên liệu mà chỉ xuất hiện trong
những điều kiện gia công nhất định trước khi tiến hành ly trích hay dưới tác dụng cơ
 12

học. Còn ở trạng thái tự do, tinh dầu có sẵn trong nguyên liệu có thể thu hái ly trích
trong điều kiện bình thường (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014).
1.2.2. Phân bố tinh dầu trong tự nhiên
Các loại cây có tinh dầu được phân bố rộng trong thiên nhiên. Kết quả thống
kê cho thấy có khoảng 2.500 loài cây có chưa tinh dầu.
Trữ lượng tinh dầu trong cây phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thỗ nhưỡng. Cây
mọc ở vùng nhiệt đới có trữ lượng tinh dầu cao hơn ở vùng ôn đới. Ngay trong một
cây, thành phần và lượng tinh dầu trong các bộ phận khác nhau cũng khác nhau.
Ngoài ra lượng tinh dầu thu được còn phụ thuộc vào điều kiện, phương pháp thu
hoạch, bảo quản, tách chiết,... Hàm lượng tinh dầu trong những cây khác nhau cũng
rất khác nhau: hoa hồng hàm lượng tinh dầu vào khoảng 0,25%; bạc hà hàm lượng
khoảng 1%; quả hồi và nụ đinh hương thì hàm lượng tinh dầu tương ứng có thể đạt
giá trị 5% và 15% (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014).
1.2.3. Quá trình tích lũy tinh dầu
Trong thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích trữ trong các mô. Hình thành các
mô này thay đổi tùy theo vị trí của chúng trong cây. Những mô này có thể hiện ở tất
cả mọi nơi trong cây như rễ, thân, lá, hoa và trái,... dưới những tên gọi khác nhau
như:
 Tế bào tiết: tế bào tiết ra tinh dầu rồi giữ luôn trong tế bào (mô tiết) như
trong cánh hoa hồng, củ gừng,...
 Lông tiết: cũng là tế bào tiết nhưng nằm nhô ra ngoài bề mặt thực vật,
thường bắt gặp ở lá các họ Hoa môi, Cúc, Cà,...
 Túi tiết: tế bào tiết ra tinh dầu nhưng không chứa lại bên trong mà dồn chung
chứa vào một xoang trống, tạo ra bởi cơ chế ly bào hay tiêu bào. Túi tiết
thường năm bên dưới biểu bì. Thường có ở vỏ trái các loài thuộc Citrus,
Eucalyptus,...
 Ống tiết: cách tạo ra tinh dầu cũng như túi tiết nhưng nằm sâu bên trong phần
gỗ và chạy dài theo sớ gỗ, bắt gặp trong các loài thuộc chi Dipterocarpi,
Artmisia,...
 13

Về phần phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ Long não, họ
Hoa môi, Họ Cam, Họ Sim, họ Hoa tán.
Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây: như ở hoa (hồng, nhài,
cam, chanh,...); ở lá (bạch đàn, bạc hà, hương nhu, tần dầy lá,...); ở vỏ cây (quế); ở
thân cây (hương đàn, peru, sả,...); ở rễ (hương bài, gừng, nghệ, xuyên khung,...)
(Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014).
1.2.4. Tính chất vật lý của tinh dầu
Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp như menthol,
camphor,... là ở thể rắn.
Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thể tách thu
tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Tinh dầu rất ít tan trong
nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một
phần trong dung dịch kiềm,...
Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu
như: tinh dầu quế có màu nâu sẫm, tinh dầu thymus màu đỏ. Tinh dầu thường có vị
cay và hắc.
Tỷ trọng của tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95; có một số tinh dầu
nặng hơn nước như tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế. Tỷ trọng thay đổi theo thành
phần hóa học. Nếu tinh dầu có thành phần chủ yêu là hydrocarbon terpenic thì tỷ
trọng thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thì tỷ trọng cao hơn.
Tinh dầu thường có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 – 1,56. Chỉ số khúc xạ
cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no hoặc
có nhân thơm. Nếu tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều dây nối đôi thì có chỉ số
khúc xạ cao.
Vì tinh dầu là một hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định. Điểm sôi
của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất. Ví dụ, hợp chất terpen có điểm
sôi là 150 – 160oC, hợp chất sesquiterpen có điểm sôi cao hơn, khoảng 250 – 280oC,
còn các hợp chất polyterpen có điểm sôi trên 300oC. Từ đó, ta có thể tách riêng các
thành phần khác nhau trong tinh dầu bằng phương pháp chưng cất phân đoạn.
 14

Khi hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu hồi, tinh dầu bạc
hà, tinh dầu xá xị,... (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014).
1.2.5. Tính chất hoá học của tinh dầu
Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, nước tinh dầu dễ bị oxy
hóa và có thể bị nhựa hóa một phần. Alcol trong tinh dầu bị oxy hóa thành
aldehyde, aldehyde biến thành acid.
Các hợp chất có nối đôi dễ bị oxy hóa hoặc tham gia vào phản ứng cộng hợp.
Các hợp chất ceton và aldehyde dễ bị aldol hóa tạo nhựa khi có dự hiện diện
của kiềm.
Nhiều thành phần có các nhóm chức khác nhau có thể tham gia các phản ứng
hóa học, làm thay đổi tính chất của tinh dầu (Phùng Thị Ái Hữu, 2012).
1.2.6. Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất
của tinh dầu trầu không
Tinh dầu chứa trong thực vật có thành phần không cố định mà luôn thay đổi
theo hướng phát triển của cây cũng như ảnh hưởng của những yếu tố khác.
a) Nguyên liệu chế biến và bộ phận dùng để chế biến
Ở mỗi loại cây có chứa tinh dầu, ở mỗi bộ phận chứa tinh dầu, có thành phần
nhất định trong những điều kiện nhất định, các giống khác nhau thì thành phần tinh
dầu cũng khác nhau. Trong cùng một cây lượng tinh dầu khác, hàm lượng và thành
phần cũng khác nhau.
b. Phương pháp chế biến
Tùy thuộc vào phương pháp chế biến mà hàm lượng và thành phần cũng
khác nhau. Tinh dầu nhận được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ít bị
tạp hơn so với tinh dầu trích ly bằng dung môi bay hơi vì các thành phần tạp khác sẽ
hòa tan vào nước.
c. Hướng phát triển của cây
Trong thời gian cây sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt các biến
đổi và những chuyển hóa này có thể xác định thời kỳ mà cây tích tụ được nhiều tinh
dầu nhất và có chất lượng cao nhất để thu hoạch và chế biến.
 15

Tinh dầu tạo thành trong cây không phải có 1 lượng cố định mà biến đổi liên
tục theo hướng phát triển của cây. Sự biến đổi này có xu hướng là càng ngày càng
tích tụ nhiều những hợp chất có chứa oxy.
Trong các bộ phận khác nhau của cây, tinh dầu tạo thành và tích lũy không
giống nhau mà luôn luôn chuyển hóa lẫn nhau (Lê Ngọc Thạch, 2003).
1.2.7. Ứng dụng của tinh dầu trầu không
Khoa học ngày càng tiến bộ thì ứng dụng của tinh dầu ngày càng rộng rãi và
chiếm một vị trí quan trọng:
 Trong thực phẩm: ăn kèm với cau, vôi trong tục ăn trầu.
 Mỹ phẩm: tinh dầu đóng vai trò quan trọng vì nó có khả nằng giữ mùi, chống
oxy hóa, bảo vệ da, tạo hương thơm dịu tự nhiên. Nên tinh dầu được ứng
dụng nhiều trong: dầu thơm, nước hoa, kem, dầu gội,dung dịch vệ sinh phụ
nữ,...
 Trong y học: giúp dễ tiêu hóa, bài tiết của dạ dày, tăng khả năng tuần hoàn
máu, giảm đau, tăng quá trình trao đổi chất, chống vi khuẩn, virus. Nên tinh
dầu được được sử dụng nhiều dưới dạng thuốc viên, cao, dung dịch lỏng,...
1.2.8. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên
 Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu.
 Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu.
 Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất.
 Đơn giản, thuận tiện và nhanh chóng (Mai Thị Anh Tú, 2009).
1.2.9. Nguyên tắc trích ly tinh dầu
Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những
đặc tính của tinh dầu như:
 Dễ bay hơi.
 Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100oC.
 Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ.
 Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí.
 16

1.2.10. Các phương pháp trích ly tinh dầu

Do những yêu cầu về nguyên tắc sản xuất nên khi khai thác hợp chất thơm từ
thực vật, động vật, người ta thường dùng một trong các phương pháp sau đây:
a) Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hình 1.3. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước

1. Bình cấp hơi nước
2. Bình chứa nguyên liệu chưng cất
3. Lớp tinh dầu
4. Lớp nước
Hơi nước tạo ra từ nồi hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa
thẳng vào bình chưng cất. Ngày nay thường dùng phương pháp này để chưng cất
tinh đầu từ các nguyên liệu thực vật. Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta
có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm nhưng phải
giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy.
Việc sử dụng phương pháp cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế, yêu
cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm. Nếu quá nóng nó có thể phân hủy nhưng
cấu phần có độ sôi thấp. Nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta
phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự
khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá
nhiệt. Nếu hơi nước quá ẩm sẽ dẫn đến hiện tượng hơi nước ngưng tụ, phần chất
nạp phía dưới sẽ bị ướt, trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một
van xả dưới đáy nồi. Trong công nghiệp, hơi nước trước khi vào bình chưng cất
phải đi ngang một bộ phận tách nước.
 17

Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng, nên tốt
nhất là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết
thúc. Không có một quy tắc chung nào cho mọi nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi
một kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau. Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ vào
đặc tính của tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất (Lã Đình Mỡi, 2001).
Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu người ta thường dùng
bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger
Ưu điểm:
 Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản
 Thiết bị gọn, dễ chế tạo
 Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ.
 Thời gian tương đối nhanh
Nhược điểm:
 Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp.
 Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu
phần dễ bị phân hủy.
 Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn.
 Những tinh dầu có độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém.
b) Phương pháp cơ học

Hình 1.4. Máy ép tinh dầu

 18

Đây là phương pháp tương đối đơn giản dùng để tách tinh dầu ở dạng tự do
bằng cách tác dụng lực cơ học lên nguyên liệu (thường là ép). Phương pháp này
được dùng phổ biến đối với các loại vỏ quả họ Citrus như cam, chanh, quýt, bưởi,...
Vì ở những loại nguyên liệu này tinh dầu thường phân bố chủ yếu ở lớp tế bào
mỏng trong biểu bì. Khi có lực tác dụng lên vỏ quả, các tế bào có chứa tinh dầu bị
vỡ ra giải phóng tinh dầu.
Phương pháp ép có nhiều ưu điểm như: tinh dầu giữ nguyên được mùi vị
thiên nhiên ban đầu, các thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi.
Nhược điểm của phương pháp ép tinh dầu bị lẫn nhiều tạp chất, chủ yếu là
các hợp chất hữu cơ hòa tan vật liệu đem ép (Lê Ngọc Thạch, 2003).
c) Phương pháp trích bằng dung môi dễ bay hơi
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa
tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp
ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các
hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm
thấu giữa dịch chiết bên trong với dung môi bên ngoài do chênh lệch nồng độ. Sau
khi trích ly phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu.
 Ưu điểm: sản phẩm thu được theo phương pháp này thường có mùi thơm tự
nhiên. Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn các phương pháp khác.
 Khuyết điểm: yêu cầu cao về thiết bị; thất thoát dung môi; quy trình tương
đối phức tạp (Mai Thị Anh Tú, 2009).
d) Trích ly bằng dung môi môi không bay hơi
Dựa vào tính chất có thể hòa tan trong chất béo động vật và thực vật của tinh
dầu, người ta ngâm nguyên liệu vào dầu động vật hoặc thực vật, tinh dầu sẽ khuếch
tán qua màng tế bào, hoà tan vào dầu, sau đó tách riêng tinh dầu để thu tinh dầu.
Phương pháp ngâm bằng dung môi không bay hơi có nhiều ưu nhiều ưu điểm
hơn phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi ở chỗ thu dầu được dầu nhiều
tạp chất hơn. Tuy nhiên, phương pháp này rất thủ công, khó cơ giới hóa và có
nhược điểm lớn là chất béo dùng làm dung môi rất khó bảo quản và chế biến, giá
 19

thành cao. Chính vì vậy hiện nay phương pháp này rất ít được sử dụng (Mai Thị
Anh Tú, 2009).
e) Phương pháp trích ly bằng CO2
Lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng ở áp suất cao, dùng CO2 lỏng
chiết tinh dầu ra khỏi nguyên liệu.
Phương pháp trích ly dùng CO2 lỏng được sử dụng nhiều trong công nghiệp
trong thời gian gần đây do có nhiều ưu điểm như:
 Dung môi CO2 có tính chọn lựa tốt.
 CO2 không có tác dụng độc hại đối với con người như các loại dung môi
khác.
 Dễ loại và không để lại vết dung môi.
 Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, vì vậy giữ được mùi thơm của
tinh dầu mà không sợ tinh dầu bị phân hủy.
 Quá trình kín ít bị hao tốn.
 Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp chịu áp lực cao, chi phí
cho CO2 còn đắt, nên chưa được phổ biến (Mai Thị Anh Tú, 2009).
f) Phương pháp vi sóng

Hình 1.5. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng
 20

Phương pháp vi sóng có đặc điểm: vi sóng (micro – onde, microwave) là

sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng. Sóng điện từ này được đặc trưng bởi:
 Tần số f, tính bằng Hertz (Hz = cycles/s), là chu kỳ của trường điện từ trong
một giây, nằm giữa 300 Hz và 30 GHz.
 Vận tốc c là 300.000 km/giây.
 Độ dài sóng 𝜆 (cm) là đoạn đường đi của vi sóng trong một chu kỳ, liên hệ
với tần số theo công thức 𝜆 = c/f.
 Hầu hết các lò vi sóng gia dụng đều sử dụng tần số 2450 MHz, ở tần số này 𝜆
= 12,24 cm.
Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử một cách
bất đối xứng. Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính định hướng trong
nhiều điện trường. Dưới tác dụng của điện trường một chiều, các phân tử lưỡng cực
có khuynh sắp xếp theo chiều điện trường này. Nếu điện trường là một điện trường
xoay chiều, sự định hướng của các lưỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sơ
của hiện tượng phát hiện do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử
phân cực bên trong vật chất. Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao 2,45 x
109 Hz , điện trường này sẽ gây ra một sự xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử,
đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất.
Với một cơ cấu có tính bất đối xưng cao, phân tử nước có độ phân cực rất
lớn, do đó nước là một chất rất lý tưởng để đun nóng bằng vi sóng. Ngoài ra, các
nhóm định chức phân cực như: - OH, - COOH, - NH2,... trong các hợp chất hữa cơ
cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ.
Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ
của vi sóng. Việc này liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự
đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng (Phạm Thế Chính và
cộng sự, 2009).
g) Phương pháp sinh học
Phương pháp này được ứng dụng cho các nguồn nguyên liệu có tinh dầu ở
trạng thái kết hợp (glucosid). Để phân lập tinh dầu, người ta phải sử lí bằng cách lên
 21

men hoặc dùng enzyme, sau đó kết hợp với chưng cất hay trích ly để thu tinh dầu
giống như các loại vật liệu chứa hợp chất thơm khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000
– 2001).
1.3. Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Phương pháp này dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo
hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc
với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu
trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất
định. Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo thì phải dùng nhiều hơi
nước hơn và sự chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp
chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên
khó khăn.
1.3.1. Nguyên lý hoạt động của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Phương pháp chưng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước được dựa trên
nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và
tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt, cả hai chất đều bay hơi. Nếu áp suất của
hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng với áp suất môi trường thì hỗn hợp sôi
và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước.
 Chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp
Nguyên liệu và nước được cho vào cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay
ra sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu, sau đó làm lạnh ngưng tụ hơi, ta sẽ thu được tinh
dầu sau khi phân ly tách nước ra. Thiết bị sử dụng tương đối đơn giản, rẻ tiền, phù
hợp với sản xuất nhỏ ở địa phương, nhất là ở những nơi mới bắt đầu khai thác tinh
dầu, bước đầu chưa có điều kiện đầu tư vào sản xuất.
Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm:
 Chất lượng tinh dầu sản phẩm không cao.
 Nguyên liệu dễ bị cháy khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị.
 Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng
cất kéo dài.
 22

 Tiêu tốn nhiều năng lượng.

 Chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp
Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi nước riêng hoặc sử
dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chung cho các thiết bị khác nhau.
Do bộ phận chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp nên phương pháp khắc
phục được tình trạng nguyên liệu bị khê khét, màu sắc và phẩm chất của tinh dầu
thu được tốt hơn.
Do hơi nước cấp từ bên ngoài nên dễ dàng khống chế và điều chỉnh các yếu
tố như lưu lượng, áp suất cho phù hợp với từng loại nguyên liệu, giúp nâng cao hiệu
suất cũng như chất lượng tinh dầu thu được.
1.4. Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng
khuẩn có nguồn gốc thực vật
1.4.1. Khái niệm
Hợp chất kháng khuẩn ở thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có
trong thực vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt sự phát triển của vi sinh vật. Các
hợp chất kháng khuẩn thường có khả năng tác dụng đặc hiệu lên vi sinh vật với một
nồng độ rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).
Các hợp chất này thường thuộc nhiều nhóm hợp chất khác nhau như alkaloid,
glucoside, phenolic và tinh dầu.
1.4.2. Các cơ chế kháng khuẩn
 23

Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật
(Silva và Fernandes, 2010).

a. Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn:

Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Tác động lên quá trình tổng hợp
vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm
thấu.
b. Ức chế chức năng của màng tế bào:
Gồm colistin, polymycin, gentamicin và amphoterricin. Cơ chế sẽ làm mất
chức năng của màng, làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra
ngoài.
c. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:
 Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.
 Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
 Nhóm macrolide và lincoxinamide gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm
ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
d. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic:
 Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã
tạo thành mRNA.
 24

 Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho 2 mạch
đơn DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
 Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA có tác dụng cạnh tranh PABA và
ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotide.
 Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic (Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng
sự, 2010).
1.4.3. Một số nhóm hợp chất alkaloid ở thực vật
 Morphine
Morphine là alkaloid chủ yếu trong nhựa của cây anh túc còn xanh (Papaver
somniferum). Morphine tinh sạch được thu được lần đầu vào năm 1806 và xác định
cấu trúc hóa học vào năm 1927.
Morphine có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, gây nghiện . Morphine có
khả năng giảm đau, tạo cảm giác lâng lâng dễ chịu. Hiện nay rất nhiều hợp chất
tổng hợp giống morphine nhưng ít độc hơn được sử dụng trong y tế như linol, lerit
hay phenazone… (Nguyễn Tiến Thắng, 2012).

Hình 1.7. Cấu trúc của Morphine

 Quinine
Từ rất lâu, quinine đã được sử dụng làm thuốc trị sốt rét. Quinine có trong
cây Cinchona officinalis có nguồn gốc từ Peru, Bolivia. Cấu trúc hóa học của
quinine được xác định vào năm 1907 và tổng hợp hóa học từ năm 1945. Quinine ức
 25

chế quá trình sao chép DNA và phiên mã tạo RNA của tác nhân gây sốt rét (Nguyễn
Tiến Thắng, 2012).

Hình 1.8. Quinine trích ly từ cây Cinchona officinalis

 Glucoalkoloid
Đại diện là latisolin hoạt chất trích ly từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium) thuộc họ Amaryllidaceae. Vào năm 1986, Ghosal công bố tách được một
số dẫn xuất alkaloid từ cây Trinh nữ hoàng cung có khả năng chống ung thư. Nhiều
nghiên cứu về sinh học phân tử từ cây Trinh nữ hoàng cung và trong họ
Amaryllidaceae đã chứng minh rằng các alkaloid trong họ này có khả năng chống
ung bứu, chống vi khuẩn và kích thích miễn dịch.
 Nhóm glucoside
Glycoside là một phân tử đường liên kết với một nhóm chức bằng liên kết
glycosidic. Trong cơ thể sống glycoside đóng rất nhiều vai trò quan trọng như dự
trữ năng lương, cấu trúc tạo hình (cellulose…), bảo vệ (Mucopolysaccharide…),
chống tạo thể cetone gây độc cho cơ thể, đồng thời rất nhiều glycose từ thực vật
được sử dụng làm thuốc (Marco, 2007).
Glycoside thường ở dạng rắn, kết tinh một số ít ở dạng lỏng hoặc vô dịnh
hình. Các hợp chất glycoside thường không màu, tan trong nước và cồn, ít hoặc
không tan trong dung môi hữu cơ như ether hoặc chloroform.
Phân loại
Nhóm glycoside thường được phân loại theo tính chất hóa học của aglycone
bao gồm các nhóm:
 26

 Nhóm alcoholic glycoside: salicin.

 Nhóm anthraquinone glycoside.
 Nhóm coumarin glycoside: apterin.
 Nhóm chromone glycoside: benzo-gamma-pyrone.
 Nhóm cyanogenic glycoside: amygdalin, dhurrin, linamarin, lotaustralin và
prunasin.
 Nhóm flavonoid glycoside: hesperidin, naringin, rutin, quercitrin.
 Nhóm phenolic glycoside.
 Nhóm saponin.
 Nhóm cardiac glycoside.
 Nhóm steviol glycoside.
 Nhóm thioglycosides: sinigrin, sinalbin.
Một số nhóm hợp chất glycoside ở thực vật:
 Tannin
Tannin là một polyphenol tan trong nước có trong cây Sồi. Gồm 2 nhóm
chính là tannin tan và tannin phức không tan. Tannin tan trong nước là những dẫn
xuất đơn của benzoic acid như gallic acid và hexahydroxydiphenic acid liên kết với
đường đơn. Tannin phức là các đại phân tử tạo thành từ một số gốc
hydroxyflavanol.
Tannin thường không gắn với vách tế bào như các phenol khác mà nằm ở
không bào. Một trong những chức năng sinh học quan trọng nhất của tannin là làm
chất xua đuồi dinh dưỡng (chất làm ngán ăn). Tannin có thể gây độc cho nấm mốc,
nấm men và vi khuẩn (Nguyễn Tiến Thắng, 2012).
 Saponin
Saponin là một glucoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật đặc
biệt là nhân sâm. Saponin có một tính chất chung đó là khi bị hòa tan vào nước,
saponin có khả năng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch, tạo nhiều bọt, có độc
đối với động vật máu lạnh đặc biệt là đối với cá. Tạo phức với cholesterol, có vị hắc
và làm hắc hơi mạnh. Một vài loài động vật cũng có saponin như hải sâm, cá sao.
 27

Ngày nay, saponin được công nhân là thành phần chính giúp tạo ra những
công dụng của nhân sâm. Sâm càng nhiều saponin thì càng tốt, dựa trên tiêu chí đó
để đánh giá chất lượng của các loại sâm. Saponin được chia làm 2 nhóm chính dựa
trên cấu trúc phần sapogenins là saponin trung tính dẫn xuất steroid và các saponin
có tính acid chứa gốc triterpenoid.

Saponins

Saponin Saponin steroid

triterpenoid Nhóm
spirostan

Saponin triterpenoid Saponin triterpenoid Nhóm

pentacyclic tetracyclic furostan

Nhóm
aminofurosta
Nhóm Nhóm n
hopan dammara Nhóm
n spirosolan
Nhóm
olean Nhóm
lupan Nhóm Nhóm
lanostan solanidan
Nhóm
ursan Nhóm
cucurbitan
Hình 1.9. Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013)
 Flavonoid
Flavonoid là nhóm hợp chất thứ cấp gồm khoảng hơn 5.000 chất có bộ khung
cấu tạo C15 và thường được cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) và (-
OCH3). Thông thường flavonoid thường tồn tại ở dạng phức với glucose và acid
hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất phổ biến như flavonone và flavonol,
 28

authocyacin, roteno. Một số nhóm đại diện chính của flavonoid là isoflavone,
flavanonem, flavonol và leucoanthocyanidin (Nguyễn Tiến Thắng, 2012).
Flavonoid chủ yếu tập trung ở các cây ngành hạt kín, lớp 2 lá mầm. Trong
thực vật bậc cao flavonoid là nhóm sắc tố phổ biến nhất tạo màu cánh hoa từ da
cam, đỏ đến xanh dương. Trong lớp 1 lá mầm chỉ có khoảng 10 họ được tìm thấy có
chứa flavonoid. Ngoài ra hàm lượng của flavonoid còn phụ thuộc vào nơi mọc, cây
mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì có hàm lượng flavonoid cao hơn những nơi
thiếu ánh sáng (Ngô Văn Thu, 2011).
 Nhóm tinh dầu
Tinh dầu thường là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần, có mùi thơm, không
tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi ở nhiệt độ thường và có thể
tách chiết từ thực vật bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
Thông thường tinh dầu đa số là chất lỏng chỉ có một số ít ở thể rắn như:
menthol, borneol, vanilin, heliotropin. Không màu hoặc màu vàng nhạt và có thể
sẫm màu vì oxy hóa.
Tinh dầu có mặt rộng rãi trong các họ cây như: họ Cúc (Asteraceae), họ Hoa
Tán (Apiaceae), họ Hoa Môi (Lamiaceae), họ Long Nhãn (Lauraceae), họ Sim
(Myrtaceae), họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae).
Tinh dầu được sử dụng như một vị thuốc, trong đông y tinh dầu được sử
dụng để trị sán (Thymol), diệt ký sinh trùng sốt rét (Artermisinin) ngoài ra còn
chống viêm, làm lành vết thương, kháng khuẩn và diệt khuẩn,… (Ngô Văn Thu,
2011).
Phân loại
Thành phần hóa học và cấu tạo của tinh dầu khá phức tạp nhưng có thể chia
thành 4 nhóm sau:
 Nhóm dẫn xuất monoterpene.
 Nhóm dẫn xuất sesquiterpene.
 Nhóm dẫn xuất các dẫn xuất nhân thơm.
 Nhóm các hợp chất chứa Nitơ và lưu huỳnh.
 29

Một số nhóm hợp chất tinh dầu ở thực vật

 Monoterpene
Monoterpene chủ yếu có mặt trong tinh dầu, có mùi thơm và thường được
tách chiết bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. một vài đại diện tiêu biểu
của monoterpene là menthol, geraniol và citral được sử dụng rất rộng rãi trong y
học, mỹ phẩm và thực phẩm.
 Sesquiterpene
Sesquiterpene có cấu tạo từ pharnesylpyrophosphate thường có mặt trong
tinh dầu và nhựa thực vật. Một số loại serquiterpene là hormone ảnh hưởng đến quá
trình lột xác của sâu bọ, chất thơm và chất gây ngán ăn ở thực vật.
Farnesol, abscisic acid và phaseic acid là một số hợp chất sesquiterpene
thường thấy (Nguyễn Tiến Thắng, 2012).
1.5. Giới thiệu về các chủng vi khuẩn gây bệnh
Một số loại vi khuẩn hay gặp là: Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli,
Bacillus subtilis,...
1.5.1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878, sau khi thực
hiện phân lập từ mủ ung nhọt.
Năm 1880, Louis Pasteur cũng đã thực hiện tiến hành phân lập và nghiên
cứu về Staphylococcus aureus.
 30

Hình 1.10. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 –
1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ nhưng thường tạo từng chùm giống chùm nho, không
di động, không sinh bào tử. Staphylococcus aureus thường cư trú trên da, niêm mạc,
đường ruột các động vật máu nóng .
Staphylococcus aureus là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên
môi trường nuôi cấy thông thường. Phát triển được ở nhiệt độ 10 – 45°C, mọc tốt ở
37°C, pH thích hợp là 7,0 – 7,5.
Ở môi trường canh thang thì sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ thì
làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn.
Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, đường kính khoảng 1 – 2
mm, có thể màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng.
Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, làm tan máu hoàn
toàn. Tụ cầu vàng tiết ra năm loại dung huyết tố (hemolysin): α, β, γ, δ, ε.
Coagulase do S. aureus sinh ra có khả năng làm đông huyết tương người và
động vật khi đã được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ
cầu vàng với các tụ cầu khác. Coagulase có ở tất cả các tụ cầu vàng.
 31

Coagulase có hai loại: một loại tiết ra môi trường (coagulase tự do), một loại
bám vào vách tế bào (coagulase cố định).
Staphylococcus aureus cho phản ứng catalase dương tính, lên men được
nhiều loại đường như: mannitol, glucose, lactose, mannose, sucrose, levulose,
manit.
Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi
khuẩn không sinh bào tử khác. Nó bị tiêu diệt ở 80°C trong 1 giờ, 100°C trong 1 – 2
phút, có thể sống ở môi trường có nồng độ NaCl cao (15%), có thể tồn tại ngoài môi
trường khô ráo 4 – 5 tháng.
Vi khuẩn tụ cầu vàng gây bệnh bằng cách gây tổn thương trực tiếp lên các cơ
quan như:
 Da: nhọt da, áp xe, viêm mô tế bào.
 Hô hấp: viêm khí quản, viêm phổi hoại tử, áp xe phổi biến chứng tràn khí
màng phổi, tràn khí trung thất, tràn khí dưới da, tràn mủ màng phổi
 Tim: viêm nội tâm mạc, tràn mủ màng tim.
 Màng não: viêm màng não mủ.
 Xương: cốt tủy viêm, viêm khớp
 Máu: nhiễm trùng máu hoặc gây bệnh bằng cách gián tiếp tiết các độc tố gây
viêm da tróc vẫy hoặc hội chứng sốc độc tố.
1.5.2. Escherichia coli (E.coli)

Hình 1.11. Vi khuẩn E.coli

E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước 2 x 0,6 – 3 x 0,6
𝜇m.
 32

Trong cơ thể E.coli có dạng trực khuẩn hình cầu, đứng riêng lẻ đôi khi xếp
thành chuỗi ngắn. Phần lớn E.coli có khả năng di động do có lông xung quanh thân.
Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
E.coli lên men sinh hơi các loại đường fructose, glucose, lactose, levulose,
galactose, xylose, ramnose, mannit, H2S âm tính (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Chúng sinh Indole, methyl red dương tính, không có khả năng sử dụng citrate, khử
nitrate và lên men decarboxylase với arginine, lysine (Trần Linh Thước, 2010).
E.coli gây bệnh qua nhiều con đường khác nhau nhưng chủ yếu là đường tiêu
hóa. Chúng có sẵn trong ruột động vật nhưng chỉ gây bệnh cho sức đề kháng của
con vật bị giảm sút. Bệnh do E.coli gây ra giống như một bệnh truyền nhiễm kế
phát do thiếu vitamin và mắc các bệnh virus, ký sinh trùng.
1.5.3. Salmonella
Năm 1874, nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả một
loại vi khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh thương hàn.
Năm 1880, Karl Joseph Eberth và Robert Koch phát hiện tác nhân gây bệnh
sốt thương hàn ở người.
Năm1884, Georg Gaffky thành công trong việc cấy mầm bệnh trong môi
trường nuôi cấy thuần khiết.
Năm 1889, nhóm nghiên cứu dưới quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer
Salmon tìm thấy vi khuẩn gây ra bệnh "dịch tả cho heo" và tên vi khuẩn được đặt
theo tên của ông.
 33

Hình 1.12. Vi khuẩn Salmonella

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống
vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tuỳ nghi, không tạo bào tử, di động
bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính 0,7 μm đến 1,5 μm, dài
từ 2 – 5 μm và có vành lông rung hình sợi.
Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và
động vật máu nóng, và trong môi trường. Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các
bệnh như thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu
(do Salmonella choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis). Các triệu
chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12
– 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thường kéo
dài từ 2 – 7 ngày.
Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 giờ và làm đục môi trường.
Môi trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc dạng s
màu trắng xám.
Salmonella được phân loại dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên.
Hiện nay có khoảng 1.500 typ huyết thanh (còn gọi là loài) Salmonella. Đặt tên cho
mỗi loài Salmonella mới tìm ra có thể lấy tên động vật mang mầm bệnh hoặc tên
địa phương đã phân lập ra chúng lần đầu tiên. Sau đây là một số loài Salmonella
đáng được chú ý nhất:
 34

 S.typhi: chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do
S.typhi gây ra.
 S.paratyphi A: cũng chỉ gây bệnh thương hàn cho người. Ở nước ta cũng hay
gặp loài này sau S.typhi.
 S.paratyphi В: gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật.
Bệnh thường gặp ở các nước Châu Âu.
 S.paratyphi С: vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây
viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết thường gặp ở các nước đông nam
Châu Á.
 S.typhimurium và S. enteritidis gây bệnh cho người và súc vật. Hai loài này
là nguyên nhân chủ yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do Salmonella.
 S.choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do
Salmonella ở nước ta.
1.5.4. Bacillus subtillis
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion
Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm
sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872,
Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên
là Bacillus subtilius.
Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các
binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được
các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis.
 35

Hình 1.13. Vi khuẩn Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn
phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37oC.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng
cơ bản:
 Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn,
rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày
bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
 Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm
đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan
khi lắc đều.
 Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi
khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4cm sau 72 giờ nuôi
cấy.
 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Thời gian

Thời gian nghiên cứu đề tài được thực hiện từ tháng 4 năm 2016 đến tháng 7
năm 2017.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Nguyên liệu
 Lá trầu không (Piper betle L.) thu mua ở xã Long Kiến, huyện Chợ Mới,
tỉnh An Giang.
 Lá có cuống có bẹ, dài 1,5 – 3,5 cm, phiến hình trái xoan, dài 10 – 13
cm, rộng 4,5 – 0,9 cm. Lá hình tim có mặt bóng, có mũi nhọn ở chóp, có
dạng màng và cứng.

Hình 2.1. Lá trầu Piper betle L.

 Khối lượng trung bình của lá là: 4,17 g
 Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis được cung cấp bởi Viện Sinh Học Nhiệt Đới.
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị
Thiết bị:
 Bộ chưng cất tinh dầu
 37

 Autoclave (Memmert – Đức).

 Cân phân tích, cân kỹ thuật.
 Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức).
 Bếp điện
 Máy xay ướt
 Bể điều nhiệt
o Dụng cụ:
 Bao PE
 Bông thấm nước, bông không thấm nước.
 Pipetman 100 µl, 1000 µl.
 Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000ml
 Erlen 250 ml.
 Đĩa Petri
 Que cấy tăm bông
 Đèn cồn
 Ống đong.
 Pipette.
 Lọ thủy tinh.
 Đũa thủy tinh.
 Ống nghiệm.
 Phễu thủy tinh.
 Phễu chiết.
2.2.3. Hóa chất
 Các hóa chất để pha môi trường NA, NB
 Na2SO4
 NaCl
 KOH 0,1N
 HCL 0,1N
 38

 Nước deion
 Ethanol 90o, ethanol 80o, ethanol 70o và ethanol tuyệt đối
 Thuốc thử phenolphthalein
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn là: môi trương Nutrient Agar và môi trường
Nutrient Broth
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm với các nội dung:
 39

Nguyên liệu lá trầu không

Kích thước Nồng độ NaCl

nguyên liệu

Thời gian ngâm

Cắt nhỏ Xay Xác định ảnh hưởng của
nguyên liệu trong
1 cm nhuyễn các yếu tố đến khả năng
thu nhận tinh dầu trầu dung dịch NaCl
1 phút
không bằng phương pháp
chưng cất lôi cuốn hơi
Thời gian để héo nước Thời gian
nguyên liệu chưng cất

Tỷ lệ rắn/lỏng
Màu sắc

Đánh giá cảm quan Mùi

Vị

Chỉ số hóa học tinh Định lượng tinh

dầu trầu không dầu trầu không
Xác định chỉ tiêu hóa lý của
tinh dầu trầu không
Độ hòa tan trong Tỷ trọng tinh
ethanol dầu trầu không

Xác định thành phần hóa học tinh dầu

trầu không bằng phương pháp GC – MS
Salmonella
E.coli
Staphylococcus Đánh giá hoạt lực kháng khuẩn
aureus Bacillus subtilis

Hình 2.2. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu trầu
không bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
 40

2.3.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
Quy trình trích ly tinh dầu lá trầu không bằng phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước.

Nguyên liệu
(lá trầu không)

+ Loại bỏ tạp chất

+ Cắt bỏ là héo, già.

Ngâm trong dung dịch nước + NaCl

Ly trích bằng phương pháp lôi

cuốn hơi nước

Hỗn hợp tinh dầu với nước

Bình long (phễu chiết)

Nước Tinh dầu thô (tinh dầu + nước)

Làm khan bằng Na2SO4

Tinh dầu trầu không

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình chưng cất và thu nhận tinh dầu trầu không
 41

Thuyết minh quy trình:

 Lá trầu sau khi rửa sạch (chú ý không cắt quá mỏng có thể làm vỡ các túi
chứa tinh dầu), ảnh hưởng đến kết quả khảo sát, cắt từng lá rộng khoảng 1
(cm). Sau đó, cân chính xác 200 g (± 0,001 g) xay nhuyễn lá trầu trong trong
máy xay.

Hình 2.4. Nguyên liệu lá trầu không (Piper betle L.) dùng để thu nhận
tinh dầu
 Quá trình xay giúp dễ dàng trích ly được tinh dầu trong quá trình chưng cất.
 42

Hình 2.5. Lá trầu không sau khi xay nhuyễn và chuyển vào bình cầu
 Cân 1,25 g (± 0,001 g) muối NaCl cho vào 500 ml nước cất. Cho tất cả trầu
đã xay nhuyễn vào bình cầu chưng cất 1000 ml, thêm 500 ml nước đã hoà
tan hoàn toàn 1,25 g muối NaCl. Ngâm 30 phút sau đó đặt vào hệ thống
chưng cất.
 Lắp đặt hệ thống chưng cất hơi nước và chưng trong khoảng từ 30 phút đến
120 phút để lấy tinh dầu trầu không ở dạng thô.
 Sau quá trình chưng cất là quá trình lắng và làm sạch tinh dầu. Để cho việc
tách tinh dầu ra dễ dàng, phân lớp rõ ràng của lớp nước và tinh dầu.
 Sau khi tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp nước chưng thì tiếp tục cho khoảng 5 g
Na2SO4 khan để làm khan triệt để những hạt nước còn nằm trong lớp tinh
dầu.
 Lấy phần nước chưng còn lẫn ít tinh dầu trữ lại và đem chưng lại để thu tinh
dầu triệt để hơn.
 Thu tinh dầu đã được làm sạch và bảo quản. Tinh dầu Trầu không là hỗn hợp
các hợp chất có chứa liên kết đôi trong phân tử nên rất dễ bị oxy hóa bởi oxy
 43

không khí. Vì vậy, quá trình bảo quản tinh dầu phải đựng trong các lọ dung
tích khoảng 5 – 10 ml, sẫm màu, được bịt kín bằng nút cao su và cho tinh dầu
vào lọ sao cho lượng không khí trong lọ càng ít càng tốt. Tinh dầu trầu không
được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4oC.
 Tính toán kết quả và so sánh lượng tinh dầu của lá trầu không. Đem tinh dầu
trầu không đi bảo quản và thử hoạt tính sinh học
 Các thông số như: tỷ lệ dung môi (nước), muối đã được kế thừa từ đề tài của
Nguyễn Thị Lý và cộng sự (2010). Theo tài liệu thì tỷ lệ dung môi thích hợp
là 2,5/1 (thể tích dung môi/khối lượng lá trầu), tỷ lệ muối/khối lượng nguyên
liệu là 10 %. Do vậy đề tài chỉ tập trung khảo sát thời gian chưng cất lá trầu
không với khối lượng 200 g và so sánh xem loại lá trầu không nào thu được
thế tích tinh dầu cao nhất.

Hình 2.6. Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước sử dụng để trích ly tinh dầu trầu
không
 44

2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu trầu không
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Tiến hành khảo sát 6 yếu tố: nguyên liệu xay nhuyễn và cắt nhỏ, 3 loại mẫu
lá trầu không (lá non, lá bánh tẻ, lá già), thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian
chưng cất, lượng nước chưng cất và nồng độ muối.
Nguyên tắc: cố định 5 yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được mức tối
ưu cho yếu tố đó. Sau đó cố định yếu tố này và tiếp tục thay đổ một yếu tố khác, cứ
tiến hành như vậy cho đến khi chọn được 6 mức tối ưu của 6 yếu tố cho quá trình ly
trích.
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (cắt
nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng thu được bằng phương pháp chưng
cất lôi cuốn hơi nước
Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu mẫu: lá già, thời gian ngâm nguyên liệu, thời
gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nồng độ muối. Sau đó tiến hành trích ly thu
tinh dầu và so sánh để tìm ra được nguyên liệu nào tối ưu.
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá
bánh tẻ, lá già) đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định các yếu tố: thời gian chưng cất, nồng độ muối, thời gian ngâm mẫu,
lượng nước chưng cất, nguyên liệu được xay nhuyễn và thay đổi 3 loại lá trầu: lá
non, lá già, lá bánh tẻ. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những
thời gian khác nhau, từ đó chọn loại nguyên liệu lá trầu làm nguyên liệu trích ly tinh
dầu trầu không thích hợp.
2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung
vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định thời gian chưng cất, thời gian ngâm mẫu, nguyên liệu: lá già, lượng
nước chưng cất, nguyên liệu được xay nhuyễn, ta thay đổi nồng độ muối chưng cất
như sau: 0 % (0 g/500 ml nước cất), 5 % (1,25 g/500 ml nước cất), 10 % (2,5 g/500
 45

ml nước cất), 15 % (5 g/500 ml nước cất). Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước
thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh
dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có
trong tinh dầu vào nước. Đồng thời sẽ tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng
nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) của nước. Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo
sự tăng nồng độ của muối do khi ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh
dầu co lại, ngăn cản sự thoát tinh dầu ra ngoài.
2.3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm muối NaCl đến
hàm lượng thu hồi tinh dầu
Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch nước muối trước khi chưng cất có
ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được. Do có thời gian để tạo sự thẩm
thấu cho tinh dầu thoát ra môi trường bên nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều
ngay từ đầu và thể tích tăng đáng kể. Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước
phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và tinh dầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn
khi chưng cất. Thời gian ngâm khảo sát 0 phút, 15 phút, 30 phút, 45 phút và 60
phút, cố định các yếu tố đã tối ưu.
2.3.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm
lượng tinh dầu trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước
Với các mức tối ưu đã chọn, tiếp tục cố định các yếu tố còn lại và thay đổi
các mức thời gian chưng cất như sau: 30 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ 30
phút, 3 giờ. Thời gian chưng cất càng lâu lượng tinh dầu thu được càng nhiều. Tuy
nhiên, đến một thời điểm nào đó thì lượng tinh dầu thu được không tăng lên theo
thời gian. Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất còn ảnh hưởng đến chất lượng tinh
dầu do nguyên liệu bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên của tinh dầu.
2.3.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm
lượng tinh dầu trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước
 46

Với các mức tối ưu của 5 yếu tố đã chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất
như sau: 400 ml, 500 ml và 600 ml. Ghi lại lượng tinh dầu thu được trong mỗi
trường hợp, từ đó xác định được lượng nước chưng cất tối ưu. Tỷ lệ nguyên
liệu/nước chưng ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu tinh dầu. Lượng nước quá nhiều
một số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nước. Nếu lượng nước quá ít
thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu.
2.3.3. Xác định chỉ số vật lý, hoá học của tinh dầu trầu không
2.3.3.1. Đánh giá cảm quan
Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan phương pháp thực
hiện dựa theo tác giả Tôn Long Dày. Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài
như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt,...
Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài này có thể phán đoán và đánh giá
sơ bộ về chất lượng của tinh dầu và mục đích sử dụng tinh dầu.
 Màu sắc và độ trong suốt:
Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào
một ống thủy tinh trong suốt không có màu có dung tích 20 ml, thỉnh thoảng lắc và
quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ:
vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu tinh dầu còn vẩn đục và không trong suốt chứng tỏ còn
tạp chất và nước.
 Mùi:
Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi
một loại tinh dầu có một mùi đặc trưng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và
mục đích sử dụng của nó.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc hoặc bôi một ít vào
mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong
một giờ.
Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc,...).
 Vị:
 47

Vị cũng là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại
tinh dầu có mùi vị riêng. Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi
nhận xét bản chất (ngọt, đắng,…) và cường độ của vị (dịu, thoảng,…) (Tôn Long
Dày, 2013).
2.3.3.2. Xác định chỉ số vật lý
a. Định lượng tinh dầu
Theo (DĐVN IV) hàm lượng tinh dầu được tính theo công thức:
số ml tinh sau chưng cất
% tinh dầu = × 100%
số gam nguyên liệu tươi hoặc khô
b. Tỷ trọng
Do điều kiện vật chất của phòng thí nghiệm chưa có bình tỷ trọng nhỏ 10 ml
nên chúng tôi tiến hành đo tỷ trọng tinh dầu theo phương pháp thủ công.
Dùng một ống tiêm y tế (loại 1 ml), trên than ống tiêm được vạch một đường
làm dấu.
Cách xác định:
Ban đầu, đem cân ống tiêm không và ghi số liệu lại (G).
Tiếp theo: Hút nước cất đến vạch (lưu ý trong ống tiêm không có bong bóng
khí), đem cân và ghi lại số liệu (G1). Rồi xả bỏ nước trong ống tiêm, vảy cho khô
nước.
Cuối cùng: Hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý không để cho có bong bóng
khí trong ống tiêm) đem cân và ghi lại số liệu (G2).
Tỷ trọng (d) được đo ở 25o C được tính bằng công thức:
D = (G – G2)/(G – G1)
Với:
 G: khối lượng của ống tiêm không, tính bằng gam (g)
 G1: khối lượng của ống tiêm và nước cất, tính bằng gam (g)
 G2: khối lượng của ống tiêm và tinh dầu, tính bằng gam (g)
Cứ như thế lập lại nghiệm thức 3 lần: D(tb) = (D1 + D2 + D3)/3
(TCVN 189:1993)
 48

c. Độ hoà tan của tinh dầu trong ethanol

Pha cồn 90o, 80o, 70o từ cồn tuyệt đối.
Dùng pipette chuẩn hút 1ml tinh dầu trầu không cho vào bình tam giác có nút
mài. Từ buret nhỏ dần ethanol vào bình đựng tinh dầu. Sau mỗi lần nhỏ khoảng
0,2ml vào đậy nút và lắc đều cho đến khi tan hết tinh dầu. Tiếp tục nhỏ ethanol vào
và lắc cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất trong suốt, ghi lượng ethanol đã
dùng. Lặp lại thao tác 3 lần (TCVN 189:1993).
2.3.3.3. Xác định chỉ số hoá học
a. Chỉ số acid (Index Acid)
Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hoà các acid tự do có trong 1 g
tinh dầu. KOH trung hoà các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng
RCOOH + KOH  RCOOK + H2O
Cách xác định:
Cho vào erlen 100 ml: 10 ml etanol, thêm vào 5 giọt dung dịch
phenolphthalein. Cho tiếp vào 1 g tinh dầu, lắc đều cho dầu tan hoàn toàn. Tiếp tục
chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu hồng bên
trong 30 giây. Ta thực hiện phép đo 3 lần, ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1 N
dùng chuẩn độ, lấy kết quả trung bình.
Chỉ số acid được tính theo công thức:
5,61 ⋅ 𝑉
𝐼𝐴 =
𝑔
Trong đó:
 VKOH: số ml dung dịch KOH 0,1N dùng chuẩn độ.
 5,61: số mg KOH có trong 1 ml dung dịch KOH 0,1 N.
 g: số g tinh dầu dùng để chuẩn độ.
(TCVN 189:1993)
b. Chỉ số ester (Index Ester)
Chỉ số ester hoá của tinh dầu là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng
acid béo nằm ở dạng ester có trong 1 g tinh dầu.
 49

Các xác định:

Sử dụng mẫu thử đã xác định ở trên, thêm chính xác 10ml KOH 0,095 trong
ethanol. Lắp ống sinh hàn ngược vào bình đun cách thủy trong 1 giờ đến khi phản
ứng xà phòng hóa kết thúc (lúc đó dung dịch trong bình màu hồng, đồng thời xuất
hiện tinh thể nhỏ màu vàng nâu).
Đồng thời làm một mẫu đối chứng với 10ml KOH 0,095N trong etanol và
10ml etanol 96o , tiến hành trong cùng điều kiện như trên.
Đun xong để nguội, chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N. Hiệu số giữa số ml
dung dịch HCl 0,1N đã dùng trong mẫu đối chứng và số ml dung dịch HCl 0,1N đã
dùng trong mẫu thử là số ml HCl đã dùng để trung hòa lượng KOH dùng cho phản
ứng este hóa.
5,61.(𝑉0 −𝑉1 )
Chỉ số ester được tính theo công thức: 𝐼𝐸 =
𝑔

Trong đó:
 V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml)
 V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml)
 g: số g tinh dầu dầu (TCVN 8444:2010)
c. Chỉ số savon hoá (Index Savon)
Chỉ số savon hoá là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả các acid tự
do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1 g tinh dầu
Quá trình savon hoá tinh dầu bao gồm:
 KOH trung hoà các acid tự do: KOH + RCOOH  RCOOK + H2O
 KOH xà phòng hoá các ester: KOH + R1COOK +R2OH
Chỉ số savon hoá của tinh dầu bằng tổng số giữa chỉ số ester hoá và chỉ số
acid:
IS = IE + IA
Trong đó:
 IS: chỉ số savon hoá.
 IE: chỉ số ester hoá.
 50

 IA: chỉ số acid hoá.

(TCVN 8444:2010)
2.3.3.4. Xác định thành phần hoá học của tinh dầu
Thành phần hoá học của tinh dầu trầu không được xác định bằng phương
pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS với các điều kiện như sau:
 Máy sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS:HP6890
 Cột mao quản: dài 30 m, đường kính trong 250 𝜇m, lớp phim dày 250 𝜇m.
 Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 250oC
 Tỷ lệ dòng (splitless)
 Đầu do khối phổ tứ cụ (MSD)
 Tốc độ dòng khí mang (He) 0,9 ml/phút, áp suất 6.9 psi
Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu ở 60oC, giữ trong 4 phút. Sau đó tăng
lên 100oC, với tốc độ tăng 10oC/phút. Tiếp tục tăng đến 280oC với tốc độ tăng
30oC/phút và giữ trong 15 phút (Phùng Thị Ái Hữu, 2012).
 51

2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn

Vi khuẩn thuần

Tăng sinh

Pha loãng

Cấy trang

Đặt khoanh giấy tẩm tinh dầu

và kháng sinh

Ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 24

giờ

Đo kích thước vòng kháng

khuẩn và chụp ảnh

Hình 2.7. Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của tinh dầu trầu không
a. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị tinh dầu nguyên chất của lá trầu không: tinh dầu trầu không.
Chuẩn bị 4 loại vi khuẩn: Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli,
Bacillus subtilus.
Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh để đối chiếu (Ampicillin)
Cân chính xác 100 mg thuốc kháng sinh Ampicillin cần thử, hòa tan vào 10
ml nước cất, nếu thuốc không tan trong nước thì hòa tan với DMSO, ta sẽ được
nồng độ dung dịch mẹ 10 mg/ml. Dung dịch để bảo quản trong tủ lạnh.
b. Chuẩn bị môi trường
 52

Thạch nền: sử dụng môi trường NA, pha NA vào nước cất sau đó hấp khử
trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 50oC đến 60oC sau đó đổ vào các
đĩa petri đã tiệt trùng. Để nguội sau đó úp ngược đĩa petri lại.
Môi trường lỏng: sử dụng môi trường NB, pha 4 g NB vào 500 ml nước cất
sau đó chia ra làm 4 lọ để hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến nhiệt
độ phòng sau đó cấy E.coli vào lọ số (1), Staphylococcus aureus vào lọ số (2), cấy
Salmonella vào lọ số 3, cấy Bacillus suptilis vào lọ số 4, còn lọ số (5) dùng để set
máy. Sau đó mang đi lắc.
Chuẩn bị 20 ống nước muối sinh lý 0,9 % hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15
phút.
c. Nguyên tắc
Các hợp chất kháng khuẩn có trong tinh dầu sẽ khuếch tán vào trong môi
trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu tinh dầu có khả năng tiêu
diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy. Từ đó, xác
định được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng đường kính vòng kháng khuẩn
(mm).
d. Tiến hành
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn:
Lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô
trùng (NaCl 0,9 %), lắc đều.
Lấy tăm bông vô khuẩn thấm vào huyền dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa và
đạt mật độ 106 CFU/ml lên mặt thạch NA và tiến hành cấy trang đều cho tới khô.
Sau đó đặt 3 đĩa kháng sinh đã có tinh dầu trầu không (đã pha loãng theo từng nồng
độ) và kháng sinh có đường kính 6 mm trên đĩa thạch, giữ yên trong vòng 1 giờ để
tinh dầu và kháng sinh ĐC có thể khuếch tán vào môi trường thạch. Cuối cùng, các
đĩa được đem ủ trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua
việc đo đường kính vòng ức chế (mm).
e. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Đối với thạch: dùng thước đo vòng vô khuẩn (tính bằng mm) và chụp hình.
 53

So sánh đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu với kháng sinh.
f. Phương pháp tính toán
Kết quả đường kính vòng vô khuẩn thu được qua 3 lần thí nghiệm lặp lại tính
trung bình
Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được phân loại dựa theo đường
kính vòng vô khuẩn của (Celikel và Kavas, 2008):
 Đường kính vòng vô khuẩn < 8 mm: không nhạy
 Đường kính vòng vô khuẩn từ 9 – 14 mm: nhạy
 Đường kính vòng vô khuẩn 15 – 19 mm: rất nhạy
 Đường kính vòng vô khuẩn > 20 mm: cực nhạy
2.4. Thống kê và xử lý số liệu
Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu
tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm MicroSoft Excel 2016® và phần mềm
xử lý số liệu SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo
dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các số liệu trung bình có cùng ký tự a,
b,... thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ
sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
 54

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng
tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực
tiếp
Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu lá trầu già, thời gian chưng cất, lượng nước
chưng cất, nồng độ muối trên 500 ml nước cất và thời gian ngâm nguyên liệu. Ghi
lại lượng tinh dầu thu được trong mỗi trường hợp, từ đó xác định được nguyên liệu
xay hay cắt nhỏ chưng cất tối ưu.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
V tinh Hàm
Xay
Khối Nồng Thời dầu lượng
Nguyên hay Thời Lượng
lượng độ gian thu tinh
liệu lá không gian nước
mẫu muối ngâm được dầu
xay
(ml) (%)
30
Lá già Cắt nhỏ 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,217 0,108b
phút
Xay 10% 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 0,800 0,400a
nhuyễn phút
(Phụ lục 2)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận:
Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu lá già, thời gian chưng cất 2 giờ, nồng độ muối
10%, lượng nước chưng cất 500 ml, thời gian ngâm nguyên liệu 30 phút.
Sau khi khảo sát, tôi ghi nhận mẫu trầu không sau khi xay nhuyễn thu được
lượng tinh dầu cao hơn so với khi cắt nhỏ. Lá già sau khi xay thu được lượng tinh
dầu là 0,8 ml (hàm lượng tinh dầu trầu không thu được: 0,4 %). Lá già cắt nhỏ 1 cm
 55

chỉ thu được lượng tinh dầu là 0,217 ml (hàm lượng tinh dầu trầu không thu được:
0,108 %).
0,450
0,400a
0,400
Hàm lượng tinh dầu thu được (%)

0,350

0,300

0,250

0,200

0,150
0,108b
0,100

0,050

0,000
Cắt nhỏ 1 cm Xay nhuyễn 1 phút
Kích thước nguyên liệu

Hình 3.1. Đồ thị ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh
dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Theo hình 3.1. ta thấy: trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất hơi
nước với nguyên liệu xay nhuyễn cho hàm lượng tinh dầu cao hơn rất nhiều so với
nguyên liệu cắt nhỏ. Khi xay, các tế bào chứa tinh dầu bị vỡ, nước dễ thẩm thấu vào
các túi dầu, tinh dầu dễ thoát ra môi trường ngoài và hơi nước có nhiệm vụ lôi cuốn
tinh dầu tự do ra bình hứng. Ngoài ra, với nguyên liệu xay tinh dầu thu được trong
suốt, không màu, có mùi tự nhiên hơn so với nguyên liệu không xay tinh dầu có
màu vàng do tiếp xúc nhiệt quá lâu và mùi không còn tự nhiên.
Theo kết quả khảo sát, kết quả hàm lượng tinh dầu thu được khi xay nhuyễn
lá trầu không của nhóm tác giả Nguyễn Thiện Chí và cộng sự là: 0,63%, cao hơn
nhiều so với hàm lượng tinh dầu thu được khi cắt nhỏ lá trầu không của cùng nhóm
tác giả. Ngoài ra theo kết quả của tác giả Mai Thị Anh Tú cho thấy hàm lượng tinh
dầu thu được khi xay nhuyễn tần dày lá là 0,1020% cao hơn hàm lượng tinh dầu thu
được khi không xay là 0,0886%.
 56

Từ đó cho thấy việc xay nhuyễn nguyên liệu sẽ cho hàm lượng tinh dầu cao
hơn nhiều so với khi cắt nhỏ. So sánh kết quả khảo sát từ thực nghiệm với các kết
quả của tác giả khác cho thấy hàm lượng tinh dầu thu được khi xay nhuyễn cao hơn
nhiều so với khi cắt nhỏ.
3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá già)
đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn
hơi nước.
Cố định các yếu tố: thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nguyên liệu
được xay nhuyễn, nồng độ muối, thời gian ngâm nguyên liệu và thay đổi 3 loại lá
trầu: lá non, lá bánh tẻ, lá già. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở
những thời gian khác nhau, từ đó chọn loại lá trầu trích ly tối ưu.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá già) đến hàm
lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Thời V tinh Hàm
Tác Khối Nồng gian dầu lượng
Nguyên Thời Lượng
động lượng độ ngâm thu tinh
liệu lá gian nước
cơ học mẫu muối được dầu
(ml) (%)
Xay 30
Lá non 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,117 0,058c
nhuyễn phút
Lá bánh Xay 30
2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,300 0,150b
tẻ nhuyễn phút
Xay 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,800 0,400a
nhuyễn phút
(Phụ lục 2)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận:
Cố định 5 yếu tố: thời gian chưng cất 2 giờ, thời gian ngâm mẫu 30 phút,
nguyên liệu trầu xay nhuyễn, lượng nước chưng cất 500 ml, nồng độ muối chưng
cất 10 %.
 57

Sau một thời gian khảo sát, tôi ghi nhận nguyên liệu trầu không lá già thu
được lượng tinh dầu cao hơn so với các loại lá trầu khác. Lá trầu già sau khi chưng
cất thu được 0,8 ml (hàm lượng tinh dầu trầu không thu được: 0,4 %), lá non (0,058
%), lá bánh tẻ (0,15 %).
0,450
0,400a
Hàm lượng tinh dầu thu được (ml)

0,400

0,350

0,300

0,250

0,200
0,150b
0,150

0,100
0,058c
0,050

0,000
Lá non Lá bánh tẻ Lá già
Nguyên liệu lá

Hình 3.2. Đồ thị ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trầu
không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Dựa vào yếu tố phát triển cây của tác giả Lê Ngọc Thạch cho thấy: trong thời
gian cây sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt các biến đổi và những
chuyển hoá này có thể xác định thời kỳ mà cây tích tụ được nhiều tinh dầu nhất.
Tinh dầu tạo thành trong cây không phải có một lượng cố định mà biến đổi liên tục
theo hướng phát triển của cây.
Hiện nay chưa có đồ án nào về tinh dầu trầu không khảo sát về tuổi nguyên
liệu. Tuy nhiên, theo kết quả khảo sát của tác giả Nguyễn Thị Hồng nghiên cứu về
thành phần và cấu tạo một số hợp chất hóa học trong tinh dầu từ cây ngải cứu ở
Quảng Nam cho thấy hàm lượng tinh dầu ngải cứu thu được khi xay nhỏ lá ngải cứu
non là 1,1 % thấp hơn so với hàm lượng tinh dầu ngải cứu già xay nhỏ (1,4 %). Từ
đó cho thấy trong thời gian cây sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt các
biến đổi và những chuyển hoá này có thể xác định thời kỳ mà cây tích tụ được nhiều
 58

tinh dầu nhất. Sự biến đổi này có xu hướng là càng ngày càng tích tụ nhiều tinh dầu
(Nguyễn Thị Hồng, 2011).
Từ hình 3.2. tôi rút ra kết luận tinh dầu trầu không thu được tối ưu nhất khi
sử dụng nguyên liệu là lá trầu già.
3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lượng nước đến hàm lượng tinh dầu trầu
không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Với các mức tối ưu của 5 yếu tố đã chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất
như sau: 400 ml , 500 ml và 600 ml. Ghi lại lượng tinh dầu thu được trong mỗi
trường hợp, từ đó xác định được lượng nước chưng cất tối ưu.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của lượng nước đến hàm lượng tinh dầu thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Thời V tinh Hàm
Tác Khối Nồng gian dầu lượng
Nguyên Thời Lượng
động lượng độ ngâm thu tinh
liệu lá gian nước
cơ học mẫu muối được dầu
(ml) (%)
Xay 30
Lá già 2 giờ 400 ml 200 g 10% 0,417 0,208b
nhuyễn phút
Xay 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,800 0,400a
nhuyễn phút
Xay 30
Lá già 2 giờ 600 ml 200 g 10% 0,483 0,242b
nhuyễn phút
(Phụ lục 2)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận:
Cố định các yếu tố: thời gian chưng cất 2 giờ, thời gian ngâm mẫu 30 phút,
nguyên liệu trầu xay nhuyễn, nguyên liệu lá lá già, nồng độ muối chưng cất 10 %.
 59

0,450
0,400a
Hàm lượng tinh dầu thu được (ml) 0,400

0,350

0,300
0,242b
0,250
0,208b
0,200

0,150

0,100

0,050

0,000
400 500 600
Lượng nước chưng cất (ml)

Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của lượng nước đến hàm lượng tinh dầu thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Với các yếu tố đã cố định tôi tiến hành khảo sát lượng nước chưng cất. Dựa
vào hình 3.3. với các mức nước 400 ml, 500 ml, 600 ml, lượng tinh dầu thu được
thay đổi khá đáng kể. Tỷ lệ bã trầu/nước chưng ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu
tinh dầu. Lượng nước quá nhiều, một số thành phần có tính phân cực sẽ tan vào
nước. Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hoà tan các chất keo, muối bao bọc xung
quanh tinh dầu dẫn đến nguyên liệu bị cháy, khét, ảnh hưởng xấu đến chất lượng và
hiệu suất thu hồi của tinh dầu.
So sánh kết quả khảo sát của tác giả Nguyễn Thị Lý và cộng sự (2010), khi
giữ nguyên các yếu tố còn lại và thay đổi lượng nước chưng cất, kết quả cho thấy
lượng nước tối ưu để trích ly là 500 ml. Dựa vào hình 3.3., kết quả khảo sát của
thực nghiệm cũng cho thấy hàm lượng tinh dầu trầu không thu được ở lượng nước
chưng cất 500 ml là cao nhất (0,4 %). Khi tăng lượng nước chưng cất, hàm lượng
tinh dầu giảm (Nguyễn Thị Lý và cộng sự, 2010).
Kết quả cho thấy hàm lượng tinh dầu tăng khi thể tích nước cất cho vào bình
cầ u tăng, hàm lươ ̣ng đa ̣t cao nhấ t khi lươ ̣ng nước thêm vào là 500 ml. Ngoài ra, do
điề u kiện tiế n hành thí nghiệm không cho phép tổ ng thể tích dung dich ̣ và nguyên
 60

liệu cho vào bình cầ u vươ ̣t quá 2/3 thể tích bình nên không thể khảo sát ở những thể
tích lớn hơn. Vì vậy, cho ̣n 500 ml là thể tích tố i ưu trong pha ̣m vi nghiên cứu này.
3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên
liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước
Cố định thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được xay
nhuyễn, nguyên liệu lá trầu già, ngâm 30 phút ta thay đổi nồng độ muối chưng cất
như sau: 0 % (0 g/500 ml nước cất), 5 % (1,25 g/500 ml nước cất), 10 % (2,5 g/500
ml nước cất), 15 % (5 g/500 ml nước cất). So sánh lượng tinh dầu thu được để tìm
ra nồng độ muối tối ưu.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Thời V tinh Hàm
Tác Khối Nồng gian dầu lượng
Nguyên Thời Lượng
động lượng độ ngâm thu tinh
liệu lá gian nước
cơ học mẫu muối được dầu
(ml) (%)
Xay 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 0% 0,300 0,150d
nhuyễn phút
Xay 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 5% 0,417 0,208c
nhuyễn phút
Xay 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10 % 0,800 0,400a
nhuyễn phút
Xay 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 15 % 0,533 0,267b
nhuyễn phút
(Phụ lục 2)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
 61

Nhận xét và thảo luận:

Từ bảng kế t quả trên và hình 3.4., có thể thấ y hàm lươ ̣ng tinh dầ u thu đươ ̣c
phu ̣ thuộc vào nồ ng độ dung dich ̣ NaCl thêm vào, hàm lươ ̣ng tinh dầ u trầu không
tăng khi nồ ng độ muố i tăng và đa ̣t cao nhấ t ở nồ ng độ muố i là 10%. Việc thêm
muố i NaCl vào quá trình chưng cấ t nhằ m mu ̣c đích tăng hiệu suấ t ly trích do NaCl
̣ điện ly dẫn đế n làm tăng nhiệt độ sôi (hay
hòa tan trong nước sẽ ta ̣o thành dung dich
làm tăng áp suấ t hơi) của nước, do đó tinh dầ u ly trích đươ ̣c nhiề u hơn.
0,450
0,400a
0,400
Hàm lượng tinh dầu thu được (ml)

0,350

0,300
0,267b
0,250
0,208c
0,200
0,150d
0,150

0,100

0,050

0,000
0 5 10 15
Nồng độ muối chưng cất (%)

Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Tuy nhiên, khi chưng cấ t với nồ ng độ lớn hơn, lươ ̣ng tinh dầ u thu đươ ̣c giảm,
điề u này có thể giải thích là do khi sử du ̣ng muố i ở nồ ng độ cao thì các lớp biể u bì
ngoài chứa tinh dầ u bi ̣ co la ̣i, ngăn cản sự khuế ch tán tinh dầ u ra ngoài. Mặt khác,
do làm tăng nhiệt độ sôi của nước nên việc thêm muố i NaCl vào quá trình chưng cấ t
không thể áp du ̣ng cho những tinh dầ u có nhiệt độ sôi thấ p hoặc kém bề n với nhiệt.
Kết quả của thực nghiệm khác với kết quả của tác giả Nguyễn Thiện Chí, so sánh ta
thấy nồng độ muối tối ưu của tác giả Nguyễn Thiện Chí là 15% cao hơn nồng độ
muối tối ưu của thực nghiệm là 10%.
 62

3.1.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh
dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định các yếu tố: nguyên liệu lá trầu già, thời gian chưng cất, lượng nước
chưng cất, nguyên liệu được xay nhuyễn, nồng độ muối và thay đổi thời gian để
ngâm nguyên liệu như sau: 0 phút, 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút. Sau khi ly
trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, từ đó chọn mức
thời gian để ngâm tối ưu.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
V tinh Hàm
Tác Khối Nồng
Nguyên Thời Lượng Thời dầu thu lượng
động lượng độ
liệu lá gian nước gian được tinh
cơ học mẫu muối
ngâm (ml) dầu (%)
Xay 0
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,300 0,150d
nhuyễn phút
Xay 15
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,500 0,250c
nhuyễn phút
Xay 30
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,800 0,400a
nhuyễn phút
Xay 45
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,667 0,333b
nhuyễn phút
Xay 60
Lá già 2 giờ 500 ml 200 g 10% 0,600 0,300b
nhuyễn phút
(Phụ lục 2)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận:
 63

Sau khi cố định các yếu tố trên, tôi tiến hành khảo sát thời gian ngâm trong
nước muối trước khi chưng cất. Tôi tiến hành khảo sát với 5 mức thời gian: 0 phút,
15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút. Từ đó ghi nhận kết quả khảo sát.
Dựa vào bảng 3.10., ta thấy ở mức thời gian ngâm mẫu 30 phút, lượng tinh
dầu thu được là cao nhất (0,4 %).

0,450
0,400a
0,400
Hàm lượng tinh dầu thu được (ml)

0,333b
0,350
0,300b
0,300
0,250c
0,250

0,200
0,150d
0,150

0,100

0,050

0,000
0 10 20 30 40 50 60 70
Thời gian ngâm mẫu (phút)

Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian ngâm NaCl mẫu đến hàm lượng tinh dầu
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Thời gian ngâm với dung dịch nước muối trước khi chưng cất có ảnh hưởng
đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được. Do có thời gian để tạo sự thẩm thấu cho tinh
dầu thoát ra môi trường bên ngoài nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều ngay
từ đầu và thể tích tăng đáng kể. Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước phá
vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và tinh dầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn khi
chưng cất. Nhưng nếu ngâm quá lâu thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu bị co
lại, ngăn cản sự khuếch tán của tinh dầu ra ngoài nên hàm lượng tinh dầu thu được
sẽ bị giảm. Kết quả này phù hợp với kết quả tham khảo tách chiết tinh dầu lá trầu
của tác giả Nguyễn Thị Lý và Trần Thị Hồng Vân (2010). Theo kết quả của 2 tác
 64

giả trên, thời gian ngâm NaCl tối ưu là 30 phút. Vì vậy, kết luận ở mức thời gian 30
phút là thời gian ngâm tối ưu nhất để trích ly tinh dầu trầu không.
3.1.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh
dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nuớc
Cố định các yếu tố nguyên liệu lá già, xay nhuyễn, nồng độ muối, thời gian
ngâm mẫu, lượng nước. Khảo sát thời gian 30 phút đến 180 phút và so sánh để tìm
ra thời gian tối ưu ly trích tinh dầu trầu không.
Lá trầu không được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, cắt nhỏ, cho 200 g ± 0,001 g
lá trầu vào máy xay, chưng cất lôi cuố n theo hơi nước thu lấ y tinh dầ u trầu không.
Tinh dầu này được làm khan với bô ̣t Na2SO4 khan. Kết quả thu được trình bày ở
bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nuớc

Hàm lượng tinh

Trầu không
Thể tích tinh dầu lá già (ml) dầu thu được
(%)
Thời gian chưng cất
30 phút 0,083 0,042e
60 phút 0,200 0,100d
90 phút 0,517 0,258c
120 phút 0,800 0,400a
150 phút 0,767 0,383a
180 phút 0,700 0,350b
(Phụ lục 2)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận:
Bảng kết quả 3.6. cho thấ y hàm lươ ̣ng tinh dầ u thu đươ ̣c phu ̣ thuộc vào thời
 65

gian chưng cấ t, hàm lươ ̣ng tinh dầ u tăng khi thời gian chưng cấ t tăng và với thời
gian chưng cấ t là 120 phút, hàm lươ ̣ng gầ n như đa ̣t cao nhấ t. Sau thời gian 120 phút
hàm lượng tinh dầu trầu không thu được giảm.
Kế t quả này phù hơ ̣p với những nghiên cứu tương tự, thời gian chưng cấ t tố i
ưu đươ ̣c các nhóm nghiên cứu cho ̣n đề u không vươ ̣t quá 240 phút (Rawat et al.,
1989; B. Prakash et al., 2010). Khi ly trích với thời gian lâu hơn thì lươ ̣ng tinh dầ u
giảm. Mặt khác, kéo dài thời gian còn ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu do
nguyên liệu dễ bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên cuả tinh dầu.
0,450
0,400a
0,383a
0,400
Hàm lượng tinh dầu thu được (ml)

0,350b
0,350

0,300
0,258c
0,250

0,200

0,150
0,100d
0,100
0,042e
0,050

0,000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Thời gian chưng cất (phút)

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nuớc
Theo kết quả khảo sát của tác giả Nguyễn Thiện Chí và cộng sự, thời gian
trích ly tối ưu thu được hàm lượng tinh dầu trầu không cao nhất (0,63%) là 4 giờ.
Kết quả trên cao hơn so với kết quả khảo sát của thực nghiệm (0,4 %) nhưng so về
thời gian trích ly tối ưu thì nhanh hơn so với tác giả là 2 giờ.
Dựa vào hình 3.6., tôi rút ra kết luận thời gian chưng cất thu được hàm lượng
tinh dầu trầu không cao nhất là 120 phút. Vì vậy, để tiế t kiệm thời gian, thời gian ly
trích tinh dầ u trầu không tố i ưu đươ ̣c cho ̣n là 120 phút và đươ ̣c cố đinh
̣ để tiế p tu ̣c
khảo sát các yế u tố khác.
 66

3.2. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu trầu không
3.2.1. Đánh giá cảm quan
Tinh dầu trầu không ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
thu được có tính chất sau:
 Màu: trong suốt màu vàng nhạt.
 Mùi: có mùi thơm đặc trưng.
 Vị: có vị gắt, the và cay nồng.
3.2.2. Định lượng tinh dầu trầu không
Tiến hành định lượng tinh dầu trầu không, lấy 200 g trầu không đã xay
nhuyễn chưng cất ở các điều kiện tối ưu trong thực nghiệm, kết quả thu được như
sau:
Bảng 3.7. Kết quả định lượng tinh dầu trầu không
Khối lượng Thể tích tinh dầu Hàm lượng tinh
Số lần
nguyên liệu (g) thu được (ml) dầu thu được (%)
1 200 0,80 0,400
2 200 0,75 0,375
3 200 0,85 0,425
Hàm lượng
0,400
trung bình (%)
Nhận xét: hàm lượng tinh dầu trầu không thu được ở các điều kiện tối ưu là
0,4 %.
Hàm lượng tinh dầu thu được của thực nghiệm tuy thua hàm lượng tinh dầu
thu được ở điều kiện tối ưu của tác giả Nguyễn Thiện Chí là 0,63% nhưng thời gian
trích ly tối ưu của thực nghiệm là 2 giờ, nhanh hơn thời gian trích ly tối ưu của tác
giả là 4 giờ (Nguyễn Thiện Chí, 2016).
3.2.3. Kết quả đo tỷ trọng tinh dầu trầu không
Tiến hành thí nghiệm xác định tỷ trọng tinh dầu trầu không ta thu được kết
quả như sau:
 67

Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ trọng tinh dầu trầu không
Số lần G G1 G2 D
1 2,275 3,326 3,278 0,954
2 2,273 3,329 3,282 0,955
3 2,273 3,324 3,289 0,967
Trung bình 2,274 3,326 3,283 0,959

Nhận xét và thảo luận:

Tinh dầu trầu không thu được có chứa lượng lớn Eugenol có tỷ trọng 1,06, α-
Copaene có tỷ trọng là 0,939 và Sabinene có tỷ trọng là 0,844. Do vậy tỷ trọng của
tinh dầu trầu không là 0,959.
Tỷ trọng của tinh dầu trầu không nhẹ hơn nước, vì vậy khi chưng cất tinh
dầu trầu không thu được nằm ở trên, nước nằm ở dưới. So sánh với kết quả tỷ trọng
tinh dầu trầu không của tác giả Nguyễn Thiện Chí: 0,94 là cao hơn không đáng kể.
3.2.4. Kết quả xác định độ hoà tan của tinh dầu trầu không trong ethanol
Tiến hành xác định độ hòa tan của tinh dầu trong ethanol tuyệt đối, 90o, 80o,
70o, thu được kết quả như sau:
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ hoà tan tinh dầu trầu không bằng phương pháp
chưng cất hơi nước trong ethanol
V ethanol V ethanol 90o V ethanol 80o V ethanol 70o
Số lần
tuyệt đối (ml) (ml) (ml) (ml)
1 10,5 16,5 25 41
2 10,6 16 25,5 47
3 10,4 17,5 25 45
Thể tích
trung bình 10,5 16,7 25,2 44,3
(ml)
Tỷ lệ hòa tan
1:10,5 1:16,7 1:25,2 1:44,3
tinh dầu
 68

Nhận xét và thảo luận:

Dựa vào tính chất vật lý của tinh dầu, tinh dầu trầu không gần như không tan
trong nước và dễ bay hơi nhưng lại tan tốt trong cồn.
Vì vậy khi tăng nồng độ ethanol sẽ tỷ lệ thuận với độ hoà tan của tinh dầu.
Khi độ cồn càng cao thì hàm lượng ethanol trong cồn càng lớn nên khả năng hòa tan
tinh dầu càng cao.
3.2.5. Chỉ số hóa học của tinh dầu trầu không
Tiến hành xác định chỉ số lý hóa của tinh dầu trầu không thu được kết quả
như sau:
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát chỉ số hóa học của tinh dầu trầu không
Số lần IE IA IS
1 8,415 6,171 14,586
2 11,220 7,293 18,512
3 7,293 7,293 14,586
Trung bình 8,976 6,919 15,895

Nhận xét và thảo luận:

Tinh dầu trầu không có chỉ số acid cao, chứng tỏ lượng acid tự do trong tinh
dầu trầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp cao. Chỉ
số ester của tinh dầu trầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
trực tiếp cũng cao, điều này cho ta thấy hàm lượng glycerol trong tinh dầu cao.
Theo tác giả Nguyễn Quốc Châu Thanh, chỉ số acid cao cho thấy được độ
tinh khiết và ít tạp chất làm biến đổi tinh dầu. Mặt khác, chỉ số ester cao cho thấy
trong tinh dầu trầu không có chứa nhiều cấu tử tạo nên mùi thơm đặc trưng của tinh
dầu trầu không (Nguyễn Quốc Châu Thanh, 2013).
3.3. Kết quả xác định thành phần hoá học tinh dầu
Thành phần hoá học của tinh dầu trầu không được xác định bằng phương
pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS với các điều kiện như sau:
 69

Bảng 3.11. Kết quả phân tích thành phần và hàm lượng tương đối các hợp chất
trong mẫu tinh dầu trầu không bằng phương pháp GC – MS
Độ tương
Hàm
TT Rt Tên chất Mass hợp khối
lượng
phổ
1 7.28 α.-Thujene 0,54 136 90
2 7.53 1R-.α.-Pinene 2,47 136 95
3 8.13 Camphene 0,72 136 91
4 9.33 Sabinene 6,66 136 93
5 10.28 β.-Myrcene 1,07 136 88
6 11.51 α.-Terpinen 1,49 136 91
7 12.15 β.Thujene 2,06 136 89
8 12.28 Eucalyptol 2,36 154 95
9 13.94 γ.-Terpinen 2,29 136 94
10 20.69 (-)-4-Terpineol 4,30 154 94
11 27.26 Không xác định 0,67 - -
Hỗn hợp Eugenol, 3-Allul-6- 164
12 28.02 methoxyphenol và một lượng nhỏ α.- 12,36 và -
Copaene 204
13 28.37 3-Allyl-2-methxyphenol 1,48 164 80
14 28.55 β.-Cubebene 0,55 204 73
15 28.61 β.-Elemen 2,37 204 87
16 29.42 β.-Caryophyllene 1,40 204 92
17 30.41 α.-Caryophyllene 0,79 204 89
18 31.08 γ.-Muurolene 2,89 204 93
19 31.22 Germacrene D 4,32 204 89
20 31.63 γ.-Elemene 1,42 204 88
21 31.73 α.-Muurolene 1,19 204 93
 70

22 32.11 .γ.-Cadinene 1,04 204 92

23 32.37 (-)-.β.-Cadinene 7,57 204 90
24 32.54 3-Allyl-6-methoxyphenyl acetate 9,68 206 75
25 32.72 Eugenol acetate 1,13 206 75
26 35.07 Cubenol 0,66 222 84
27 35.42 tau.-Muurolol 9,08 222 86
28 35.49 δ.-Cadinol 1,17 222 86
4-Allyl-1,2-diacetoxybenzene 5,25 234 85
29 35.75 .α.-Cadinol 10,97 222 92
(Phục lục 4)
Nhận xét và thảo luận: Từ kế t quả GC – MS cho thấy thành phần hoá ho ̣c
chính của tinh dầ u trầ u không ở khu vực An Giang là các hơ ̣p chấ t thuộc nhóm
terpene (4- terpineol, γ-muurolene, δ-cadinene, tau.- muurolol, α-cadinol) và các
hơ ̣p chấ t là dẫn xuấ t của phenol là như phenol, hỗn hợp eugenol, 3-Allul-6-
methoxyphenol, 3-Allyl-6-methoxyphenyl acetat. Tổ ng hàm lươ ̣ng của tấ t cả các
cấ u tử chiế m gầ n 90% lươ ̣ng tinh dầ u ly trích đươ ̣c. Trong đó, hỗn hợp Eugenol, 3-
allul-6-methoxyphenol và 1 lượng nhỏ α.-Copaene chiế m hàm lươ ̣ng cao nhấ t
(12,36%). Có thể thấ y các cấ u tử chiế m hàm lươ ̣ng cao nhấ t trong tinh dầ u đề u là
những dẫn xuấ t của phenol nên tinh dầ u này có nhiệt độ sôi, tỷ tro ̣ng và chiế t suấ t
cao. Các dẫn xuấ t phenol có mặt trong tinh dầ u có những tác du ̣ng sinh ho ̣c tố t như
tác du ̣ng kháng khuẩ n, kháng nấ m, chố ng oxy hóa, độc tính tế bào... (Roy and
Vijayalaxmi, 2013, Bhanu P.et al., 2010).
3.4. Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
3.4.1. Hoạt tính kháng Salmonella của tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Kết quả hoạt tính kháng Salmonella của tinh dầu trầu không được thể hiện
trong bảng 3.12. qua đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính đĩa kháng
khuẩn, 6 mm).
 71

Bảng 3.12. Kết quả kháng Salmonella của tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Độ pha loãng tinh dầu Đường kính vòng kháng
Nghiệm thức
trầu không khuẩn (mm)
Kháng sinh Ampicillin
A0 38
(ĐC)
A1 Nguyên chất 20,000a
A2 10-1 16,667a,b
A3 10-2 14,667b,c
A4 10-3 12,667c
A5 10-4 8,667d
(Phụ lục 3)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận: Sau ba lần kháng khuẩn của tinh dầu trầu không ở
mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml.
Dựa vào kết quả bảng 3.12. trên ta thấy rằng tinh dầu trầu không ở nồng độ
nguyên chất có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella ở mức độ cực nhạy (đường
kính trung bình vòng kháng khuẩn là 20,000a mm) theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-1 có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella
ở mức rất nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 16,667a,b mm) nằm
trong khoảng 15 – 19 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-2 có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella
ở mức nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 14,667b,c mm) nằm trong
khoảng 9 – 14 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-3 có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella
ở mức nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 12,667c mm) nằm trong
khoảng 9 – 14 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
 72

Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-4 có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella
ở mức nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 8,667d mm) do đường
kính trung bình > 8 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng
là 38 mm. Đánh giá: cực nhạy (Celikel và Kavas, 2008).
Dựa vào bảng 3.12., kết quả nghiệm thức A0 và A1 có đường kính vòng
kháng khuẩn lớn, đạt mức cực nhạy. Tuy nghiệm thức A1 này có vòng kháng không
nhạy bằng kháng sinh Ampicillin đối chứng nhưng vẫn được xét là có kết quả
kháng khuẩn rất tốt. Ở các nồng độ pha loãng tinh dầu còn lại, kết quả cho thấy ở
nghiệm thức A5, đường kính vòng kháng khuẩn vẫn nằm ở mức nhạy.
Từ đó cho thấy tinh dầu trầu không trích ly từ phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước cho kết quả kháng Salmonella tốt trên cả 5 nồng độ pha loãng.

Hình 3.7. Kết quả kháng Salmonella Hình 3.8. Kết quả kháng Salmonella
của tinh dầu trầu không của thuốc kháng sinh
 73

3.4.2. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu trầu không thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Kết quả hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu trầu không được
thể hiện trong bảng 3.13. qua đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính đĩa
kháng sinh, 6 mm).
Bảng 3.13. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu trầu không thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Độ pha loãng tinh dầu Đường kính vòng kháng
Nghiệm thức
trầu không khuẩn (mm)
Kháng sinh Ampicillin
A0 29
(ĐC)
A1 Nguyên chất 30,000a
A2 10-1 24,667b
A3 10-2 19,333c
A4 10-3 14,667d
A5 10-4 7,333e
(Phụ lục 3)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận: Sau ba lần kháng khuẩn của tinh dầu trầu không ở
mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml.
Dựa vào kết quả bảng 3.13. trên ta thấy rằng tinh dầu trầu không ở nồng độ
nguyên chất có khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus ở mức độ cực
nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 30,000a mm) nằm trong khoảng
> 20 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-1 có khả năng ức chế vi khuẩn
Staphylococcus aureus ở mức cực nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn
là 24,667b mm) nằm trong khoảng > 20 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
 74

Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-2 có khả năng ức chế vi khuẩn
Staphylococcus aureus ở mức rất nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là
19,333c mm) nằm trong khoảng 15 – 19 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-3 có khả năng ức chế vi khuẩn
Staphylococcus aureus ở mức nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là
14,667d mm) nằm trong khoảng 9 – 14 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-4 có khả năng ức chế vi khuẩn
Staphylococcus aureus ở mức không nhạy (đường kính trung bình vòng kháng
khuẩn là 7,333e mm) nằm trong khoảng < 8 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng
là 29 mm. Đánh giá: cực nhạy (Celikel và Kavas, 2008).
Dựa vào bảng 3.13., kết quả nghiệm thức A0 và A1 có đường kính vòng
kháng khuẩn lớn, đạt mức cực nhạy. Nghiệm thức A1 này có vòng kháng nhạy hơn
kháng sinh Ampicillin đối chứng, kết quả kháng khuẩn rất tốt. Ở các nồng độ pha
loãng tinh dầu còn lại, kết quả cho thấy ở nghiệm thức A4, đường kính vòng kháng
khuẩn vẫn nằm ở mức nhạy.
Từ đó cho thấy tinh dầu trầu không trích ly từ phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước cho kết quả kháng Staphylococcus aureus tốt trên cả 4 nồng độ pha
loãng.
So sánh với kết quả của tác giả Huỳnh Kỳ Trân (2017) về đề tài tinh dầu lá
trầu Hóc Môn cho ta thấy đường kính trung bình kháng Staphylococcus aureus của
tác giả là 15 mm ở nồng độ tinh dầu trầu không nguyên chất, nhỏ hơn đường kính
trung bình kháng Staphylococcus aureus của thực nghiệm (30 mm).
 75

Hình 3.9. Kết quả kháng Hình 3.10. Kết quả kháng
Staphylococcus aureus của Staphylococcus aureus
tinh dầu trầu không của thuốc kháng sinh
3.4.3. Hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu trầu không thu được bằng phương
pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Kết quả hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu trầu không được thể hiện trong
bảng 3.14. qua đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính đĩa kháng sinh, 6
mm).
Bảng 3.14. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu trầu không thu được bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Độ pha loãng tinh dầu Đường kính vòng kháng
Nghiệm thức
trầu không khuẩn (mm)
Kháng sinh Ampicillin
A0 25
(ĐC)
A1 Nguyên chất 20,667a
A2 10-1 16,000b
A3 10-2 9,000c
A4 10-3 7,000c
A5 10-4 7,000c
(Phụ lục 3)
 76

*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận: Sau ba lần kháng khuẩn của tinh dầu trầu không ở
mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml.
Dựa vào kết quả bảng 3.14. trên ta thấy rằng tinh dầu trầu không ở nồng độ
nguyên chất có khả năng ức chế vi khuẩn E.coli ở mức độ cực nhạy (đường kính
trung bình vòng kháng khuẩn là 20,667a mm) nằm trong khoảng > 20 mm theo
(Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-1 có khả năng ức chế vi khuẩn E.coli ở
mức rất nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 16,000b mm) nằm trong
khoảng 15 – 19 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-2 có khả năng ức chế vi khuẩn E.coli ở
mức nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 9,000c mm) nằm trong
khoảng 9 – 14 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-3 có khả năng ức chế vi khuẩn E.coli ở
mức không nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 7,000c mm) nằm
trong khoảng < 8 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-4 có khả năng ức chế vi khuẩn E.coli ở
mức không nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 7,000c mm) nằm
trong khoảng < 8 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng
là 25 mm. Đánh giá: cực nhạy (Celikel và Kavas, 2008).
Dựa vào bảng 3.14., kết quả nghiệm thức A0 và A1 có đường kính vòng
kháng khuẩn lớn, đạt mức cực nhạy. Tuy nghiệm thức A1 này có vòng kháng không
nhạy bằng kháng sinh Ampicillin đối chứng nhưng vẫn được xét là có kết quả
kháng khuẩn rất tốt. Ở các nồng độ pha loãng tinh dầu còn lại, kết quả cho thấy ở
nghiệm thức A3, đường kính vòng kháng khuẩn vẫn nằm ở mức nhạy.
 77

Từ đó cho thấy tinh dầu trầu không trích ly từ phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước cho kết quả kháng E.coli tốt trên 3 nồng độ pha loãng.
So sánh với kết quả của tác giả Huỳnh Kỳ Trân (2017) về đề tài tinh dầu lá
trầu Hóc Môn cho ta thấy đường kính trung bình kháng E.coli của tác giả là 15 mm
ở nồng độ tinh dầu trầu không nguyên chất, nhỏ hơn đường kính trung bình kháng
E.coli của thực nghiệm (20,667 mm).

Hình 3.11. Kết quả kháng E.coli Hình 3.12. Kết quả kháng E.coli
của tinh dầu trầu không của thuốc kháng sinh

3.4.4. Hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis của tinh dầu trầu không thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Kết quả hoạt tính kháng Bacillus subtilis của tinh dầu trầu không được thể
hiện trong bảng 3.15. qua đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính đĩa
kháng sinh, 6 mm).
 78

Bảng 3.15. Kết quả kháng Bacillus subtilis của tinh dầu trầu không thu được
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Độ pha loãng tinh dầu Đường kính vòng kháng
Nghiệm thức
trầu không khuẩn (mm)
Kháng sinh Ampicillin
A0 18
(ĐC)
A1 Nguyên chất 27,000a
A2 10-1 23,333b
A3 10-2 20,333b
A4 10-3 8,667c
A5 10-4 8,667c
(Phụ lục 3)
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,... thì
không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai
khác thống kê với p < 0,05.
Nhận xét và thảo luận: Sau ba lần kháng khuẩn của tinh dầu trầu không ở
mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml.
Dựa vào kết quả bảng 3.15. trên ta thấy rằng tinh dầu trầu không ở nồng độ
nguyên chất có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis ở mức độ cực nhạy
(đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 27,000a mm) nằm trong khoảng > 20
mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-1 có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus
subtilis ở mức cực nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 23,333b mm)
nằm trong khoảng > 20 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-2 có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus
subtilis ở mức cực nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 20,333b mm)
nằm trong khoảng > 20 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
 79

Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-3 có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus
subtilis ở mức nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 8,667c mm) nằm
trong khoảng > 8 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Tinh dầu trầu không ở nồng độ 10-4 có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus
subtilis ở mức nhạy (đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 8,667c mm) nằm
trong khoảng > 8 mm theo (Celikel và Kavas, 2008).
Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của kháng sinh Ampicillin đối chứng
là 18 mm. Đánh giá: rất nhạy (Celikel và Kavas, 2008).
Dựa vào bảng 3.15., kết quả nghiệm thức A0 và A1 có đường kính vòng
kháng khuẩn lớn. Tuy nghiệm thức A1 này có vòng kháng nhạy hơn kháng sinh
Ampicillin đối chứng, được xét là có kết quả kháng khuẩn rất tốt. Ở các nồng độ
pha loãng tinh dầu còn lại, kết quả cho thấy ở nghiệm thức A5, đường kính vòng
kháng khuẩn vẫn nằm ở mức nhạy.
Từ đó cho thấy tinh dầu trầu không trích ly từ phương pháp chưng cất lôi
cuốn hơi nước cho kết quả kháng Bacillus subtilis tốt trên cả 5 nồng độ pha loãng.

Hình 3.13. Kết quả kháng Bacillus Hình 3.14. Kết quả kháng Bacillus
subtilis của tinh dầu trầu không subtilis của thuốc kháng sinh
 80

Kết luận: Kết quả khảo sát của 4 chủng vi khuẩn cho thấy rằng tinh dầu trầu
không có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram âm và gram dương, đặc biệt những
chủng vi khuẩn này là những vi khuẩn điển hình của hệ vi sinh vật đường ruột. Tinh
dầu trầu không cho kết quả kháng rất tốt với tất cả các loại vi khuẩn trong thí
nghiệm. Trong 4 loại vi khuẩn thì tinh dầu trầu không kháng mạnh nhất là
Staphylococcus aureus, kháng yếu nhất là E.coli. So sánh với các kết quả kháng
khuẩn của tinh dầu lá lốt (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014) và kết quả kháng khuẩn
tinh dầu trầu Hóc Môn của tác giả Huỳnh Kỳ Trân (2017) thì tinh dầu trầu không
của thực nghiệm có khả năng kháng mạnh hơn và nhạy hơn rất nhiều so với tinh
dầu lá lốt và tinh dầu trầu không Hóc Môn. Đây là cơ sở thiết thực cho việc nghiên
cứu áp dụng tinh dầu trầu không làm hương liệu trong ngành công nghiệp dược
phẩm và mỹ phẩm.
 81

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận
Từ quá trình nghiên cứu ta thu được các thông số kỹ thuật cho quá trình
chưng cất lôi cuốn hơi nước ở quy mô phòng thí nghiệm:
- Nguyên liệu lá trầu già xay nhuyễn trong 1 phút.
- Tỷ lệ rắn / lỏng là 1:2,5
- Nồng độ nước muối: 10%
- Thời gian ngâm nước muối: 30 phút
- Thời gian chưng cất: 120 phút kể từ khi giọt tinh dầu đầu tiên ngưng tụ rơi
xuống.
Tinh dầu trầu không thu được có màu vàng nhạt, nhẹ hơn nước, có mùi thơm
đặc trưng, vị cay nồng. Đã xác định được các chỉ số vật lý và hóa học của tinh dầu
trầu không như sau:
- Hàm lượng tinh dầu: 0,4%
- Tỷ trọng tinh dầu trầu không: 0,959
- Chỉ số acid: 6,919
- Chỉ số savon hóa: 15,895
- Chỉ số ester hóa: 8,976
- Chỉ số ethanol: Tỷ lệ tinh dầu: cồn tuyệt đối = 1:10,5
Tỷ lệ tinh dầu: cồn 90o = 1:16,7
Tỷ lệ tinh dầu: cồn 80o = 1:25,2
Tỷ lệ tinh dầu: cồn 70o = 1:44,3
Thành phần chính của tinh dầu trầu không: Hỗn hợp Eugenol, 3-Allul-6-
methoxyphenol và 1 lượng nhỏ α.-Copaene (12,36%), .α.-Cadinol (10,97%), 3-
Allyl-6-methoxyphenyl acetate (9,68%).
Kết quả khảo sát 4 loại vi khuẩn: Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli,
Bacillus subtilis cho thấy tinh dầu trầu không có khả năng ức chế các loại vi khuẩn
 82

gram (+), gram (-). Trong 4 loại vi khuẩn thì tinh dầu trầu không kháng khuẩn mạnh
nhất là Staphylococcus aureus, kháng khuẩn yếu nhất là E.coli.
4.2. Kiến nghị
Vì điều kiện thời gian, chi phí không cho phép nên đề tài mới chỉ xây dựng
được quy trình trích ly tinh dầu trầu không với điều kiện thích hợp và thử hoạt tính
kháng khuẩn. Vì vậy, nếu có điều kiện cần tiếp tục nghiên cứu tinh dầu trầu không
và ứng dụng vào sản xuất để tăng nguồn lợi cho những người dân và nước nhà.
 Cần khảo sát thêm nhiệt độ chưng cất tinh dầu trầu không.
 Khảo sát khả năng kháng của tinh dầu trầu không trên một số loại vi khuẩn
Gram âm và Gram dương khác.
 Có thể nghiên cứu theo hướng mở rộng để xác định thành phần các chất có
trong thân rễ và hoa của cây trầu, so sánh với thành phần các chất có trong lá
trầu. Từ đó sẽ lựa chọn được nguồn nguyên liệu tối ưu để tiếp tục nghiên cứu
các hoạt tính sinh học phục vụ cho y học.
 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu tiếng Việt
[1]. Trần Thị Ngọc Anh (2011). Khảo sát thành phần hoá học quả quất trên địa bàn
tỉnh Đồng Tháp. Đại học Đồng Tháp.
[2]. Nguyễn Thiện Chí và cộng sự (2016). Khảo sát thành phần hoá học và hoạt
tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không, Tạp chí Khoa học Trường Đại
học Cần Thơ.
[3]. Pha ̣m Thế Chính, Dương Nghiã Bang, Phan Thanh Phương, Khiế u Thi ̣ Tâm,
Pha ̣m Thi ̣ Thắ m, Lê Thi ̣ Xuân, Bùi Thi ̣ Thúy (2009). Thành phầ n hóa học của
tinh dầ u lá trầ u (Piper Betle L.) Trồ ng tại Hải Dương. Ta ̣p chí Khoa ho ̣c &
Công nghệ.72(10): 48–52.
[4]. Tôn Long Dày (2013). Ly trích và khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu
Bạc Hà. Đại học Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp.
[5]. Nguyễn Nho Dũng (2011). Nghiên cứu chiế t tách, xác đi ̣nh thành phầ n hoá học
tinh dầ u và di ̣ch chiế t từ lá Trầ u không. Luận văn tha ̣c si ̃ Hoá hữu cơ. Đa ̣i ho ̣c
Đà Nẵng. Đà Nẵng.
[6]. Nguyễn Kim Đào (2003). Danh mục các loài thực vật Việt Nam. Nxb. Nông
nghiệp, Hà Nội, tập 2: 115-122.
[7]. Phạm Hoàng Hộ (1999). Cây cỏ Việt Nam, quyển I, Nxb. Trẻ, TP. Hồ Chí
Minh, trang 288-301.
[8]. Nguyễn Thị Hồng (2011). Nghiên cứu xác định thành phần một số hợp chất
hoá học trong tinh dầu từ cây ngãi cứu ở Quảng Nam, Đại học Đà Nẵng.
[9]. Phùng Thị Ái Hữu (2012). Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hoá
học tinh dầu cây sả chanh Cẩm Lệ - Đà Nẵng, Trường Đại học sư phạm – Đại
học Đà Nẵng.
[10]. Nguyễn Thị Hồng Liên (2014). Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu
lá lốt được ly trích từ phương pháp lôi cuốn hơi nước và phương pháp vi sóng,
Trường Đại học Cần Thơ.
 84

[11]. Đỗ Tấ t Lơ ̣i (2003). Những cây thuố c và vi ̣ thuố c Việt Nam. Lầ n xuấ t bản thứ
XII. Nhà xuấ t bản Y ho ̣c. Hà Nội, trang 118–119.
[12]. Hoàng Văn Lựu (2003). Thành phần hoá học cuả tinh dầu cây Hồ tiêu Piper
nigrum L. Tạp chí Dược học. Trang 15 – 17
[13]. Nguyễn Thi ̣Lý và Trầ n Thi ̣Hồ ng Vân (2010). Tách tinh dầ u và carotenoid từ
lá trầ u (Piper betle L.). Hội Nghi ̣ Khoa Ho ̣c & Công Nghệ lầ n 9, Phân ban
Công nghệ Hóa ho ̣c, Khoa Công nghệ Hoá ho ̣c, Đa ̣i ho ̣c Bách Khoa, Tp. Hồ
Chí Minh.
[14]. Lã Đình Mỡi (2001). Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, NXB Nông
Nghiệp.
[15]. Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010. Chất kháng khuẩn thực vật, Tiểu luận môn
CNCB rau trái, Trường đại học Bách khoa, tp.hcm.
[16]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2000 – 2001). Các phương pháp nhận danh, trích ly
cô lập các hợp chất hữu cơ. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.
[17]. Nguyễn Vĩnh Phước (1977). Vi sinh vật thú y. Tập II. Nxb. Đại học và trung
học chuyên nghiệp, Hà Nội, pp. 3-180.
[18]. Lê Ngọc Thạch (2003). Tinh dầu. Nxb. Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.
[19]. Nguyễn Quốc Châu Thanh (2013). Ly trích và khảo sát thành phần hoá học
của tinh dầu sả chanh, Đại học Cần Thơ.
[20]. Nguyễn Như Thanh (1997). Vi sinh vật thú y. Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội.
[21]. Nguyễn Tiến Thắng, 2012. Công nghệ sản xuất sinh phẩm. Nhà xuất bản Bộ
giáo dục và đào tạo – Trường đại học công nghệ kỹ thuật. Tp.HCM.
[22]. Nguyễn Tấn Thịnh, 2013. Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây
lược vàng callisia fragrans (lindl) Wood, Khóa luận tốt nghiệp, đại học công
nghệ kỹ thuật, Tp. HCM.
[23]. Ngô Văn Thu, 2011. Bài giảng dược liệu – tập 1. Nhà xuất bản Trung tâm
thông tin thư viện - Trường đại học Dược Hà Nội.
[24]. Trần Linh Thước (2010). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm. Nxb. Giáo dục, Hà Nội.
 85

[25]. Huỳnh Kỳ Trân (2017). Tinh dầu lá trầu Hóc Môn, Tạp chí y tế Công Cộng.
[26]. Mai Thị Anh Tú (2009). Khảo sát tinh dầu tần dầy lá, Đại học Cần Thơ.
[27]. Dược điển Việt Nam IV (2004), nhà xuất bản Y học.
[28]. Tiêu chuẩn Việt Nam 189:1993. Tinh dầu và phương pháp thử. Năm ban hành
1993-09-07, 430/QĐ-TĐC.
2. Tài liệu tiếng Anh
[29]. Bhanu, P., Ravindra, S., Priyanka, S., Ashok, K., Prashant, K.M. and Nawa,
K.D., 2010. Efficacy of chemically characterized Piper betle L. essential oil
against fungal and aflatoxin contamination of some edible commodities and its
antioxidant activity. International Journal of Food Microbiology. 142: 114–119.
[30]. Celikel và Kavas (2008). Antimicrobial properties of some essential oils
against some pathogenic microorganisms. Czech J. Food Sci, 26: 174 – 181.
[31]. Menon, A N, Padmakumari, K P, Jayalekshmy, A. (2003), “Essential Oil
Composition of Four Major Cultivars of Black Pepper ( Piper nigrum L.) III”,
Journal Of Essential Oil Research, 15(3), pp. 155 – 157.
[32]. Marco B.A, 2007. Synthesis and Characterization of Glycosides. Springer,
Mexico.
[33]. Nascimento. D. J. C., Paula. D. V. F., David J. M., David J. P. 2012.
[34]. Gutierrez R. M., Gonzalez A. M., Hoyo-Vadillo C. 2013. Alkaloids from
Piper: A review of its phytochemistry and pharmacology, Mini-Reviews in
Medicinal Chemistry, vol. 13, pp. 163-193.
[35]. Parmar V. S., Jain S. C., Bisht K. S. 1996. Phytochemistry of the genus Piper,
Phytochemisrry, vol. 46 (4), pp. 591-673.
[36]. Rawat, A.K.S., Tripathl, R.D. Khan, A.J. and Balasubrahmanyam, V.R., 1989.
Essential Oil Components as Markers for Identification ofPiper betle L.
Cultivars. Biochemical Systematics and Ecology. 17(1): 35-38.
[37]. Roy, U.B. and Vijayalaxmi, K.K., 2013. Evaluation of Cytotoxic Activity of
Piper betle Linn. Using Murine and Human Cell Lines InVitro. International
Journal of Scientific & Engineering Research. 4(9): 221–233.
 86

[38]. Furter, W.F. and Cook R.A., 1967. Salt effect in distillation: a Literature
Review. International Journal of Heat and Mass Transfer. 10: 23-36.
[39]. Silva NCC, Fernandes Júnior A. Biological properties of medicinal plants: a
review of their antimicrobial activity. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis
vol.16 no.3 Botucatu 2010.
3. Tài liệu Internet
[40].http://www.caycongtrinh.com.vn/cay-lam-thuoc/cay-trau-khong/cay-trau-
khong---tinh-dau-trau-khong
[41]. http//thuvien.yh.vn.node/1030
[42].http://chicucthuytphcm.org.vn/new/2005/09/23/Ngo-doc-thuc-pham-do-vi-
khuan-Ecoli.aspx
[43]. www.wikipedia.org
[44]. https://vi.wikipedia.org/wiki/Trầu_không
 1

PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Thành phần các chất môi trường và cách pha 1 số dung dịch thử
 Dung dịch chuẩn độ KOH 0,1 N
Cân khoảng 0,56g KOH rắn, hòa tan trong 100 ml ethanol 96o, ta được dung
dịch KOH trong cồn nồng độ khoảng 0,1 N.
 Môi trường tăng sinh NB
Cân chính xác 5 g môi trường Peptone, 3 g môi trường Beef extract (có thể
thay thế bằng 3 g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl. Hòa 23 g môi trường
Nutrient Broth trong 1000 ml nước cất vô trùng. Đun sôi, khuấy đều và khử trùng
bằng nồi hấp ở 121°C trong 15 phút. PH cuối 7,0 ± 0,2.
 Môi trường cấy kháng khuẩn NA
Cân chính xác 5 g môi trường Peptone, 3 g môi trường Beef extract (có thể
thay thế bằng 3 g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl và 15 g Agar. Hòa 38 g
môi trường Nutrient Broth trong 1000 ml nước cất vô trùng. Đun sôi, khuấy đều và
khử trùng bằng nồi hấp ở 121°C trong 15 phút. PH cuối 7,0 ± 0,2.
Phụ lục 2: Xử lý thống kê ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu
trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
1. Xử lý thống kê ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng
tinh dầu trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước
ANH HUONG CUA KICH THUOC NGUYEN LIEU
1

23:11 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

KICHTHUOC 2 CATNHO XAYNHUYE

Number of Observations Read 6

Number of Observations Used 6
 2

ANH HUONG CUA KICH THUOC NGUYEN LIEU

2

23:11 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: HAMLUONG

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 1 0.12760417 0.12760417

306.25 <.0001

Error 4 0.00166667 0.00041667

Corrected Total 5 0.12927083

R-Square Coeff Var Root MSE HAMLUONG

Mean

0.987107 8.031114 0.020412

0.254167

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

KICHTHUOC 1 0.12760417 0.12760417

306.25 <.0001
ANH HUONG CUA KICH THUOC NGUYEN LIEU
3

23:11 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 4
Error Mean Square 0.000417
Critical Value of t 2.77645
Least Significant Difference 0.0463
 3

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N KICHTHUOC

A 0.40000 3 XAYNHUYE

B 0.10833 3 CATNHO
ANH HUONG CUA KICH THUOC NGUYEN LIEU
4

23:11 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 4
Error Mean Square 0.000417
Critical Value of t 4.60409
Least Significant Difference 0.0767

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N KICHTHUOC

A 0.40000 3 XAYNHUYE

B 0.10833 3 CATNHO

2. Xử lý thống kê ảnh hưởng của tuổi nguyê liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá già)
đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn
hơi nước
ANH HUONG CUA TUOI NGUYEN LIEU
1

23:04 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

 4

Class Levels Values

TUOI 3 LABANHTE LAGIA LANON

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9
ANH HUONG CUA TUOI NGUYEN LIEU
2

23:04 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: HLUONG

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 2 0.18763889 0.09381944

193.00 <.0001

Error 6 0.00291667 0.00048611

Corrected Total 8 0.19055556

R-Square Coeff Var Root MSE HLUONG

Mean

0.984694 10.87295 0.022048

0.202778

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

TUOI 2 0.18763889 0.09381944

193.00 <.0001
ANH HUONG CUA TUOI NGUYEN LIEU
3

23:04 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
 5

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 0.000486
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 0.044

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N TUOI

A 0.40000 3 LAGIA

B 0.15000 3 LABANHTE

C 0.05833 3 LANON
ANH HUONG CUA TUOI NGUYEN LIEU
4

23:04 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 0.000486
Critical Value of t 3.70743
Least Significant Difference 0.0667

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N TUOI

A 0.40000 3 LAGIA

B 0.15000 3 LABANHTE

C 0.05833 3 LANON

3. Xử lý số liệu ảnh hưởng của lượng nước đến hàm lượng tinh dầu trầu
không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
ANH HUONG CUA LUONG NUOC
1
 6

23:16 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

LUONGNUOC 3 400 500 600

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9
ANH HUONG CUA LUONG NUOC
2

23:16 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: HAMLUONG

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 2 0.06291667 0.03145833

90.60 <.0001

Error 6 0.00208333 0.00034722

Corrected Total 8 0.06500000

R-Square Coeff Var Root MSE HAMLUONG

Mean

0.967949 6.576671 0.018634

0.283333

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

LUONGNUOC 2 0.06291667 0.03145833

90.60 <.0001
ANH HUONG CUA LUONG NUOC
3

23:16 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

 7

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 0.000347
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 0.0372

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N LUONGNUOC

A 0.40000 3 500

B 0.24167 3 600

B 0.20833 3 400
ANH HUONG CUA LUONG NUOC
4

23:16 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 0.000347
Critical Value of t 3.70743
Least Significant Difference 0.0564

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N LUONGNUOC

A 0.40000 3 500

B 0.24167 3 600
 8

B 0.20833 3 400
4. Xử lý thống kê ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên
liệu đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu được bằng phương pháp
chưng cất lôi cuốn hơi nước
ANH HUONG CUA NONG DO MUOI NACL
1

23:19 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NONGDOMUOI 4 0 10 15 5

Number of Observations Read 12

Number of Observations Used 12
ANH HUONG CUA NONG DO MUOI NACL
2

23:19 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: HAMLUONG

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 3 0.10307292 0.03435764

82.46 <.0001

Error 8 0.00333333 0.00041667

Corrected Total 11 0.10640625

R-Square Coeff Var Root MSE HAMLUONG

Mean

0.968674 7.965820 0.020412

0.256250

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F
 9

NONGDOMUOI 3 0.10307292 0.03435764

82.46 <.0001
ANH HUONG CUA NONG DO MUOI NACL
3

23:19 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 0.000417
Critical Value of t 3.35539
Least Significant Difference 0.0559

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N NONGDOMUOI

A 0.40000 3 10

B 0.26667 3 15

C 0.20833 3 5

D 0.15000 3 0

5. Xử lý thống kê ảnh hưởng cùa thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh
dầu trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước
ANH HUONG CUA THOI GIAN NGAM MAU
1

23:22 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

 10

THOIGIANNGAM 5 0PHUT 15PHUT 30PHUT

45PHUT 60PHUT

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15
ANH HUONG CUA THOI GIAN NGAM MAU
2

23:22 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: HAMLUONG

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 4 0.10566667 0.02641667

90.57 <.0001

Error 10 0.00291667 0.00029167

Corrected Total 14 0.10858333

R-Square Coeff Var Root MSE HAMLUONG

Mean

0.973139 5.957530 0.017078

0.286667

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

THOIGIANNGAM 4 0.10566667 0.02641667

90.57 <.0001
ANH HUONG CUA THOI GIAN NGAM MAU
3

23:22 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
 11

Error Mean Square 0.000292

Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 0.0311

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N THOIGIANNGAM

A 0.40000 3 30PHUT

B 0.33333 3 45PHUT

C 0.30000 3 60PHUT

D 0.25000 3 15PHUT

E 0.15000 3 0PHUT
ANH HUONG CUA THOI GIAN NGAM MAU
4

23:22 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 0.000292
Critical Value of t 3.16927
Least Significant Difference 0.0442

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N THOIGIANNGAM

A 0.40000 3 30PHUT

B 0.33333 3 45PHUT
B
B 0.30000 3 60PHUT

C 0.25000 3 15PHUT
 12

D 0.15000 3 0PHUT

6. Xử lý thống kê ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh
dầu trầu không thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước
ANH HUONG CUA THOI GIAN CHUNG CAT
1

23:24 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

THOIGIANCHUNG 6 120PHUT 150PHUT 180PHUT 30PHUT

60PHUT 90PHUT

Number of Observations Read 18

Number of Observations Used 18
ANH HUONG CUA THOI GIAN CHUNG CATE
2

23:24 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: HAMLUONG

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 5 0.34819444 0.06963889

334.27 <.0001

Error 12 0.00250000 0.00020833

Corrected Total 17 0.35069444

R-Square Coeff Var Root MSE HAMLUONG

Mean

0.992871 5.647992 0.014434

0.255556
 13

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

THOIGIANCHUNG 5 0.34819444 0.06963889

334.27 <.0001
ANH HUONG CUA THOI GIAN CHUNG CAT
3

23:24 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 12
Error Mean Square 0.000208
Critical Value of t 2.17881
Least Significant Difference 0.0257

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N THOIGIANCHUNG

A 0.40000 3 120PHUT

A 0.38333 3 150PHUT

B 0.35000 3 180PHUT

C 0.25833 3 90PHUT

D 0.10000 3 60PHUT

E 0.04167 3 30PHUT
ANH HUONG CUA THOI GIAN CHUNG CAT
4

23:24 Thursday, July 28, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for HAMLUONG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.
 14

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 12
Error Mean Square 0.000208
Critical Value of t 3.05454
Least Significant Difference 0.036

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N THOIGIANCHUNG

A 0.40000 3 120PHUT

B A 0.38333 3 150PHUT

B 0.35000 3 180PHUT

C 0.25833 3 90PHUT

D 0.10000 3 60PHUT

E 0.04167 3 30PHUT

Phụ lục 3: Xử lý thống kê kết quả mức độ kháng khuẩn của tinh dầu trầu
không trên các nhóm vi sinh vật chỉ thị
1. Xử lý thống kê kết quả mức độ kháng khuẩn của tinh dầu trầu không
trên vi sinh vật Salmonella
HOAT TINH KHANG SALMONELLA CUA TRAU KHONG;
RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH; CARDS;10^1 2010^- 1
01:11
Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

PLOANG 5 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^1

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15
HOAT TINH KHANG SALMONELLA CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH;
CARDS;10^1 2010^- 2
01:11
Friday, July 24, 2017
 15

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DKINH

Sum of
Source DF Squares Mean Square F
Value Pr > F

Model 4 217.0666667 54.2666667

15.65 0.0003

Error 10 34.6666667 3.4666667

Corrected Total 14 251.7333333

R-Square Coeff Var Root MSE DKINH Mean

0.862288 12.81123 1.861899 14.53333

Source DF Anova SS Mean Square F

Value Pr > F

PLOANG 4 217.0666667 54.2666667

15.65 0.0003
HOAT TINH KHANG SALMONELLA CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH;
CARDS;10^1 2010^- 3
01:11
Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 3.466667
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 3.3873

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N PLOANG

A 20.000 3 10^1

B A 16.667 3 10^-1
 16

B C 14.667 3 10^-2

C 12.667 3 10^-3

D 8.667 3 10^-4
HOAT TINH KHANG SALMONELLA CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH;
CARDS;10^1 2010^- 4
01:11
Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 3.466667
Critical Value of t 3.16927
Least Significant Difference 4.818

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N PLOANG

A 20.000 3 10^1

B A 16.667 3 10^-1

B 14.667 3 10^-2

B C 12.667 3 10^-3

C 8.667 3 10^-4

2. Xử lý thống kê kết quả mức độ kháng khuẩn của tinh dầu trầu không
trên vi sinh vật Staphylococcus aureus
HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREAUS CUA TRAU KHONG;
RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH; CARDS;10 1

01:16 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

 17

PLOANG 5 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4

10^1

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15
HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREAUS CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT
PLOANG $ DKINH; CARDS;10 2

01:16 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DKINH

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 4 923.7333333 230.9333333

138.56 <.0001

Error 10 16.6666667 1.6666667

Corrected Total 14 940.4000000

R-Square Coeff Var Root MSE DKINH

Mean

0.982277 6.723929 1.290994

19.20000

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

PLOANG 4 923.7333333 230.9333333

138.56 <.0001
HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREAUS CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT
PLOANG $ DKINH; CARDS;10 3

01:16 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
 18

Error Mean Square 1.666667

Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 2.3487

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N PLOANG

A 30.000 3 10^1

B 24.667 3 10^-1

C 19.333 3 10^-2

D 14.667 3 10^-3

E 7.333 3 10^-4
HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREAUS CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT
PLOANG $ DKINH; CARDS;10 4

01:16 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 1.666667
Critical Value of t 3.16927
Least Significant Difference 3.3407

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N PLOANG

A 30.000 3 10^1

B 24.667 3 10^-1

C 19.333 3 10^-2

D 14.667 3 10^-3
 19

E 7.333 3 10^-4

3. Xử lý thống kê kết quả mức độ kháng khuẩn của tinh dầu trầu không
trên vi sinh vật E.coli
HOAT TINH KHANG E.COLI CUA TRAU KHONG;
RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH; CARDS;10^1 2010^-1 1

01:19 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

PLOANG 5 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4

10^1

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15
HOAT TINH KHANG E.COLI CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH;
CARDS;10^1 2010^-1 2

01:19 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DKINH

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 4 450.2666667 112.5666667

19.86 <.0001

Error 10 56.6666667 5.6666667

Corrected Total 14 506.9333333

R-Square Coeff Var Root MSE DKINH

Mean

0.888217 19.94812 2.380476

11.93333

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

PLOANG 4 450.2666667 112.5666667

19.86 <.0001
 20

HOAT TINH KHANG E.COLI CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH;

CARDS;10^1 2010^-1 3

01:19 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 5.666667
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 4.3307

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N PLOANG

A 20.667 3 10^1

B 16.000 3 10^-1

C 9.000 3 10^-2

C 7.000 3 10^-4

C 7.000 3 10^-3
HOAT TINH KHANG E.COLI CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH;
CARDS;10^1 2010^-1 4

01:19 Friday, July 24, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 5.666667
Critical Value of t 3.16927
Least Significant Difference 6.16
 21

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N PLOANG

A 20.667 3 10^1

A 16.000 3 10^-1

B 9.000 3 10^-2

B 7.000 3 10^-4

B 7.000 3 10^-3

4. Xử lý thống kê kết quả mức độ kháng khuẩn của tinh dầu trầu không
trên vi sinh vật Bacillus subtilis
KET QUA KHANG BACILLUS SUBTILIS CUA TINH DAU TRAU
KHONG 1

00:06 Friday, July 29, 2017

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NONGDO 5 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4

10^0

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15
KET QUA KHANG BACILLUS SUBTILIS CUA TINH DAU TRAU
KHONG 2

00:06 Friday, July 29, 2017

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DUONGKINH

Sum of
Source DF Squares Mean Square
F Value Pr > F

Model 4 823.7333333 205.9333333

31.20 <.0001

Error 10 66.0000000 6.6000000

 22

Corrected Total 14 889.7333333

R-Square Coeff Var Root MSE DUONGKINH

Mean

0.925820 14.65236 2.569047

17.53333

Source DF Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

NONGDO 4 823.7333333 205.9333333

31.20 <.0001
KET QUA KHANG BACILLUS SUBTILIS CUA TINH DAU TRAU
KHONG 3

00:06 Friday, July 29, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DUONGKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 6.6
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 4.6738

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N NONGDO

A 26.667 3 10^0

B A 23.333 3 10^-1

B 20.000 3 10^-2

C 9.000 3 10^-3

C 8.667 3 10^-4
KET QUA KHANG BACILLUS SUBTILIS CUA TINH DAU TRAU
KHONG 4
 23

00:06 Friday, July 29, 2017

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DUONGKINH

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not
the experimentwise error
rate.

Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 6.6
Critical Value of t 3.16927
Least Significant Difference 6.6479

Means with the same letter are not significantly

different.

t Grouping Mean N NONGDO

A 26.667 3 10^0

B A 23.333 3 10^-1

B 20.000 3 10^-2

C 9.000 3 10^-3

C 8.667 3 10^-4

Phụ lục 4: Kết quả kiểm nghiệm thành phần hóa học và hàm lượng tương đối
các hợp chất trong mẫu tinh dầu trầu không bằng phương pháp GC – MS
24
25
26
27