EMBRİYO TRANSFERİ

Doç. Dr. Saadet BELHAN

Ovumun spermle döllenmesiyle oluşan 7 günlük
canlıya embriyo denir.

Embriyo bir yavrunun ilk halidir.

Daha önceki dönemde "Zigot",
daha sonraki dönemde "Fetus" adını alır.
(Sığırlarda gebeliğin 42. gününden sonra "Fetus"
olarak adlandırılır.)
Embriyo transferi; Seksüel olgunluğa ulaşmış verici
(donor) dişi hayvanlarda, eksojen hormon
enjeksiyonlarıyla oluşturulan süperovulasyon
sonucu, in vivo olarak fertilizasyonları sağlanan
ovumların, uterusa implante olmadan, donorlardan
alınarak, doğuma dek yaşamlarını sürdürecekleri
önceden senkronize edilmiş aynı türden taşıyıcı
(resipient) hayvanların uterusuna nakledilmesi
olarak tanımlanır.
Yavru kalıtsal karakterlerini çiftleştirilen boğa
ile donor olarak tanımlanan hayvandan alacak
ve taşıyıcı hayvanın yavruya doğrudan hiçbir
genetik etkisi olmayacaktır.
Embriyo Transferinin Mantığı;

*Ovaryumlarda bulunan OOSİT potansiyelinden

mümkün olabildiğince fazla yararlanmak,

*Birim zamanda daha çok yavru almak,

*Üstün verim kabiliyetindeki hayvanların sürü

içerisindeki sayısını artırmak.
Embriyo Transferinin Yararları:

1- Bir inekten yılda sadece bir buzağı elde edilir ve

normal şartlarda fertil yaşamı boyunca yaklaşık olarak 5-
6 yavru alınabilmektedir. Embriyo transferiyle, yılda 8-20
buzağı elde etme şansı vardır. Böylece üstün yetenekli
ineklerden daha çok yavru elde etmek mümkündür.

2- İyi bir boğa ile genetiğin yarısı kontrol edilebilirken

embriyo transferi vasıtasıyla % 100`ünü kontrol
etmek mümkün olabilmektedir. Dolayısı ile kısa
sürede genetik kapasitesi yüksek bir sürü oluşturmak
ve yoğun bir genetik ilerleme sağlamak olasıdır.
3- Embriyo transferi IRK ıslahının en kestirme, en çabuk , en
güvenilir yoludur.

4-Canlı hayvan ithalatıyla ortaya çıkabilecek pek çok

olumsuzluk giderilmiş olur. Bir sıvı azot tankı içerisinde
yüzlerce embriyoyu daha ucuz ve daha kolay bir şekilde
ithal ya da ihraç etmek mümkündür.

5-Kimse en iyi damızlık ineğini başkasına satmaz. Ancak

onların embriyolarını satın almak mümkündür.

6-Gerektiğinde yavruların cinsiyetlerinin kontrolü.

İsteğe göre erkek ya da dişi buzağı elde edilebilir.
7-Kültür ırklarında fazlaca görülen hastalıklara karşı
duyarlık taşıyıcı annenin maternal antikorları
vasıtasıyla giderilmiş olur.

8-Verim yönü istenilen şekilde değiştirilebilmekte

sütçü bir ırktan etçi bir ırk eldesi yada tersi mümkün
olabilmektedir.
9-Hastalık ve yaşlılık gibi çeşitli nedenlerden dolayı
döl veriminde aksama olmuş olan üstün nitelikli
ineklerden embriyo transferi yoluyla yavru elde
etmek mümkündür.
10-Bazı infertil hayvanlardan yavru elde edilebilmesi,

8- Araştırma amacıyla bir örnek yavruların elde

edilmesi,
Embriyo Transferinin Dezavantajları

1-Pahalıdır.
(Donör ve Boğa’nın kalitesine, erkek ve dişi garantisine bağlı
olarak fiyatları 300 –1000 $ civarındadır)

2-Dondurulmuş embriyo nakillerinde başarı düzeyindeki

düşüklük bu işin cazibesini azaltmaktadır.

3-Herkes yapamaz. Kurs görmüş , deneyimli kişilerin

yapabileceği bir iştir.
4-Süperovulasyon uygulamasına cevabın hayvanlara
göre geniş bir varyasyon göstermesi önemli bir sorundur.

Bazı ineklerde süperovulasyon meydana gelmeyeceği

gibi bazılarında ise bir defada 15-20 den fazla ovum
üretilebilmektedir.

Aynı ineğin farklı zamanlarda süperovulasyona vereceği

cevap ta farklı olabilmektedir.

Taze embriyo naklinde bütün bunlar bir donor için kaç

adet taşıyıcı hayvanın senkronize edilmesi gerektiği
teşhisini zorlaştırmaktadır.
5-Donor hayvanlara uygulanan hormonlar nedeniyle
östrojen-progesteron düzeylerinde artış olmakta bu
da uterus ortamını ve gametlerin normal
transportunu bozmaktadır. Böylece ovum
olgunlaşması ve fertilizasyon kabiliyeti etkilenmekte
sonuç olarak elde edilen embriyolarda gözle görülür
oranlarda anomaliler oluşmaktadır.
EMBRİYO TRANSFERİNİN AŞAMALARI
1-Verici ve taşıyıcıların seçimi.
2-Verici ve taşıyıcıların seksüel sikluslarının
senkronizasyonu.
3- Vericinin hormon yardımıyla süperovulasyonu.
4-Vericinin tohumlanması.
5-Vasat ve benzeri materyalin hazırlanması.
6-Vericilerden embriyoların toplanması.
7-Embriyoların değerlendirilmesi.
8-Embriyoların kısa ve uzun süreli saklanması.
9-Embriyoların taşıyıcı hayvanlara nakledilmesi.
1-Vericilerin (donör) seçimi

Genel sağlık durumunun iyi olması,

Problemsiz reprodüktif hayata sahip olmaları,
En az iki kez düzenli östrus göstermeleri,
Bir ya da iki tohumlamada gebe kalan,
Bulaşıcı hastalıklardan ari olmaları,
Verim özelliği üstün olan,
Yaşı 3–6 arasında bulunan,
Her yıl düzenli ve normal doğum yapan,
Geçmiş dönemlerinde güç doğum ve Retensio
secundinarium rastlantısı olmayan,
1-Taşıyıcıların seçimi
Genel sağlık durumunun iyi olması,
Problemsiz reprodüktif hayata sahip olmaları,
En az iki kez düzenli östrus göstermeleri,
Bir ya da iki tohumlamada gebe kalan,
Bulaşıcı hastalıklardan ari olmaları,
Verim özelliği üstün olan,
Yaşı 3–6 arasında bulunan,
Her yıl düzenli ve normal doğum yapan,
Geçmiş dönemlerinde güç doğum ve Retensio secundinarium
rastlantısı olmayan,
*Gebe kalma açısından herhangi bir sorununun bulunmaması,
*Doğuma kadar gebeliği devam ettirebilecek vücut kondüsyonuna
sahip olması,
2-Verici ve taşıyıcıların seksüel sikluslarının senkronizasyonu

11 gün ara ile yapılan PGF2 ile düzenlenir.

Aradaki (Verici Alıcı) farkın maksimum 24 saat olması istenir.

Donörler süperovulasyonda kullanılan hormonların

etkisinde olduklarından PGF2 enjeksiyonlarına
taşıyıcılardan daha erken cevap verirler. Bu farklılığın
ortadan kaldırılması amacıyla donörlere PGF2
enjeksiyonu 12-18 saat daha geç yapılmalıdır.
Alıcı ve vericiler arasındaki ±12 saatlik farklılıklar normal
olarak kabul edilirken, ±24 saatten fazla olan farklılıklar
gebelik oranlarının azalmasına sebep olmaktadır.
3- Vericinin hormon yardımıyla süperovulasyonu

Süperovulasyon amacıyla en yaygın ve pratik olarak

PMSG ve FSH kullanılmaktadır. Kızgınlığın 9-14.
günleri arasında herhangi bir günde (en uygun 10.
gün) bir kez PMSG veya 3-4 gün süreyle ikişer kez,
FSH uygulaması yapılır.
Arkasından var olan korpus luteumun (CL)
regresyonu ve ovulasyonun sağlanması amacıyla
PGf2 enjeksiyonu yapılır. Enjeksiyonu takip eden
36-72. saatlerde kızgınlık gösteren hayvan
tohumlanır ve tohumlamayı takip eden 7. günde
uterus yıkaması (flushing) yapılır.
 Üstün verimli inekte hormon
enjeksiyonlarıyla süperovulasyon
gerçekleştirilir
Türlerin süperovulasyon uygulamalarına cevapları
oldukça farklıdır. Örneğin atların bahsi geçen hormon
uygulamasına cevabı oldukça düşüktür. Buna rağmen
inekler iyi sayılacak oranda bir cevap geliştirirler.
Hayvanların süperovulasyona verecekleri cevap; ırka,
yaşa, genel kondisyona, hormon tipine, uygulama
şekline, iklime, beslenmeye ve çevresel koşullara az
yada çok bağlıdır.
Genel olarak sütçü ineklerin süperovulasyon
uygulamalarına cevabı etçilerden daha düşüktür.
10 yaşından sonra ineklerde süperovulasyona verilen
cevap düşmektedir. Bu yüzden siklik geçmişi bilinen
düveler çoğu zaman tercih edilir durumdadır.
Genel olarak sütçü ineklerin süperovulasyon
uygulamalarına cevabı etçilerden daha düşüktür.
10 yaşından sonra ineklerde süperovulasyona verilen
cevap düşmektedir. Bu yüzden siklik geçmişi bilinen
düveler çoğu zaman tercih edilir durumdadır.
Genellikle ineklerin süperovulasyonunda iki
hormon kullanılır.

Bunlar FSH veya PMSG`dir.

Daha az olarak da hMG kullanılmaktadır.

PMSG’nin kullanım avantajları,
Gebe kısrakların serumundan elde edilen
plasental bir gonadotropindir.

Biyolojik yarılanma ömrünün uzun olması

nedeniyle tek doz yeterlidir. Bu sebeple
ekonomiktir.

FSH’dan daha ucuz ve kolay temin edilebilir ,

PMSG’nin Dezavantajları;

*Elde edilen embriyo sayısında ve kalitesinde geniş

bir varyasyon olmaktadır,

*Verici hayvanda antikor şekillenmesine ve ovaryum

kistlerinin oluşmasına neden olur

Bahsedilen sebeplerden dolayı FSH daha yaygın

kullanım alanı bulmaktadır.
FSH
At, koyun ve domuzdan elde edilen bir hipofiz
gonadotropinidir.

Biyolojik yarılanma ömrünün kısa olması sebebiyle

günde sabah-akşam iki enjeksiyon tarzında
uygulanır.

En büyük avantajı daha etkili ve güvenilir olması

ve tekrarlanan uygulamalarda vücutta antikor
oluşumuna neden olmamasıdır.
FSH uygulamalarının başlangıcı olarak östrus
siklusunun 9-14. günleri en uygun zamandır.
Çalışmalarda 6. siklus gününe değin çok erken
olduğu, 9 ve 14. günler arasında toplanan embriyo
sayı ve kalitesi bakımından bir fark olmadığı ortaya
konulmuştur. Bu günlerde hormonun etkili olmasının
nedeni hem olgun bir korpus luteum varlığı ve hem
de folliküler dalgalanmanın süperovulasyon için en
uygun olduğu zaman olmasıdır.
Süperovulator hormonlarla birlikte kullanılan diğer
hormonlar

hCG: Süperovulasyon uygulanan ineklerde

ovulasyonlar 24–48 saat hatta daha geniş bir zaman
dilimine yayılmakta ve ovumların fertilizasyonu
açısından sorun oluşturmaktadır. Bu sorunu ortadan
kaldırmak amacıyla östrusun başlangıcında 2500–
5000 İÜ hCG i.v. uygulanabilir (Pregnyl, Chorulon).
Östradiol–17: Süperovulasyon tedavisi uygulanan
ineklerde çoğu zaman östrus hiç gözlenmemekte ya
da zayıf gözlenmektedir. Bu nedenle 10 mg
östradiol–17 beklenen östrus gününde ya da bir
gün önce hayvana verilebilir (Progynon Depot, ECP,
Östrin).

Anti-PMSG: PMSG’nin yarılanma ömrü bir hafta

kadardır. Etkinliğinin ovulasyonlardan sonra devam
etmesi embriyoların kalitesini olumsuz yönde
etkilemektedir. Bu nedenle östrusun başlangıcından
sonraki 18–24. saatler arasında PMSG’nin etkisini
ortadan kaldırmak için hayvanlara Anti-PMSG
uygulanabilir (Neutra-PMSG).
Siklus ve Hormon HORMONLAR
Uygulama Günleri
FSH PMSG PMSG +Anti PMSG

0. gün
10. gün (sabah) 5 mg
10. gün (akşam) 5 mg 2500 IU 2500 IU
11. gün (sabah) 5 mg
11. gün (akşam) 5 mg
12. gün (sabah) 5 mg
12. gün (akşam) 5 mg
13. gün (sabah) 5 mg + PGF2α PGF2α PGF2α
13. gün (akşam) 5 mg
15. gün (sabah) Suni Tohumlama Suni Tohumlama Suni Tohumlama
15. gün (akşam) Suni Tohumlama + hCG Suni Tohumlama + hCG Suni Tohumlama + Anti
PMSG
16. gün (öğle) Suni Tohumlama Suni Tohumlama Suni Tohumlama
22. gün Uterus Yıkaması Uterus Yıkaması Uterus Yıkaması
4- Vericinin Tohumlanması
Süperovulasyon uygulamasında gelişen folliküllerin
çok sayıda olması ve ovumların farklı zaman
dilimlerinde ovule olmasından dolayı, tohumlamaların
normale göre daha sık aralıklarla yapılması gerekir.
Üstün genetik özellikteki boğadan alınan sperma ile 2. PGF2
enjeksiyonundan 48-60 saat sonra ya da kızgınlıklar izlendikten sonra 12
saat aralıkla 3–4 kez tohumlama yapılır.
5-Vasat ve benzeri materyalin hazırlanması.
6-Vericilerden embriyoların toplanması
İnek embriyoları uterusa genelde östrus 0. gün kabul
edildiğinde 4-5.5 gün civarında iner ve 8.5-9 gün
civarında zonadan kurtulurlar. Dolayısı ile 5-9 günler
arasında uterus yıkaması ile embriyolar toplanabilir.
Cerrahi olmayan yöntemle embriyo transferinde
embriyolar, ilk tohumlamadan sonraki 7. günde
toplanır.
Embriyolar uterustan, östrus siklusunun 5 ile 9.
günleri arasında her hangi bir günde yıkamayla
toplanabilirler ancak, 7. günde toplanan embriyoların
gelişim aşamaları (Kompakt morula- Erken Blastosist)
hem embriyo dondurma işlemine hem de taze
embriyo transferi işlemlerine karşı çok daha dayanıklı
oldukları için 7. gün tercih edilir.

Embriyolar hem cerrahi ve hem de cerrahi olmayan

yöntemlerle toplanabilirse de son yıllarda cerrahi
yöntem terk edilmiş durumdadır.
Flush işlemine başlanmadan önce rektum boşaltılarak
perineal bölgenin dezenfeksiyonu sağlanır. Epidural
anestezi yapılır. Bu amaçla %2 lidokain hidroklorür, 5-
6 ml üst epidural boşluğa verilir. Uterus irrigasyonu
amacıyla kullanılacak olan solusyon uterustan bir
metre yukarı sabitlenerek yıkamanın yerçekimi
yardımıyla yapılması sağlanır. Balon kateter vajinadan
sokulur serviks geçilerek bifurkasyon bölgesinden
yaklaşık 5-7 cm ileride balon şişirilir (10-25 ml hava
ile).
Uterus irrigasyonu amacıyla son yıllarda daha
çok Laktatlı ringer ayrıca Dulbeko’nun modifiye
tampon çözeltisi kullanılmaktadır. Önceleri
kullanılan TCM-199 ise çabuk pH değişimlerine
uğradığından tercih edilmemektedir. Laktatlı
ringer solusyonunun bir avantajı embriyonun
toplanmasından sonra bahsedilen solusyon
içerisinde gelişim göstermemesidir.
 KORNU UTERİYE
FOLEY KATETERİNİN
YERLEŞTİRİLMESİ
Verilecek havanın miktarı hayvanın cüssesine ve
kornuların büyüklüğüne bağlı olmaktadır. Gereğinden
fazla hava verildiğinde kornularda hasarlanmalar
oluşabilir. İlk defada kornulara az hacimde sıvı verilir
arkasından her defasında kornuların alabileceği
miktarda sıvı verilerek ve her kornu yaklaşık 250-500
ml sıvı ile yıkanabilecek tarzda işlem sürdürülür. İşlemi
gerçekleştiren şahıs devamlı olarak eli ile uterusu
kontrol altında tutmalı gereğinden fazla sıvı
verilmesini engellemelidir. ikinci kornu uteri
irrigasyonu amacıyla yeni bir kateter kullanılmalıdır.
Özel solusyonlarla uterustan embriyolar
toplanır ve değerlendirilir.
Yıkama sonrasında yıkama yapılan ineğe, uterus içi
antibiyotik ve PGF2α enjeksiyonu uygulanır. Böylece
hem uterusun kontamine ve enfekte olması, hem de
uterusta kalabilecek embriyo ya da embriyolardan
kaynaklanabilecek gebelikler önlenmiş olur.
Toplanan yıkantı 70 mikron genişliğinde gözenekleri
olan filtreler yardımı ile süzülerek, alt kısımları
karelere bölünmüş olan petrilerde, stereo mikroskop
altında ve 10-15X büyütmede arama işlemi yapılır.
Bulunan embriyolar başka bir küçük petriye konulmuş
olan PBS solusyonuna aktarılır.
Filtrasyon işlemi
 7-EMBRİYOLARIN-DEĞERLENDİRİLMELERİ

Embriyo değerlendirmesi, gelişim durumlarına göre

ve kalitelerine göre yapılır. Kalitelerine göre
embriyolar, mükemmel, iyi, vasat ve zayıf olarak
değerlendirilir ayrıca fertilize olmamış ve dejenere
olmuş embriyolar da tespit edilir.
7. EMBRİYOLARIN DEĞERLENDİRİLMELERİ
Taze nakil ve senkronizasyon kullanılıyor ise donor –
taşıyıcı arasındaki senkronizasyon farkının 24 saatten
fazla olmamasına özen gösterilir. Dondurup
çözündürülmüş embriyoda bu sürenin 12 saati
geçmemesi yerinde olur. Nakilde alt epidural
anesteziden sonra korpus luteum bulunan taraftaki
kornuya zarar vermeden ve mümkün olduğunca uç
kısma embriyo bırakılır.
8-EMBRİYOLARIN KISA SÜRELİ SAKLANMASI

**Embriyoların kısa süreli muhafazası;

37oC’de 24-48 saat kültüre edilmesi veya
+4oC’de buzdolabında 5 güne kadar tutulması şeklinde
yapılabilir.
8-EMBRİYOLARIN DONDURULMASI
Donörlerin süperovulasyona verecekleri cevap
kestirilemediğinden bir donor için kaç adet taşıyıcı
senkronize edilmesi gerektiği tam olarak
bilinememekte, bu yüzden gereksiz hormon
uygulamaları ve embriyo kayıpları söz konusu
olabilmektedir. Bu gibi olumsuzluklar embriyoların
dondurulmaları ile giderilebilmektedir. Ayrıca canlı
hayvan nakliyle yaşanabilecek sorunlar embriyo
dondurulması yapılarak aşılmaktadır.
 EMBRİYOLARIN DONDURULMASI

Dondurulmaya uygun embriyolar, özel solusyonlarla muamele edilip

–196oC’deki sıvı azot içerisinde yıllarca saklanabilirler
Embriyo dondurulmasında en önemli nokta hücre içi su
dinamiğinin kontrolüdür. Zira hücre içerisinde gelişecek
olan buz kristalleri embriyo için öldürücü olmaktadır.
Embriyonun dondurulması esnasında buz kristallerinin
oluşumuna engel olmak için embriyo dehidratasyona
uğratılır ve bir kısım kriyoprotektanın hücre içine girmesi
temin edilir.

Genel olarak optimum soğutma hızı 0.1–1.0oC/dk’dır.

Bu tarzda -30oC’ye dek soğutulmuş olan embriyo bu
aşamadan sonra direkt olarak -196oC’deki sıvı azot
içerisine bırakılır.
Embriyo dondurulması amacıyla permeabl olan küçük
molekül ağırlıklı maddeler (Dimetil sülfoksit, Gliserol,
Etilen glikol...) ve permeabl olmayan nisbeten büyük
molekül ağırlıklı maddeler (Sakkaroz, Laktoz, Polivinil
pirolidon...) kriyoprotektan olarak kullanılırlar.
Morula, kompakt morula, erken blastosist ve
blastosist aşamaları dondurulmaya en uygun gelişme
safhaları olarak kabul edilmektedir.

Embriyo toplama ve dondurulmanın başlaması

arasında geçen sürenin sekiz saati aşmaması gerekir.
9-Embriyoların taşıyıcı annelere transferi

İlk olarak 7 gün önce östrus gösterdiği tespit edilmiş

ineklerin rektal muayeneleri yapılarak, corpus
luteumları dikkatlice incelenir.

Uygun corpus luteumu bulunmayan ya da üreme

kanalında herhangi bir sorun bulunan ineklere
transfer yapılmaz.

Transferler, corpus luteumun bulunduğu taraftaki

kornuya verilmelidir.
EMBRİYOLARIN TAŞIYICI ANNEYE TRANSFERİ
Taze transferlerde payet içerisine ilk olarak 5-6 cm’ye
kadar solüsyon çekilir. Bu kısımda yaklaşık 0,5 cm hava
boşluğu bırakıldıktan sonra, içerisinde embriyo
bulunan solüsyon çekilir. İkinci hava boşluğu da
bırakıldıktan sonra, payet solüsyon ile doldurulur.
Ticari olarak satılan dondurulmuş embriyolar, sahada
kolaylıkla uygulama yapılması için, direkt transfer
edilecek tarzda payetler içerisinde dondurulmuştur.
Bu dondurulmuş payetler, 37 °C ve 30 sn çözdürme
sonrası embriyo transferi için özel olarak tasarlanmış
embriyo transfer kataterine yerleştirilir.
Kateter hazırlandıktan sonra üzerine naylon kılıf
takılarak vajina yoluyla serviks geçilir. Serviksin
geçilmesinden sonra, ilk olarak katatere takılan naylon
kılıf yırtılarak çıkarılır ve kataterin ucunun korpus
luteumun bulunduğu taraftaki kornu lumenine,
travmaya neden olmadan nazik bir biçimde sokulması
gerekir. Uygun pozisyon alan kataterin stilesi itilerek
embriyonun lumene geçmesi sağlanır ve katater
dikkatli bir biçimde dışarıya çıkarılır. Böylece embriyo
transfer işlemi gerçekleştirilmiş olur.
İlk başarılı embriyo dondurma çalışması 1972 yılında
Wittingham ve arkadaşları tarafından fare embriyoları
üzerinde olmuştur.

1973 yılında Willmut ve Dowson sığır embriyolarını

başarılı bir şekilde dondurmuşlardır.

Ege Vet 1990 yılında Türkiye’de ilk defa Embriyo

Transferi uygulamıştır.
ÜLKEMİZDE YAPILAN EMBRİYO TRANSFERİ ÇALIŞMALARI

1981 yılında TAVŞANLARDA (Kılıçoğlu ve Tekeli)

1983 yılında FARELERDE (Ünal)
1984 yılında KOYUNLARDA (Kılıçoğlu ve ark.)
1986 yılında İNEKLERDE cerrahi olmayan yöntemle (İleri ve
Sayın)
1989 yılında ineklere dondurulmuş embriyo transferi (Sungur
ve ark.)
1997 yılında ANKARA KEÇİLERİNDE (Kılıçarslan ve Şenünver)
1997 yılında KISRAKLARDA (Ekici, 1997* )