З 220 обстежених на ВІЛ-інфікованість амбулаторних пацієнтів
шкірно-венерологічного диспансеру у 12 було отримано позитивний
результат. Дослідження здійснювали методом твердофазного ІФА на
полістеролових планшетах для визначення антитіл до ВІЛ. До осіб, що
виявили позитивний результат в ІФА, застосували ІІ етап серологічної
діагностики для остаточного встановлення факту ВІЛ-інфікованості.
Таких осіб виявилось 8.
1. Який принцип методу, застосованого на першому етапі
серологічної діагностики? Антитіла до яких компонентів ВІЛ
визначають в ІФА? Яке діагностичне значення методу ІФА?
Принцип методу: в якості твердої фази - лунки полістиролових
планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлоза, на яких
адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на
твердій фазі, додають досліджувану сироватку, а після інкубації і
промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені
ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат для
використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова
реакція, після затримки якої облік проводять візуально або
спектрофотометрично.
Принцип методу полягає в тому, що специфічні антитіла з
досліджуваної сироватки зв'язуються з антигеном, сорбованим на
твердій фазі, і виявляються в подальшому вторинними антитілами,
міченими ферментом. В перших поколіннях тест-систем ТІФА в якості
антигену використовували лізати очищеного вірусу імунодефіциту
людини. В імуноферментних системах другого покоління застосовували
рекомбінантні білки та синтетичні пептиди; вторинними антитілами
являлись антитіла (проти імуноглобулінів людини), мічені ферментом.
Однак, в такому варіанті тест-системи, як правило, не здатні виявляти
імуноглобуліни класів М та А – в більшості тест-систем
використовується кон'югат проти IgG людини. При цьому не
враховується можлива наявність специфічних IgM, що з'являються
першими на початку вірусемії та зберігаються протягом кількох місяців.
Таким чином, збільшується період початкової стадії інфікування перед
появою антитіл в крові. В системах третього покоління застосовують
кон'югат рекомбінантних білків або синтетичних пептидів з ферментом,
що дає можливість виявляти специфічні імуноглобуліни незалежно від
їх приналежності до певних класів G, M чи A і, таким чином, зменшити
період "сероконверсійного вікна" до 20-28 днів. ТІФА четвертого
покоління базується на принципі одночасного виявлення специфічних
антитіл та антигену в сироватці крові. Такий аналіз дозволяє виявляти
ВІЛ-інфекцію на 4-5 днів раніше ТІФА третього покоління, однак цей
новий тест поки що знаходиться в стадії експериментальних
досліджень.
Серологічні маркери ВІЛ:
1. Антитіла до ВІЛ (тип 1,2 і антиген р24 до типу)
2. Чутливість: 99.7% при визначенні антитіл до ВІЛ 1/2.
3. Специфічність: більше 99.9% при визначенні антитіл до ВІЛ 1/2.
Діагностичне значення: імуноферментні методи широко
використовуються у лабораторній практиці; особливо при
імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючих
антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в
діагностиці інфекційних хвороб. Ферментний імуносорбентний (ELISA)
аналіз широко застосовується для діагностики різноманітних
інфекційних захворювань, визначення концентрації різноманітних
низькомолекулярних сполук, таких як токсини, лікарські засоби,
ракових процесів (в основному завдяки специфічним білкам і пептидам)
2. Які компоненти потрібні для здійснення твердофазного ІФА? 4. Який принцип імуноблотингу? Антитіла до яких компонентів ВІЛ
визначають імуноблотингом?
Принцип імуноблотингу: метод імуноблотингу схожий на ІФА, проте
фінальний етап дослідження полягає у переносі й іммобілізації
Основними компонентами твердофазного ІФА є:
біополімера (Аg або Аb) на пористу мембрану, де біополімер
• імуносорбент - адсорбовані на твердій ф азі антигени або антитіла
аналізують за допомогою імуносорбентів. Метод: досліджувані
(залежно від цілей аналізу)
антигени розділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані
• імуноф ерментний кон’югат - ковалентно зшиті з ф ерментом
фракції електрофоретично - переносять на листок нітроцелюлози
специф ічні антитіла або антигени
(блот), який знаходиться в спеціальній камері. Фіксовані блоти
• досліджуваний матеріал - біологічні рідини організму.
обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і
додають радіоактивно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які
В якості антигенів можуть використовуватися очищені нативні
зв’язались з антигеном. Після повторного промивання листок
антигени мікроорганізмів або їх аналоги - рекомбінантні білки та
нітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для
синтетичні пептиди.
радіоавтографії. На проявленій плівці появляться смуги локалізації
В якості антитіл використовують поліклональні (пул специфічних
антигена, який зв’язав мічені антитіла.
антитіл, виділених з сироваток тварин) або моноклональні
Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні
(моноспецифічні анти-тіла, отримані методами клітинної інженерії)
антитіла або антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку
антитіла.
субстрат для ензиму (хромоген) повинен бути попередньо нанесений
Імуноферментні кон’югати - це ковалентно зшиті молекули антигенів
на нітроцелюлозну мембрану.
або антитіл з ферментом. Одним із біологічних феноменів, на якому
базується ІФА, являється висока каталітична активність ферментів,
Дозволяє визначити в сироватці (плазмі) крові антитіла до наступних
які використовуються в якості індикатора в ІФА.
білків ВІЛ 1: глікопротеінів вірусної оболонки (гену env)- gp41, gp120,
gp160, серцевини вірусу (гену gag) - р17, р24, р55 і ферментів вірусу
Основними ферментними мітками є:
(гену pol) - р31, р51, р66. У випадках ВІЛ 2 визначаються антитіла до
• пероксидаза хрону - ф ермент, що найчастіше використовується
білків гену env – gp140, gp105, gp36; гену gag – р16, р25, р56; гену pol –
; містить вуглеводні залишки, що легко окиснюються періодатом,
р68.
через які може відбуватися зв’язування ферменту з антитілами
або антигеном
• лужна ф осф атаза - дуже стабільний, але дорогий ф ермент 5. За результатами якого серологічного методу ставиться
β-D-галактозидаза - рідко використовується остаточний діагноз ВІЛ-інфікованості?
• глюкооксидаза - рідко використовується
За результатами методу імунного блоту (Вестерн-блот) - якісного
методу, який дозволяє з великою вірогідністю визначати Аg або Аt в
3. Який метод треба використати на ІІ етапі визначення
будь-якому біологічному середовищі організму.
ВІЛ-інфікованості, щоб уникнути гіпердіагностики?
Специфічність і чутливість методу - 99-100 %
Позитивні результати ІФА завжди потребують підтвердження методом
імуноблотингу, оскільки при ІФА дослідженнях існує ймовірність хибних
результатів. Хибно-негативні результати ІФА, які можуть мати місце,
пов’язані з:
• відсутністю антитіл в сироватці в період «серологічного вікна»
• вродженою агамаглобулінемією
• розвитком гіпогамаглобулінемії в пізній стадії хвороби.