BÀI SEMINA

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY BAO PHẤN

VÀ HẠT PHẤN INVITRO

SVTH : Đỗ Thị Hoài Thương

Lớp : Sinh K39
GVHD: Trương Thị Bích Phượng
 NỘI DUNG
1 Vấn đề đơn bội ở thực vật.
2 Phương pháp tạo thể đơn bội in vivo
Phương pháp tạo thể đơn bội in vitro
3

Quy trình và những điều kiện ảnh hưởng

4
đến nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

5 Hiện tượng bạch tạng trong nuôi cấy đơn bội

6 Ứng dụng của thể đơn bội .

7 Ưu , nhược trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

 I. Vấn đề đơn bội của thực vật.
Bao phấn, hạt phấn
tách rời, cụm hoa Hai phương
(phương pháp này hay pháp cơ Cứu phôi sau lai xa.
được áp dụng cho bản của kỹ
những loài có hoa
thuật đơn
nhỏ).
bội
Vật liệu ban đầu cho
quá trình nuôi cấy in
Tạo dạng đồng hợp
Nghiên cứu di truyền Tạo
vitro tạođột
câybiến
đơnởbội
mức độ
tử tuyệt đối.
về mối tương tác của đơn bội.
Nuôi cấy các phấn hay tiểu bào tử tách
baogen. Nuôi cấy tế bào trứng chưa thụ tinh
rời hay còn gọi là như phương pháp hay còn gọi là phương pháp trinh
Thụ tinh giả. Đây là
trinh sinh đực trong ống nghiệm (in sinh cái trong ống nghiệm (in vitro
quá trình thụ phấn
chưa thụ tinh.
vitro androgenesis).
Noãn gynogenesis).
nhưng không xảy ra
sự thụ tinh.
Trong số các vật liệu trên, bao phấn, hạtphấn tách rời và noãn
chưa thụ tinh là những nguồn nguyên liệu quan trọng, được sử
dụng phổ biến hơn để tạo cây đơn bội.
 II. Phương pháp tạo thể đơn bội in vivo
1 Sinh sản đơn tính cái (gynogenesis)
Sản xuất các thể đơn bội riêng rẽ bằng cách phát
triển các tế bào noãn bất thụ (unfertilised egg-cell)
2 Sinh sản đơn tínhhợp đực
trong trường sự (androgenesis)
thụ phấn xảy ra chậm.
Sản
Sự xuấtthải
đào
Gynogenesis các hệ thểgen
được đơn bội riêng
thấy
tìmbằng lailaixarẽ
khi khácbởiloài giữa
3 sựSolanum
phát triển của tế (2n
tuberosum 4x) ´ S.
bào=noãn phureja (2n =
mang
2x) kết
nhân của quảbố. tạoTrong
ra dạngtrường
song đơn hợpbộinày,
(dihaploid)
sự là
SựHiện
giaotượngphối xảy rakhoai
nàykhông khi
hoàn tâykhác
lai (2n =chi
toàn 2x).
và khác loài do
(semigamy)
4 đào thải hoặc bất hoạt của nhân noãn
sự đào thảiClick chọnto lọcadd
của Title
một trong những hệ gen của bố
(egg-nucleus)
mẹ trong quá trình phát xuấttriểnhiện trước
sau khi tinh.thụ
thụ khi Vì thế,
Quá
phôitrình
tinh.
được Xửlaitạo
lý ở đóchỉ
màthành
hóa nhân
chất vớicủamộttếhệ
bàogennoãn và phát triển
và cây
5 từnhân
phôisinhnhưsản thế (generative đơn bội.của
có thể là câynucleus) hạt hạn: lai
Chẳng
Một số hóaphấn
chất,nảy
khác như
loài mầm
giữachloramphenicol
Hordeum độcvà
phân chia vulgare lập, cho
và H.kết quả
bulbosum cho ra có thể
parafluorophenylalanine
tạothải
ra thể bộikhảm đơn bội sắc(haploid
thể ở cácchimera).
6 cảm ứng đàocây đơn một
Shock bộ vulgare.
H. nhiễm
nhiệt tế bào hoặc mô soma, làm
tăng các thể đơn bội. Xử lý bằng toluene blue, maleic hydrazide, nitrous
Xử lý
oxide vànhiệt
Ảnh độ caocũng
hưởng
colchicine hoặccủa thể
cónhiệt
chiếuđộ thấp
cho xạ có
các kếtthể
quảcótương tự. trong việc
tác dụng
7 ngăn cản sinh sản hữu tính (syngamy) và cảm ứng thể đơn bội.
Tia X hoặc ánh sáng UV gián tiếp cảm ứng làm đứt gãy
nhiễm sắc thể và đào thải chúng, tạo ra các thể đơn bội.
 III. Phương pháp tạo thể đơn bội in vitro

3 phương thức sinh sản

đơn tính đực:

Sinh sản đơn Sinh sản vô Sinh sản đơn

tính trực tiếp tính qua callus tính hỗn hợp
từ tiểu bào tử

Tiểu bào tử trong bao Tiểu bào tử trong bao Giai đoạn phát triển
phấn  Phôi  Cây phấn  Callus  Chồi callus xảy ra rất ngắn và
đơn bội (n = 1)  Cây đơn bội (n = 1) khó nhận biết, ví dụ:
Datura, Lycopersicum
IV. Quy trình và những điều kiện ảnh hưởng đến
nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Đặc điểm của nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.

• Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát
sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu
bào tử, các hạt phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù của bao phấn tại
thời điểm nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất đối với sự thành công của
phát sinh phôi.

• Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn
phát triển khác nhau. Vì vậy, mỗi chồi hoa phải được kiểm tra để xác
định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ
tuổi phù hợp cho nuôi cấy.
Các phương pháp cơ bản sử dụng trong nuôi cấy bao
phấn và hạt phấn

Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao

phấn và hạt phấn là:
 Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi
trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi
xảy ra trong bao phấn.
 Phương pháp 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương
pháp cơ học hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường
lỏng.
 Quy trình nuôi cấy

• Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4
nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu
tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn.
• Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi
cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia
của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội.
• Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao
phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng.
• Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu
bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so
sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình
thái, kích thước.
 Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn

Tách các bao phấn

Khử trùng bề mặt

Hoa
Loại bỏ chỉ nhị

Nhuộm acetoarmine để xác định

GĐPT của hạt phấn

Nuôi cấy trên

mt đặc
Phát triển phôi
Nuôi cấy trên

Cây đơn bội mt lỏng

Các bước phát triển phôi của hạt phấn
Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn

Nhân tố thành bao phấn

Môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng

Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây mẹ có vai trò rất

quan trọng trong việc xác định tần
số sản xuất cây hạt phấn

Mỗi kiểu gen khác nhau tương ứng

với phản ứng sinh sản đơn tính
khác nhau trong nuôi cấy bao phấn.
Nhân tố thành bao phấn

Hạt phấn của một giống thuốc lá sẽ phát

triển thành phôi ngay cả khi chuyển vào
bao phấn của một giống khác

Nhiều nhà nghiên cứu sử dụng “hiệu ứng

bảo mẫu” (nursing effect) của bao phấn
hoàn chỉnh để phát triển sinh sản đơn tính
ở các hạt phấn phân lập của nhiều loài.

Dịch chiết của bao phấn cũng có tác dụng

kích thích sản xuất phôi hạt phấn (pollen-
embryo production).
Môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi

tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao
phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây
cho bao phấn sinh trưởng

Hầu hết các loài thuộc họ Solanaceae chỉ

phát triển sinh sản đơn tính trên môi
trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete
nutrient medium) bao gồm các loại muối
khoáng, vitamin và sucrose của Nitsch
hoặc MS

Ở các loài không thuộc họ Solanaceae,

thành phần môi trường bao gồm: các chất
điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp
dinh dưỡng phức tạp (như dịch chiết nấm
men, dịch thủy phân casein, nuớc dừa).
Môi trường nuôi cấy

Thay thế sucrose bằng cách bổ sung

glutathione, ascorbic acid và glucose cũng
có tác dụng tương tự, kích thích sinh sản
đơn tính ở lúa mạch đen.

Bổ sung than hoạt tính hoặc 2-chloroethyl-

phosphate vào môi trường nuôi cấy cũng
có tác dụng kích thích sinh sản đơn tính ở
một số hệ thống nuôi cấy.

. Trong khi nhiều loài cần có auxin

và/hoặc cytokinin để cảm ứng sinh sản
đơn tính thì đa số các loài thuộc họ
Solanaceae chỉ cần môi trường cơ bản.
Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng
Gây shock nhiệt sẽ tăng tần số sinh sản
đơn tính tiểu bào tử. Các nụ được xử lý
lạnh ở 3oC hoặc 5oC/72 giờ kích thích hạt
phấn phát triển thành phôi (xấp xỉ 58%) ở
một số loài thuộc họ Solanaceae (Datura,
Nicotiana)

bao phấn được duy trì ở 22oC trong cùng

thời gian chỉ cho khả năng phát triển phôi
khoảng 21%.

gây shock nhiệt từ 2-5oC/72 có tác dụng

kích thích sự phát triển không bình thường
của giao tử đực và tích lũy hạt phấn đơn
nhân (ức chế sự phát triển tiếp ở các giai
đoạn sau).
Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng

Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh

trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu
chúng được nuôi trong điều kiện chiếu
sáng

các hạt phấn phân lập dường như mẫn cảm

với ánh sáng hơn so với bao phấn. Ánh
sáng trắng cưòng độ thấp (low intensity
white light) hoặc ánh sáng huỳnh quang đỏ
(red fluorescent light) kích thích phát triển
nhanh hơn của phôi trong nuôi cấy hạt
phấn thuốc lá phân lập so với với ánh sáng
trắng cường độ cao.
Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn
Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngày ngắn (8
giờ/ngày) và ở vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng
tương đối tốt hơn so với cây dài ngày (16 giờ/ngày) có cùng
cường độ chiếu sáng

Sự phát sinh phôi hạt phấn có thể được cải thiện nhiều hơn nếu
nhiệt độ dưới điều kiện ngày ngắn duy trì ở 18oC

Sự thay đổi mùa vụ thích hợp và tuổi cây cho bao phấn ảnh
hưởng lớn đến phản ứng của các hạt phấn

Cây thiếu nitrogen có thể ảnh hưởng xấu đến bao phấn hơn so
với cây được cung cấp đủ nitrogen

. Xử lý cây bằng cách bơm thuốc trừ sâu hoặc các chất độc khác
cần phải được tránh.
 Một số chỉ số kết quả nuôi cấy
Tỷ lệ bao phấn tạo callus và phôi

CR : Tỷ lệ tạo callus tính theo %

NAC : Số bao phấn có callus.
NAE : Số bao phấn có phôi.
NA : Tổng số bao phấn được cấy.
•Tỷ lệ bao phấn có phôi (CE tính theo %)
•Tỷ lệ callus và phôi trên số hạt phấn nuôi cấy (SE tính theo %)

NC : Số callus.
NE : Số phôi.
f : Số hạt phấn/ bao phấn.
•Hiệu suất tạo callus hay tạo phôi (PE)
V. Hiện tượng bạch tạng trong nuôi cấy đơn bội
Ở các đối tượng cây hai lá mầm như Datura, Atroppa, Nicotiana,
Brassica... khi nuôi cấy bao phấn cây đơn bội thường phát triển
trực tiếp từ tiểu bào tử và ít khi xuất hiện cây bạch tạng

ở những đối tượng cây một lá mầm như lúa nước (Oryza), lúa mì
(Triticum)... cây hoàn chỉnh phát sinh thông qua giai đoạn callus
thì tần số cây bị bạch tạng chiếm khá cao (20-30 % hoặc cao hơn
nữa).

Tần số cây bạch tạng phụ thuộc vào các yếu tố

Tuổi callus cấy chuyển từ môi trường tạo mô sẹo sang môi
trường tái sinh cây.
Càng cấy chuyển muộn tần số bạch tạng càng cao.

Nhiệt độ nuôi cấy. Nhiệt độ cao thường làm tăng số

lượng cây bạch tạng
Một số hình ảnh của cây bị bạch tạng
 Nghiên cứu về tế bào học

Nghiên cứu đột biến và di truyền

Nghiên cứu tạo cây từ hạt phấn của các giống thuần
VI. Nghiên cứu đột biến , gây đột biến ở các dạng đơn bội
Ứng và chọn lọc
dụng Phát triển các dòng vô tính ở các loài cây thân gỗ lâu
của năm
thể Chuyển các gen ngoại lai mong muốn
đơn Thiết lập các dòng tế bào đơn bội và nhị bội của cây
bội hạt phấn

Chọn lọc các đột biến kháng bệnh

VII. Ưu điểm, nhược điểm.
Ưu điểm
• Nuôi cấy bao phấn:
 Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ
dàng.
 Môi trường nuôi cấy đơn giản.
• Nuôi cấy hạt phấn:
 Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh.
 Giống tạo ra có phẩm chất di truyền đồng đều.
 Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
 Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di
truyền.
Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời
đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số
lượng các cá thể đơn bội thu được.
 Nhược điểm
Nuôi cấy hạt phấn:
 Khó thao tác do hạt phấn có kích thước nhỏ.
 Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu
suất tạo cây đơn bội không cao.
 Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp
gen, tuy nhiên nó ít được sử dụng vì làm giảm tỉ lệ tái sinh cây
Nuôi cấy bao phấn:
 Khó sàng lọc cây đơn bội.
 Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc
nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn,
kiểu gen, kinh nghiệm…