Professional Documents
Culture Documents
TTCNSH DCQ2014 PDF
TTCNSH DCQ2014 PDF
KHOA DƯỢC
LỚP DCQ2014
BÁO CÁO THỰC TẬP
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
DƯỢC
- Ở bài thực hành này ta khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic (tế bào sinh
dưỡng và bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) trong dịch vị nhân tạo ( ở các pH
1 và 3) và dịch mật nhân tạo ( ở nông độ muối mật 0.3 và 0.5%).
- Đối chứng:
+ 90 phút:
- pH 3:
+ 60 phút:
+ 90 phút:
- Đối chứng
- pH 2:
- 60 phút:
- 90 phút:
-pH 3:
+ 60 phút:
Bảng 1. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo*
Thời gian pH
(phút)
MT pH
Đối ch ng 2 MT pH 3
TBSD Bào tử TBSD Bào tử TBSD Bào tử
3 4
0 70.10 215.10
3 4 3 4
60 13.10 138.10 6.10 88.10
3 4
90 10 42.10 0 ∞
Bảng 2. Kết quả ph n trăm tế bào sống sót pH dịch vị khác nhau ( )**
Thời gian pH 2 pH 3
TBSD Bào tử TBSD Bào tử
0
60 18,57 64,18 8,57 40,93
90 1,43 19,53 0 ≈ 100
** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào ở thời điểm và pH khảo sát/ Số tế bào ở mật đối chứng
tương ứng x100.
Bảng 3. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch mật nhân tạo*
** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào ở thời điểm và pH khảo sát/ Số tế bào ở mật đối
chứng tương ứng x100.
c. So sánh khả năng chịu acid dịch vị và muối mật của dịch mật ở các nồng độ khác
nhau
- Acid dịch vị:
• Khả năng sống sót của vi sinh vật (VSV) ở dạng bào tử cao hơn rất nhiều so với
tế bào sinh dưỡng ở các pH dịch vị đã khảo sát.
• Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và
bào tử càng giảm đi.
- Muối mật:
• Khả năng sống sót của vi sinh vật (VSV) ở dạng bào tử cao hơn rất nhiều so với
tế bào sinh dưỡng ở các nồng độ muối mật đã khảo sát.
• Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và
bào tử càng giảm đi.
2.2.2. Bàn luận
9 -3 7
Số lượng vi khuẩn ban đầu được sử dụng là: 0.4x10 x50x10 = 2.10 con
A. Muối mật
- Ở nồng độ muối mật 0,5%, tỷ lệ sống sót của tế bào sinh dưỡng thấp hơn nhiều so
với nồng độ 0,3% còn bào tử thì thấp hơn không đáng kể.
- Bào tử có khả năng chịu được dịch mật tốt hơn tế bào sinh dưỡng sau một khoảng
thời gian tiếp xúc với muối mật.
B. Dịch vị nhân tạo
- Khả năng sống sót của dạng bào tử cao hơn rất nhiều so với tế bào sinh dưỡng ở các
pH dịch vị đã khảo sát.
- Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và bào
tử càng giảm đi.
- Dạng bào tử sống sót tốt trong acid dịch vị, bào tử mọc nhanh hơn và giảm ít hơn so
với tế bào sinh dưỡng. Bởi vì bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu được những
điều kiện khắc nghiệt của môi trường.
* Các khó khăn trong quá trình thực tập
- Số lượng tế bào sinh dưỡng và bào tử cần phải điều chỉnh sao cho OD600=0.5.
- Các yếu tố ngoại nhiễm đặc biệt vi khuẩn từ không khí xâm nhập trong quá trình trải
thạch dẫn đến đếm nhầm yếu tố ngoại lai.
M c tinh chế:
ΔOD
0,7
0,6
0,5
0,4
0,1
Nồng độ mg/ml
0
0 2 4 6 8 10 12
- Tỉ lệ hoạt tính:
• Phương pháp hấp phụ
c. Nhận xét về hiệu suất cố định và và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym.
Báo cáo TT CNSH Dược Page 16
- Hiệu suất cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ cao hơn 1,35 lần phương pháp
hấp phụ. Vì ở phương pháp bắt giữ enzym bị giữ bên trong hạt gel không thoát ra
được, đây là quá trình cố định không thuận nghịch. Còn ở phương pháp hấp phụ là quá
trình cố định thuận nghịch, enzym chỉ bị hấp phụ lên bề mặt của hạt gel.
- Hoạt tính của enzym bị cố định theo bắt giữ cao hơn 2,34 lần so với hấp phụ
- Hoạt tính của enzyme bị cố định thấp hơn nhiều so với enzyme tự do, do lúc này
enzyme đã bị gắn với chất mang nên sự tiếp xúc của enzym với cơ chất bị cản trở về
mặt không gian cũng như cấu trúc của enzym bị thay đổi, vì vậy khả năng gắn với cơ
chất sẽ bị giảm.
4.2.3. Bàn luận
- Các phương pháp cố định CGTase lên alginate hấp phụ và bắt giữ có các ưu – nhược
điểm khác nhau và hiệu suất cố định cũng khác nhau:
+ Với phương pháp hấp phụ:
Ưu điểm: đây là phương pháp dễ thực hiện, thường ít ảnh hưởng đến hoạt tính
của enzym.
Nhược điểm:
• Enzyme dễ bị hòa tan trở lại trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần, do đây là
phương pháp hấp phụ vật lý, liên kết enzym với chất mang lỏng lẻo, độ bền liên
kết của enzym phụ thuộc vào pH và lực ion.
• Ngoài ra trong quá trình làm, do thao tác thí nghiệm như nhỏ dung dịch alginate
và CaCl2 nhanh và không đều làm cho gel tạo ra có kích thước không đồng nhất,
việc lọc và rửa gel không cẩn thận sẽ làm enzym đã bị hấp phụ tan trở lại môi
trường,… dẫn đến hiệu suất cố định thấp.
+ Với phương pháp bắt giữ:
Ưu điểm: enzym bị giữ chặt hơn, enzym không liên kết trực tiếp với chất mang,
mà chỉ bị nhốt bên trong chất mang nên cấu trúc enzym hầu như không thay
đổi.
Nhược điểm:
• Không thể áp dụng phương pháp này để cố định các enzym mà cơ chất có phân
tử lớn, do cơ chất phân tử lớn không thể qua màng gel.
• Kích thước của các mắt lưới trong gel không đồng nhất nên enzym vẫn có thể
thoát ra ngoài được. Và kích thước của các mắt lưới phải đủ lớn để cơ chất và
sản phẩm thoát ra và phải đủ nhỏ để giữ enzym ở lại.
• Một số gốc tự do tạo ra do quá trình trùng hợp tạo gel có thể làm kìm hãm enzym
do đó phải chú ý đến nhiệt độ, pH và các điều kiện khác để tránh sự tạo gel ảnh
hưởng đến enzym.
• Ngoài ra trong quá trình làm, do thao tác thí nghiệm như thêm enzym vào
alginate không lắc kỹ, việc tạo gel quá nhanh và không đều nên enzym bị giữ
lại không đồng nhất ở các hạt gel, viêc hấp phụ enzym lên bề mặt hạt gel vẫn
xảy ra nên việc xác định các thông số vẫn có sai số.
- Nhìn chung, phương pháp bắt giữ ưu việt hơn so với phương pháp hấp phụ, bên
cạnh các phương pháp này còn có nhiều phương pháp có ưu điểm hơn mà có thể
đưa vào sản xuất với quy mô lớn như phương pháp cố định enzym bằng liên kết
cộng hóa trị, phương pháp tạo vi nang có nhiều ưu điểm vượt trội như có thể giữ
Báo cáo TT CNSH Dược Page 17
bọc đồng thời nhiều enzym trong một dãy phản ứng mà hầu như không làm ảnh
hưởng đến cấu trúc enzym,…
- Việc cố định enzym có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực nông
nghiệp, công nghiệp, y học,… Chẳng hạn như trong công nghiệp cố định enzym
glucoisomerase và enzym invertase để sản xuất các loại siro giàu fructose hay sản
xuất sữa không lactose bằng việc cố định enzym β-Galactosidase và lactase. Trong
y học cố định enzym penicillin amydase để sản xuất ra các penicillin bán tổng hợp
và cố định các enzym không tan là steroid 11β-oxygenase và Δ-dehydrogenase để
sản xuất prednisolone điều trị bệnh thấp khớp,…
1. Để yên 10 phút
2. Lọc
Gộp
Enzym bị hấp Dịch rửa
phụ trên gel Xác định V Dịch gộp
Nhỏ từ từ
1. Để yên 10 phút
2. Lọc
Gộp
Enzym bị bắt Dịch rửa
giữ trong gel Xác định V Dịch gộp