“Софийски Университет “Св.

Климент Охридски”
Катедра “Обща и Промишлена Микробиология”

Учебна тетрадка за практически занятия

по МИКРОБИОЛОГИЯ
за специалност “ФАРМАЦИЯ ”
за учебната 2015/2016гoдина,
към катедра “ОБЩА и ПРОМИШЛЕНА
МИКРОБИОЛОГИЯ”

Водещ курса: доц. д-р Петя Христова

Упражнения на ..................................................
Фак. № ...................................................

1
 УПРАЖНЕНИЕ № 1
---------------------------------------
Микробиологична лаборатория – устройство, правила за работа с
микроорганизмите, техника на безопасност, принцип на стерилност в
микробиологията.
Стерилизация и дезинфекция. Видове стерилизация, подготовка и
стерилизация на пособия и стъклария при работа с микроорганизми.

Хранителни среди за култивиране на бактерии. Принципи за съставяне,

видове, стерилизация, техника на приготвяне и разливане.

Микробиологична лаборатория – устройство, правила за работа с

микроорганизмите, техника на безопасност, принцип на стерилност в
микробиологията.

1. Устройство на микробиологичните лаборатории

А) Според характера на извършваната работа – общи и специализирани
В) Според изучаваната група микроорганизми– бактериологични, микологични,
вирусологични
С) Според предназначението – диагностични, научно-изследователски, учебни,
производствени.
Устройството и обзавеждането на лабораториите се определя от техните задачи и
функции. Общи изисквания за микробиологичните лаборатории е да бъдат
просторни помещения, с водопроводна, електреческа и газова инсталация, като
повърхностите (подове, работни плотове) са изработени от гладки, миещи се,
огнеопорни и подлежащи на дезинфекция материали.
2. Видове помещения в микробиологичната лаборатория:
А) Основно помещение – извършва се непосредствена работа с
микроорганизмите. Помещението е оборудвано с работни места и плотове,
апаратура, стъклария и реактиви.
В) Препараториум – включва автоклави, сушилни шкафове, миални машини
С) Допълнителни помещения – термостатни за култивиране на микроорганизми
при определена температура.
3. Правила за работа с микроорганизми
Основни правила:
 В лабораторията се пребивава и работи задължително с работно облекло.
При нужда се използват предпазни средства: шапка, маска, ръкавици.
 Личните вещи се поставят на определено място далече от работното място
(желателно е в отделно помещение). На работното място може да се сложи
само лабораторния дневник.
 Забранено е да се внасят и консумират в лабораторията храна и напитки, да
се пие вода и да се пуши.
 Забранено е да се пипат предмети, прибори и пособия, чието предназначение
не е точно известно и които нямат отношение към непосредствено отношение
към работата.
 Необходимите за практическата работа материали и микробни култури се
получават от преподавателя или специалиста, подготвящ упражненията.
Посетите култури се поставят за инкубиране на определените места.
2
  Предметите и пособията, влезли в допир с микробните култури се
обезаразяват на пламъка на спиртната лампа или се поставят в съд с
дезинфекционен разтвор.
 След приключване на работата работното място се почиства, дезинфекцира и
подрежда.
 Ръцете се измиват с топла вода и сапун при влизане и преди напускане на
лабораторията. При наличие на дезинфекционни препарати се извършва
обеззаразяване на ръцете. Работното облекло се съблича и се прибира в
самостоятелен плик. Работното облекло се пере и дезинфекцира
самостоятелно от останалите дрехи.
4. Основни правила и хигиенни принципи в микробиологичната лаборатория
В микробиологичната лабораторя се поддържа изрядна хигиена, която се постига
чрез дезинфекция на повърхностите (подове, работни плотове) и стерилизация на
пособията използвани за работа с микроорганизми (бактериологично йозе, игла,
пинсети, предметни стъкла, петрита, пипети, епруветки).
4.1. Определения за стерилизация и дезинфекция
4.1.1.Стерилизация – процес, при който всички живи микроорганизми, включително
и вируси, се унищожават. Даден предмет или хранителна среда са стерилни, само
тогава когато са абсолютно свободени от всякакви живи микроорганизми.
4.1.2.Дезинфекция – процес, при който вегетативните и неспорообразуващи
микроорганизми се унищожават. Агентите, които водят до дезифекция, се наричат
дезинфектанти.
4.1.3.Принцип на стерилност – основен принцип в микробиологичната техника.
Всяка микробиологична работа се извършва с материали и пособия предварително
освободени от микроорганизми.
4.2. Правила за работа с микробни култури – микроорганизмите се култивират в
течни или твърди среди, които са предварително разляти в разнообразни по форма
лабораторни съдове. В съответствие с основия принцип на стерилността в работата
с микробна култура има следните шест задължителни етапа:
 Всички манипулации в микробиологичната работа се извършват в седнало
положение, с устойчиво облегнати на плота предлакти.
 Стерилна зона около пламъка на спиртната лампа – това е сферична зона с
радиус приблизително равен на височината на пламъка. Най-висока е
температурата в средната част на пламъка
 Правила за отваряне на епруветките и петрита
 Правила за обработка на йозето преди и след работа с бактерии

Схема на работа с микробна култура

3
 Йозето се нагрява Културата се Отстранява се тапата и
докато почервенее разбърква гърлото се обгаря

Взимане на Обгаряне на гърлото, Затваряне на

микробен материал след взимане на епруветката
материал

4.3. Лабораторен дневник

Воденето на лабораторен дневник е задължителен елемент в микробиологичната
практика. В него се записват всички сведения за извършените анализи, използвани
хранителни среди и методи на култивиране, както и получените резултати. Този
дневник е задължителен елемент, както в референтните микробиологични
лаборатории, така и в научно-изследователските. При акредитации на лаборатории,
той е първия документ, който се представя на комисията.
При изготвяне на записките се спазва следния ред:
 Наименование на опита, дати на неговото започване и приключване
 Задача и обект на изследването
 Основен метод на анализа
 Условия за провеждане на опита
 Получени резултати
 Изводи
Получените резултати се записват подробно, описанията може да са съпроводени с
рисунки или снимки. Цифровият материал се подрежда в таблици или графики
според анализите.

4
Стерилизация и дезинфекция. Видове стерилизация, подготовка и
стерилизация на пособия и стъклария при работа с
микроорганизми.
Основният принцип на стерилността в микробиологичната работа изисква всички
форми на живот да бъдат унищожени. Това се постига с предварително
стерилизиране на всички видове стъклария (епруветки, колби, петриеви блюда,
пипети, шпатули, бехерови чаши, цилиндри, фунии) и инструменти (йозета, игли,
скалпели, пинсети, ножици, тапопробивач).
1. Подготовка на лабораторните пособия
Стъклените лабораторни съдове и инструменти не се стерилизират директно, а се
подготвя чрез следните задължителни етапи:
 Измиване – премахване на остатъците от предишни среди и култури
 Изсушаване – елиминиране на водното съдържание
 Опаковане в хартия – за запазване на стерилността
 Стерилизация – избира се подходящ режим
Незпазването на последователността на етапите води до получаване на
нестерилни пособия!

2. Видове стерилизация
2.1.Термична стерилизация
а) накаляване в пламъка на спиртната лампа (краткотрайно) – за малки и бързо
нагряващи се стъклени или метални инструменти (шпатули, йозета, игли, пинсети,
скалпели, гърла на колби, памучни тапи);резултат: временно отстраняване на
вегетативните и спорови форми по повърхността на инструментите. Прилага се само
при непосредствена работа с микроорганизми (посяване, пресяване, разреждане).
б) стерилизация с горещ въздух (суха стерилизация) – с най-голяма
ефективност, извършва се в стерилизатори; прилага се само за стъклария
(предварително затворена с памучни тапи) и метални предмети (предварително
опаковани); резултат: убиват се вегетативните и споровите форми;
стерилизираните пособия могат да се съхраняват в сухи шкафове за продължително
време.
Техника и режим на стерилизация:

Температура [C] Време [min]

150 120-180
160 60-120
170* 20-60
200 10-20
Над 170C целулозата се възпламенява!
Стерилизацията се счита за завършена, когато след протичане на избрания режим
температурата на апарата спадне до 70 оС. Отварянето на апарата по-рано води до
спукване на стъклените съдове и нарушаване на стерилността.
в) стерилизация с водна пара под налягане – реализира се в автоклав; прилага се
за стерилизация на гумени, метални, пластмасови и комбинирани изделия, филтри,
маркучи. Резултат: убиват се както вегетативните, така и споровите форми. Техника
и правила за автоклавиране. Използва се както за подготовка на стерилни
лабораторни пособия, така и за деконтаминиране на микробиологичния материал.
Автоклавирането се прилага и за стерилизация на хранителните среди, които се
използват за култивиране на микроорганизмите.

5
Основни режими на автоклавиране:

Нaлягане tC Време [мин] Обект на стерилизация

[атм.]

0.8 115 20-30 Гумени, метални, пластмасови и комбинирани изделия;

бактериални филтри
1.5 128 30-60 Деконтаминиране на използвана стъклария
2.0 134 30-60 Унищожаване на инфекциозни (заразни) биологичин
2.5 138 30-60 материали

2.2. Студена стерилизация

а) химична- обработка на лабораторните съдове с различни химични вещества
(70% етанол, етер, хлороформ, формалдехид, толуол, метил-бромид, етиленов или
пропиленов окис);
б) облъчване с УВ-лъчи, -лъчи, ултразвук – стерилизация на пластмасови изделия
(петрита, пипети, центрофужни епруветки). Всеки производител подбира режим на
стерилизация според състава на използваната пластмаса. Стерилизираните чрез
облъчване пособия се опаковат и така се съхраняват. Фирмите предлагат две нива
на стерилизация на пластмасовите пособия – по-ниско (асептични) и по-високо
(стерилно). Асептичните петрита и пипети се използват за учебни цели, докато
стерилните (с много по-висока цена) за научно-изследователски цели и за работа с
чисти култури или патогени.

3. Дезинфекция
Микроорганизмите изпитват непрекъснато въздействието на различни фактори
на заобикалящата ги среда като: топлина, влага и изсушаване, светлина,
хидростатично налягане, рН на средата, тежки метали, ултразвук и йонизиращи
лъчи. В зависимост от крайния ефект на въздействието се различават два основни
вида фактори с:
БАКТЕРИОСТАТИЧНО ДЕЙСТВИЕ – когато се задържа размножаването на
микроорганизмите и при отстраняване на външното въздействие развитието на
бактериите продължава.
БАКТЕРИЦИДНО ДЕЙСТВИЕ – когато външното въздействие убива
микроорганизмите.
Обеззаразяването (дезинфекция) е комплекс от методи и средства,насочени към
унищожаване на заразното начало във външната среда.То има своето определено
място в цялостната микробиологична, медицинска и фармацевтична практика, като
се изхожда от високата му превантивна цел за осигуряване на хигиенно съобразен
начин на живот и получаване на безопастни лекарства.
В зависимост от целите и задачите дезинфекцията се разпределя на:
 Профилактична (предпазна) дезинфекция. Провежда се там, къдено
наличието на патогенни микроорганизми е крайно нежелателно или съществува
опасност от поява на огнище на зараза – микробиологични лаборатории,
обеззаразяване на водата, в хранителните заведения, места където се събират
много хора, детски колективи, лечебни заведения,и др. Профилактичната
дезинфекция се извършва и в ежедневния живот на хората - миене на ръце къпане,

6
пране, почистване. Тези белези са белег на хигиенно съобразен начин на живот и
имат огромно значение в профилактичната дезинфекция.
 Огнищна дезинфекция-извършва се в огнището на заразата.Тя цели
унищожаването на патогенните микроорганизми по външната среда, заобикаляща
извора на заразата. В медицината са въведени още две подпонятия на огнищната
дезинфекция: текуща и крайна. Дезинфекцията,която се извършва през
времетраенето на болестта, се нарича текуща.След оздравяване на
болния,преместването му или неговата смърт, в огнището на заразата се извършва
крайна дезинфекция.

3.1.Методи - който се използват за обеззаразяване, се основават на биологични,

механични, физични и химични въздействия върху микроорганизмите се разделят
на:
A.Биологичен метод. Все още не е намерил приложение в противоепидемичната
работа в огнищата на заразата, но има важно приложение като профилактично-
дезинфекциознен метод - например за обеззаразяване на водата чрез биологични
филтри.
B.Механичен метод. Прилага се най-често като измиване с топла вода,сапун и
четка изпиране водещи до санитария,което е в основата на всяко обеззаразяване
както с профилактична цел,така и за огнищна дезинфекция.
C. Физически метод. Към него се отнася използването на различни физични агенти-
слънчево,ултравиолетово и йонизиращо лъчение,ултразвук. Слънчевото лъчение
има огромно значение за унищожаването на патогенни микроорганизми и като
елемент на природните самоочистващи процеси в почвата,водата и въздуха.
D.Химичен метод.Той се основава на токсичното въздействие на различни химични
съединения върху микробната клетка,което води до гибелта й. Най-често
прилаганите в обеззаразителната практика препарати, наречени дезифектанти,
групирани според основни химични качества, са следните;
а) Киселини - намират огромно приложение поради разрушителното си действие.
Солната киселина в 5% разтвор е удобна за дезинфекция и измиване на тоалетни,
медицински хигиенни уреди, гумени катетри.
б) Основи - от тях натриевата основа намира приложение като 2-5% горещи
разтвори за дезинфекция на складове за хранителни и животински продукти, във
ветеринарната практика.
в) Халогении производни - това са едни от най-широко използванитепрепарати.
Имат силно бактерицидно, вируцидно и спороцидно действие, притежават обаче
дразнещи, корозивни и избелващи свойства, затова приложението им е строго
показно(обикновено за груби повърхности).
г) Хлорната вар - представлява смес от калциеви съединения, като активна
субстанция е калциевият хипохлорит. Съгласно стандарта съдържа25-30% активна
хлор. Нестабилна е при съхранение и когато съдържанието на активен хлор спадне
под15% е негодна за употреба. За дезинфекция се приготвя 10% избистрен разтвор,
който се използва за правене на работни разтвори - например за подове в 1%
разтвор.
е) Хлорамините - са органични съединения, които отделят хлор и като
обеззаразителни средства са практични - нямат корозивното и избелващо действие
на хлорната вар и са стабилни. Съдържат 20-25% активна хлор и се прилагат за
дезинфекция на белъо, повърхности-1-2%, медицински пособия -1% за 1час, съдове
за хранене-0,5% за 30 минути.

7
ж) Соли на ди-и трихлоризоциануровата киселина - отделят голямо количество
хлор, прилага се за дезинфекция на белъо, кухненски съдове, медицински прибори и
повърхности.
з) Йод - притежава бактерицидно, вирусоцидно и спороцидно действие. Под
формата на 0,05-1%разтвори се прилагат за хигиенна и хирургична дезинфекция на
ръце, оперативно поле, в хранителната промишленост и др.
и ) Фенол и производни - най-известни са крезолите (метил-феноли). На тяхна
база са създадени редица препарати: хлорин-екстра, хелипур, весфен 32 и др. В
концентрации 3-6% се препоръчватза дезинфекция на санитарен фаянс, болнично и
работно облекло.
й ) Хексахлорофен - антисептик с бактериостатично действие при кожно
приложение, влиза в състава на сапуни и унгвенти. Прилаган е за профилактика на
стафилококови кожни заболявания само по епидемични показания (сравнително
висока токсичност).
к ) Окислители - водородният прекис, особено в комбинация със синтетични миещи
вещества, които усилват неговите бактерицидни и спороцидни свойства, може да се
прилага за дезинфекция на различни повърхности в 3% разтвор; при спороностни
инфекции - 6%, за обеззаразяване на спринцовки и игли в централните
стерилизационни - 1%.
л) Пероцетна киселина - притежава изразени бактерицидни, вируцидни и особено
спороцидни качества. Може да се използва за дезинфекция на ръце в 0,2% разтвор,
за повърхности при спороностни инфекции в 1% разтвор, за термолабилни
материали и инструменти.
м) Алкохоли - имат почистващо действие, тъй като разтварят мазнините, не цапат,
нямат мирис, лесно се изпаряват, действат бързо. Намират широко приложение за
обеззаразяване на ръце и кожа. Влизат в състава на много препарати: декосепт,
монопронто, проматум, сагросепт, софта-ман, стерилиум, хосписепт и др.
н) Алдехиди - имат силна дразнеща миризма, прилагат се под формата на водни
разтвори,пари и аерозоли. Комбинират се обикновено с детергенти, за подобряване
на органолептичните им качества и микроцидната активнаст.
о) Формалдихид - рядко се прилага под формата на формалин, например като 5%
разтвор за дезинфекция на фекалии за 6 часа, при микози- в 3% разтвор.
п) Параформалинова дезинфекция - използват се формалиновите пари, получени
чрез изпаряване на формалина след загряване. Използва се в херметично
затворени помещения, където формалиновите пари се вкарват за 6-12часа, след
което последва 24 часово проветряване.
р) Параформ - таблетки, които при деполимеризацията им чрез капка HSO отделят
формалдехид. Подходящи за обеззаразяване на термобилни материали, в
херматично затварящи се съдове където се поставят инструментите и таблетките
при норма 10 таблетки х1гр. На 1 куб. метър обем за 18-24 часа при температура
най-малко 25оС.
с) Глутаралдехид - отлични дезифекционни свойства и мощен антимикробен ефект,
прилага се под формата на 2% воден разтвор, буфериран с 0,3%натриев бикарбонат
преди употреба.
т) Комбинирани препарати - на основата на формалдехид, глутаралдехид,
оксалалдехд се препоръчват за студена химична стерилизация на термолабилни
инструменти. На пазара се предлагат дезофарм, идоскоп корзолин, пронтоцид,
секусепт, сайдекс, хелипурН и др. За повърхности се прилагат: алдозан,
деконикс50FF Идо-септ, инцидур, мелзепт ST и др.

8
у) Повърхностно-активни вещества (ПАВ)- широко приложение преди всичко за
профилактична дезинфекция,притежава бактериостатични качества. На пазара се
предлагат; за ръце-манипур, манисофт, октинидерм, стерилификс, трайджийн и др.;
за повърхности- еконекс53, деконекс51 , инцидин-екстра, кватохекс, родасан и др.
ф) Хлорхексидин - в малки концентрации има бактериостатично действие, а в по-
висока- бактерицидно. Преимущество е ниската му токсичност - хлорхексидиновите
разтвори се прилагат като антисептици за бърза дезинфекция на инструменти, за
оперативно поле, за ръце и др. Често се предлага в 0,5% в алкохолен разтвор.
Известен е и препаратът хибитан-глюконат, подходящ за гореизброените цели,
хибискръб е подходящ за обработка на повърхности. Други препарати са: савлон,
маноскръб, пливасипт, хандскръб.
х ) Етиленов окис - безцветен газ, токсичен и избухлив. Действа сравнително бавно
при 50-60гр.С за 3-4 часа. За предпазване от токсичността му, камерите за
стерилизация с етиленов окис следва да отговарят на специални изисквания при
експлоатацията му.
Успехът на дезинфекцията зависи от:
 Пътищата на разпространение на инфекцията, което се определя от обектите
на външната среда, третирани чрез обеззаразителни методи.
 Устойчивостта на микроорганизмите.
 Характера на средата, в която са изложени микроорганизмите.
 Свойствата и начините на употреба на дезифекционните средства.
Факторите, които влияят на дезинфекцията по време на въздействие на
дезинфекционното средство са концентрация, количество, температура,
проникваемост и др. Механизмът на действие на дезинфекционните средства върху
микробната клетка е сложен биофизичен и биохимичен процес. От контакта на
дезинфекционното средство с патогенния микроб до гибелта на последния се
преминава през различни стадии:

І стадий Физико-химичен процес

Дифузия адсорбция Активна адсорбция

ІІ стадий Химична реакция

(при достатъчна концентрация )

Метаболитни характеристики на
Морфологичен състав на клеткатаклетката

ІІІ стадий Нарушение на нормалните клетъчни реакции чрез реакциите

(във ІІ стадий)

ІV стадий Промяна на нарушения на биологичните растежни процеси

Веднага постепенно

Задръжка на размножението

9
V стадий Клетъчна смърт
Силните киселини и основи, както и врялата вода, хидролизиратклетъчните
белтъчни инградиенти. Хлорхексидиновите препарати унищожават бактериалните
клетки по пътя на реакцията с цитоплазмената мембрана и разстройството на
функцията й.

Санитизация - означава рязко намаляване на микробната флора по дадена обектна

външна среда. Тя има изключително голямо значение като профилактична мярка в
ежедневния живот. Естествената биологична устойчивост на организма е
достатъчна бариера пред малкото инфекциозни причинители, останали след
механично почистване (миене,пране и др.). Като най- пополярна предпазна
антимикробна мярка е миенето на ръце –което в същност е санитария.
Антисептика – това е унищожаване или препятстване развитието микроорганизмите
върху покривните (кожа, лигавици) на живите организми. Дезинфекцията по своята
биологична същност е процес на бързо отмиране на микроорганизмите по даден
обект от външната среда.

Хранителни среди за култивиране на бактерии. Принципи на

съставяне, видове, стерилизация, техника на приготвяне и
разливане

1. Култивиране на микроорганизмите – размножаване на микроорганизми в

стерилни хранителни среди.
2. Принципи на съставяне на хранителните среди – съставът на хранителните
среди трябва да отговаря на физиолого-биохимичните особености на дадения
микроорганизъм, който се култивира в нея; да съдържа всички необходими вещества
за биосинтетичните процеси и за получаване на енергия.
3. Основни компоненти на хранителните среди и изисквания на
микроорганизмите към тях.
3.1.Източници на въглерод.
а) автотрофи – използват СО2 от въздуха или други неорганични съединения
(NaHCO3, CaCO3)
б) хетеротрофи – използват органичен въглерод от органични съединения
(алкохоли, органични киселини, въглехидрети, въглеводороди)
3.2.Източници на азот.
а) азотфиксиращи – могат да усвояват атмосферен азот N2
б) усвояващи различни азот-съдържащи съединения
- неорганични: амониеви соли [(NH4)2SO4,NH4Cl]; нитрати (KNO3, NaNO3),
нитрити
- органични: аминокиселини (белтъчен хидролизат на животински или
растителни белтъци); пептони (продукти от непълното разграждане на белтъците)
или белтъци
3.3.Потребност от растежни фактори.
а) прототрофи – имат способност сами да синтезират нужните растежни фактори
б) ауксотрофи– задължително се нуждаят от внасянето на растежни фактори в
хранителната среда (дрождев автолизат, дрождев екстракт, царевичен екстракт)
3.4.По източник на енергия.
а) фототрофи– използват светлинна енергия; култивират се при дневно или
изкуствено осветление, процес фотосинтеза

10
б) хемотрофи– получават енергия от окислението на различни химични
съединения (хемосинтеза). Те се разделят на две групи в зависимост от източика на
химична енергия
- хемолитотрофи – от неорганичниcъединения (H2S, S, H2, NH4+, NO2-, Fe2+)
- хемоорганотрофи– на органичниcъединения
3.5. Други източници, необходими за растежа на микроорганизмите
 Източници на сяра и фосфор – сулфати и фосфати
 Източници на макроелементи (K, Na, Ca, Mg, Fe) – под форма на катиони на
неорганичини соли (KCl, NaCl, CaCO3, CaCl2, MgSO4, FeSO4, FeCl3)
 Източници на микроелементи (Mn, Co, Cu, Mo, Zn) – следи от неорганични
соли
 Източници на H и O – получават ти от вода

4. Видове хранителни среди – хранителните среди се разделят на няколко

групи според следните критерии:

А) По състав средите се разделят на:

1. Среди с неопределен състав
а) естествени – съдържат естествени продукти или екстракти от естествени
субстрати (месо, мляко, почва, растителни или микробни клетки: такива среди са
МПБ, МПА, МПЖ, пивна мъст); Използват се за поддържане на микроорганизмите,
за натрупване на биомаса; за диагностични цели.
б) полусинтетични – съединения с известен химичен състав и в известно
количество са прибавени малки количества от вещества с неопределен химичен
състав (например Сабуро, Гаузе); Използват се за култивиране на прадуценти на
аминокиселини, витамини, антибиотици, органични киселини
2.С определен състав (синтетични) – компонентите са с известен химичен
състав и в точно определено количество (например среди на Саратчандра, Чапек);
Използват се за изучаване на обмяната на веществата на МО

Б) По предназначение
1. Обикновени – естествени хранителни среди, на които растат по-голямата част
от микроорганизмите;
2. Специални
а) елективни – осигуряват преимуществено развитие на определена група
микроорганизми, без да потискат развитието на други групи микроорганизми;
използват се за изолиране на микроорганизми от естествените им местообитания
(напр. Саратчандра – за нитрифициращи микроорганизми).
б) селективни – подпомагат развитието на точно определена група микроорганизми,
но и подтискат развитието на останалите групи [среда на Ендо за изолиране на
колибактерии и подтискане на Грам- положителните бактерии]
в) диференциално-диагностични – създават възможност за бързо диференциране
на един вид микроорганизъм от друг или за откриване на някои техни метаболитни
особености. Пример рН-индикаторни хранителни средии хромогенни среди – при
видовата идентификация на микроорганизми в санитарната и медицинската МБ.

В) По физично състояние
а) течни - за получаване на микробна биомаса, продукти от обмяната на
веществата

11
б) ронливи – с ронлива консистенция получена на базата на прибавянето на семена,
трици, кварцов пясък; използват се за култивиране на продуценти на билогично
активни вещества; за поддържане и съхранение на плесени
в) твърди – за изолиране на чисти култури; за количествено отчитане на
микроорганизмите; за поддържане на културите; съдържат втвърдители, които
придават плътност и твърдост на средата

втвърдител изп. конц [% химична природа

произход Тт [ºC] Твтв. [ºC]
агар 1-3 полизахарид растителен 100 40
желатин 10-20 белтък животински 22-25 18-20
силикагел - HCl+Na2SiO3 минерален - -
K2SiO3

5.Приготвяне и стерилизация на хранителни среди.

5.1.Изисквания към хранителните среди – да съдържат всички необходими
вещества в лесно усвоима форма, да бъдат изотонични; да имат оптимална
влажност, вискозитет, рН, окислително-редукционен потенциал, да бъдат прозрачни;
5.2.Техника на приготвяне – поотделно претегляне и разтваряне на компонентите;
смесване на компонентите, корекция на рН, разливане в подходящи съдове –
епруветки, банки, колби.

Претегляне Разтвяряне Смесване Корекция на рН

Необходима апаратура: техническа везна (точност до 0.01 гр.), аналитична

везна (точност до 0.0001 гр.), подходяща посуда, магнитна бъркалка, рН метър.

Важно: За приготвяне на хранителните среди се използва дестилирана вода.

5.3. Стерилизация – зависи от компонентния състав на хранителните среди.

Използват се следните подходи:
а) автоклавиране – комбиниране на два фактора – температура и налягане.
- Унищожават се всички вегетативни клетки и спори.
- Основни режими на работа

Нaлягане tC Време [мин] Обект на стерилизация

[атм.]
0.0 100 30 в 3 посл. дни
0.5 112 15-20 Течни и твърди хранителни среди със захари,
аминокиселини, белтъци, витамини
0.8 115 20-30 Течни и твърди хранителни среди несъдържащи
1.0 121 20-30 захари Синтетични или естествени хранителни среди
1.2 124 20-30 с термостабилни съставки (нишесте, пептони,
шротове, брашна);
1.5 128 30-60 Почва, костно и рибно брашно,

12
Студена стерилизация –
Компоненти на хранителни среди – аминокиселини
мембранна филтрация

б) фракционна стерилизация (тиндализация) – нагряване на среди или компоненти

при 100оС няколко пъти, като в периода между нагряването се дава възможност за
прорастване на спорите да прораснат във вегетативни клетки.
в) пастьоризация – 80оС за 10-15 мин. Унищожаване само на вегетативни форми, а
не и на спори. Използва се за изолиране на чисти култури от спорообразуващи
бактерии. В хранително-вкусовата промишленост за обработка на продукти.
г) мембранна филтрация – стерилизация на компоненти, които не издържат
нагряване като аминокиселини, витамини, антибиотици, лесно окисляващи се
компоненти). Компонентите се филтруват през мембранни филтри с размери на
порите най-често 0,2 мкм и 0,45 мкм.

5.4.Съхранение – в прохладни и защитени от светлина помещения, хладилни

камери
6.Разливане на хранителни среди
6.1.Основен принцип – запазване на стерилността на разлятата хранителна среда.
6.2.Техника на разливане – използване на епруветки, петрита и колби.

агар

течност агар

твърда хр.ср. скосен

течна (полегат) твърда хр.ср. твърда хр.ср.
хр.ср. агар прав агар петри, 15-20 ml

Важно: Твърдата хранителна среда се разлива разтопена и охладена до 48-50 оС,

след което се оставя да изстине и втвърди.

13
6.3.Тест за стерилност – инкубиране при 37оС за 24 часа преди използване.

Дискусия:

1. Посочете разликата между стерилизация и дезинфекция.

................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
.................................................................................................................................
2. Защо пособия влезли в контакт с микробната култура трябва да бъдат
обеззаразени преди да бъдат изхвърлени.
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
.................................................................................................................................
3. Защо в микробиологична лаборатория трябва да се работи с
микробиологично облекло.
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
.................................................................................................................................

4. Какъв метод на стерилизация бихте избрали за стерилизиране на

температурночувствителни компоненти?...............................................
.....................................................................................................................
.....................................................................................................................

5. Каква е разликата между пастьоризация и стерилизация?..................

....................................................................................................................
....................................................................................................................

УПРАЖНЕНИЕ № 2
--------------------------------

14
 Методи за изучаване на морфологията на микробната клетка –
бактерии, актиномицети, дрожди и плесени.
Изготвяне на свежи микроскопски препарати – нативни и витално
оцветяване.
Трайни микроскопски препарати – просто оцветяване.

Идентификацията на микроорганизмите се извършва въз основа на две групи

признаци - морфологични и физиологични. Морфологичните и цитологичните
особености на микробните дават информация за семейството и рода,
физиологичните признаци дават информация за вида и разновидността, докато
генетичните анализи дават потвърдителна информация за по-точно определяне на
щамовата, видовата и родовата принадлежност

1.Морфология на микробната клетка:

Основните изследвани морфологични признаци на бактериите са: форма, размери и
подвижност.
а) форма - определя се от наличието на клетъчна стена; микроорганизмите
които нямат клетъчна стена нямат и постоянна форма - пример – микоплазми
Според своята форма микроорганизмите биват сферични, пръчковидни,
спираловидни, нишковидни и разклонени.
Сферичните бактерии - (коки) в зависимост от големината си се разделят на
микрококи ( с размери под1 микрон) и макрококи (с размери над 1 микрон). В
зависимост от разположението си в плоскостта на делене и способността си да
образуват микроформации коките могат да се различават като: монококи, диплококи
(гонококи и менингококи), тетракоки, сарцини, стафилококи и стрептококи. Като
основно правило - коките са неподвижни и аспорогенни, могат да бъдат сапрофитни
или патогенни.
Пръчковидни бактерии - в зависимост от формата си те се разделят на бацили с
правилна цилиндрична форма и овални краища (Bacillus cereus), цилиндрична
форма и отлязани краища (Proteus vulgaris) и вретеновидни (Cytophaga).
Пръчковидните бактерии образуват формации подобно на сферичните бактерии и
съответно се разграничават - монобактерии, диплобактерии и стрептобактерии.
Според способността си да образуват спори се разделят на две групи:
спорообразуващи (род Bacillus, клостридиуми) и неспорообразуващи (род
Bacterium).
Спираловидни (извити) бактерии - това са бактерии с хеликоидални или
витлообразни дълги, тънки тела с различна дължина и дебелина. Разграничават се
следните видове: вибриони (род Vibrio), спирили (род Spirillum)и спирохети (род
Spirochaetae), които се разделят на пиронеми, трепонеми и лептоспирили
Нишковидни бактерии - дълги нишки, съдържащи множество цилиндрични клетки,
Разклонени микроорганизми - прокариотни и еукариотни мицелни структури като
актиномицетите и плесените. Основните цитоморфомологични характеристики на
актиномицетите и плесените са:
 Актиномицети – прокариоти с неправилна или изменчива форма. Наблюдава
се субстратен и въздушен мицел, с различна степен на разклоненост, но
винаги съставен само от една клетка. Хифите на актиномицетите са по-тънки
от тези на плесените и несептирани.

15
  Плесени – еукариотни микроорганизми, чието тяло се състои от преплетени
нишки (хифи), образуващи мицел, който е диференциран на субстратен и
въздушен (размножителен). Мицелът може да бъде несептиран едноклетъчен
(зигомицети) или септиран многоклетъчен (аскомицети и несъвършенни гъби).
На агарови среди плесените образуват меки, широко разпростиращи се по
повърхността нишковидни, паякообразни или прахообразни колонии, подобно
на пухкав налеп. Формата и структурата на въздушния мицел служи за
диференциране на плесените.
 Дрожди – еукариотни едноклетъчни безхлорофилни микроорганизми с голямо
разнообразие във формата: кръгли, овални, елипсоидни, лимоновидни,
хифоподобни или бутилковидни.

2.Методи за изучаване на морфологията на живи микроорганизмите

Морфологичните особености на микроорганизмите се изучават като се приложат
различни методи за микроскопирате. Микроскопските методи за изучаване на
формата, големината и подвижността на бактериите включват: свежи и витално
оцветени микроскопски препарати, препарат висяща капка, трайни микроскопски
препарати.
2.1. Приготвяне на свеж покривен препарат: материали и техника.
а) необходими материали: микробна култура, предметни и покривни стъкла, вана
с мостче за багрене, пръскалка или прибор за промиване на препарата, пинсети и
стъкла с багрила и реактиви, вазелин или парафин
б) техника: върху предметното стъкло се нанася капка чиста водопроводна вода
или физилогичен разтвор и с помоща на йозето се внася малки количество от
микробната култура, разтрива се добре до получаване на монослойна суспензия и
се покрива с предметното стъкло без да се образуват мехурчета. Излишното
количество вода се попива с филтърна хартия. При работа с течна микробна култура
не е необходимо предварително разреждане с вода. При по-продължителна работа
с препарата за да се предпази културата от изсушаване се препоръчва да се
намажат краищата на покривното стъкло с вазелин или парафин. Препаратът е
готов за наблюдение и се наблюдава при увеличение 40х.
2.2. Витално оцветяване на свежи покривни препарати - видове, техника.
При този метод микробите се оцветяват в живо състояние и след оцветяването
остават живи и способни за размножаване.Това позволява изучаване структурите на
клетката без да бъдат деформирани. Като витални оцветители се използват се
силни разреждания на багрила (0.001 до 0.0001%) на неутрал рот, брилянт-
крезолблау, янусово зелено и други.
Техника на приготвяне - приготвя се се свеж покривен препарат и недалеч от
покривното стъкло се поставя капка разредено багрило. С йозето багрилото се
придвижва към препарата като от другия край с парченце филтърна хартия се
създава капилярен ток и багрилото постепенно прониква в препарата.
2.3. Препарат “висяща капка”
Препаратът позволява да се наблюдава движението на микробната култура,
размножаване, образуване на микроформации и спорообразуване;
Материали: използва се специално предметно стъкло с вдлъбнатина по средата и
по-големи покривни стъкла
Техника: ръбовете на вдлъбнатината на предметното стъкло се намазват с вазелин,
на покривното стъкло се поставя малка капка от течната култура, двете стъкла се
прилепват като се внимава капката да не се размаже, а да остане да виси в
образуваната камера. Наблюдава се с обектив 40х.

16
2.4. Препарат „отпечатък“
Това е своеобразен вариант на свежия покривен препарат. От твърда агарова среда
с прораснал плътен посев или отделни колонии със скалпел се изрязва малко
блокче, което внимателно се поставя върху предметното стъкло. Към горната страна
на блокчето се допира чисто покривно стъкло, леко се притиска с пинсета и веднага
се вдига. Полученият препарат отпечатък се поставя в капка вода оцветена с
метиленово синъо и се ноблюдава. Използва се за наблюдение на въздушния мицел
и спороносците на актиномицетите и плесенните гъби.
Предимства на свежите покривни препарати:
Недостатъци на свежите покривни препарати:
3.Трайни микроскопски препарати
Недостатъците на свежите покривни препарати се предоляват, ако наблюденията се
извършват върху трайни микроскопски препарати. В този случай изследваните
микроорганизми са убити и фиксирани към предметното стъкло, разположени са в
един слой, който позволява тяхното оцветяване, няма опасност от замърсяване и
заразяване; по-лесно и удобно се провеждат изследванията. Използват се за
наблюдаване и изучавяне на детайли в строежа на бактериалната клетка (капсула,
ресни, клетъчна стена, спори, включения, ядро); за определяне на формата и
размерите на бактериите, най-подходящ метод за изучаване на морфологията на
патогенните микроорганизми
Възможни недостатъци на трайните микроскопски препарати са свързани с
деформация на клетките, да се променят клетъчните структури и да се получат
необичайни и нереални резултати –“ артефакти”.
3.1.Техника на приготвяне на трайните микроскопски препарати
Техниката включва 4 основни етапа, които трябва да се изпълняват
последователно и в определен ред. Пропускането само на един от етапите или
изпълнението му не по процедура води до получаване на дефектни препарати.
а) приготвяне на натривка – взема се малко количество от изследваната култура с
йозе или с пипета (при течни култури) и се нанася върху предметното стъкло,
разтърква се до монослой. Натривката трябва да е тънка, равномерна, кръгла или
овална, на площ от 1-2 см2
б) изсушаване - целта на етапа е да се елиминира излишната вода около клетките в
натривката;
 въздушно – на стайна температура, когато е тънка натривката, това става
бързо
 чрез подгряване – на пламъка на спиртната лампа или със сешоар
 значение на сушенето – да не се допуска прегряване на препарата, тъй като
това води до коагулиране на белтъците в протоплазмата и нарушаване на
структурата на бактериалната клетка. При недостатъчно изсушаване в следващия
етап микробните клетки се увреждат.
 изсушаване на патогенни микроорганизми – под стъклен похлупак
в) фиксиране – целта на този етап е прикрепване на препарата към предметното
стъкло; денатурация на белтъците и спиране на обменните процеси в клетката;
повишаване пропускливостта на клетъчната стена и афинитета към багрилата, тъй
като се освобождават свободни амино- и карбоксилни групи; убиване на
микроорганизмите.
Начини на фиксиране:
 физично – на пламъка на спиртната лампа – три пъти по 2 сек.

17
  химично – чрез органични разтворители – етанол, метанол, амилов алкохол,
фиксатори – на Буен, Робиноу – използва се за препарати на фини структури, които
се увреждат от топлината (актиномицети, мастни включения, ядро, ресни)
г) оцветяване – основава се на микрохимични реакции между багрилото и
структурите на клетката, в резултат на което нееднородни части се различават
Изисквания към багрилата –
 да поглъщат определена дължина на вълната и да се фиксират върху
клетъчните структури
 да направят видими бактериалните клетки под микроскоп;
Багрилата могат да се използват за изучаване на някои физиологични
закономерности, като растеж и развитие на бактериите. Например багрилата могат
да променят цвета си при промяна в рН на средата и по този начин да се отчита
развитието на микроорганизмите. Това явление се използва в микробната
цитохимия за изучаване на редукционната способност на бактериите в хода на
техния растеж и развитие. На тази основа прибавянето на метиленово синьо в мляко
позволява да се открива бактериалния растеж по обезцветяване на това багрило.
д) промиване- промиване на препарата с вода, за да се отстрани излишното
багрило;
е) изсушаване – важно за наблюдение на отчетлива картина под имерсия
4.Видове багрила:
а) според силата на действиесе разделят на два основни вида – витални и
невитални
 витални багрила – не пречат на жизнената дейност на бактериите, клетките
остават живи без изменение на морфологичните и биохимичните особености.
Използват се силни разреждания от 0.001 до 0.0001% на неутрал рот, брилянт-
крезол блау, янусово зелено и други.
 невитални – свързват се трайно с микробната клетка и я увреждат
б) според характера си също се разделят на: кисели, алкални и неутрални. Това
са производни на анилиновите бои, които според електролитното дисоцииране във
вода се отнасят като оцветен катион или анион.
 алкални – хромофорът е катион, с ауксохромни аминогрупи – метиленово
синьо, кресталвиолет, генцианвиолет, сафранин
 кисели–хромофорът (йонът който придава окраската) е анион, с ауксохромни
групи ОН-радикали, отделят се Н+ катиони, например еритрозин, еозин, кисел
фуксин
 неутрални – оцветителната способност се дължи и на анионите, и на
катионите
в) по механизма на действие – обикновени и диференциращи багрила
 обикновенни – оцветяват цялата клетка равномерно по такъв начин, че
стават ясно видими нейната форма и размери. такива багрила са фуксин,
генцианвиолет, метилено синьо
 диференциращи – основава се на нееднаквия афинитет на различните
клетъчни струкрути към багрилото или на микроцитохимичните реакции.
4.1. Байцове – използват се за по-добро оцветяване на препарата. Като байц се
използват съединения, които трайно се свързват с дадено структура в микробната
клетка и едновременно имат висок афинитет към хроматофора на багрилото.
5.Техника на оцветяването
а) определение – протича биохимична реакция, при която от значение са
приложеният метод на багрене, вида на багрилата и използваните байцове,
видовата принадлежност на микроорганизмите и фазата на тяхното развитие
18
б) задачи на оцветителната техника:
 да се въздейства върху микробната клетка с оцветители, които да направят за
определено време определени структури по-интензивно оцветени.
в) техника на оцветяването:
 Приготвя се траен микроскопски прерарат по описаната по-горе методика
 Фиксираният препарат се залива или потопява в разтвор на подбрания
оцветител, който може да се филтрува преди употреба или да се нанесе върху
филтърна хартия
 След като изтече времето за оцветяване прераратът се промива с вода и се
изсушава
6.Видове оцветявания
а) просто (обикновено) оцветяване – използва се само едно багрило което
оцветява равномерно цялата клетка. Продължителността на оцветяването се
определя единствено от афинитета на багрилото към бактериалната клетка и
неговата концентрация. Най.често се използват водни разтвори или водно-
алкохолни разтвори на фуксин по Пфайфер или метиленово синьо по Льофлер. За
оцветяване с фуксин са необходими от 10 сек. До 1-2 минути, а за оцветяване с
метиленово синьо от 2 до 5 мин. Прилага се най-често при наблюдение на формата
и размерите на изучаваните бактерии.
б) сложно или диференциращо оцветяване
Основават се на особеностите във физико-химичния строеж на микробната клетка.
Различните структури на бактериалната клетка (стена, капсула, спори, ресни,
волутинови телца, ядрен апарат и др.) имат различен състав поради което
адсорбират различни бои и се оцветяват различно от бактериалната цитоплазма.
При тези методи се използват повече от една анилинови бои.

19
 УПРАЖНЕНИЕ № 3
--------------------------------
Методи за изучаване структурата на бактериалната клетка.
Диференцираще методи на оцветяване: оцветяване по Грам,
оцветяване на ендоспори, капсула и волутин.

1. Методи за изучаване структурата на бактериалната

клетка - диференциращи (сложни) методи за оцветяване:
1.1. Същност на диференциращото оцветяване – метод, при който се използва
повече от едно багрило, обезцветяващи реактиви и байцове в няколко
последователни процедури на оцветяване и промиване. Първият оцветител се
означава като основен, а вторият – допълнителен (контрастен). Използването на
такъв подход позволява оцветяването на определени структури в бактериалната
клетка в зависимост от физико-химичната им природа и различния им афинитет към
тези багрила.
1.2. Приложение – използва се за детайлно изучаване структурата на микробната
клетка; за характеризиране и диференциране на един микроорганизъм от друг,
важен елемен при идентификацията на микрооргазмите.
2. Оцветяване на бактериите по Грам
а) същност на метода - този диференциращ метод на багрене, предложен през
1884 г. от датския лекар Кристиян Грам, позволява разделянето на почти всички
микрооргавизми в две основни групи според своята степент на афинитет им към бои
от групата на триметилфенолните производни. По-късно се установява, че
различното оцветяване на бактериите е в зависимост от строежа на клетъчната
стена на бактериите. Това не е метод за оцветяване и наблюдение на клетъчната
стена. Нито метод за доказване наличието на клетъчна стена! Това диференциращо
оцветяване показва разликата в състава и структурата на клетъчната стена. Двете
групи бактерии се означават съответно като Грам-положителни (синьо-виолетови) и
Грам-отрицателни (розово-червени), в зависимост от гова дали се оцветяват или не
с основното багрило.

20
 Грам-положителни бактерии: стафилококи, сарцини, бацили, микобактерии,
актиномицети, по-чувствителни са на антибиотици и бактерицидното действие на
основните багрила.
Грам-отрицателни бактерии: чревни бактерии, гонококи, менингококи,
оцетно-кисели бактерии - не образуват спори; по-устойчиви са на токсини и
антибиотици.
б) механизъм на оцветяването – като основно багрило се използват бои от
групата на триметилфенолните производни (генцианвиолет, кристалвиолет), които
при наличие на йод образуват, със съдържащите се в протоплазмата вещества,
комплексно съединение, което е слабо разтворимо в етанол и неразтворимо във
вода. Клетките на бактериите, които се отнасят към групата на Грам-положителните
бактерии, обагрени по този метод, при промиване с етанол или ацетон запазват
виолетовия си цвят. Докато клетките на бактерии, отнесени към Грам-
отрицателните, се обезцветяват и за тяхното визуализиране се налага
допълнително оцветяване с контрастно багрило (карбол-фуксин или сафранин).
Затова Грам-отрицателните бактерии при микроскопиране са розово-червени.
в) фактори, влияещи върху оцветяване по Грам: способността за задържане
на багрилото при обезцветяване зависи силно от физиологичното състояние на
клетките, от цялостта на бактериалната клетка; от възрастта (18-24 часови култури);
от стадия на развитие; от видова принадлежност; от индивидуалните особености; от
условията на култивиране; от дебелина на натривката, спазване условията на
оцветяване.
г) техника на приготвяне на препарата – изготвя се тънка еднослойна
натривка, коята се фиксира физично трикратно на пламъка на лампата;
задължително се изготвят на същото предметно стъкло и контролни натривки с
известни Грам-положителни и Грам-отрицателни бактерии, които са в сходно
физиологично състояние както изследваната култура. Етапи на изпълнение на
процедурата за оцветяване:

21
 Схема Оцветяване по Грам

Реагент Грам + Грам -

Натривка и
фиксиране

Кристал-
виолет 1min

Йоден
Разтвор Лугол
1 min

Етилов
алкохол
5s

Сафранинили
карбол-фуксин
30 s – 1 min
Син цвят Розово-червен цвят

Промиване
с вода

Наблюдение под микроскоп с имерсионен обектив.

22
 Методи за оцветяване на ендоспори.

1. Определение. Някои бактерии притежават при определени

условия да образуват спори. Ендоспорите са клетки в покой, които морфологично се
различават от вегетативната клетка;
Да не се забравя, че при бактериите ендоспорите са средство за преживяване на
неблагоприятните условия, а не за размножаване. Това е основна разлика между
бактериите и актиномицетите, плесените и някои дрожди, при които образуването на
спори е форма на размножаване.
2. Методи за наблюдение на ендоспори при бактериите
а) чрез свеж микроскопски препарат под светлинен микроскоп в светло поле –
поради свойствато на спорите да пречупват по-силното светлината, те се виждат в
клетката като по-тъмни включения с овална или кръгла форма
б) чрез фазово-контрастно устройство – ендоспорите имат вид на много светли
(блестящи) включения на фона на почти черни клетки.
в) чрез различни методи на оцветяване: простите методи на оцветяване са
неприложими тъй като обвивката на ендоспорите е многослойна и трудно
проницаема. При прилагането на просто оцветяване ендоспорите имат вид на
безцветни включения в клетката, а ако се намират извън нея, наподобяват
безцветни клъбца. Затова методите за оцветяване на ендоспори се основават на
комбинираното действие на силен оцветител (с висок афинитет към ендоспорите и
по-слаб към вегетативната клетка) и нагряване. Нагряването на препарата
позволява проникването на багрилото в ендоспорите и по-здравото му свързване с
техните компоненти. След промиване на препарата – спорите остават оцветени, а
вегетативните клетки се обезцветяват. за тяхното визуализиране се прилага
контрастно багрило. Най.често се използват методите на Мьолер и на Шефер-
Фултон.
г) косвен метод за установяване наличието на спорообразуване: чрез
пастьоризация
3.2. Метод на Шефер-Фултон за оцветяване на ендоспори – диференциращ
метод на оцветяване,
 Приготвяне на натривка, изсушаване и фиксиране на пламъка на
спиртната лампа
 Оцветяване на натривката с малахитово зелено за 5 минути на вряща
водна баня
 Промиване на препарата с вода
 Оцветяване с 0.25% алкохолен разтвор на сафранин в продължение
на 30 сек.
 Промиване с вода, изсушаване и наблюдение с имерсионен
микроскоп
Наблюдава картинна: Ендоспорите са оцветени в ярко зелено, вегетативните
клетки в червено-оранжево

Капсула. Методи за наблюдение.

1. Определение – слизесто вещество с различна дебелина, отлагащо се върху

клетъчната стена
2. Видове капсули - в зависимост от дебелината им
а) микрокапсули – под 0.2, видими под електронен микроскоп
23
б) макрокапсули – над 0.2, видими под светлинен микроскоп
в) слизест слой – дебелината му превишава d на клетката
Капсулата не е задължителна структура за бактериалната клетка; не е видов
признак; образуването й зависи от щамовата специфичност, възрастта на културата
и условията на култивиране. Тя обаче е важен фактор в патогенността на
бактериите и участва активно в процесите на противодействие на естествената
резистентнтост на макроорганизмите.

3. Методи за наблюдение
а) метод на негативно контрастиране – стара култура на Azotobacter chroococcum,
изготвя се свеж микроскопски препарат, като се прибавя разредентуш или нигрозин
вместо капка вода. Капсулата се наблюдава като светли зони около бактериалната
клетка
б) оцветяване по Клет – траен микроскопски препарат; диференциращ (сложен)
метод на оцветяване, при който се използва различния афинитет на капсулата и
клетката към багрилата.
 Изготвяне на натривка, изсушаване и фиксиране на пламъка на спиртната
лампа
 Оцветяване на натривките с водно-алкохолен разтвор на метиленово
синьо по Клет при загряване на багрилото на спиртна лампа до поява на
пари. Багрилото не трябва да засъхва по предметното стъкло.
 Промиване с вода и подсушаване на натривката
 Оцветяване с водно-алкохолен разтвор на фуксин за 20-3- сек. (второто
багрило измества първото от капсулата)
 Промиване с вода, изсушаване и наблюдение с имерсионен обектив
Микроскопска картина: Капсулите се виждат като розово-червени ореоли около
тъмно-синьо оцветени клетки.

Включения. Волутин ( метахроматиново телце)

Включенията са резервни хранителни вещества, които се натрупват вътре в

клетките при определени условия на средата. Волутинът е включение с фосфатна

24
природа – гранули от фосфорна киселина с типична за видовете форма – гирички,
броеница, играе роля на фосфатно депо. Другото наименование на този тип
включения е метахроматин, което се обуславя от това, че предизвикват характерно
изменение на цвета (метахромазия) на някои оцветители – метиленово синьо,
толуидно синьо. За първи път е установен при вида Spirilum volutans, от където идва
наименованието му. Обикновенно волутинът се натрупва в големи количества и
лесно се диференцира в клетките на много бактерии – спирили, млечно-кисели
бактерии, азотобактер или дрожди.
а) метод на оцветяване на волутин –
 Изготвяне на натривка, изсушаване на въздух
 Фиксиране на пламък
 Оцветяване с Найсер І за 1-2 мин.
 Промиване с вода
 Оцветяване с Найсер ІІ за 2-3 мин.
 Промиване с вода
 Изсушаване и наблюдение с имерсия
Наблюдавана микроскопска картина: Волутинът (метахроматинът) се оцветява в
тъмно синьо до виолетово и при въртене на микровинта опалесцира в червено,
клетките са бледо жълти.

Практически задачи:

1.Оцветяване по Грам от предоставените свежи 24-часови култури по избор – E.coli,

B.subtilis, B.megaterium и неизвестна култура Х или У

Контрола Тест Контрола

Вид ................................... ..................................... ..................................

..

Грам .................................. ...................................... .................................

...

2.Оцветяване на спори от предоставените култури B.megaterium, B.subtilis или

грахова култура

25
Вид ............................................. ……………………………
Спори .............................................. ..........................................
Разположение ............................................... …………………………..
Цвят на спорите ............................................... ……………………………
Цвят клетки ................................................ ...........................................
Увеличение ...............................................…………………………….

3. Изготвяне на свеж препарат на капсула по метода на негативното контрастиране и

траен микроскопски препаратпо метода на Клет от стара култура на Azotobacter
chroococcum (2 – 3 седмици )

Вид ...................................... ...................................................

Капсула ...................................... ...................................................
Цвят клетки ....................................... ....................................................
Увеличение ....................................... ....................................................

4.Изготвяне на траен микроскопски препарат за волутин чрез просто оцветяване

с метиленово синьо по Льофлер от кисело мляко ( L. bulgaricus)

26
Вид ...................................... ...................................................
Оцветяване ...................................... ...................................................
Цвят на клетките ....................................... ....................................................
Разположение ....................................... ....................................................

УПРАЖНЕНИЕ № 4
--------------------------------

Методи за изучаване на растежа и развитието намикроорганизмите. Видове

посевки и пресевки на микробни култури. Методи за култивиране на аеробни и
анаеробни микроорганизми.

Методи за изучаване растежа и развитието на микроорганизмите. Видове

посевки и пресевки на микробни култури.

1. Определение за посявка - внасянето на материал (клетки от микрооргавизми)

от почва, храна, вода, секрет в стерилна хранителна среда (течна или твърда) с цел
узучаване на прорасналите микроорганизми и получаване на култура за по-
нататъшна работа
2. Определение за пресявка – пренасяне на развилите се вече микроорганизми
от една хранителна среда в друга, често се използва същата по състав среда, както
при посявката с цел поддържане на щама.
- инокулум (посевен материал) – точно определено количество
микроорганизми, които се внасят в хранителната среда.
Посевките и пресевките се осъществяват при спазване на принципа на
стерилността, за да не се внасят микроорганизми от външната среда в микробната
култура.
3. Видове посевки/пресевки
а) с помощта на йозе – видове: от твърда или течна хранителна среда върху твърда;
от агаризирана среда в течна среда.
- повърхностен – посев на щрих (в епруветка със скосен агар или петри)

27
 - дълбочинен – в епруветка или колба с течна хранителна среда
б) с помощта на бактериологична игла - от твърда или течна хранителна среда
върху/в твърда хранителна среда повърхностен – посев за получаване на гигантски
колонии
- дълбочинен – посев на “бод” (в епруветка с прав агар)

в) с помощта на пипета – от течна хранителна среда в течна хранителна среда; от

течна хранителна среда върху твърда хранителна среда
- повърхностен – плътен посев или под форма на единични колонии (с
помощта на шпатула в в петри)
- дълбочинен - в епруветка или колба с течна хранителна среда

Отношение на микроорганизмите към молекулния кислород. Методи за

култивиране на аероби и анаероби
1. Характеристика на микроорганизмите според отношението им кислорода
1.1.Аероби
а) облигатни (задължителни, строги) – микроорганизми, които за растежа и
развитието си се нуждаят от постоянен приток на О 2. Енергетичния процес при тях е
аеробно дишане с краен окислител (акцептор на електрони) О2 . Микроорганизми,
растящи на атмосферен въздух.
б) микроаерофили – микроорганизми, които се нуждаят от О 2, но най-добре се
развиват при парциално налягане на О 2 по-ниско от това във въздуха (при
концентрация на О2 в околната среда около 2%). Високите концентрации подтискат
тяхното развитие.
1.2.Анаероби – енергетичните и конструктивните процеси при тези
микроорганизми протичат без участието на молекулен О2.
28
а) облигатни (задължителни, строги) - микроорганизми, които не понасят
присъствието дори на незначителни количества О 2 в средата. О2 е токсичен за тях и
бързо ги убива. Напр.: метан образуващи микроорганизми; сулфат редуциращи
микроорганизми; маслено-кисели бактерии
б) аеротолерантни - микроорганизми, които притежават метаболизъм от анаеробен
тип, но могат да растат в присъствие на ниски концентрации на О2.
б) факултативни – микроорганизми, които могат да растат както в аеробни, така и в
анаеробни условия. Те са приспособени в зависимост от наличието или отсъствието
на О2 в средата да превключват от един метаболитен път на друг (от аеробно
дишане на ферментация и обратно). Напр. – дрожди.

2.Методи за култивиране на аероби.

2.1.Повърхностно култивиране – микроорганизми получават О2 непосредствено от
въздуха. За да се увеличи повърхността на съприкосновение на културата с О 2,
средата се разлива на тънък слой.
а) на твърди среди – в епруветки със скосен агар и петриеви блюда
б) на течни среди (статично) – колби на Ру и на Ференбах (за плесени); епруветки с
нисък слой среда. Аеробите образуват ципа или пелена на повърхността на средата,
а факултативните анаероби се развиват и във вътрешността на средата –
помътняване.
2.2.Дълбочинно култивиране в течни среди - микроорганизмите използват
разтворения в средата О2; неговото количество се повишава чрез постоянно
аериране на средата, което се постига:
a) чрез клатачни апарати или шейкъри – ротационни или постъпателни (въртеливи
или люлеещи движения); с различни обороти (от 100 до 250 об/мин); хранителна
среда в Ерленмайерови колби с различни обеми. С увеличаване на оборотите се
увеличава съприкосновението на средата с въздуха.
б) чрез продухване на стерилен въздух и механично разбъркване с бъркалки във
ферментори – приложение в промишлената МБ за култивиране на продуценти на
биологично-активни вещества (актиномицети, дрожди, плесени). Във ферменторите
се извършва непрекъснато култивиране на м.о., като се подава свежа ХС, а се
източва част от културалната среда.

3.Методи за култивиране на анаероби – достъпът на О 2 към културата се

ограничава или напълно се преустановява.
А) Методи при дълбочинен посев.
1. Култивиране във висок слой течна среда – преди посев средата се кипва
за 30-40 мин и бързо се охлажда. Посевът (с пипета) се прави на дъното, без
да се разбърква средата. Повърхността на средата се залива със стерилен
течен парафин, епруветките се запушват с гумени тапи.
2. Култивиране в гъсти среди – дифузията на О2 в течната среда намалява с
увеличаване на вискозитета й (картофена среда; среда с 0.2-0.3% агар)
3. Дълбочинно култивиране в твърди среди – използва се за получаване на
единични колонии при изолиране на чисти култури или при количественото
определяне на анаероби. Посевният материал се внася в епруветка с
разтопен и охладен до 48-50ºС; размесва се чрез разтъркване на епруветката
между дланите.
a. остава в епруветката на висок стълб. След втвърдяване повърхността
на агара се залива със стер. течен парафин

29
 b. в петри – съдържанието на епрув. се излива в капака на петрито.
Дъното се поставя върху агара, като се притиска и се внимава да не се
образуват мехурчета. Разстоянието между капака и дъното се запълва
с разтопен парафин.
Б) Методи при повърхностно посяване на анаероби – използват се физични,
химични и биологични способи за отстраняване на О2 от средата
1. Култивиране в ексикатори или анаеростати
i. херметически затварящи се съдове – ексикатори (стъклени; с
шлифовани и намазани с вазелин ръбове); анаеростати (метални или
плексигласови; с гумени уплътнения и щипки или винтове, плътно
притискащи капака)
c. отнемане на О2:
а) с помощта на вакуум-помпа и вкарване на газова смес (от инертни газове; СО 2, Н2,
N2) в анаеростат, снабден с манометър и два винтила. Добавъчното налягане не
позволява дифузия на О2 от въздуха в апарата
б) с помощта на вещества, които поглъщат О 2: пирогалол; натриев дитионат
(Na2S2O3); метално желязо. Контрол – чрез окислително-редукционен индикатор
4. Съвместно култивиране на аероби и анаероби (биологични методи) – в
затворена система аеробите изчерпват от средата О 2 и създават условия за
развитие на анаеробите
а) метод на Фортнер - със стерилен скалпел по диаметъра на петрито се изрязва
бразда (широка 0.5-1см) по агаровата пластинка. Аеробите и анаеробите се засяват
в едно и също петри в/у двете половини на агара.
б) метод на Снежко– върху агарова пластинка на дъното на петри се прави плътен
посев на аероби (дрожди, стафилококи). Върху агарова пластинка на капака на друго
петри повърхностно се посяват анаероби. Двете половинки се затварят така, че
дъното да се вреже в агаровата пластинка на капака. В пролуката се налива
разтопен парафин.
5. Растеж на микроорганизмите.

Повърх-
ностен Растеж под
растеж повърхността

Тв. хр. Цялостен

растеж
среда

Растеж на
дъното

Облигатни Факултативни Аеро- Облигатни Микро-

аероби анероби толерантни анаероби аерофили

V. Практически задачи:

30
 1. Разливане на хранителни среди – 2 броя петриеви блюда с МПА, 2 броя
епруветки на полегат агар с МПА и 2 броя епруветки с МПБ - по една нисък и висок
слой
2. Посевки и пресевки на различни култури, почвена суспензия и грахова
култура – на щрих върху полегат агар и петри; “на бод” в прав агар; с пипета в
епруветка и в петрива паничка
3. Изолиране на чисти култури от почвени проби
- по метода на Пастьор
- по метода на Дригалски

1. Посявка от твърда хранителна среда на полегат агар с йозе.

Култивиране

Хранителна среда:
Вид:

Резултати

Описание на растежа:
Отношение към кислорода:

2. Посявка на щрих с йозе от твърда хранителна среда на петри с хранителна

среда.
Култивиране

Хранителна среда:
Вид:

Резултати:
Описание на растежа
Отношение към кислорода:

31
 3.Посев на бод с бактериологична игла от развита култура на полегат агар в
епруветка с прав агар
Култивиране
Хранителна среда:
Вид:

Резултати
Описание на растежа:
Отношение към кислорода:

4. Посявка на плътен посев от култура, развита в течна среда върху твърда

среда в петри с пипета и шпатула.

Култивиране

Хранителна среда:
Вид:

Резултати

Описание на растежа:
Отношение към кислорода:

5. Посявка от грахова култура в епруветка с течна хранителна среда висок

слой с пипета и заливане със стерилен течен парафин.
Култивиране

Хранителна среда:
Вид:

Резултати

Описание на растежа
Отношение към кислорода:

32
6. Посявка от култура развита в течна култура в течна хранителна среда нисък
слой с пипета.
Култивиране

Хранителна среда:
Вид:

Резултати

Описание на растежа:

33
 УПРАЖНЕНИЕ № 5
--------------------------------
Методи за изолиране, съхранение и контрол на чисти култури от
микроорганизми.
Методи за количествено определяне на микроорганизмите – непреки
(индиректни ) и преки методи

Методи за изолиране, съхранение и контрол на чисти култури от

микроорганизми

I. Чиста и обогатена култура.

1. Определение за чиста култура – съвкупност от бактериални клетки,
принадлежащи към един и същи вид или култура получена от една единствена
бактериална клетка в резултат на множество деления.
2. Определение за обогатена култура – тази култура, в която преобладават
представители на даден микробен вид или група микроорганизми с желаните
свойства. Получава се чрез култивиране на проба от изходния материал при
условия (селективни или елективни), благоприятстващи развитието на желаните
микроорганизми. Постига се чрез подбор на подходящи по състав хранителни
среди, температура, рН, аерация и др. Елективните условия не винаги са
оптималните за желания за изолиране вид, но подволяват намаляване на
съпъстващата микрофлора. При диагностиката на инфекциозни заболявания се
използват по-често селективни условия, които бързо и лесно да селекционират
инфекциозния агент.
II. Етапи на получаване на чиста култура.
1. Получаване на обогатена култура
2. Същинско изолиране на чиста култура
3. Проверка за чистота на културата
III. Meтоди за изолиране на чиста култура
1) Изолиране на чиста култура от една колония – може да бъде изолирана от
една клетка или от една колония. съществуват различни методи за това:
а. Фракционен метод на Пастьор (метод на разрежданията).
- Основен принцип: приготвяне на серия от разреждане на изходния материал като
се пресвята така, че в последните епруветки да попаднат единични клетки.
Начин на приготвяне на разрежданията - изследваният материал последователно
се разрежда в серия от 7-8 епруветки, съдържащи 9 мл стерилна вода или
физиологичен разтвор. Броят на епруветките се определя според предполагаемия
брой на микроорганизмите в обогатената култура. От изходния материал се взема 1
мл със стерилна пипета при стерилни условия и се прехвърля в първата епруветка.
Така изходната проба се разрежда 10 пъти. След това от първата епруветка, след
добро разбъркване, се прехвърля 1 мл с нова стерилна пипета във втората
епруветка. В нея изходната проба се разрежда 100 пъти. Дейстивята се повтарят до
последната епруветка от серията. Този тип разреждания се нарича още падащи
разреждания.
- Посев върху твърда хранителна среда – от последните 3 разреждания се
пренасят по 0,1 мл върху подходяща за развитието на желаните микроорганизми
твърда хранителна среда. Прави се плътен посев с помощта на шпатула. Посявките
се култивират при оптимални температура и време според изискванията на
микроорганизмите, от които ще се изолира чиста култура.

34
- Изолиране на чиста култура – след появата на единични колонии върху посятите
петрита с хранителна среда, се избират най-подходящите за изолиране. Те трябва
да бъдат ясно разграничими една от друга. С бактериологичното йозе се взима
материал от избраната колония и се пренася обикновено в епруветка с полегат агар
чрез щрихова посявка. След култивиране и развитие на бактериите, прорасналата
култура задължително се проверява за чистота.
б. Метод на последователен (изтощаващ) разсев по Дригалски – основава се
на същия принцип като метода на Пастьор. Това може да се извърши чрез плътен
посев или посев на щрих. За плътен посев се приготвят 3-4 стерилно разлети
петрита с подходяща хранителна среда. В първото петри се внася 0.1ml от
изследвания материал. Със стерилна шпатула течността се разтрива равномерно по
цялата повърхност на агара и без да се обгаря се пренася във второто и след това в
следващото петри. По подобен начин се процедира и при изтощаващия посев на
щрих. Културата се взема с йозе и се прави посев на щирх в първата паничка. След
това без да се обгаря се прави посев на щрих във втората и следваща петриева
паничка.
в) Метод на дълбочинна посявка на Кох – позволява да се изолират аеробни,
анаеробни и факуртативно анаеробни микроорганизми. Посявката се извършва в
дълбочина на твърда агаризирана среда.
Методи за изолирани на чисти култури - схема

Фракционен метод на Пастьор за изолиране на чиста култура чрез посев върху

твърда хранителна среда в петри.

10-1 мл 10-2 мл 10-3 мл 10-4 мл

Изходна
култура
0,1 мл 0,1 мл 0,1 мл

Плътен посев с
шпатула

Култивиране 18-24 h

Отчитане на растеж
и избор на единична
колония

35
Изтощаващ разсев с шпатула Изтощаващ щрих с йозе

1 2 3

Фракционен метод на Пастьор за изолиране на чиста култура чрез дълбочинно

посяване

Изходна култура

Разливане на
хран.среда в
петри

Култивиране 18-24 h

Отчитане на растеж
и избор на единична
колония

36
 г. Метод на температурните въздействия – използва се в съчетание с а.-в.
- чрез използване на оптимална температура за култивиране на желания
микроорганизъм.
- чрез висока температура – при изолиране на спорообразуващи
микроорганизъм. за получаване на обогатена култура – посевният материал се
пастьоризира при 80ºС за 15 мин. Изолирането на чистата култура става по м-да на
Пастьор

2) Изолиране на чиста култура от една клетка под контрол с микроскоп –

използват се при изучаване изменчивостта на микроорганизмите и процеса на
размножаване
Автоматизирани методи – с помощта на микроманипулатор или микроселектор.
Приборите са снабдени със специални фини игли или микропипети (капилярки). С
помощта на микровинтове те се придвижват много точно в различни посоки и дават
възможност при контрол под микроскоп да се уловят отделни микробни клетки и да
се пренесат в хранитителна среда за култивиране.

IV. Проверка за чистота на културата – видове контрол

1. Визуален – еднороден щрих на скосен агар
2. Микроскопски – свеж или траен микроскопски препарат; морфологично
еднородни клетки. Допустимо е незначително вариране на размера на клетките.
3. Култивационен – разсяване по Дригалски на различни хранителни среди;
следи се за еднородност на колониите

Количествено определяне на микроорганизмите

1. Същност на методите – чрез тях се определя концентрацията на бактериалните

клетки или бактериалната биомаса в единица обем. Изборът на метод зависи от
целта на изследването, състава на хранителната среда и морфологията на
микроорганизмите. Най-общо методите се разделят на две групи:
а) директни (преки) – отчита се общият брой клетки (живи и мъртви)
б) индиректни (непреки) - отчита се броя само на живите клетки
1.2. Преки методи – бързи, евтини, широко разпространени методи, но понякога
могат да доведат до погрешни резултати
а) с помощта на микроскоп – дават представа за формата и големината на
бактериалните клетки и възможност за диференциране на микроорганизмите в
морфологични групи (коки, пръчки)
 камера за броене на Тома, Бюркер, Тюрк, Горяев – използват се за
отчитане на броят на големи клетки: дрожди, големи бактерии; спори на
актиномицети и плесени. Камерата представлява дебело предметно стъкло, където
средната работна част е ограничена от две бразди. На централната му част е
нанесена мрежа. Мрежата е разположена по-ниско от другите две страни. Това е
дълбочината на камерата. Тя както и площта на квадратите в мрежата са посочени
в/у предметното стъкло.
- Техника на работа с камера за броене: камерата се приготвя за работа, като
работната част се покрие със специално стъкло до поява на Нютонов пръстен. Само

37
тогава внесеният обем от суспензията е точен. Затворената камера се запълва със
суспензията, която се внася с пастьорова пипета. Преброяването на клетките
започва след 3-5 мин за утаяване на клетките и разполагането им в една плоскост.
Отчитането става със сухите обективи. Броят се клетките в 10 големи или 20 малки
квадратчета – всички клетки вътре в квадрата, както и тези, които пресичат горната и
дясната страна на квадрата. Броят им да не надвишава 20.

 чрез мембранни филтри – използват се за броене на микроорганизми в

субстрати с ниска плътност (вода, инфузионни разтвори, стерилни и нестерилни
лекарствени форми, плодови сокове). Основава се на концентриране на клетките в/у
повърхността на филтър в резултат на филтруване на определен обем от
изследваната проба с последващо оцветяване и броене под микроскоп. Избира се
филтър с диаметър на порите 0,2 μm. Колкото е по-голяма плътността на клетките в
суспензията, толкова обемът на пробата трябва да е по-малък. Оцветеният филтър
се поставя в/у предметно стъкло и се брои под имерсия.

б) други методи за директно отчитане

 тегловно определяне на биомасата – използва се за оценка на растежа на
микроорганизмите в течни хранителни среди чрез определяне на сухото тегло на
биомасата
- Техника: подготвят се филтри, предварително изсушени за 1h при 100°С, които се
пренасят в ексикатор. След 1h се претеглят на аналитична везна с точност до 0,1
mg. Изсушаването и претеглянето се повтаря до постоянно тегло. Така подготвените
филтри се изпорзват за филтруване на определен обем културална течност, която
се суши при същия режим до постоянно сухо тегло. Сухата биомаса се определя по
формулата:

 определяне на биомасата по количеството белтък – съдържанието на

белтък в клетките се характеризира с относително постоянство. Неговото
количество в културалната течност нараства пропорционално на увеличаването на
броя на клетките и може да се използва за оценка на растежа на културата.
Използват се спектрофотометрични методи на Лоури или на Брадфорд.

 нефелометричноопределяне на броя на микробните клетки (оптичен

метод, основан на мътността на суспензията). Измерва се количеството разсеяна
светлина от клетъчната суспензия. В определени граници разсейването на
светлината е пропорционално на броя на клетките. При постоянна дължина на
вълната светоразсейването зависи от размера на клетките. Изискването е
равномерно помътняване на културалната среда; културата да не образува
струпвания, мицел, ципа; хранителната среда да е оптически прозрачна. Апарат –
спекол.
 определяне на броя на микробните клетки с помощта на стандарти за
мътност – визуално. За единица мътност условно е приета мътността на суспензия
от живи клетки на тифната бактерия във физиологичен разтвор. Има 4 еталона. С
тях се сравнява изследваната суспензия в отразена или преминаваща светлина на
бял фон.

Б. Същност на индиректните (непреки) методи

Чрез тях се определя броя само на жизнеспособните (живи) клетки в популацията,
които могат да образуват колонии върху твърда среда или да се развият в течна

38
среда. Трябва да се има предвид, че различните по състав хранителни среди са
подходящи за различни групи микроорганизими. (таксономични или физиологични) и
при определяне броя на микроорганизимите се отчитат само тези, които са способни
да растат на използваната среда (напр.: Гаузе 1 – за актиномицети; бирен агар – за
дрожди и плесени; МПА – за бактерии).
Предимства и недостатъци – по-точни (дават реална представа за броя на живите
клетки), но по-трудоемки и дълготраещи, изискващи стерилна стъклария и среди,
инкубация на микроорганизимите при определена температура и т.н.
2. Видове методи
а) определяне на броя на микроорганизмите чрез посев на твърди хранителни
среди (метод на Кох) - в основата му лежи съвременното схващане, че от една
клетка се формира една колония в резултат на многократни последователни
деления на тази клетка. Такава клетка се нарича колония образуваща единица
(colony forming unit – cfu). Прилага се за определяне на броя на жизнеспособните
клетки в 1 g или 1 ml проба от различни естествени субстрати (почва, вода,
хранителни продукти) или лабораторни хранителни среди.
Същност – посяване на определен обем от изследваната суспензия от
микроорганизими на твърда хр. среда в петриеви блюда и отчитане броя на
колониите след инкубация.
Етапи:
- приготвяне на разреждания – поради високата численост на
микроорганизимте. е необходимо да се правят разреждания на изходната суспензия
за получаване на изолирани (единични) колонии. Те се приготвят в 0,85% р-р на
NaCl (физииологичен р-р) или стерилна Н 2О, като се използва постоянен
коефициент на разреждане (обикновено десетократни). Разливат се епруветки с по
9ml физ. разтвор. След това по 1ml oт изходната суспензия се внасят в I вата
епруветка (това е първото разреждане – 10 -1). С нова пипета, след хомогенизиране
на съдържанието на епр., взема се 1ml и се внася в друга епр. (това е второто разр.
– 10-2). Броят на разр. зависи от плътността на м.о. в изследваните субстрати. Всяко
разреждане се прави с нова пипета.
- извършване на посев: може да бъде повърхностно или дълбочинно
а) повърхностно – в/у предварително разлята в петрита хр. среда (20-25ml) се
накапва инокулум с точно определен обем (0,05ml или 0,1ml). Посев се прави от
последните три последователни разр. в по 2-4 повторения. Посевът може да се
направи с една пипета като се започне от най-високото разр. Материалът се
разтрива много добре с шпатула по повърхността на средата.
б) дълбочинно – в празно стерилно петри се накапват 0,1ml посевен материал,
заливат се с разтопена и охладена среда и внимателно с кръгови движения се
разклаща за размесване на съдържимото. Посева може да се извърши и по
начина описан при изолиране на чисти култури от факултативни анаероби.
Култивирането става за: 2-3 дни на бактерии; 5-7 дни - дрожди и плесени; 7-14
дни – актиномицети при съответната температура, като петритата се обръщат с
дъното нагоре.
- отчитане броя на колониите – брои се без да се отварят петритата. Може да
се използва специален апарат – брояч на колонии. Всяка колония се
отбелязва с маркер за да се избегне повторно преброяване. Брои се във
всички петрита от всяко разреждане, но изчисления се правят за
разреждането, при което са прораснали от 30-100 колонии.
Количеството на клетките в 1ml от даден субстрат се изчисляват по формулата:

39
 N= a.10n N– количество на клетките в 1ml [cfu/ml]
V a – среден брой колонии от дадено разреждане.
10 – коефициент на разреждане
n – номер на разреждането, от което е направен
посева
V – обем на посева [ml]

б) определяне на количеството на клетките чрез посев в течна хранителна

среда (метод на пределните разреждания – МПР) – използва се за отчитане на
МО, които лошо или съвсем не се развиват в плътни среди, а също и за определяне
числеността на микроорганизмите, отнасящи се към една или друга физиологична
група.
Същност: в епруветки с течна хранителна среда се внася строго определен обем
от различни разреждания на изследвания субстрат. След инкубацията, изхождайки
от броя на епруветките, в които се наблюдава или отсъства развитие се разчита по
таблица най-вероятния брой (НВБ) клетки, съдържащ се в 1ml от изходния субстрат.
Етапи:
- приготвяне на разреждания – по същия начин както в точка а)
- посев в течна хранителна среда – средата се разлива в еднакъв обем (5ml
за аероби и 10-15ml за анаероби) в епруветки и се стерилизира. Посев се прави от
последните 3-4 разр. От тях се посяват от 3 до 5 епруветки. Количеството на
посевния материал е еднакво – по 1мл. Засетите епрув. се инкубират 3-10 дни в
зависимост от скоростта на растеж на м.о.
- регистрация на наличие или отсъствие на растеж след инкубацията –
става въз основа на различни показатели: помътняване на средата; образуване на
ципа, утайка, газове или по натрупването на определени продукти в средата.
- пресмятане на НВБ клетки в единица обем от изходния субстрат – отчита
се по таблицата на Мак-Креди, разработена на основата на вариационната
статистика. Първоначално се съставя числова характеристика от 3 цифри.
Количеството на м.о. в 1ml (g) от изходния субстрат съответства на това
число, умножено по това разреждане, което е взето за получаване на първата
цифра на числовата характеристика.
Точността на методите зависи от грешките на метода (от случайното разпределяне
на клетките в суспензията и се явява резултат от ограничения брой на отчетените
клетки) и от технически грешки (неточност в приготвянето на разрежданията и
накапването).

III. Практически задачи

1. Количествено определяне на броя на клетките в почвена суспензия
суспензия по метода на Кох.

40
2. Количествено определяне на броя на клетките в 1 мл почвена суспензия по
метода на пределните разреждания

41
Резултати:

42
 УПРАЖНЕНИЕ № 6
--------------------------------
Влияние на физичните, химичните и биологичните фактори върху
растежа и развитието на микроорганизмите.

I.Физични фактори
1. Влажност на средата
Съдържанието на вода в микробната клетка е 73-90%, така че всички жизнени
функции протичат във водна среда, но присъствието на вода все още не означава,
че тя е достъпна за микроорганизмите. Достъпността на водата се определя от
нейната активност в средата (аw). По отношение на издръжливостта на засушаване
микроорганизмите се подреждат по следния начин. Най-чувствителни са
бактериалните видове, следвани дрождите и най-издържливи са плесените.
Вегетативните форми са много по-чувствителни към засушаване от спорите.
Намаляването на водното съдържание в микробните клетки до определено
поносимо ниво води до намаляване интензивността на жизнените процеси и
съответно до удължаване на времето, в което могат да останат жизнеспособни. В
практиката това има огромно значение за продължителното съхраняване на
микроорганизмите под формата на лиофилизирани култури. Лиофилизацията е
процес, при който микробните култури бързо се замразяват и изсушават под вакуум.
В хранителната промишленост за съхраняване на нестерилизирани продукти (месо,
риба, плодове, зеленчуци), те се подлагат на изсушаване.
2. Налягане
а) осмотично
Приема се, че нормалното осмотично налягане за бактериите отговаря на 0,5% р-р
на NaCl. Тази концентрация варира при различните видове бактерии от 0,5 до 3%.
Бързото пренасяне на бактерии от среда с високо в среда с ниско осмотично
налягане (хипотоничен р-р) води до навлизане на вода и до разкъсване на
микробните клетки (плазмоптиза) и обратно, пренос в хипертоничен р-р – до
плазмолиза. За да бъдат жизнеспособни микроорганизмите, вътреклетъчното им
осмотично налягане трябва да бъде по-високо в сравнение с осмотичното налягане
на окръжаващия ги разтвор. Съществуват бактерии, които в процеса на еволюцията
са се пригодили към живот в среда с високо осмотично налягане – т. н. осмофили.
Те се срещат в морската вода или в концентрирани захарни разтвори. Халофилите
не растат при по-ниско съдържание на NaCl от 13-29%. Някои осмофилни дрожди
могат да се развиват в 70-80% захарни разтвори, дори в чист пчелен мед. Корекция
на осмотично налягане при приготвяне на хранителни среди се постига с добавянето
на някои осморегулатори: NaCl и KCl – за еубактериите; аминокиселини - за
архебактериите, алкохоли или захари – за еукариотните микроорганизмите. За
консервиране на някои продукти в практиката се използват разтвори с високо
съдържание на NaCl или захари.
б) хидростатично
Хидростатичното налягане се понася добре от бактериите. Едва налягане над 1000
атм. причинява необратими промени в тях, вследствие на промяна на вискозитета
на протоплазмата. Почвените микроорганизмите загиват при налягане 200-600 атм.,
докато сулфатредуциращи бактерии, изолирани от земно масло издържат с лекота
такива налягания. Висока издържливост показват и морските бактерии. В този аспект
микроорганизмите се обозначават като барофилни и барофобни. Съвсем друг

43
ефект има налягането, комбинирано с топлина. Прегрети водни пари при налягане
1,5 атм. са достатъчни да разрушат вегетативните форми за 10-15 мин., а за 20-30
мин. и най-устойчивите спори. Този метод на обезвреждане на микроорганизмите.
намира широко приложение в микробиологичната практика.
3. Температура
Температурата (t) е фактор с особена важност, тъй като значително повлиява
интензивността на бактериалния растеж. Тя влияе върху скоростта на клетъчните
реакции, характера на клетъчния метаболизъм, потребността на клетката от
хранителни вещества. Влиянието на t върху микроорганизмите се определя по
способността им да преживяват след продължително престояване в екстремални t
условия и по способността им за растеж при тези условия. Бактериите не разполагат
с терморегулационни механизми, поради което приемат температурата на средата,
която обитават. Съществува диапазон от три точки, описващи влиянието на t върху
растежа и развитието на микроорганизмите:
- минимална t - размножаването на микроорганизмите спира; обменните процеси
са сведени до минимум, но клетките остават живи. Незначително понижаване на
тази t води до гибел на клетките. Причина за това се счита, че при тази t в клетката
се натрупват ненаситени липиди, което променя пропускливостта на мембраната. От
друга страна, се натрупват и много токсични вещества, които не могат да преминат
през мембраната. Способността за преживяване при ниски t има значение за
практиката: от една страна - за съхраняване на хранителните продукти, а от друга -
за продължителното съхраняване на микроорганизмите в замразено състояние.
Критични точки за преживяване на микроорганизмите. при ниски t са при
замразяването и размразяването им. При неколкократно замразяване и
размразяване клетките загиват поради механичното действие на образувалите се
ледени кристали. При бавно и постепенно замразяване се позволява излизане на
водата от клетките и не се допуска образуване на вътреклетъчни кристали.
Използването на протектиращи среди (с мляко, захари, минерални соли) повишава
преживяемостта на м.о. при замразяване в течен азот.
- оптимална t - при нея микроорганизмите се развиват най-добре; натрупват най-
интензивно биомаса; ензимните процеси протичат с най-висока скорост. Пример: E.
coli при опт. t удвоява биомасата си за 20 мин., а при 8С – за 41 часа.
- максимална t - най-високата t, при която микроорганизмите спират растежа и
размножаването си, но все още са жизнеспособни. Над тази t, дори незначително
повишаване води до смърт. За практиката голямо значение имат t над
максималната, защото с тяхна помощ може да стане обезвреждане на редица
болестотворни микроорганизмите. Механизъм на действие на високите t - под тяхно
действие се разрушават редица слаби връзки (водородните, сулфхидрилните) в
макромолекулите на клетката. Това води до денатурация на белтъците,
инактивиране на ензимите и до необратима промяна в нуклеиновите к-ни.
Издържливостта на бактериите към високи t е различна за различните видове и
щамове и е генетично обособена. Спорите са по-устойчиви поради по-високото
съдържание на калциеви йони и наличието на дипиколинова к-на и аминокиселини
със сулфхидрилни групи. Най-устойчиви на високи t са архебактериите. Скоростта,
с която загиват бактериите се определя от степента на покачване на t, от
продължителността на въздействие, от бактериалната плътност и от състава на
средата. Полезната t област е близка до оптималната, а максималната е само с
няколко градуса по-висока от нея. Обратно – минималната t може да бъде с 20-40С

44
по-ниска от оптималната. Между скоростта на растеж и t има линейна зависимост,
но само в тесен диапазон при t по-ниски от оптималната.
Според отношението им към t, микроорганизмите се подразделят на:
- психрофили – растат при оптимална t: 10-15-20С, мин. t: -8С; макс. t: 30С;
това са морски и почвени м.о. и патогенни за рибите и морските растения м.о.
- мезофили – опт. t: 25-38С; мин. t: 5-10С; макс. t: 40-45С; голяма част от
почвените м.о.; м.о. от нормалната микрофлора и патогените по животните и човека;
почти всички дрожди и плесени
*психротолерантни
*термотолерантни
- термофили - опт. t: 50-70С; мин. t: 30-35С; макс. t: 80С; м.о. в термалните
извори, гейзерите, оборския тор, почви богати на растителни отпадъци
4. Киселинност на средата (рН)
Тя е показател за концентрацията на водородните йони в средата. Влияе върху
микроорганизмите пряко – чрез непосредственото въздействие на Н + върху клетката
и косвено – чрез повлияване на: йонното състояние и достъпността на
неорганичните йони и метаболитите; стабилността на макромолекулите;
равновесието на електричните заряди на повърхността на клетката. Измерва се
потенциометрично. Поддържа се чрез буферни р-ри. Зависи от температурата.
Микробните ензими са активни в диапазона от 4,0 до 9,0.
Според отношението им към рН на средата, микроорганизмите се подразделят на:
- киселинноустийчиви – диапазон на развитие рН: 2,0-6,0
*ацидофили – дрожди и плесени (рН:4,0-6,0); p. Lactobacillus, p. Acetobacter, Sarcina
ventriculi (pH: 2,0-5,0); p. Thiobacillus (екстремални – рН: 1,5)
- неутрофили – опт. рН: 6,0-8,0 – болшинството от бактериите; някои от тях могат
да се развиват в диапазон на рН: 4,0-9,0; патогенните м.о. – рН: 7,2-7,4
- алкалноустойчиви – рН: 4,0-11,0 - актиномицети
*алкалофили – рН: 9,0-11,0.
5. Звукова енергия (ултразвук)
Представлява високочестотни колебания, които в течна среда предизвикват
образуване на мехурчета (кавитация) в протоплазмата и водят до разрушаване на
микробната клетка. Бактериите са по-чувствителни от гъбите.
6. Лъчиста енергия
Това е енергията под формата на електромагнитни вълни с различна дължина на
вълната: инфрачервени, ултравиолетови и късовълнови (Rö, -, - и-) лъчи.
Инфрачервените “топлинни” лъчи имат физиологично действие върху м.о.
Ултравиолетовите лъчи действат повърхностно на микробната клетка. Биологично
действие (мутагенно и летално) имат УВ–лъчите с : 200-295 nm. Те предизвикват
образуването на тиминови димери (точкови мутации) в молекулата на ДНК. Много
м.о. притежават репарационни ензимни системи, чието действие се активира от
светлината (фотореактивация) за отстраняване на увредените ДНК-участъци. Най-
чувствителни са младите, размножаващи се клетки. По-устойчиви са зрелите клетки
и спорите. Поради бактерицидното им действие се използват широко в
микробиологичната практика за стерилизация на боксови помещения и пластмасови
изделия.
Лъчите във видимата област се използват от фотосинтезиращите
микроорганизмите (пурпурни серни бактерии) като източник на енергия за
асимилация на СО2. Но други бактерии са чувствителни към слънчевите лъчи.
Тяхната чувствителност може да бъде повишена от някои в-ва : багрила – еозин,

45
фуксин. Това явление се нарича фотосенсибилизация, а самото действие –
фотодинамичен ефект. Грам (-) бактерии са по устойчиви на слънчевите лъчи.
Йонизиращи лъчи (Rö, -, - и -) – проникват дълбоко в микробната клетка,
предизвикват йонизация на атомите и разрушаване на молекулните структури.
Механизъм на действие – теория на мишените (ензимите или ДНК директно
поглъщат фотони) и теория на свободните радикали (водата и някои съединения,
поглъщайки енергия се разцепват на Н + и ОН-, които могат да предизвикат
разрушителни окислително-редукционни реакции). Най-чувствителни са младите (от
лог-фазата) клетки, както и безцветните бактерии, а пигментираните (с розов,
оранжев или жълт пигмент) са по-устойчиви.
Бактерицидното действие на лъченията се определя от интензивността на
облъчване, от коефициента на поглъщане на лъчите от микроорганизмите и от
времето на експозиция.

II.Химични фактори – подразбират се тези от тях, които оказват токсично

въздействие или причиняват гибел на бактериалната клетка.
1. Видове химични вещества по произход: природни; синтетични химически
вещества, резултат от жизнената дейност на други организми
2. Въздействие на химичните вещества върху бактериалната клетка
а) бактерицидно – предизвиква необратими промени в микробната клетка и нейната
смърт
б)бактериостатично – води до задържане на развитието на микроорганизмите, без
да бъде убит. След отстраняване на фактора, микроорганизмите се развиват
отново.
3. Фактори, от които зависи действието на химическите вещества:
а) химичната природа
б) структурата на веществото
в) концентрацията
г) биологията на въздействания микроорганизмите – възраст (в лог-фазата е най-
чувствителен); способност да образува капсула; състава на клетъчната стена: Грам
(–) по-устойчиви
д) температурата на средата – повишаването на температурата в определени
граници засилва токсичното действие на в-вото
е) присъствието на друг химичен фактор – синергизъм (адитивно или потенцирано
действие) или антагонизъм (отслабва ефекта на първия фактор)
4. Механизъм на действие на химическите вещества върху бактериалната
клетка
а) химически вещества, действащи върху повърхността на микробната клетка:
повърхностно-активни вещества (детергенти) - променят повърхностното
напрежение на клетката; отлагат се върху мембраната; променят пропускливостта
на мембраната
б) химически вещества, инхибиращи ензимната активност – блокират SH-групите
на дехидрогеназите – йони на: Ag; Hg; As; Cu; Cd и др.
в) химически вещества, увреждащи бактериалната протоплазма – взаимодействат
с протоплазмените белтъци, водят до дехидратация на белтъците, до слепването и
коагулацията им, а от тук и до спиране на обменните процеси
г) антиметаболити (структурни аналози) – имат структурно сходство с метаболитите,
конкурират се с тях за място върху ензимната повърхност и така пречат за

46
протичането на дадено метаболитно стъпало. Напр. сулфонамидите се конкурират с
n-аминобензоената к-на при синтеза на фолиевата к-на (важен растежен фактор).
д) химическите вещества, действащи върху нуклеиновите к-ни - нарушават
секвенцията на нуклеиновите бази, като предизвикват точкови мутации или смърт на
бакт. клетка: нитрозо-съединения, акридинови багрила, акриламид

III. Биологични фактори - определение:

Влиянието, което оказват микроорганизмите върху други видове бактерии, вируси,
гъби и др. Означението е условно, тъй като тяхното влияние е физикохимично.
Някои са с изяснена химична структура като антибиотици, бактериоцини, растежни
вещества, витамини, аминокиселини
2. Видове взаимоотношения между организмите: асоциативни и конкурентни.
2.1. Асоциативни взаимоотношения:
а) симбиоза - съжителство, при което два организма взаимно си създават
благоприятни условия за развитие, изразени най-често в продукция на обменни
вещества. Пример: млечно-кисели бактерии (кисело рН) +дрожди (витамини и АК);
б) метабиоза - един организъм подготвя развитието на друг, в основата на
кръговрата на основните биогенни елементи,
Пример: аероби и анаероби, амонификатори и нитрификатори
в) коменсализъм - взаимна полза не е изразена отчетливо, но съвместното
съжителство не причинява и вреда. Предполага се, че едната популация е
облагодетелствана, другата остава неповлияна т.е. не се благоприятства нито пък
търпи отрицателно влияние. Наблюдава се често, когато неповлияната популация в
хода на своето развитие и метаболизъм модифицира местообитанието по токъв
начин, че другата е облагодетелствана.
г) сателизъм – косвено стимулиране развитието на един микроорганизъм от
друг.
Пример: дрождите и сарцините, продуцираните от тях аминокиселини и витамини,
често способстват за растежа и размножаването на други, по-взискателни към
хранителни субстрати бактерии (млечно-кисели и оцетно-кисели)
3. Конкурентни взаимоотношения:
а) антагонизъм - явление, противоположно на симбиозата. Съвместният живот
на двата антагониста е невъзможен, тъй като обикновено единият подтиска
развитието на другия.
- пасивен – не се установява директно взаимодействие, често с пасивен
антагонизъм се означава по-бърза приспособеност към условията на живот и
хранителните субстрати и изпреварване на по-бавно растящите видове.
- активен - единият антагонист отделя вещества, които увреждат пряко втория,
Пример: млечно-киселите бактерии продуцират млечна киселина, която подтиска
гнилостните бактерии. Стрептомицетите продуцират антибиотици с различен
спектър на действие, които подтискат или напълно инхибират развитието на голяма
група бактерии.
б) паразитизъм - един микроорганизъм използва друг като източник на
хранителни вещества, Пример: бактерии – бактериофаги („вируси“ по бактериите),
бактерии-бактерии Bdellovibrio
в) хищничество.
4. Антагонизъм, антибиоза - явление, при което бактериите по време на
жизнената си дейност отделят вещества, които имат бактерицидно или
бактериостатично върху други микроорганизми, отделените вещества се наричат
антибиотици.

47
 1. Антибиотици
Вторични метаболити, нискомолекулни вещества, притежаващи висока
физиологична активност по отношение на опредерени групи микроорганизми или
към злокачествени тумори, избирателно задържайки техния растеж или напълно
потискайки тяхното развитие. В много ниски концентрации оказват своето
бактерицидно действие.
Класификация:
- на принципа на биологичния им произход (синтезирани от бактериални видове,
плесени, актиномицети)
- на принципа на химичната им структура и строеж (бета-лактамни,
аминогликозидни, тетрациклини, макролиди, анзамицини, полипептиди и такива
които не са отнесени в никоя от изброените групи)
- по механизма на действие - Инхибиране на синтезата на клетъчната стена,
Инхибиране на белтъчния синтезата, Инхибиране на синтезата на нуклеитовите
киселини и други.
- по спектъра на действие – широкоспектърни, тесноспектърни

Практическа работа:
1.Установяване леталния ефект на ултравиолетовото лъчение върху суспензия от
Е.coli и намиране процента на преживяемост
2. Проверяване действието на различни концентрации на белина върху същата
суспензия
3. Установяване на взаимоотношения на антагонизъм между микроорганизмите:
- метод на перпендикулярния щрих
- методна радиалните щрихи
- метод на агаровите блокчета
- метод на ямките
- антибиотикограма

а. Метод на перпендикулярния щрих – предварително посяване на предполагаем

щам продуцент на подходяща хранителна среда и култивиране при подходящи
условия. Нанасяне на щрихи от тест култури, перпендикулярно на прорастването на
щама продуцент. Ако продуцираното вещество оказва действие върху тест-
микроорганизмите, то растежът на последните ще бъде отдалече на известно
разстояние от щриха на продуцента. Колкото по-голяма е отдалечеността, толкова
по-висока е чувствителността на тест-микроорганизма. Методът дава възможност за
тестване на спектъра на действие на продуцираното антибактериално вещество.

1
2
3
4

Тест култури: 1 – Escherihia coli (грам-отрицателна бактерия), 2 – Bacillus subtilis

(спорообразуваща бактерия), 3- Sarcina lutea (грам-положителна бактерия), 4 –
Saccharomyces cerevisiae (дрожди).

48
Недостатък на метода: една и съща среда се използва за култивиране на щама
продуцент и тест-културите.

б. Метод на радиалните щрихи – върху центъра на подходяща за развитието на

тест-микроорганизми хранителна среда, се поставя блокче от агарова среда с
развит щам продуцент. Под формата на радиални щрихи се нанасят тест-културите.
Посетите петрита се поставят в хладилник за 2 часа за дифундиране на
антибактериалното вещество от агаровото блокче в средата с тест-културите.
Култивиране при условия подходящи за развитието на тест-микроорганизмите. По
растежа на щриха на културите се съди за тяхната чувствителност към тестваното
вещество. Колкото по-отдалечен е щриха от агаровото блокче на щама продуцент,
толкова по-чувствителна е тест-културата.
4
1

3
2
Тест култури: 1 – Escherihia coli (грам-отрицателна бактерия), 2 – Bacillus subtilis
(спорообразуваща бактерия), 3- Sarcina lutea (грам-положителна бактерия), 4 –
Saccharomyces cerevisiae (дрожди).

в. Метод на агаровите блокчета – използва се предварително развита култура на

щама продуцент. Със стерилизирана сонда (тапопробивач) се изрязва блокче от
културата и се пренася върху ново петри, върху което преди това е направена
плътна посявка от течна среда на тест-култура. Методът дава възможност за
тестване на повече продуценти към дадена тест-култура, като агаровите блокчета се
подреждат радиално равномерно върху повърхността на петрито с тестваната
култура. Инкубиране 2 часа в хладилник за дифундиране на антибиотика от
агаровите блокчета в средата. Култивиране на подходяща за развитието на тест-
културата условия. Ако използваната тест-култура е чувствителна към антибиотика
около агаровите блокчета се образуват зони без растеж, т.нар. стерилни зони. По
диаметъра на стерилната зона се съди за чувствителността на използвания тест.

Плътен
посев от
тест-кулура

Агарово
блокче с
развита
култура на
щам
продуцент на
антибиотик

49
 г. Метод на ямките в агарова среда – Използва се за проверка на антибиотичната
активност на култура от течна среда. Върху повърхността на агарова среда,
върху която предварително е посят тест-миккроорганизъм, се правят ямки с
помощта на стерилна сонда, разположени на еднакво разстояние една от друга.
С питена в направените ямки се поставя културална течност на различни
микроорганизми, за които се предполага, че синтезират антибиотик.
Количеството трябва да е такова, че да не излиза извън ямката. Инкубиране в
хладилник за дифундиране на течността в агаровата среда. Култивиране в среда
подходяща за развитието на тест-културата. Ако посетият тест е чувствителен
около ямките ще се образуват стерилни зони. Диаметърът им показва силата на
действие на антибиотика и чуввстителността на изследвания тест.

Плътен
посев от
тест-кулура

Ямка с течна
култура на
щам
продуцент на
антибиотик

д. Антибиотикограма – Чувствителността на микроорганизмите към различни

антибиотици може да бъде определена чрез специално произвеждатни хартиени
дискове, нопоени с определени антибитици в различни концентрации. Тест-
микроорганизмите се посяват в подходящи за техния растеж твърди хранителни
среди. Върху повърхността на инокулираната среда се поставят дисковете. Петрита
се поставят в хладилник за дифундиране на антибиотика в средата. След
инкубиране при подходящи условия, ако даденият тест-микроорганизъм е
чувствителен към изследваните антибиотици около дискчетата се появяват
стерилни зони с различни размери. Стерилна зона с диаметър по-голям от 30 мм е
показател за висока чувствителност на изследвания микроорганизъм към дадения
антибиотик. Зона, чийто диаметър е по-малък от 12 мм показва ниската
чувствителност на микроорганизма.

R R
Антибиотични
дискове

G
A G
A

Стерилна зона

50
 УПРАЖНЕНИЕ № 7
--------------------------------
Разпространение на микроорганизмите в природата. Санитарно-
микробиологичен анализ на почва, вода и въздух.

I. Почвата като среда за развитие на микроорганизмите.

1. Определение за почвата. Видове почвени фази
- твърда фаза - обединява минералните вещества и органичните
съединенияния, резултат от жизнената дейност на микроорганизмите - представлява
80-90% от почвата.
- течна фаза - обединява водата от валежите и грунтовите води, образува
почвения разтвор съдържащ разтвор на соли, орган. киселини, хуминови кисилини и
газове; от този разтвор микроорганизмите усвояват хран. вещества и водата.
Оптималната влажност за микроорганизмите е 60-70-%. При повишаване на
влажността се измества въздуха от почвените частици и се нарушава аерацията.
- газообразна фаза - въздухът запълващ промеждутъците в почвените
частици, незаети от водата. Количеството му се определя от порьозността на
почвата и обезпечава развитието на аеробни и факултативно анаеробните
микроорганизми.

2. Фактори, оказващи влияние върху количеството и качествения състав на

почвената микрофлора.
а) микроорганизмите попадат в почвата по различни начини, намират се в го-
леми количества, участват в минерализацията на органични вещества и участват
във формирането на почвата, наблюдава се голямо разнообразие на видовете
микроорганизми: преобладават бактериите, но се откриват и актиномицети, дрожди,
плесенни гъби, водорасли и т.н. Микроорганизмите се разполагат на повърхността
от 1.5 см до 2 см. Най-богати почвени проби се вземат на дълбочина от 3-30 см.
б) фактори:
- аерация на почвата - определя две основни групи - аероби и анаероби, всяка
от групите има под отнасяния в зависимост от отношението си към кислорода.
- реакция на средата - определя наличието на ацидофилни (плесени, дрожди,
бактерии от род Acetobacter, рН на средата е 3-5), неутрофилни микроорганизми
(при рН на средата от 6.5-8 и се изолират нитрифициращи бактерии, плесени и
актиномицети) и алкалофили (над рH 8.5). Някои микроорганизми имат много тесен
диапазон на рН като азотфиксиращите бактерии - рН 7.4-7.6
- температура на почвата - определят се три групи : психрофили (15-20 оС),
мезофили (25-30оС) и термофили (50-66оС.) Установени са и микроорганизми
живеещи при екстремални условия - криофили (при 0-4 оС) и екстремални термофили
при 80-90оС в горещите минерални извори.
- други фактори: годишен сезон, метеорологични условия, агротехнически
условия, индустриални предприятия

3. Обща характеристика на почвената микрофлора.

а) бактерии - Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus
aglomeratus, Bacillus idosus, азотфиксиращи микроорганизми Azotobacter, Rhizobium

51
 б) актиномицети - повечето известни видове от род Streptomyces, както и дру-
гите родове от Actinomycetales
в) плесени - Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria и други .

А) Типична (собствена, нормална) почвена микрофлора – състои се от различни

таксономични и физиологични групи микроорганизми. Най-многобройни са
бактериите (от тях – спорообразуващите: p. Bacillus, p. Clostridium), следвани от
актиномицети – p. Streptomyces и гъби – p. Penicillium, p. Aspergillus, p. Fusarium, p.
Alternaria (те формират голяма биомаса поради разклонения мицел). Голяма част от
м.о., участващи в кръговрата на веществата (амонифициращи, нитрифициращи,
денитрифициращи, азотфиксатори – p. Azotobacter, p. Rhizobium,
целулозоразлагащи, пектинразлагащи и др.) са почвени м.о. В зависимост от
условията в почвата превес има една или друга група м.о. (напр. в кисели почви –
числено превъзходство имат плесените и киселинно устойчивите бактерии). Към
нормалната почвена флора принадлежат и някои причинители на инфекциозни
болести по човека – причинителите на антракс, тетанус, ботулизма, газ-гангрената.
- автохтонна микрофлора –микроорганизми в ненаторена почва, богата на хумус и
разгражда хумусовите съединения – проактиномицети, бактерии и гъби
Б) Вторична (алохтонна) – допълнително попаднала, несвойствена за почвата.
Това са главно патогенни м.о., попаднали чрез трупове и екскременти на животни,
отпадни води, торове. Тези м.о. не могат да се размножават в почвата и преживяват
в нея кратко време (5-6 мес.). Количеството на някои от тях (E. coli и
Clostridiumperfringens), които са нормални обитатели на стомашно-чревния тракт
на човека, служи като санитарен показател за фекално замърсяване на почвата. За
санитарно-бактериологична оценка на почвата се определя коли–титър и
перфрингенс-титър (най-малкото количество почва, в което се откриват клетки на
тези бактерии). Едновременното им откриване свидетелства за епидемиологично
опасно фекално замърсяване.

II.Водата като среда за разпространение на микроорганизмите:

1.Вода - съдържа широк спектър от органични и минерални компоненти, които
служат като хранителен субстрат на микрорганизмите. Във водата слънчевите лъчи
имат по-слабо изразено бактерицидно действие отколкото във въздуха и това
определя наличието на повече мо в тази среда.
2. Природните води се разделят на:
- подземни (съдържат малко количество мо, което се обяснява с естествената
филтрация през почвата)
- атмосферни (увличат микроорганизмите от въздуха) и са по-слабо населени
над планинските и арктическите области, повече мо има над промишлените райони.
- повърхностни слоеве на реки, езера, морета и водохранилища; типични
представители за тези води са зелените и пурпурните бактерии, желязобактериите,
Pseudomonas, Bacillus, Spirillum и други.
3. Фактори, оказващи влияние върху числеността и качествения състав на мо
във водата.
а) рН, температура, разтворен кислород, съдържание на соли
б) степен и характер на замърсяването: въведени са три сапробни зони
*/полисапробна зона - води съдържащи голямо количество разнообразни
органични в-ва от растителен и животински характер, битови и отпадни води.
Наблюдават се процеси на анаеробно разграждане на орг.в-ва с отделяне на Н2,

52
амоняк, метан и др. Основни мо в тази зона са представителите на род Clostridium и
чревни бактерии
*/мезосапробна зона - води характеризиращи се с процеси на минерализация
на органичните в-ва с преобладаване на анаеробните процеси.
*/олигосапробна зона - води характеризиращи се с процеси на окисление на
нитритите в нитрати, на желязо (2+) в желязо (3+) и незначително присъствие на
чревни бактерии.
4. Санитарен анализ на водата:
а) необходими микробиологични анализи за непозната вода
- определяне на общия брой микроорганизми на среда МПА с инкубиране за
72 часа при 37 оС
- отчитане общия брой на колиформите с идентификация на E.coli на течна
хранителна среда Readycult Coliform 100
- отчитане на общия брой на стрептококите (Streptococcus faecalis) на течна
хранителна среда - Roth-Litsky
- отчитане общия брой на Clostridium, сулфат-редуктори на твърда хранителна
среда VF ou Wilson Blair. Характеризирането на Cl. perfringens е задължително
- отчитане наличието на бактериофаги във водната проба на пептонна вода
- отчитане броя на патогенните микроорганизми в случай на епидемия -
Salmonella, Shigella
б) вземане на водна проба - директно и чрез филтруване за концентриране на
микробите
5. Норми за съдържанието на микроорганизмите във вода
5.1. Санитарни норми
а) за нетретирани води:
- липса на патогенни мо
- отсъствие на E.coli в 100 ml вода
- отсъствие на стрептококи в 50 ml вода
- отсъствие на Clostridium сулфат-редуктори в 20 ml вода
б) за третирани води:
- недопустима е наличието на патогенни микроорганизми, E.coli, Enterococcus.
faecalis
- допустимо е наличието на Clostridium в много малък брой
5.2. Санитарни норми за питейна вода:
0 до 10 бактерии - много чиста вода
10 до 100 бактерии - съмнителна вода
над 100 бактерии - замърсена вода
5.3. Норми за индустриална вода:
0 до 100 бактерии/мл - много чиста вода
100 до 1000 бактерии/мл - чиста вода
1 000 до 10 000 бактерии/мл - средно чиста вода
10 000 до 100 000 бактерии/мл - замърсена вода
повече от 100 000 бактерии/мл - силно замърсена вода
Колититър – най-малкото количество вода, в което може да се докаже наличието на
поне една колибактерия.
Колииндекс – количеството чревни бактерии E.Coli в 1l вода.

III.Въздухът като среда за развитие на микроорганизмите - неблагоприятна

среда поради:
- отсъствие на хранителни вещества

53
 - бактерицидно действие на слънчевите лъчи
- температурни колебания

1.Фактори, определящи количеството и състава на микроорганизмите във

въздуха:
- степен на замърсеност с прах, дим, водни капчици, органични и минерални
замърсявания, най-обилна и разнообразна на мо е микрофлората на ниските слоеве
на тропосферата, намиращи се в непосредствена близост до земната повърхност.
- географска зона, надморска височина, метеорологични условия, годишен
сезон
2.Основни групи микроорганизми във въздуха: нестабилен качествен състав:
а) бактерии : пигментни микрококи като Micrococcus candidus, Micrococcus
roseus; Sarcina lutea, Sarcina aurantiaca,
споровите бактерии от род Bacillus като Bacillus subtilis, Bacillus megaterium,
б) актиномицети, плесени, дрожди като Penicillium, Aspergillus, Mucor,
Torulopsis
в) патогенни бактерии се установяват във въздуха на помещенията и като
санитарни показатели се отчитат следните видове микроорганизми: ( -зеленеещи
стрептококи Streptococcus salivarius – причинява α – хемолиза/ частична / на
хемоглобина и води до появата на зелеещи зони около колониите на среда кръвен
агар); (-хемолитични стафилококи Staphylococcus pyogenes – β – хемолиза -
напълно хидролизира хемоглобина и води до появата на светли зони около
изолираните колонии на среда кръвен агар), хемолитични стафилококи
(Staphylococcus aureus)

3. Методи за микробиологичен анализ:

3.1. Отчитане на общия брой микроорганизми в 1 m 3 въздух по утаителния
метод на Кох:
Основава се на автоутаяване на микроорганизмите от въздуха върху твърда
хранителна среда (МПА, малцов агар, дрождев автолизат). В петриеви панички се
разливат по 10-15 см3 хранителна среда, темперират се за проверка на
стерилността и се пренасят в изследваното помещение. Петритата се отварят и
оставят за 15 минути. Посетите по този начин петрита се оставят в термостат при
30оС и броя на прорасналите колонии се отчитат на 24, 48 и 72 час.
8.2. Филтрационни методи - основават се на пропускане на въздух през
стерилна среда (МПБ или физ.р-р) или през стерилни сухи вещества, които
задържат MO-те (захар, натриев сулфат).
III. Практически задачи:
1. Вземане на водна проба:
- от чешма в лабораторията или друг водоизточник. Необходими изисквания -
стерилност на крана, стерилност на съда и стерилност при пробовземането.
Необходими материали: стерилна колба от 500 мл, спирт и спиртна лампа.
2. Определяне количеството на микроорганизмите във водна проба.
За определяне на общия брой микроорганизми в изследваната водна проба се
използва среда МПА на петрита и се посява по 1 мл. Култивиране при 37 оС за 48-72
часа.
3. Определяне колититъра на среда Readycult Coliforms 100 – в стерилна
стъклена банка се поставят 100мл от изследваната проба, взета според
изискванията, и се прибавя 1 опаковка от средата като се работи в асептични
условия. Банката се разклаща добре и се инкубира за 24 часа при 37 0 С.

54
Отрицателна реакция – жълт цвят, положителна – синьозелен. Доказване на E. coli –
чрез флуоресценция на УВ-лампа ( 366 нм ). В епруветка от положителна проба се
накапва реактив на Ковач – появата на червен пръстен потвърждава наличието на
E.coli.
4. 1.Определяне количествения и качествен състав на микроорганизмите във
въздуха на лабораторията, коридора и кафето по утаителния метод на Кох.
Използват се петрита със среда МПА,кръвен агар и Сабуро/ Чапек-Докс/ които
се поставят отворени за 15 мин. в определените помещения. Култивират се при 28 оС
за 3-7 дена.

IV. Резултати

Коли-титър

Проба Цвят Флуоресценция Заключение

Питейна вода
Канална вода
(контрола)

Микробно число на питейна вода

Метод Хр.среда Ср. брой колонии Брой cfu/ml

Повърхностно
посяване
Дълбочинно
посяване

Микробиологичен анализ на въздух по метода на утаяването:

Проба Среда Брой колонии Брой кл./м3 Заключение

1 МПА
2 Чапек-Докс
3 Кръвен агар

55