TIBBİ BİYOKİMYA LABORATUVARI

HEMOGLOBİN ANALİZİ VE ELEKTROFOREZİ

DERS NOTU

2022-2023
 HEMOGLOBİN ELEKTROFOREZİ
HEMOGLOBİNOPATİLER

Hemoglobin (Hb), dolaşımda oksijenin taşınmasından sorumlu eritrositlerin majör

elemanıdır. Hem ve globin olmak üzere iki kısımdan oluşmuştur. Hem, hemoglobinin O2
taşıyan kısmıdır. Globin kısmı protein yapısında olup dört polipeptit zincirinden oluşur,
bunlar iki alfa (α) ve iki beta (β) zinciridir.
Gelişmenin farklı dönemlerinde farklı hemoglobin tipleri görülür. Bu hemoglobinlerin
globin zincirlerinin amino asit bileşimi farklılıklar gösterir.
Normal erişkin hemoglobini 3 formda bulunur. Bunlar HbA, HbA2, HbF’ dir.

Tipi Eritrositte bulunma yüzdesi (%) Alt üniteleri (zincir bileşimi)

HbA 95-98 2α+2β
HbA2 2 2α+2δ
HbF <1 2α+2γ

Alfa ve beta zincirlerinin sentezi ayrı genler tarafından düzenlenir, bu genler 11. ve 16.
kromozomlarda bulunmaktadır. 16. kromozomda α-geni, 11. kromozomda ise β, delta (δ) ve
gama (γ) genleri bulunur.
Hemoglobinopatiler, yapısal olarak anormal bir hemoglobin molekülünün üretimine
veya normal hemoglobinin yetersiz miktarda sentezlenmesine bağlı olarak gelişen hastalık
ailesi olarak tanımlanmaktadır.
Hemoglobinopatilerde hemoglobinin 4 polipeptit zincirindeki amino asit dizilişlerinde
değişiklikler oluşabilir. Klinik olarak belirgin hastalıklar, genellikle α ya da β zincirindeki
bozukluktan ileri gelir. γ ya da δ zincirlerine ait bozukluklar ise nadir görülür.
Yapısal bozukluğa bağlı olarak hemoglobinin çözünürlüğü ve dayanıklılığı azalır,
oksijene karşı afinitesi artar ya da azalır. Hemoglobinin değişen özellikleri nedeni ile
eritrositlerin fonksiyonu bozulur.
Hemoglobinopatilerin en sık görülenleri talasemiler ve orak hücreli anemisidir.
Talasemi normal hemoglobin üretiminin azalmasına bağlı meydana gelirken, orak hücreli
anemi amino asit sırası değişik olan bir hemoglobin üretimi sonucu meydana gelir.

Orak Hücre Anemisi (HbS Hastalığı)

Orak hücre hastalığı en sık görülen hemoglobinopatidir. Bu hastalık homozigot, resesif

bir hastalıktır. Orak hücre anemisi ömür boyu görülen hemolitik anemi ve ağrılı krizler ile
karakterizedir. Bir HbS molekülünde iki normal α-globin zinciri vardır. β zincirinde 6.
pozisyonda yer alan glutamik asidin yerini valin almıştır. Bu yapı değişikliği oksijenin
azaldığı ortamda, hemoglobinin taktoid denilen kristaller yapmasına ve eritrositi deforme
etmesine neden olmaktadır. Deforme olan eritrosit kılcal damarlarda tutulmakta ve trombotik
olaylara ve hemolize yol açmaktadır.
Orak hücre anemisi olan hastalarda Hb S düzeyi % 100’ dür, eritrositler her an
oraklaşmaya meyillidir. Orak hücre anemisi taşıyıcılarında Hb S düzeyi % 30-40 oranındadır.
Tanı, klinik öykü ve fiziksel bulgular yanında Hb elektroforezi ile kolaylıkla konur.
Hb S’ nin elektroforetik mobilitesi Hb A’ dan farklıdır.
 Talesemiler

Talesemi, genetik bir mutasyon nedeniyle globin polipeptitlerinden (α, β, γ, δ) bir

tanesinin sentezinin azalması veya tamamen durması ile meydana gelen hastalık grubunu
oluşturmaktadır. Talesemiler eksik polipeptit zincirine göre α, β, γ ve δ talesemiler şeklinde
sınıflandırılırlar.
β talesemi; en sık görülen talesimi tipidir. β zincir yapımı yok veya azalmışken, α
zincir yapımı normaldir. α-globin zincirleri, dayanıklı tetramerler oluşturamaz ve çöktükleri
için olgun eritrosit oluşturacak hücrelerin premature ölümüne neden olurlar. β taleseminin,
homozigot yada heterozigot olmak üzere iki tipi vardır. Homozigot olana talesemi majör veya
Cooley Anemisi, heterozigot olana ise Talesemi Minör denir.
α talesemi; α polipeptit zincirini kodlayan gende bir mutasyon sonucu ortaya çıkar.
Bunda α zincirinin yapımı yok veya azalmıştır. Diğer normal polipeptit zincirleri tetramer
oluştururlar; dört beta zinciri HbH, dört gamma zinciri de HbBart’s oluştururlar.

ELEKTROFOREZ

Yüklü partiküllerin bir elektrik akımının tesiri ile birbirinden ayrılması olayına
elektroforez denir. Elektroforezin yapılması için 4 şeye ihtiyaç vardır:

1. İyonların hareket edebileceği destek ortamı

2. Elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı
3. Güç kaynağından gelen doğru akımı geçiren ve istenilen pH’ a sahip olan tampon çözelti
4. Elektroforezle birbirinden ayrılan bantları kantitatif değerlendiren dansitometre

Elektroforezde mobilite, molekülün net elektriksel yüküne, molekülün yapısı ve

büyüklüğüne, elektriksel alanın gücüne, destek ortamının özelliğine, uygulama ısısına
bağlıdır.

Destek ortamı olarak filtre kağıdı, selüloz asetat kağıdı, nişasta ve poliakrilamid jelleri
kullanılır.

Elektroforezde kullanılan tamponların fonksiyonları:

1. pH’ ı sabit tutarlar.

2. Elektrik akımını iletirler.
3. Moleküllerin tek yönde göç etmelerini sağlarlar.

Güç kaynağı: Elektroforezde kullanılan güç kaynağı tek yönde sabit bir akım sağlar. Akımın
yüksekliği uygulamanın ihtiyacına göre değiştirilebilmektedir.

Dansitometre: Uygulama, yürütme, boyama ve kurutma işleminden sonra bantlar gözle

değerlendirilip yorumlanabilir. Fakat standardizasyonun sağlanması ve yanlış
değerlendirmelerin önlenmesi için bu bantların kalınlığı ve koyuluğu dansitometrede okutulur
ve grafik çizilerek yüzdeleri bulunur. Böylece kantitatif bir değerlendirme yapılmış olur.
ELEKTROFOREZ ÇEŞİTLERİ

Destek materyaline göre elektroforez tekniği çeşitli isimler alır:

Kağıt elektroforezi: Destek ortamı olarak kaliteli filtre kağıdı kullanılır. Avantajı ucuz
olması ve yüksek gerilime dayanabilmesidir ancak deney süresi uzun olduğundan rutinde pek
kullanılmaz.
Agaroz jel elektroforezi: Destek maddesi olarak agaroz kullanılır. Bu maddenin proteinlere
afinitesi az olduğundan protein bantları birbirinden iyi ayrılır. Bu yüzden rutin uygulamalarda
sıkça kullanılır. Deney süresi oldukça kısadır. (30-90 dk)
Destek materyaline göre isimler alan nişasta jeli ve poliakrilamid jel elektroforezleri çok iyi
ayırma sağladıklarından hem rutin hem de araştırma amaçlı kullanılırlar.

ELEKTROFOREZİN YAPILIŞI

1. Uygulama
2. Yürütme
3. Boyama
4. Temizleme
5. Şeffaflaştırma
6. Değerlendirme

1-2.Uygulama ve yürütme (elektroforez süresi): Tekniğe ve analiz çeşidine göre

değişebilir.
3. Boyama: Sadece incelenecek maddeyi boyayan boyalar kullanılır. Protein elektroforezinde
Coomassie Blue kullanılması gibi
4. Temizleme: Destek ortamı boya içine konulunca tamamen boyanır. Sadece incelemek
istenen bantların boyalı kalması istenir. Bunun için destek ortamı belli bir temizleme sıvısında
bir süre tutulur (% 5 asetik asit).Bu süre sonunda destek ortamı üzerinde yürütülmüş olan
partikül bantları boyalı kalır, ortamın diğer kısımlarındaki boya temizlenmiş olur.
5. Şeffaflaştırma: Dansitometre de okuma yapılabilmesi için destek ortamının şeffaf olması
gerekir. Bunun için %30-40 dimetil sülfoksit veya diğer şeffaflaştırıcılar kullanılabilir.
Şeffaflaşan şeritler kurutulduktan sonra dansitometrede okutulur.
6. Değerlendirme: Dansitometre de yapılır. Bantların kalınlığı ve koyuluğu dansitometrede
okutulur ve grafik çizilerek yüzdeleri bulunur. Böylece kantitatif bir değerlendirme yapılmış
olur.
 Hemoglobin Elektroforezi

Anormal hemoglobinin elektriksel yükü normal hemoglobinin elektriksel yükünden

farklı ise, anormal hemoglobinler elektroforez yöntemi ile saptanabilir. Hemoglobinin
yapısında yer alan aminoasit dizilişindeki değişiklik, hemoglobinin total yükünde de bir
değişikliğe neden oluyorsa, bu anormal hemoglobin elektroforez ile normal hemoglobinden
ayırt edilir.
pH 8.6’da anoda doğru en hızlı HbA göçer, HbF onu takip eder, fakat HbA2 uygulama
noktasından çok uzaklaşmaz. Hemoglobinler negatif yüklüdürler ve elektroforezde anoda
(pozitif elektrot) doğru göç ederler. Alkali pH’da elektroforez sırasında HbS anoda doğru
HbA’ya göre daha yavaş göç eder. Çünkü HbS de negatif yüklü glutamat kalıntıları yoktur ve
HbA’ya göre daha az negatif yüklüdür. Parçalanmış eritrositlerden elde edilen hemoglobin
elektroforezi orak hücre hastalığının tanısında rutin olarak kullanılır.

Sağlıklı kişilerin elektroforez sonucunda HbA1 ve HbA2 bantları görülmektedir.

Patolojik olgularda bantların dağılımı değişmekte ve normalde görülmeyen diğer fraksiyonlar
saptanmaktadır. Örneğin β talesemide HbA1 ve HbA2 ile birlikte HbF bantları da
görülmektedir.
Sağlıklı kişinin elektroforez sonucu
Hemoglobinlerin selüloz asetat elektroforezi ile ayırımı:

Prensip: pH=8,6’da hemoglobinler negatif yüklüdür ve anoda doğru hareket ederler.

Hemoglobinler molekül başına düşen yük açısından farklılık gösterirler. Örneğin; HbA ile
karşılaştığında HbS ve HbC daha fazla pozitif yük vardır. Buna göre, HbS ve HbC’nin anoda
doğru göçü, HbA’ya göre taşıdıkları yük ile orantılı olarak daha yavaş olur.

Ayıraç: -Tampon çözelti (Tris-Edta- Borat) pH=8,6

-Boya (Ponceau S, 100 ml %5 sulu asetik asit)
-Yıkama çözeltisi (300ml %5 sulu asetik asit)

HEMOGLOBİN ELEKTROFOREZİ AŞAMALARI

Selüloz Asetat Kağıdı Hazırlanması:
a) 1X TBE Buffer içerisine batırılan selüloz asetat kağıdı, agitation platformu (mekanik
sallayıcı) üzerinde 10 dk sallandırılır.
b) Fazla bufferı atmak için, platformdan alınan selüloz asetat kağıdının 2 tarafı da, filtre
kağıdı ya da havlu kağıt kullanılarak kurutulur.

Elektroforez Tankı Hazırlanması:

a) Elektoroforez tankının ok ile belirtilen çukur kısımlarına eşit seviyede 1X TBE buffer
doldurulur.
b) Selüloz asetat kağıdı, elektroforez tankının tümsek kısmına yerleştirilir. Tümsek kısmına
sığmayan kağıdın üst ve alt kısımları kıvrılarak, çukur kısımlardaki TBE buffer ile temas
etmesi sallanır.
1) 1 ünite (önerilen 5 mikrolitre) tam kan örneğine, 3 ünite (önerilen 15 mikrolitre) hemolizat
çözeltisiyle eklenir.
2) Toplam 20 mikrolitrelik çözelti, iyice vortekslenir ve 5 dakika oda sıcaklığında bekletilir.
3) Her örnekten yaklaşık 3 mikrolitre alınıp, 1 mikrolitre yükleme tamponuyla pipetlenir.
Aralarında 1 cm boşluk bırakılarak selüloz asetat kağıdının üstüne bırakılır.
4) Örnekler 200 Voltta, 30-90 dk (optimize edilmelidir) elektroforeze tabi tutulur. Bu sırada
Ponceau S boyama solüsyonu hazırlanabilir.

Ponceau S Boyama Solüsyonu Hazırlanması:

a) Aşağıdaki sırayla kimyasallar eklenerek Ponceau S solüsyonu hazırlanır ve homojen renk
elde edilene kadar karıştırılır:
-10 mL ultra saf su
- 0.3 mL %100 (glacial) asetik asit - puarlı pipet sistemiyle eklenmelidir
- 0.035 g Ponceau S boyası
- 20 mL ultra saf su

5) Elektroforezden alınan selüloz asetat kağıdı, Ponceau S boyama solüsyonuna batırılır ve 5

dakika bekletilir.
6) Ponceau S boyama solüsyonundan alınan selüloz asetat kağıdı, %5’lik asetik asit
solüsyonuna batırılır ve 5 dakika bekletilir.
7) %5’lik asetik asit solüsyonundan alınan selüloz asetat kağıdı, yeni bir %5’lik asetik asit
solüsyonuna batırılır ve 5 dakika daha bekletilir.
8) %5’lik asetik asit solüsyonundan alınan selüloz asetat kağıdı, saf suya batırılır ve 5 dakika
daha bekletilir.
9) Selüloz asetat kağıdı, yeni bir saf suya batırılır ve 5 dakika daha bekletilir.
10) Cam bir tabakaya yerleştirilen selüloz asetat kağıdı, fırında 10 dakika 80 °C’de bekletilir.
11) Tarayıcı ya da densitometre özelliği bulunan bir yazılım kullanılarak elde edilen bantlar
kantifiye edilir.