PRIMERA PART TEMA 6.

Part 1.- Biotic stress. Defence mechanisms and plant resistance. Breeding for resistance to biotic
stress: intraspecific and interspecific crosses. Pyramiding resistance genes.
Responsible: Dr. Balanya (1.5 h), e-mail: jbalanya@ub.edu

Estres biòtics:

Exemples de les plagues mes fortes de la historia

Plagues que trobem en un mateix tipus de cultiu:

Les agallas son enduriments que forma la planta per defensar-se dels patogens (ex.
Nematodes). Serveixen per confinar la larba en aquest espai per evitar que es propagui.

Mamlties que afecten al fruit son mes greus. En algunes casos si no afecten al fruit no afecta la
produccio I no es tracta. Ex. Atracnosses: fong
 Els insectes danyen aprets celulars I fan ferides I llavors els fongs
aprofiten per infectar. Poden produir micotoxines que son toxiqus al se consumides. Es un
comportament synergistic the dany per insectes amb el fong Fusarium.

Els virus son biotrofs obligats- Si maten la celula ells no poden viure per que no tenen
metabolisme propi. A més tenen molta dificultat per penetrar per la paret però sovin ho fan a
traves dels plasmodesmes, tot I que nomes poden infectar els virus amb proteins que obren
els plasmodesms o be pasen virus que es desglosen en parts.

Els fongs poden ser necrotodes  salimenten de cel mortes (pro no sembre es aixi).

Resistències a Bacteris i Fongs

Non-host els patogens son especifics per

algunes plantes però per la resta de plantes
no podran atacar degut a mecanismes de
Resistencia non-host o speceies resitantce.
Aquesta resistència es present en tota
l’especie I es un mana de immunitat innnata o resitencia basal.

Host plant Resistencia specifica de variedad de genotipo. Depen del genotip de la planta I
no de l’especie.

Non-host or species Resistance:

Es basa en dos mecanismes:

 Performed defense a traves de barreres fisiques com la cuticula que eviten la entrada
del pathogen (resistencia passiva). Exemples d’aquest defensa són:
o Producció de phytoalexines que són metabòlics secundaris que cobreixen es
espais intercel·lulars per evitar el creixement del patògen.
 o Cell wall thickening, es formen unes papil·les en la paret que evita l’entrada
del patògen.
o Cell wall lignification per endurir la paret
o Accumulation of phenolics, que son induïts per ferides i solen ser toxics per
molts microorganismes (Agrobacterium no).
o Production of saponins
 Inducible defense a través de mecanismes actius per impidir que el patògen es
progpagui dins la planta. La activació d’aquests mecanismes es dóna per Elicitors
PAMPs (Pathogen Associed Molecular Patterns). Els PAMPs són reconeguts en les
superficies cel·lulars per receptor PRR (Pattern Recongtion Receptors).Alguns
exemples de PAMPs son la chitinasa que es troba en tots els fongs o la flagelina,
present en bacteris Gram-negatius. El concepte PTI fa referència a la Immuniat
Produida per PAPMPs. La resposta PTI consiteix en una activació de la transducció dels
senyal que comporta l’expressió d’enzims que ataquen al patògen o bé, sobretot en
patògens biotrofs, activen la mort de la cèl·lula infectada per evitar la propagació.

Els patogens també tenen mecanismes per contrarestar estes resistencies. Algns poden
injectar un efector a la celula vegetal que produeix la inhibició desencadenada pels PAMPs.
Aleshores pot infectar la planta. Si aixo passa la planta es sucestible de manera que s’activen
els sistemes de Host-resistence.

Host Plant Cultivar-specific Resitence

Es un Sistema basat en “gene

for gene interaction”. És la
conseqüència de la co-evolució
patògen planta. Quan un
patògen muta el elicitor, la
planta pot ser infectada però
aquesta pressió evolutiva
promourà que en aquesta
variat apareguin individus amb
mutacions que permetin
reconèixer alguna proteïna
efectora especíca del patògen
(Avr), desencadenant
mecanimes de Resitencia
Cultivar-especific. La respota
normalement es una
hipersensibilitat que actiba la
mort de la cèl·lula infectada les
del cantó per que no es
propagui la infecció.

No hi ha un amolecula
universal per a tots els
receptors. A cada efector Avr li
correspon un gen de resitencia. En una especie hi poden haver mes d’gen de Resistencia inclus
pel mateix pathogen.
Exemple virus (biotrofos en planta resisten on no es pot propagar vs. planta sensible on es
propaga)

Cada puntet representa un punt on hi ha caigut un virus I la plata la confinat.

Tots els efectors Avr tenen entre ells una

estructura molecular semblant:

Peptid senyal en l’exrem +aa concrets+

regio rica en glutamate I aspartate (motiu
que es va repetint varis cops).

Els genes de Resistencia R també tenen un

motiu que es va repetint i es divideixen en
classes, per exemple:

La Classe 1 i 2 son proteines

citoplasmatiques mentre que la 3 i4 son
proteins de membrane.

Ex. La proteïna R Cf-2 es de la classe 3 I es

troba codificada en Tomata. Aquesta
proteïna reconeix el Avr2 de C. fulvum.
Resistencia sistemica adquirida SAR:
Resistència que es dóna teixits sans
d’una planta que ha estat infectada.
Aquests teixits també responen a la
infeció mitjançant l’àcid Salicylic. Les
plantes que ho poden fer tenen un gen
que codifica per una proteïna R.

Pasos:

Hi ha un reconeixem Plant R protein vs.

Avr pathogen efector, el que active la
transducció del senyal provocant una resposta HR (Hypersensibilty) que provoca la mort de les
cèl·lules en la regió infectada. Aquestes cèl·lules alliberen salicicat, un senyal químic que
circula per la planta i genera una resposta de Restistencia Non-host (contra varis patògens).
Aquestes plantes no sol poden confiner la infecció, sinó que també preparen els teixits sans
per si la infecció es propaga.

Resistence Durability

La Sistemica: pot durar desde unes setmanes a fins

tota la vida de la planta. No obstant la resistan cultivar tendeix a ser usada només quan hi ha
un medi favourable pel pathogen.
Hi ha diferents varietats d’arròs amb gens de Resistencia contra X. oryzae (BB genes) però la
variatat altament productive PR106 con conté cap dels BB gens.

L’estrtègia és portar els tres genes de Resistencia a la varietat PR106, mitjançant creuaments.
El primer creuament serà amb la varietat IRBB62 que conté els tres gens.

En la F1 les plantes son suceptibles. Amb marcadors STS per

cada gen I l’anàlisi de la descendència BC2F2 es pot aconseguir
varietats PR106 resistents:
BC1F1 PR106 x F1  seleccionem les llabors amb amb els tres marcadors moleculars.
Aquestes llabors es planten i es fan recurents creuaments amb amb PR106 ( BC1F2)fins que
obting plantes amb les
característiques de PR106,
tot I que no siguin
homozigotiques per la
resitència. Els marcadors
moleculars em permeten
detectar la presència dels
al·lels de resistència en
heterozygosis.

Finalment, per obtenir els

al·lels de resitencia en
homozigosi, faig un
creuament BC2F2 I
selecciono les plantes
productives am els
marcadors en homozigosi
de resitència.
TEMA 7. Abiotic Stresses in Plants
PRIMERA PARTE. ASPECTOS FISIOLOGICOS (SALVADOR NOGUES)

Aclimatació d’un Sistema in-vitro a un Sistema Ex-vitro.

Aclimatació: process pel qual una planta s’adapta al ambient. Etapes per les quals ha de
passar:

In vitroex vitro hivernacle camp (Durant l’aclimatació no es pot trencar la cadena).

 Llum:

Les cambres de creixement tenen poca llum i aquesta va augmentan gradualment. En una
camera hi ha 5-100micro mols/m2. Segons .En un dia am molta llum al camp I pot haver fins
1500 micromols… això provocaria un xoc de llum produit per la fotoinhibició (inhibicio
fotosintesis). Les plantes san d’adaptar poc a poc.

 Humitat

En un Sistema invitro la humitat es proxima a 100, en el camp en canvi, es molt menor. En les
plantes invitro no tenen estomes sino porus que son estomes no funcionals. S’ha de fer que els
estomes siguin funcionals. S’ha de disminuir la huiminat gradualment. A més aquestes plantes
no tenen cutícula (eviten la perdua d’aigua) peque sempre tenen molta humitat. Per tant s’ha
de estimular que formin cuticula, per evitar la deshidratació en un Sistema ex-vitro.

 Estrés

Les plantes necessiten carboni, H i O2 els

treuen de l’aigua (O i C) I del CO2 (C I O),
mitjançant la fotosintesi. En un Sistema invitro
no hi ha difusio de CO2 I el carboni el treuen
de la sacarosa del medi (down-regulation
no fabriquen sacarosa pq ya la tenen al medi I
s’hinibeixen els enzims). La fotosintesis esta
molt disminuida I s’han d’aclimatar per que
s’acabi de desenvolupar la capacitate de fer la
fotosintesis. Per fero es treu gradualment la
sacarosa del medi. També s’aumgementa
gradualment els nivells de CO2, d’aquesta
manera disminueix la gs (conductivitat aire) que també provoca es tanquin els estomes pq
vagin sent mes funcionals I es pugui fer fotosíntesi.

 Hormones

També s’ha daplicar auxina per aumentar el creixement d’arrel. Tambe s’afegeix ABA per a que
es comensin a tancar el porus estomàtics (disminució de la gs).
Exemple: arros es fa un culitu de anteres en una placa de petri s’indueix el callus i aquest
es transplanta en un tub amb medi. Del tup passara a ex-vitro amb aclimatació. En un hivernacle
es controlara les condicions. La primavera seguent es planta al delta en un camp gran (primer
any) si funciona es passa en camps mitjans (segon any) amb les llavors I despres en camps grans
(tercer any). Es adir que en biotecnologia, amb tres anys consigueixes produir varietats
millorades (ex. Resistens a la sal pq al delta esta aumentan laigua salada). Sense biotecnologia
seria uns 12 anys. A més per convatir el cargol manzana van regar amb aigua salada I tot I matar
el cargol, també van afectar molt a les plantes.
Capacitat Fotosintetica

Primera part: Gs: contuctancia estomàtica. Els estomes capten el Co2 I per tan el C I tambe
treuen AIGUA

Segona part: cicle

Calvin amb la Rubisco
que agafa el C02 i
forma 2 triose-P am la
qual es fara sacarosa. I
tambe es regenera la
Ribulosa BP.

Tercera part: transport

d’electorns I
fotofosforilacio. Es
dona en els
cloroplastos i es
produeix ATP.

CO2 en l’aire 398ppm-

La fotosisntesi no te la fase oscura I la lluminosa!! Nomes es dona durant el dia!!!

*Si alguna destes 3 fases no fucnciona la fotosisntesi es para I per tant son limitants. Si x
exemple els estomaes no funcionen no fotosinstesis.

Un planta in vitro te
clorofila pq es verda I per tant te capaciotat de fototsintensis pro no la fa, perque els estomes
no són funcionals. A mes com q te sacarosa t els enzims inhibits del c. Calvin. I no es requereix
ATP (no fotofosforilacio).
GRAFIC 1: es va augmentant la llum. Les plantes in vitro:

 tenen la saturacio molt mes baixa.

 El rendiment quantic (par lineal) la tenen igual.
 El punt de compensacion luminico es el punt enque la fotosisntesis siguale amb la
respiracio (al zero). Les pantes in vitro rapidament fan fotosisntesi (punt lumínic mes
baix) pero es saturen rapid!

Grafic 2: Sense Rubisco no hi ha fotosintesi. Al aumentar el co2 va augmentan la fotosisntesis

pro despues es pare, per saturació de la Rubisco. La Rubsico es l’enzim limitant.

Grafic 3: la fluorescencia ens dona el paramentre FV/FM que es una mesura de quan bé
funciona el fotosistema 2. Es fa posant les plantes en oscuritat. Tambe es calculen altres
paraments.

Hi ha herbicides que actuen inhibit transportadoes d’electrons:

 DCMU capta els electrons I interrompt es seu transport entre QA I QB a nivell de PSII.
 Paraquat forma O2 I actua en el PSI.

Enviromental stress

 La sequia es un dels estrossos mes estudiats sobretot en el clima mediterrani. La sequïa es

caudada per un onjunct d’estresors: alta radiació, falta d’aigua, i alta temperatura.
 Temperature stressors: Chilling, temperatures entre 0-12 i freezing <0ºC.
 Dèficit d’aigua o exès.
 Radiació: Qualsevol tipus de radiacio pot produir estres. Per exemple, l’estres per UV-B es
dona pel forat de la capa ozo.
 Per salinitat: estrés químic.
 Estressos mecànics com el vent.
Les plantes al camp sofrirarn estres I depenen de les característiques del estrés (intesnsitat,
duracio I freqüència i combinacio de dif estresors) I les propies caracteristiques de la planta
(edat, genotip, estat fisiologic) hi haura una resposta de tipus:

 Resistent sobreviu s’ha de propagar

 Sensisble es mor.

Gràfic 1: Sindrome estres: primer baixe la linia (potse que es mori o pot ser que visqui I per
tant torni aumentar.

Gràfic 2: Exemple amb els

hervicides

 Hi ha plantes que sofreixen

pero sobreviuen (maiz I cereal)
 Pero les plantes males herbes
sofreixen I moren.

Estrès Oxidatiu

Es dóna quan la taxa de producció de ROS (especies reactives d’oxigen) és major que la taxa
d’eliminació de ROS. Tots els sistemes vius produexen ROS perÒ les plantes tenen un Sistema
antioxidant que l’elimina, no obstant quan els Sistema antioxidant no pot eliminar tot el ROS
produit es dona l’estres oxidatiu.

 EX. Plantes estresades es produeix ROS es dispara es Sistema antioxidant.

ANTIOXIDANTS:
Els ROS es produeixe durant el transport de l’ectrons en cloroplastos I mitocondris. Es produeix
quan l’ O2 capte un electro que es pot escapar i s’allibera un O2- (anio superoxide). L’enzim
SOD capmte l’aniò superòxid produint peròxid H2O2 que tambée es tòxic i per això és
metabolitzat amb aigua per la APX (enzim que requereix
àcid ascorbic).

ESTRES HIDRIC:

És el més important que hi ha, la disponibilitat d’aigua

limita la producció en cultius.

Grafic: relaciona la produccio de gra d’un cereal en

funció aigua mes aigua mes produccio. L’aigua es
lelement que mes limita la producció vegetal

Esquema fulla

L’aigua des de larrel puja pel xilema cap a l’epidermis

que no te clorofila i va circulant per les celules del
mesòfil. Ha de superar la Resistencia del estoma I del
boundary layer (camara limiti). El co2 tame ha de
supercar aquestes dos resitencies. Per tan la regulació
de l’obertura del estoma ha de ser molt fina (sufficient
per que entri aigua I Co2 pero sense que perdi aigua en
forma de vapoo).
Canvis fisiològics deguts a la deshidratació:

Grafic 1 a mesura que augmenta l’estres hydric van apereisen symptoms:

 Primer sintoma: es para l’extenció cellular I el creixement de la paret (abans de tancar

els estomes).
 Segon sintoma: baIxa la conductància estomatica (es tanquen els estomes per
hormona ABA)
 Tercer símptoma: com a consequencia dels símptomes anteriors, baixa la fotosintesis I
hi ha una acumulació de àcid absísic o ABA I una acumulació de soluts.

Grafic 2 en estiu hi ha una forta baxada del contingut hydric (estres) I quan plou puja.

Gràfic 3 es veu que la fotosintesis al estiu baixe en picat i després es recupera. Aquesta
baixda es dóna per limitació estomatica.

Causes del Tancament estomatic.

ABA és una hormona d’estrés I l’increment de la seva

biosíntesi és molt efectiu per al tancament d’estomes,
reduint la perdua d’aigua per transpiració.

Gràfic es deixa de regar I el potencial hydric baixe

 els nivells de ABA augmenten I es tanca l’estoma
(baixa la resistència estomàtica).

Mecanisme d’acció ABA: surt del xilema suneix a uns

receptors de les celules de guarda i tanca l’estoma.
Mecanisme de tancament estomatic: S’han descript 2 vies possibles depen de les plantes.El
ABA s’uneix a un receptor I despres hi ha dos possibilitats:

1. La via depenent de Calci- aumenten els nivells de ROS es provoca un aument del
Calci per entrada massiva (obertura dels canals)—> aixo provoca el bloqueig de
lentrada de potassi I comensa a surtir el clor i despues es bloqueja la ATPasa I
finalment surt el potassi de la vacula I despres al exterior I el estoma es tanca l’estoma
perq no queden ions. (es al reves de l’obertura en que entra aigua I ions).

 La via independen de Calci, la qual depen de NO (pot intervenir en la senyal del

tancament estomatic): aumenten els nivells de NO I això provoca aument del IP3 I AD
cyclic I despues tame aumenten indirectament els nivells de Calci i continua com el
anterior…. (pro en aqust cas cal el NO!)
 TEMA 7. SEGONA PART. ABIOTIC STRESS ANTONI TIBURCIO
PRESPECTIVES FUTURES: l’estres hydric cada cop sera major I conduira a una desertificació. A
més la poblacio human augmenta i la superficie cada cop és menor.

Es requereix millorar les plantes perque estiguin adaptades a les condicions ambientals cada
cop mes severes.

Mecanismes pels quals responen a l’estres les plantes:

Es una resposta complexa. Els estresos mes importtatns son la sequia I la salinitat (cosequencia
de la sequia), el fred… Els mecanismes condueixen a un estres oxidatiu que molts son estresos
osmòtics (sequia, sal I lfred).

Reconeixement I resposta a l’estres per la planta: sensors que reben el senyal Transduccio
de la senyla activació de factors de transcripció expression de gens com:

 Enzims per la detoxificació de l aplanta

 Porteines protectors com xaperones
 Osmolits osmoptotectors
 Gens implicats pel transport d’aigua…

Sensors: s’en coneixen pocs, pero es coneixen bastan mes les proteins que sencarreguen de la
traduccio del senyal com les MAPKK… També s’han indetinficat factors de transcripció.

Aproximaciones per la tolerancia al estres abiòtic:

 Trangenesis: sobreexpressar gens de resposta a lestres abiotic.

 Alternativa a la trangensesi: marcadors moleculars que ens permeti seleccionar
varietats tolerants aprofitan la variabilitat natural.
SOBREXPRESSIÓ DE GENS CONEGUTS IMPLICATS EN LA TOLERÀNCIA A L’ESTRÉS.

1. Singnalling Components for Regulation of Na+ homeostasis

Son Gens que codifiquen per

transportadors d’inos (homeostasis
del NA). La seva sobreexpressió
perment regular lestres salí
mitjançant una major tolerància a la
sal.

 Ex1. Sobreexpression of
NHX1 aquest enzim esta implicate
n l’acumulacio de sodi a la vacuola
com a resposta l’estrès salí. La seva
sobreexpressió va provocar
tolerancia a la sal en B. Napus.
 Ex- 2. Sobeexpressió del antiportador SOS1 al sobreexpresarlo es va acnoseguir la
tolerancia al estres Sali en Arabidopsis.

2. Sobresseprassar factors de transcripcció.

Algunes rutes son dependents de ABA . Tan en sal com sequia les rutes son les mateixes. En
l’estres per fred es poden activar rutes independents de ABA I rutes dependents d’ABA, eb tot
cas totes diferents a les anteriors.
EXemples  la sobrexpresio de factors de transcripcio comDdreb1 i cbf1 poden provocar que
les plnates siguin resistens a difernts tipus de estres

 Ex1. Sobeexpressió DREB1  usant un promotor induible per estres (rd29a) hi ha una
millor tolerància a lestres que si s’usa un promotor constitutiu. Es deu a que la
sobreexpressio de factors de transcripció afecta moltes rutes independents.
 Ex. 1. Sobrexpressió CBF1 tolerancia al fred però tambe a la sequia.
 EX3. Sobreexpressió MIB10 Tolerancia a l’estres Sali i osmòtic (sorbitol)

3. Sobrexpressió de xaperones i Proteïnes LEA.

 Les heat Cheap Proteïns (Hps) i xaperones tenen una acció protectora davant la calor.
Ajuden al replegament de proteines desnaturalitzades I a la solubilització d’agregats
proteïcs. Exemples sobreexpresio de prot Hps101.
 Les proteïnes LEA s’acumulen duran la embryogenesis terminal de les llavors, en
aquest estadi hi ha poca aigua I la sobrexpresio dels gens LEA produeix una major
tolerancia a la deshidratació. Ex. Sobrexpressioó HVA.

4. Sobrexpressió de gens implicats en el secuestrament d’espècies reactives de O2

(ROS).

Enzims implicats en el secuestrament dels ROS

(antioxidants):

 Ex1. MICROARRAY: en Arabidopsis.

Agrupacio de gens implicats en Diferents
sistemes antioxidants, segons condicions de
diferents tipus d’estres. S’activen diferents
mecanismes I diferents isoforms de cada
mecanisme.
 Ex2. Sobrexpressió de la Glutationa
peroxidosa (GPX) Tabaco.
 Ex3. Plantes trangenisques que la
sobreexpressen la ALDH, tractades amb
estressors artificials. Els nivells de clorofila I
la perdua de ectrolitos son indicatius de la
capacitat antioxidant.

5. Osmolits, osmoprotectants and Metabolyc Carbon (Metabolic keys enzimes)

L’estudi del metabolome en situacions d’estrés permet determiner els osmolits i altres
metabòlics que s’acumulen en resposta al estrés i així estudiar les possibles rutes
metabòliques implicades.

L’acumulació massiva dels omolits evita la lisi cellular per desequilibri osmotic causat per
l’augment de sal o sequera. Sobreexpressant Gens que codifiquen per la sintesi d’aquestos
compostos es pot augmenter la tolerància a aqust estrés.Exemples de osmoprotectors: GlyBet
(GB), Proline, Trehaolase.
 Ex. Expressio de l’enzim choline monoxigenasa augmeta la produccio de
osmoprotectors GB en arros.
 Ex. TomataSobreproduccio de PRolina: sobreexpressant el enzim que el produeix o amb
antisense que evita la degradacio de la PRolina acumulada.  mes tolerancia al estres Sali
 Sobrexpreso THREANOSA (TRE)

6. Polyamines, PAs (Metabolic Keys enzims)

Les poliamines també són

metabòlits que s’acumulen en
resposta a l’estrés. En plantes
n’hi ha tres de majoritaries:
putrescina (put), espermidina X
(spd) i espermina (spm).

Treballant amb Arabidopsis es va

identifiacr els gens implicats en
la sinteisi de les polyamines:
Enzims: ADC1 I ADC2 . Les SAM
descarboxilaes (SAMDC1 I 2) (fa
de donadora de grups
aminopropils).

 Adc1 induible per fred

 ADC2 induible per
estres hydric I Sali.

Estudis:

Mutants de ADC1/ 2

 mutants ACD1 son mes sensibles a la congelacio

 Mutants amb ADC1 I 2 sobrexpresseats sobreexpressio de ACD1 provoca millor
tolerancia al fred (a la congelacio). No sa vist nomes en Arabidopsis, tambe en altres
plantes. Hi ha una patent.
 Per acd2 tmabe hi ha lines trangeniques que el sobrexpresen I tenen mes toleracina al
estres

Mutants SAMDC1 I SAMDC2 Síntesi SPERMINA (SPM)

 Sbrexpresio SAM I SPM mes tolerancia a la squia I la congelació.

Proteccio per sobreproduccio de SPM Hi ha una acumulació del transcrit NECD3

augmenten els nivells de ABA  La SPM actua com a activador transcripcional del gen per la
sintesis de ABA.
IDENTIFICACIÓ DE MARCADORS QTLs I NOUS GENS ASSOSIATS AL ESTRÉS MITJANÇANT CROP
BREEDING I LA VARIETAT NATURAL.

Exploració de la variació natural Arabidopsis es troba molt distribuida I dependen del lloc el
fenotip varia molt aixi com la resposta a lestres. Molta variabilitar en resposta a la sal
variaetats molt sensibles ia altres molt tolerants comparacio de regions cromosomiques
entre estes varietats identificacio qtlS associats a la tolerancia localitzacio de gens
candidats alguns destos gens ja es coneixien (relacionats amb produccio de ABA I resposta a
lestres). També s’estàn descobrint nous gens no coneguts.
 TEMA 8.
1. OBTENCIO DE PLANTES ORNAMENTALS NOVES

Es basa principalment en bioingenyeria metabolica. Per manipular les rutes metaboliques

tenim en compte 3 coses:

1. Coneixer les rutes metaboliques secundaries (en plantes son complexes, ramificades,
moltes son compartimentades (en organuls o citoplasma..)
2. Funcio dels metabolits secundaris en la planta (els metabolits secundaris no son
essencials per la vida de la planta I alguns poden ser toxics, segons on sacumulen). Cal
estudiar be els tipus de promotors.
3. Clonacio gens.

El mercat de plantes ornamentals mou uns 50 milions d’eu al any molts diners. Lo mes
buscat son characters nous.

Les tecniques de ingenneyria genetica permeten obtenir noves varietats en poc temps en
comparacio amb el temps que requereixen els metodes classics.

Interes flors: color flor (biosintesi flavonoids (antocioants )), forma de les flors (metabolisme
hormonal), olor (modifican rutes biosintetiques de terpens), tamany plantes o cicle vital mes
llarg, o ferles mes resistents….

El color; metaòlits responsables

 Flovonoides polifenols  compostos de sintesis mixtal (mes usats q els carotenoids)

 Carotenoides tetraterpenos

Biosíntesi de Flavonoides

Són compostos fenoles de sintesis mixta ja que

en la seva biosintesis intervenen dos rutes de
metabòlits secundaris:

1. Ruta siquimat (matabolisme glucidic

s’inicia amb intermediaris del cicle d
Kalvin.

2. Ruta de policeids (metabolisme lipidic)

1. El CEBADOR P-cumaroil CoA sobre al qual

suneix el manolil coA i es forma la
CALCONA . La Calcona és un TETRACETIDO
de sintesis mixta, ja que el cebador ve d’una
altra ruta biosintetica. *en els tetracetids
“normals” el cebador prove de acetil CoA.
2. A partir de la CALCONA es formaran molts Flavonoids depenent de les modificacions. Els
principals resposnsables dels colors son:
o Antocianidinas (no estan glucosiladas), alguns tipus son: pelargonidina, cianidina i
delfinidina que difereixen en el num de grupos OH en el anell i això determina els
colors.
o Antocioanines (estan glucosilades)

3. Tambés es formen Flavones I Flvonols que intensifiquen el color.

El process fins a la formacio es força complex  a partir dels diferents dihidroflavonols (que ja
difereixen en el num de OH) es formen les diferents antocianinas I antocianidinas.

Exemple en la flor PENSAMIENTO (Blava) la ruta es la ultima de la diapo (dreta), en que

pedomina la delfinidina. La intensistat de color tambe depent del nomero de pigments
generats en aquests rutes secundaries com les flavones I flavonol que provoquen una major
absorcio en la zona visible del blau I sintensifica el color blau.

Disminuir la intensitat de color: Si sinhibeix la sintesi de aquests pigments acompanyants  ex.

Inhibin la calcona sintasa (CHS) disminueix en num de flavones I les flors de color mes clar. El
mateix passa si hinibeixo dihidroflavonol .

Canviar el color (ex roses blaves) la flavonona 3hidroxilasa F3H Dihidocanferol, a partir
del qual la via es pot ramificar segons les hidroxilacions:
  Hidroxilació en 3’ (F3’H) RUTA CIANIDINES (ROIG MAGENTA)
 Hidroxilació en dos posicions, 3’ I 5’, F3’5’H RUTA DELFINIDINA (BLAU)
 No Hidroxilació RUTA PELARGONIDINES (TARONJAROIG)

Modificació del color: ni les roses ni els clavells tenen el enzim F3’5’Hidroxilasa de la ruta de
la delfinidina  am creuaments es impossible obtenir estes flors blaves. A més els enzims DFR
son de gran especidficitat pel sustrat I en el cas de petunia sempre es dona la ruta CAP AL
BLAU per la afinitat alta amb DFR.

 Obtenció de CALVELLS BLAUS.

Els clavells blancs no tenen la F3’5’H i a mes la DFR no te afinitat per cap dels altres sustrats de
manera que obtenir un clavell balu partint d’un de blanc es força facil, no cal eliminar cap ruta
de colors, nomes afegir la del blau afegint la hidroxilasa 3’5’ i la DFR de petunia que te una
gran especificitat per la dihidromyricetina,

 Obtencio de roses blaves

No hi ha cap rosa deficient amb DFR, de manera que sh’a de partir de roses colorades. S’usa
la rosa carfenal que es de color clar. No nomes va caler posar els gens per la ruta de la
delfinidina sino que tambe es va haver d’anular la ruta del color de la rosa.

1. RNA antisentit contra DFR endògena amb amb activitat per dihidrocanferol o
dihiforquercentina  Rosa color blanc.
2. Introduccio de una R3’5’ H de la violeta (inici ruta delfinina)
3. introduccio DFR de lliri que te molta afinitat pel dihidromyricetin color blau
Modulació de la intensitat de color:

 Amb el pH tambe poden millorar el color

o ph acid mes tendencia cap al roig
o PH es neutres  mes tendencia al blau purpura.
o Ph Bàsic perd una mica de color
o Extremadament basic sidrolitza el color.

2. FITOREMEDIACIÓ

Plantes que poden metabolitzar I degrader contaminants. Tambe sinclou en aques camp els
mircroorgmanismes.

Els contaminants poden ser

 organics es poden degradar. La industra militar allibera molts conataminnants, la

agricultura, la indrustria. La majoria del orgànics son produits pel humà
 inorganicsno es poden degrdar pero alguns casos es poden passer a formes menys
tòxiques en, ex. el mercuri. Els inorganics es produeixen per humans I alguns es van
acumulant per processos naturals en lescorça terrestre tot I que lacumulacio a
aumentat per culpa indirectament dels humans.

.Solució:

 Tècniques de ingeneria  molt car!

 Fitoremediació poc usat acutament pero sembla que s’usasarà mes.
Caracteristicas d’una planta usada per fitoremediacio

Tecniques de Fitoremediaicó
 1. Filtració

 Cultiu hydroponic
(Sistema indoor)
per netejar aigua.
 Aquifer artificial
(sistmea exdoor).

Han de ser plantes capases

de viure en hypoxia. Els
contaminants de les aigues
solen ser metalls provinens
de explosisus o hervicides.

2. Barreres hidràuliques

La planta transpira molt I pot pendre

aigua de larrel.

3. Fitoestabilització

Les arrels estabilitzen sòls

empobrits. Les arrels ajuden a
estabilitzar els sols. Poden
prevenir la erosio I estabilitzar
sòls.

Les plantes han de ser resistents

als canvis de ph I altres estresos.
Tambe han de eliminar facilment
agents oxidants.
 4. Fitoacumulació

Plantes que acumulesn contaminants. Espècies que no siguin de ús aliminetari, de creixement

ràpid, que produeixen molta biomassa.

5. Fitoestimulacion

Mitjançant
microorganismes
que s’assosien a
l’arrel.
 6. Fitodregadació

Plantes q absrobeixen
contaminats organics que tenen
enzims que poden degradar estos
contaminats (x degradar
pesticides, insecticides,
herbicides,….)

7. Fitovolatilització

Exemple del merucri.

Exemples de plantes trangeniques.

1. Plantes tolerants a metalls pesats  les plantes tenen proteins que suneixen als
metals (glutatió (3-peptido), meta….  diapo. San aprofitat estes proteins. Amb les
bonmes ABC, I es controlesn les sublstancies en la vacuole.
 El gen TaPCS1 de trigo I codifica per fitochelatina sintasa en la planta Nicotiana
blauca pot acumular fins a 9-36 cops mes de Cd I Pb que la propia planta de trigo.

2. Plantes que dregaden explosius RDX I TNT  hi ha bacteries que els poden degradar
estos compostos com el gen citrocrom p459 (pel RDX) I el NADPH dependent (pel
TNT).
 San fet doble trangeniques de les dues anteriors capaces de degradar ambdos
compostos.
 3. Plantes que passen el mercuri a una forma menys tòxica

El mercuri és un dels elemets més toxics però és poc abundant. Depenent de la forma es mes o
menys toxic. El problema es que passa a la cadena tròfica fàcilment. El mercuri 0 és poc toxic I
volàtil. El mecrui 2+ passa al sòl I del sol a les aigües I als peixos I a la cadena trofica. Una forma
d’eliminar el mercuri de les aigües contaminades és usar plantes que degradin les formes més
tòxiques I passer-lo a mercuri volàtil I menys toxic.

El gen MER es troben en un microorganisme I formen un operó amb diferents MER. En plantes
susa el MerA i MerB:

 Mer A tranforma el mercuri 2+ al 0.

 MerB codifica per una organomercurila lyase: trenca les unions del mercuri als
compostos organics.

Daquesta manera MerB separa els compstos organics I allibera el Hg 2+ I mer A el passa a Hg0

4. Detecció de TNT.

Una altra aplicació es detectar mines antipersona que tenen TNT. No son detectables amb
detectors de metals perque estan cobertes de plastic. Susen les plantes com a biosensors.

 Primerament, es va fer un experiment amb bacteris:

Promotor induible per NO2 + reporter  El TNT allibera NO2.  La especificitat va ser molt
baixa perque cobrir tota la superficie era dificil. Es va fer amb plantes:

 Després es va probar amb plantes.

Planta capaç de reconeixer alguna molecula similar am alguna de la propia planta per que sigui
reconeguda per algun receptor endogen. Hauria de detector compostos NO2 o derivats I
indicaro fenotipicament. Es un Sistema complicat que implica biologia sintètica.

 S’ha posat 2 gens que formen la biosintessi d’antocianines (color violeta)  si es

detecta el compost un promotor induible expressara els gens I la planta es tornara
violeta.
 Cal posar tambe un gen per a un receptor que interaccioni amb compostos
nitrogentats a nivell d’arrel. El receptor específic es fa de forma sintètica basantnos a
receptors naturals que reconeixin molecules semblants.
 Per que el receptor sintetic transmeti la senyal al nucli (promotor induible) cal fer
biologia sintetica  multitrangèniques
TEMA 9. Plant cell and organ cultures for the production of phytochemicals.

 1a generacio: argivcultura
 2a generació: millora de les propietat organoleptiques
 3a generació: millora de la salut  producció de compostos propis o recombinants
amb fins therapeutics.

Produccio de proteines recombinants en plantes evito infraestructures costoses com els

bioreactors.  menys costos. A més les vegetals son eucariotes (glucosilació).

1. Vacunes

La principal aplicació va ser l’obtenció de vacunes

comestibles en una fruita…Això milloraria l’accès de
vacunes a nens de paisos pobres.

 Ex. En panis posar una proteina de la capside del

virus de la hepatitis B. La principal ventatge és
evitar injeccions que son cares, possible transmisió,
san de mantenir en fred…
 Si es produexien en espècies tipiques de les regions
on san d’usar les vacunes no cal mantenirles.
 S’ha vist que les vacunes continuen sent actives al
ser menjades, a nivell de mucosa I a nivell sistèmic.

Problema la dosificació de les vacunes cada planta

produeix mes o menos transgenic (efecte psocional) a mes
depen de la quantitat que mengem s’ha mirat de
purificarlos I encapsular-los.

2. Producció
anticossos

S’han produit en
plantes anticossos
monoclonals
(millors) amb bons
resultats
(plantabodies).

Ex. Porducció de
IgAes produeix
de forma natural,
principalment en
les mucoses que
son les principals
vies d’entrada al
cos pels
organismes.
La IgA pot fer dimers I es forma la immuglobulina de secresion o SIgA és la més produida per
l’organisme. L’estructura de la IgA es formada per:

 2 cadenes pesades + les 2 lleugeres (x2). Els extrems de les IgA de les lleugeres I
pesades son les regions variables I especifiques per difernts microorganismes.
 la cadena J que uneix les dos IgA
 la cadena protecció.

S’han produit diferents tipus d’aquests anticossos (fese experimental 2).

 Caro RX:

Promotor+ peptid senyal cap a la paret+ Cadena lleugera+ pesada+ J+Proteccio

El peptid senyal fara que vagi de RE a golgi on es donarà la glucosilació I serà enviat a la paret

Acumulació en llabors:

Promotor especial per llavors (ex. Gluteina).

Exemple aplicacions

 CaroRX; S’han obtingut anticossos contra streptococcus mutans (provoca caries) 

tractament amb CaroRX inhibició creixement
 Rhino Rx virus que causa la rinovitis (arrofredat) RhinoRx suneix a la ICAM-1
evitan qe si uneixi el rinovirus.
 Doxo Rx contra la caiguda del pel.
 3. Produccio de citoquines

Prducció de proteines recombinants en oleosines de llabors facil purificació.

El oli produit per les llabors es acumulat en el cos lipidic les oleosines son les proteines que
estant integrades en els cosos lipidics la idea es unir (unio labil) la proteina recombinant
amb les oleosines i una protease trencara la unió).

Promoto specific+ oleosina +peptid senyal + insulin

L’oli es purifica I es centrifuga ens quedem amb la fase oleosa (cossos lipidics) I o tractem
amb protease I centrifuguem I ens quedem amb la fase aquosa.

Ventatges llabors

 En les llabors no hi ha fenoles ni micotoxines això es bo pqe les farmaceutiques et

permetin la comercialització.
 A més les llabors acumulen proteines de forma molt estble
 Facil purificació (hi ha menys proteina endògena)
 Am les llabors oleasinoes la purificacció encara es mes facil

Comercialització per a ambits therapeutics fases I, II, II Dificil arribar ala comercioalitzacio

La unica proteina R en plantes comercialitzada es la glucocerebrosidasa (ProcCell de Pficer)

per la malaltia de Gausher  deficiencia glucocerebrosidasa ( hidrolasa del lissooma ). La
produccio en plantes va embaratir molt el preu.

Aquesta s’acumula a les vacuoles en celules de pastanaga.

El vector format per:

Prom constituit+ enhancer+ peptid senyal per la sintesi en RE+ gen huma+ senyal per vacuole+
terminador

 Gen molt quimeric cada part del gen ve d’un organisme diferent.
 Sintesi en RE I Senyal vacuole: Al final de tot una ruta de metabolisme es forma la
proteina amb xilosa I fructose que pot ser transferida al la vacuole on s’acaba de
processsar I passa a ser activa.
 Mes barat, no risc per contaminacio de virus, bacteris…, no requereix modificacions
posteriors, es pot produir a una demanda gran.
Tema 9. 1a part Dr. Palazón
A la figura es pot veure un petita llista d'alguns productes vegetals s'utilitza actualment com a
medicaments. Els que estan marcats amb un asterisc pot ser sintetitzat químicament, però la
majoria d'ells s'extreu de la planta, perquè tenen una estructura que és molt difícil de
sintetitzar químicament.

La via més efectiva (+ barata) es la síntesi quimica però tambe es la més contaminant. Una
altra opció son els cultius de plantes productives de compostos actius. No sol ser viable. El
taxol sa intentat pero els arbres an destar 50m anys abans dextreure la escorça. El Taxol te una
ruta de sintesi molt complicada i la seva sintesi sa descrit pero el rendiment es molt baix I no
es rentable.

La produccio biotecnologica es la mes

factible a partir de cultius celulars o
culstius de organs (roots o shoots).
També sestan comnesant a desenvolupar
cultius de brots de part aeria.
Concepte  cellules mare vegetals.

Són cèl·lules de plantes amb una capacitat il·limitada per al creixement I la capacitat de produir
noves plantes idèntiques. Per mitjà de tècniques de cultiu in vitro, podem per obtenir cèl·lules
mare de la planta amb la mateixa capacitat biosintètica com a tota la planta. També pot
regenerar plantes noves amb els mateixos trets genètics com les plantes mare.

Diferencies en el creixement de humans I vegetals:

En general,
els éssers
humans i els
animals
mantenen la
seva
capacitat
per créixer
durant un
període de
temps molt
limitat,
durant la
seva
infància; per contra, les plantes són capaces de créixer i regenerar nous òrgans durant
tota la seva vida. Com a exemple, aquí es pot veure el capacitat de creixement de
sequoies, que pot créixer durant centenars d'anys.
Cèl·lules meristemàtiques

El creixement ilimitat vegetal es deu al funcionament dels meristems les cèl·lules mantenen
la capacitat de divisió i de realitzar la mitosi durant tota la vida de la planta.

Les cèl·lules dels meristems es divideixen aixi: es divideix una cel mare I una es diferenciara pero
l’altra continuara sent meristematica (continua capacitat de les celules de reproduirse).

Les plantes tenen meristemes a la part superior de les tiges i branques, i en la part superior de
les arrels. També poden tenir un meristema anomenat càmbium, que és responsable de
l'expansió de l'amplada de la tija. Cèl·lules meristemàtiques són totipotents, el que significa
que aquestes cèl·lules són capaces de regenerar una nou òrgan o una nova planta, ja que
contenen el genoma complet de la planta.

Cal·lus cel·lular
Masses cel·lulars que poden apareixer despres d’una lesió o una infecció.
Són cèl·lules totipotents i tenen una capacitat il·limitada per al creixement.
Com esmentem en la primera classe, podem desenvolupar calls al laboratori utilitzant tècniques
in vitro, mitjançant l'addició d'alguns reguladors de creixement de les plantes als teixits
diferenciats de la planta (explant). Cèl·lules de calls obtinguts per tècniques in vitro tenen una
alta activitat mitòtica i són l'origen de les cèl·lules mare de plantes utilitzades en la indústria
cosmètica i farmacèutica.
L'ús de tècniques in vitro, es pot demostrar que les cèl·lules mare de calls són totipotents i
cada un d'ells és capaç de desenvolupar tota la planta per processos organogenétics.
Podem desarrollar sistemes biotecnologiquis amb celules en suspenció, capaces de fer
compostos d’interes. Aquestos compostos pero, els fan celules especialitzades en rutes
especifiques de celules I teixits, i/o etapes especifiques.

Producció de metabòlits secundaris amb cèl·lules mare

Podem induir cèl·lules mare sense diferenciació morfològica per assolir el nivell de
diferenciació bioquímica necessària per al desenvolupament de les rutes biosintèttiques
secundàries per produir compostos per mèdicament importants, com ara la compostos contra
el càncer podofilotoxina o taxol, o medicaments contra l'Alzheimer, com witaferina, etc.

A nivell de cultiu invitro volem aconseguir que les celules, sense alterar la seva morfologia,
produeixin els metabolits secondaris i les rutes corresponents, ho fem artificialment amb un
control extern.

Metabolisme secundari
 El Metabolisme secundari depèn de precursors proporcionats pel metabolisme primari i les
rutes biosintètiques no estan actives durant tot el la vida de la planta.
 Aquests processos estan relacionats amb la diferenciació cel·lular i la desenvolupament de
teixits i òrgans específics.
 Depenen de desenvolupament de la planta i es restringeixen a certa moments de
ontogènia de la planta.
 No totes les cèl·lules d'una planta sencera pot desenvolupar rutes biosintètiques
secundaries.

El primer pas és el desenvolupament de cultius de calls. Aquest procés requereix l'aïllament I

l'esterilització del explant, la desdiferenciació in vitro de les cèl·lules de explants, i la formació
de calls, seguit per l'aïllament i la cultura dels calls a condicions òptimes.
Exemple amb la planta del tejo els fruits rojos és lo unic no tòxic.
 Esterilitzem indium la formació del callus amb horomones obtenim massa del callus
friablesagitació suaususpensio cellular…
Dinàmica de creixement de les cèl·lules en suspenció

Segueix una curva sigmoidea temps vs. creixement FASES:

1- Fase de retard les celules es preparen per dividirse (sintesi RNA, lipids, replicació….),
s’estan adaptan a les condicions / canvi ubicació /estres. No augmenta la biomassa.
2- Fase creix exponencial divisió en mitosis continua. Continua la síntesi de RNA, DNA,
proteines… Es dóna el metabolisme primari com la sintesi de sucres… que es poden
usar com aliment. La duracio depen de la planta o cultiu. A mesura que els nutrients es
van agotan la capacitate de divisio va disminuint.
3- Faxe creix estacionari agotament nutrients numero de cèlules que moren =n de
cel que es divideixen no increment biomassa. La celula detecta la falta de nutrients I
respon amb mecanismes de defensa que implica la sintesi de metabolits secundaris.
Quan la planta es jove gasta tots els recursos en creixer pero quan es adulta inverteix
en metabolits secundaris.

Interessa la fase estacionaria perque es quan es dóna la sintesi de compostos bioactius. Hi ha

d’haver una compensacio de la fase de creixement (biomassa energia…) I la estacionaria (s’usa
l’energia de la fase anterior per fer met. Secundaris).

Aplicacions en COSMETICS
Ventages de cel mare en cosmetic “industria verda I sostenible”

 Produccio de grans quantitats de biomassa amb poques plantes

 Afavoreix que especies que poden ser amenaçades es mantenguin perque el Sistema
amb cel mare vagetals es sostenible, deixem de dependre de la planta.
 Garanteix productes sense microorganismes.
 Al no ser un cultiu agronomic no esta tractat amb pesticides ni herbicides.
 Cultius en bioreactors no es gasta superficie agronomic pel que es pot mantenir
superficies per la produccio d’aliments. (ex. Cultiu biodiesel amb soja van disminuir
els cultius de menja I va pujar el preu).
 No gasta gaire aigua
 El preu dun compost deun producte natural es creu q un 60% del cost es deu nomes a
l’extracció processos que generen indirectament molts compostos toxics q san de
recilclar… En la cosmetic no hi ha gast de solvents organics.
 No s’usen “en general” trangènica (al menys en Europa).

Exemples

 Empressa mibelle biochemistry: apple stem cells poden resistir fins a 4 mesos sense
fer-se malbé. L’empresa va fer cremes amb celules mare d’aquesta poma  ells diuen que
tenen factors epigenetics que poden activar les celules humanes I augmenta la seva
capacitat de regenaració I mes coses… la industria cosmetica no li interssa demostrar lo
que diu…
 Cèl·lules mare vegetals d'edelweiss, una espècie de planta en perill d'extinció dels Alps
que s'utilitza en cremes anti-envelliment, ja que és un filtre UV potent.
 Equinàcia que prové de la medicina tradicional dels indis nadius americans, s'utilitza com
un complement nutritiu per les seves propietats immunomoduladores i antiinflamatòries, i
també s'inclou en cosmètica per la seva acció anti-envelliment.
 Centella asiatica, que ve des de la medicina ayurvèdica (la medicina tradicional de l'Índia),
s'ha utilitzat des de l'antiguitat per tractar la lepra, i s'utilitza en l'actualitat principalment
per al tractament de cremades i per a la curació ferides. En els últims anys, també s'ha
 inclòs en alguns cosmètics per a la seva capacitat de regenerar les cèl·lules de la capa
epidèrmica.
 Raïm Gamay calli: es l’unica varietat que te antociants a la pulpa, en la resta es troben sol
a la pell. S’usa molt en protectors solars ja que les celules tenen antociants que filtren el
UV.

APLICACIONS EN FARMACEUTICA producció de fitofàrmacs

Ventatges:

 El producte pot ser obtingut en qualsevol part del món amb un control estricte de la
produccó. Les plantes en altres llocs del món no estan tan controlades I poden generar
conflictes politics. En afganistan el opio I en Colombia la coca. Guerra xinos anglesos per
l’opio.Control de producció si creo un mercat duna substancia augmento la
produccio baxo el preu I si trec producció el preu pujara.
 L'ús d'herbicides i pesticides és innecessària.
 No climàtic o problemes ecològics.
 Els cicles de creixement de setmana en lloc d'anys com a la planta intacta.

Exemples:

Berberine, Shikonin (colorant del roig carmin), Taxol I analogs.

Taxol I derivats anticancerigenss’obtenen de la escorça interna dels tejos per un

tractament (1a persona) es requereix 4-6 arbres de 60 anys.

Es van començar a talar arbres (tejo) de forma incontrolada  avui en dia en tot el plantenta
es una especie protegida es la especie mes amensaçada. El taxol es molt car I en molts
paisos no entra en la segurenta social. Gràcies a la biotecnologia s’ha pogut introduir en molts
paisos.

Ex.En china cremen un parc natural I el replanten amb tejos I quan son poc alts els venen.
Producció industrial de compostos bioactius vegetals
Requeriments:

Els sistemes biotecnològics són extremadament cars i només poden usar-se quan:

 El producte té un alt preu en el

mercat
 la producció específica de la
procés és més gran que a la
planta,
 és fàcil per recuperar el producte
 la producció és estable,
 no hi ha processos alternatius de
síntesi química
 és possible ampliar el procés a
nivell industrial.

Però no tots els

fitoquímics poden ser
produïts per sistemes
biotecnològics. Cal que

 el cost de producció
sigui menor que fer-ho
amb tota la planta,
 que el producte tingui
un valor afegit alt al
mercat, per sobre de
500$ / kg, i
 el rendiment del
procés ha de ser superior
a 1-2 mg / L / d.

Per aconseguir aquest tipus de

producció, és necessari optimitzar el
procés biotecnològic. Les mesures
necessàries per optimitzar la producció
són:
  Selecció de línies cel·lulars altament productives. Les tècniques in vitro estimulen la
variació somaclonal i després de la inducció del call i la desagregació del call per obtenir
suspensions de cèl·lules, no totes les línies cel·lulars tenen la mateixa capacitat per a la
producció de fitoquímics. Per tant, cal seleccionar les línies cel·lulars més productius.
 Optimització del medi de creixement i producció. En la majoria dels casos, la producció
de fitoquímics no està relacionada amb la producció de biomassa, i alguns mitjans de
cultiu i condicions externes que promouen la formació de la biomassa inhibeixen la
biosíntesi de fitoquímics. Per això cal trobar les millors condicions per a la producció de
biomassa, així com les millors condicions per a la producció dels compostos diana.
 Addició de precursors biosintètics. En alguns processos biotecnològics, quan la ruta de
biosíntesi dels compostos bioactius es coneix, podem afegir alguns precursors al medi
de cultiu per tal d'augmentar la productivitat del sistema. No obstant això, és necessari
que els precursors tingui un preu de mercat més baix que el producte final de la ruta
biosintètica.
 Addició d'inductors. Els elicitors són agents físics o químics que activen el metabolisme
secundàri fan augmentar la productivitat del bioprocés. S'utilitzen amb freqüència en
tot el processos biotecnològics.
 Estimulació de l'alliberament del compost objectiu al mitjà de cultiu. En els cultius de
cèl·lules sovint s'acumulen els compostos bioactius dins de les cèl·lules o en vacúols
provocant toxicitat I regulació feed-back de la biosíntesi, pel que és necessari recollir la
biomassa del cultiu per tal d'extreure els compostos bioactius. L’extracció de matèria
vegetal seca és un procés difícil a causa de la gran quantitat de ceres i pigments que té.
Els agents de permeabilització poden alliberar els fitoquímics, atrapats en les cèl·lules
en el medi de cultiu, facilitant així el procés d'extracció final.

Ex. Shikonin

A la part inferior de la figura es compara la producció de shikonin a la planta amb una procés
optimitzat basat en cultius en suspensió de cèl·lules.

 Productivitat (mg/g/setmana) 60 en Cs representa 1250 més productiu en Cs

Cultius en dos fases

Són els més usats.

Es genera primer
una gran
quantitate de
biomassa I
després es
transfereixen les
cèl·lules en grans
bioreactors per
incrementar i
obptimitzar la
producció dels
compostos actius.
 Primera fase: Amb factors de creixememt, hormones, nutrients… Incrementem el
creixement. Controlant factors de llum, temperatura i agitació.
 Segona fase: Tranferencia a medis de producció. Condicionem el medi amb:
 Elicitors (estrès):
o Abiòtics: Variem nutrients per exemple treient-n’hi per provocar un estrès i
assolir la fase estacionaria. També es pot estressar el cultiu amb llum UV, el
pH, estrès osmotic…
o Biòtics: normalment són de la familia dels Jasmonators, per exemple,
methyljasmonate, que són compostos de la planta implicats en la mecanisme
de resposta de les plantes a condicions d'estrès.
 Agents permebilitzants afavoreix el alliberament del compost al medi de cultiu.
Poden ser:
o QuÍmics: DMSO, Chitosan (solvents organics), ciclodextrins
o Físics: ultrasons, electroporació…

Tècniques de immobilitzacio cellular

Les cèl·lules vegetals són molt

sensibles a l’ estrès per agitació i el
canvi de medi de creixement per
medi de producció és difícil de
realitzar en les suspensions de
cèl·lules. Per tal de facilitar els
canvis del medi de cultiu i protegir
les cèl·lules de l'estrès per agitació,
es segueixen protocols
d'immobilització cel·lular. També
permeten extreure els compostos
actius del medi sense perdre
cel·lules.

Podem immobilitzar cèl·lules vegetals d'una manera fàcil mitjançant microencapsulació en

polímers de sucre o per adhesió a matrius inertes.

1. Matrius inertes: espuma de poliuretà i fibra de vidre buida  materials molt porosos que
filtren el medi de cultiu pero fan que les celules quedin atrapades. Nomes funciona quan
les celules poden alliberar els compostos al medi de cultiu ja que les celules queden
atrapades irreversiblement.
2. Agents gelificant utilitzat és alginat, que forma perles en presència d'ió calci, atrapant
les cèl·lules de la planta a l'interior. Ex. Taxol.
 En comparació amb
les suspensions de
cèl·lules, les cèl·lules
immobilitzades tenen
les següents
avantatges:

• El procés és pot
desenvolupar de
forma contínua,
mentre que el
producte s'allibera de
les cèl·lules I separat
del medi de cultiu.

• Permeten canvis
del medi de cultiu: podem afegir i suprimir diversos compostos fàcil i ràpidament.

• Es pot rejovenir la biomassa in situ per perfusió del medi de creixement a la cèl·lules a
diferents intervals de temps.

Cultius d’arrels

La produccio de fitofàrmacs no sempre és possible, sovint requereixen l’estructura d’un organ.

Les arrels de les plantes tenen un metabolisme molt actiu i poden biosintetizar un alt nombre
de compostos secundàris d'una manera exclusiva. Alguns d'aquests compostos també poden
ser biosintetizados en sistemes diferenciats com ara cultius de cèl·lules, però en alguns casos la
diferenciació cel·lular i formació d'òrgans és necessari per produir els compostos bioactius,
com és el cas dels alcaloides tropano, èsters de bornilo, ajmalicin i altres compostos.
Ex.scopolamines nomes es pot fer en arrels, altres es poden fer en cel tambe pro es fan amb
arrels.
Cultius d’arrels.

Per a fer els cultius d’arrels als anys 60 s’havia d’afegir IAA però aixo desfavoreix la producció
de metabòlits secundaris. Després es va deixar de fer això i es va fer el cultiu de arrels
transformades amb un DNA bacteria (Agrobacterius rhizogenes) però comque actualment no
s’accepten els compostos trangènics amb microorganismes, s’ha tornat a fer amb arrels no
transformades am protocols més optims que permet fero a nivell industrial.

Transformacio arrels  Hairy

roots protuberancies per
agrobacterium rhizogenes (tumor en
arrel) s’usa per fer trangenesi en
l’arrel funciona igual de qe
tumefaciens. La infecció provoca un
creixement de les celules de larrel
incontrolat molt creixement de
l’arrel! Aquestes arrels pero no son
geotropiques (cre. Vertical) sino
plagiottropiquess (creixement
horitzontal).

Així com A. tumefaciens, A. rhizogenes és capaç de transferir una part del seu plasmidi Pri al
genoma de la planta i les cèl·lules transformades comencen un procés de divisió cel·lular i la
diferenciació cel·lular per formar una arrel, els anomenats arrels peludes. Són diversos
informes que indiquen que l'ADN-T (El fragment d'ADN d'Agrobacterium integrat en el genoma
de la planta) d'A. rhizogenes porten ROL gens, que són responsables del desenvolupament de
l'arrel.

Funcions dels Rol Genes

Segment TL: RolA, ROL B I rolC Gens responsables de la trasformacio de l’arrel, la resta del T-
DNA no es necessari. No se sap molt d’aquestos gens. (funcions principals en la diapo).
Passos:

 Després les passem en

medis liquids I finalment
induim el cultiu
d’embriogenesis.

Els explants de la planta de

les hairy roots mostren una
alta capacitat de créixer en
medis de cultiu sense
reguladors del creixement de
les plantes i poden
biosintetizar els mateixos
compostos que l'arrel de la planta mare. Les hairy roots s'utilitzen actualment per a la
producció de fitoquímics que requereixen el nivell de diferenciació que correspon a l'arrel
de la planta per a la seva biosíntesi.

Les principals etapes de desenvolupament i optimització d'una cultura d'arrel vellosa són:

1. Establiment del cultiu hairy root (per la infecció dels explants amb una virulenta soca d'A
rhizogenes). Depen de lespÈcie tardarà mes o menos a sortir les arrels transformades. Cada
arrel que es forma es un clon perque prove d’1a sóla cèl·lula transformada.

2. Selecció de clons altament productius.

3. Optimització de les condicions de producció (mitjançant la millora de les condicions

externes, el medi de cultiu, elicitors i els tractaments amb agent permeabilizants, etc.). Els
passem a cultius liquids i induim embriogenensi.

4. Scalatge (Sacale-up) als bioreactors (per adaptació del bioreactor per al creixement de les
arrels).

Ventatges cultiu de arrels transformades

 Rapid creixement en medis sense reguladors

 La producció de compostos es exactament el mateix
que en la planta (mateix perfil metabolic)
 Estabilitat genetica
 Escalat a gran escala es pot fer.

Al extraure un compost de les plantes trasforamats no hi ha

probelemes per comercialitzarlo perque no venem el
transgenic sino un producte que prove d’un transgenic. A més
aquest sistema no pot provocar contamincio per polen. Pero
si es comercialitza un estracte vegetal si que sera el transgenic el que mengem i caldrà una
ligencia especial.
Escalat en bioreactors

L'últim pas d'un procés biotecnològic basat en cèl·lules de plantes o cultius d'arrel és l'escalat
en un bioreactor. En aquests processos es pot supervisar i controlar diversos paràmetres,
incloent:

 Agitació: normalment a 100 rpm.

 Ventilació: mesurat per la pressió parcial d'oxigen controlat a 50% de l'oxigen dissolt.
 Temperatura: 25 ° C normalment.
 Escuma: Podem afegir antiespumants si cal, però normalment cultius cel·lulars no
produeixen molta escuma.
 pH: normalment es controla a 5,8 ..

Biorreactor escala Piloto El

software indica una temperature
major de 26ºC I una agitació molt
gran  no és pot cultivar celules
vegetals. Els bioreactors sempre
s’havien usat per cultivar
microorganismes però les cèl·lules
vegetals funcionen molt diferent.

Diferencies principals:

 Mida (les cel vegetals son molt mes grans I pesades).

 Creixement.
o Els microorganismes creixen de forma aillada pero les vegetals tenen
tendencia agrgarse.
o Les fases de creixement son molt mes rapids en bacteris.
o Temps de duplicacio

 sensibilitat agitació (mlt

alta en vegetals degut a
la estructura i duresa I
fragilitat de la paret
vegetal.
 Acumulacio del
producte: els bacteris
alliberent el producte
però les vegetals
l’acumulen en
protoplast.
Tot aixo a comportat redisenyar els bioreactors que en un pricipi susaven per microorganismes
per readaptar-los al cultiu de cèl·lules vegetals.

Com que les cèl·lules vegetals són molt sensibles a l'estrès per agitació , el primer tipus de
modificació en els tancs agitats era canviar la forma i disposició de les fulles del bioreactor.

Stirred tanks:

Les grans fulles dels bioreactors cla`ssics són reemplaçats per

 Propulsor marí, que és menys perjudicial per cèl·lules vegetals.

 petites fulles alineades al llarg de tot l'eix del sistema d'agitació.
 Única pala central foradada (raqueta) que mou el mitjà de cultiu pel costat perifèric
 Sistema d'hèlix on les fulles estan reemplaçats per un eix amb forma de llevataps.

Bioreactors impuslasats per aire:

A. Bubble column: l’aire impulse les cèl·lules cap a dalt , distribuint els nutrients pero el
problema es l’escalat. A grans dimensions l’aire impacta molt fort I tambe trenca les
cèl·lules.

B/C. Air-rifht: te com un doble tub interior on hi ha les celules I l’aire nomes circula cap
amunt per la part externa I les bombolles van perden velocitat. El dispositiu settler genera
una corrent convexa cap a linterior. Els moviments son continus I formen una corrent
interna son idonis pels cultius de cel vegetals.

Wave bioreactors

Imiten el moviment de les onades. Es va aireJant I no s’alimenten del fons ni xoquen contra
elles. Lescalat es nomes fins 500L.
Per a l’escalatge sempre son mes pràctics els bioreactors d’agitacio mecanica que els d’aire
perque tenen mes diametre que altura. El d’aire han de ser massa alts i coste molt mes
manipular.

Cultiu de arrels

Es molt complicat en bioreactors. Les arrels Necessiten:

 un Sistema d’aclatge
 Un Sistema de proteccio contra les pales que les triturarien.

Estratègies

Malles d’acer per protegir-les I fixarles .

sapray-bioreactor : malles + aspersor que rega la

arrel) problema no es escalable, difícil
recolectar-les.
Wave tambe molt bons però no escalble.

Fixing shaft 500L Bioreactor

mechanic amb barilles de acer a
dins on si posen les arrels. Dificil
treure les arrels.

Ex producio industrial ginseng(bioreactors ballon) escalat fins a 10.OOO L

Comparació ginseng de un bioreactor de 20000L = a cultiu de 600hectarees

Sistemes de produccio:

 Forma continua  en que el compost s’allibera al medi d cultiu extraccio de medi

vell I renovació. El compost es va purificant del medi el Sistema funciona de forma
indefinida pero hi ha amenaça de contaminacio bacteriana.
 Discontiuna (bach)es carga el biorreaa, es cultiva la biomassa, I es tracta segons si es
extracte o compost actiu.
Sistemes en dos fasesex shikonina

S’usen 3 bioreactors
deferens :

Tanc de creixement

Tanc de filtrat

Tnaque de producció

1. Tanque creixement
 medi creixement
generem biomassa fina al
final de la fase d creixement
exponencial.
2. Tanc de filtrate: Es
treu poc a poc cap al de
filtrat que te un goteig  en aquest tanc ja hi ha medi de producció  les cèl·lules van
passant al medi de produccio (roig) .
3. Tanc d eproducció: es on es fa la sikonina (vermella)

És Sistema biosostenible que es va regenerant poc a poc,no depenem de planta.

Tema 9, BORONAT

Produccion industrial

1. Produccio d’olis vegetals

Produccio d’olis per alimentació i tambe olis per a pintures, biodiesel, etc

Varietats de plantes mes usades: girasol, palma, soja, colza.

Olis vegetals: triglicèrids que son una molècula de glycerol amb àcid grassos (cadenes) que
poden ser variables atribuint diferents propietats. A la natura hi ha molts tipus d’acids grassos
que compateixen una estructura comuna, variant la possicio I presensia d’enllaços dobles en la
candena. Alguns tenen la cadena carbonada mes curta o mes llarga.

La variabilitat es dóna per:

 Llargada de la cadena
 Presència/nombre/posició de enllaços dobles

Els acids grassos precursos de tots els altres son:

 Palmitic (15 carbonis)

 Estearic (18 C)
 Oleic (18:1 doble enllaç en la posició 9).

Els usos industrials dels olis son molt variables I tenen molta importancia. EX. El acid lauric es el
component basic de molts detergents I xampus, gels, etc. Tenen molta importancia economica
(64000tonelades 320 milions de dolars). El acid erucic susen com a lubricants en roba, etc.

Problemàtica: cap d’estos acids grassos es produeixen en les 4 plantes mes importants (colza,
soja, palma, girasol).

Biosíntesi olis vegetals

S’acumulen en llabors I provenen del chloroplast que es on es fabriquen. L’ensablatge es dona

en altres llocs com endosomes.
Es fabriquen amb el complex ACCase partint de Acetyl Coa de Malonyl coA a malonil ACP.

El complex esta disenyat per fer 3 tipus d’acids grassos: de 16 i 18 C amb doble enllaç o no.

 En un cicle es forma el palmonil (16C) I si es fa més cicles es pot augmenta fins a 18

carbonis. El complex no pot allargar més. Així es pot formar:
o Palmitic (15 carbonis)
o Estearic (18 C)
o Oleic (18:1 doble enllaç en la posició 9).
 La resta dac grassos provenen de reaccions externes.
 Alliberació dels àcids grassos fora del chloroplast: A La progteina ACP s’uneix al acid grass I
perque aquest pugui ser alliberat fora del cloraplas, l’enzim TE (Tioesterasa) ha de trencar
la unió.
 Síntesis dels ac grassos no precurssors. Un cop fora poden allargar-se (am elongases) o
afegir doble enllaços (amb desaturases (DES). Per tant la gran varietat es genera fora del
chloroplast.

Trangènesis de plantes per a la producció d’acids grassos que no produeixen o en produeixen

en poques quantitats.

Cada fraja representa un àcid gras. En vermell els de cadena curta i la resta, cadenes més
llargues.

La primera planta representa una Colza normal I les de sota son variants trangenics am la
modificacio de la funcio d’un unic gen amb un sol canvi varia molt la compoció I tiups
d’àcids permet produir molts olis diferents.

En l’esquerra s’indiquen les mutaciones. Ex: gen TE

El tercer transgenic te molt interes economic colza que produeix 50% d’ àcid lauric (La
Colza no produeix lauric de forma natural).

 El ac. Lauric es de cadena curta

 Les plantes que fan Ac lauric tenen una TE especial que fa que es talli a 12C I s’alliberi
el acid gras.
 La sobreexpressio d’esta TE en colza produeix que esta planta fagi ac lauric en grans
quantitats.

El penultim transgenic fa àcid esteàric i es interessant en cosmetics I altres camps la

varietat natural casi no en produeix. S’ha fet un anitsentit de la delta9 desaturasa ( converteix
el steraic en oleic posant un doble enllaç en la posició 9) al inhibir-la obtenim stearic.
Ús del olis vegetals en la industria dels
polimers

 Producció de Nylon

Modificant els àcids grassos es poden

obtenir poliamines per a la producció
de diferents tipus de NYLON. En la
fabricació de Nylon hi ha molecules
residus que son subproduectes
sobrants.

A. A partir d’àcid Erucic

B. A partir de l’àcid petroselinic

En la sínteis de NYLON amb

petroselinic els subproducte sobrant
es acid lauric que també es pot reusar
en altres productes com detergents.

El àcid petroselinic es un isomer

del acid oleic, però té un doble
enllaç en la posició 6 en comptes
de 9. Aquest doble enllaç fa que
tingui propietats molt particulars
com un punt de fusió elevat de
33ºC, a diferència del oleic que és
de 12ºC. Aquesta propietat fa que
sigui molt usat per la prdoucció de
Margarines.

Problemàtica: Les úniques plantes

que fabriquen petroselinic son
plantes com julivert, I plantes
petites, aixo provoca que la
producció a nivell industrial es
infactible.

Àcid Eleostearic  Tung olil

també te interes economic
pero no s’exploten perque les
plantes que el fan no son
cultivables a gran escala.

Solució Modificació genètica

Modificar plantes productives

per que produeixin aquests
olis en grans quantitats.
2.INDÚSTRIA DEL MIDÓ

 Es produeix a gran escala

demanda gran
 Destinat a usos industrials
sobretot alimentaria
 Altres: paper, texitil I
bioethanol
 Plantes més usades: sobretot
el panis I tambe trigo, patata
I tapioca.

Estructura Midó: amylose (lineal) + amylopectina (amb ramificacions).

 Variabilitat genètica plantes variabilitat de

midons:
 La proporcio relative d’amylosa I
amylopectina.
 La llargada de les molècules
 frequencia de ramificacions de
l’amilopectina Morfologia del gra
 poden tenir algunes molecules extres com
phosfats, etc.
Totes aquestes diferencies determinades
geneticament afecten a les propietats fisico-
quimiques I per tant els seus usos industrials
del mido.

 Industria alimentaria:
o midons amb baixa amylose:
espesiddors en menjar I
emulsionadors per guarniment
salat.
o Midons amb alta amylose:
espesidors forts,snakcs fregits
 Industria del paper I adesius: molta
amilopectina.

Biotecnologia del mido

 MIllorar I augmenter la produccio

Es coneix molt be les rutes enzimatiques, gens responsables, compartiments,etc de la

biosintesi del mido. La sintesi es un procés molt coordinat a mesura que creix el gra.

La manipulacio dels enzims que fan la amilosa I la amilopectina produeix canvis. Ex.

 Papata que acumula 60-89% de mido amb amilosa.

 Patata que te bloquejada la biosintesi d’amilosa,  molta amilopectina.

En europa es va autoritzar al 2010 una varietat de patata trangenica (AMFLORA) amb alt
contingut de amilopectina (empresa BASF). Destinada al sector textile, paper….

3. PRODUCCIÓ DE PLÀSTICS BIODEGRADABLES

Els plastics derivats de petroli no son biodegradables impacte ambiental

Plàstics biodegradables

Familia de compostos polyhydroxalkanoates s’acumulen en grans quantitats en bacteries

dins d’uns grans. En la seva estructura la part variable és el grup R. Propietats plastiques molt
variables,equivalents als plastics normals.

La empresa ICI va consegir produir plastics amb aquestos compostos però va deixar de
produirlos perque el preu del producte era alt per que la producció també era cara i aquests
plastics nno podien competir amb els plastics convencionals de les altres empreses.

Biosíntesi PHB (és el plastic biodegradable més estudiat)

 A nivell metabolic la produccio es simpleel precursor es el Acetil-coA I amb només 3

etapes I tres enzims es genera el PHB (Un tipus de platic biodegradable)

Producció de PHB en plantes tranferencia dels gens dels 3enzims.Dos strategies

 Expressió en citosòl  no va funcionar perque consumia molt acetil Coa de la planta.

 Expressió en chloroplast es va aconseguir una produccio molt elevada en
Arabidopsis 14% del pes sec de la planta era PHB, una producció més alta afectava al
creixement.
 També s’ha intentat la produccio en peroxisomes.
Producte Comercial Biopol

És un Co-polimer (2 tipus de plastics biodegradables) en un medi de cultiu d’uns bacateris

posa acetil Coa i ac. Propionic els enzims fabriquen els dos tipus de polimer. Pero l’estrategia
no es escalable.

En plantes s’ha comprovat que també es pot arribar a produir el co-polimer (molts gens
exogens actuan de forma coordinada). Tot I que el rendiment era molt mes baix.

Producció de fibres de cotó I lino amb PHB

Es va dirigir l’expressió dels gens de la produccio de polyhidroxiacaonat en fibres de cotó o de

lino confereix a les fibres unes caracteristiques físiques millorables (reistencia,flexibilitat…).

Empreses que produeixen Plàstics biodegradables.

ICI NO va tenir EXIT

MONSANTO compra patents, millora la producció,,, NO EXIT

Metabolix investigació molt activa, en pocs anys sembla que tindran plantes productores de
plastics en el mercat.

La seva estrategia es buscar plantes alternatives expressió del plàstic en plantes usades en la
produccio de biomassa. Disposen de plantes que produeixen el 4% de PHB I s’estima que si
arriben al 7% ja sera economicament factible.

 Han provat l’expressió a partir de operons sintetics am bels gens bacterians per fer el
PHB augment del rendiment.
  Han probat la producció en fulles de canya de sucre. (4,8% pes sec es plàstic).

INCÍS:

Patata commercial trangenica

en estats units: la talles I no
s’oxida (no es torna negra), a
mes an manipulate els nivells
d’asparagine (amb gens de
pata) que provoca que al
fregirles no produeix
acrilamides (toxic). L’empresa
es la que ven les patates a
macdonals…. En un future…