Analitika 2 Kolokvium 1 PDF

Универзитет „Гоце Делчев“ – Штип
Факултет за медицински науки

Студии по фармација
Катедра по аналитика на лекови и
фармацевтска хемија
Наставен предмет:
АНАЛИТИКА НА ЛЕКОВИ 2
ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА
ХРОМАТОГРАФИЈАТА;
1 ТЕНКОСЛОЈНА ХРОМАТОГРАФИЈА
(TLC)
Д–р Биљана Ѓорѓеска, редовен професор

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА
ХРОМАТОГРАФИЈАТА
ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА ХРОМАТОГРАФИЈАТА
 Под поимот хроматографија се подразбира физички метод, кој се
базира на раздвојување на компоненти од комплексна смеса, преку
нивна распределба помеѓу две фази: стационарна или неподвижна
и мобилна или подвижна фаза.
 Компонентите кои поседуваат афинитет, односно доминантно се
распределуваат во мобилната фаза, ќе се движат со поголема
брзина низ системот за хроматографија во однос на компонентите
кои поседуваат афинитет, односно доминантно се распределуваат
во стационарната фаза.
 Поконкретно, една компонента се распределува помеѓу две фази
врз основа на јачината на интеракциите кои постојат помеѓу
молекулите од таа компонента, од една страна и молекулите од
двете фази, од друга страна.
 До колку се појаки интеракциите помеѓу молекулите на компонентата
и молекулите на стационарната фаза, до толку повеќе компонентата
ќе биде задржана во системот за хроматографија.
 До колку се појаки интеракциите помеѓу молекулите на компонентата
и молекулите на мобилната фаза, до толку побрзо компонентата ќе
биде елуирана од системот за хроматографија.
ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА ХРОМАТОГРАФИЈАТА
 Хроматографијата како аналитичка техника може да се користи во
фармацевтските анализи и тоа како техника за:
 квалитативна (идентификациона) анализа;
 квантитативна анализа.
 Кога станува збор за квалитативната (идентификациона) анализа,
треба да се напомене дека постојат хроматографски атласи за
голем број на компоненти, во кои точно е наведено при кои услови
(тип на стационарна фаза, тип на мобилна фаза, температура,
време итн.) компонентата се елуира од колоната, односно
произведува хроматографски пик на хроматограмот, врз основа на
кој, може да се потврди нејзиниот идентитет.
 Од друга страна пак, квантитативната анализа е овозможена
поради фактот што секоја компонента, елуирана од
хроматографскиот систем, произведува хроматографски пик на
хроматограмот, чијашто површина е правопропорционална со
концентрацијата на таа компонента. Од тука може да се заклучи
дека, до колку е поголема површината под пикот за дадена
компонента, до толку ќе биде поголема и нејзината концентрација во
примерокот за анализа.
ПРАЗЕН ВОЛУМЕН НА КОЛОНА И ФАКТОР НА
КАПАЦИТЕТ
 Доколку одредени молекули не поседуваат афинитет кон
стационарната фаза, истите ќе се елуираат заедно со мобилната
фаза, односно ќе ја поминат хроматографската колона со иста
брзина, како и брзината на движење на мобилната фаза
(растворувачот).
 Времето потребно незадржаните молекули да поминат низ
хроматографската колона зависи од празниот волумен на
колоната (Vo), а времето потребно задржаните молекули да поминат
низ хроматографската колона зависи од факторот на капацитет
(K’), кој пак, претставува мерка за степенот до кој молекулите може
да се задржуваат на стационарната фаза.
 Факторот на капацитет може да се пресмета според следниве
равенства:
каде: Vo – празен волумен на колоната; Vr – ретенционен волумен на

аналитот; to – време потребно незадржаните молекули да поминат
низ празниот волумен на колоната; tr – време потребно аналитот да
помине низ колоната.
ФАКТОР НА КАПАЦИТЕТ
Молекулата со поголем фактор на капацитет (В)

ќе се елуира последна, а молекулата со помал
фактор на капацитет (А) ќе се елуира прва.
ЕФИКАСНОСТ НА КОЛОНАТА
 Ефикасноста на колоната се одредува преку два пристапи. Според
првиот пристап, треба да се знаат вредностите за ширината на
пиковите на половина висина, како и вредностите за ретенционите
времиња на пиковите. Имајќи ги предвид овие вредности, прво се
пресметува бројот на теоретски подови на колоната според
следново равенство:
каде: n – број на теоретски подови; tr – ретенционо време (време

потребно аналитот да помине низ колоната); W1/2 – ширина на пикот
од аналитот, на половина висина.
 По пресметката на бројот на теоретски подови, се пристапува кон
пресметка на ефикасноста на колоната според следново равенство:
каде: ЕС – ефикасност на колоната, измерена како број на теоретски

подови / m; n – број на теоретски подови; L – вкупна должина на
колоната.
ЕФИКАСНОСТ НА КОЛОНАТА
 Доколку ретенционото време на аналитот е многу кратко, тогаш за
пресметка на ефикасноста на колоната се применува вториот пристап,
согласно кој е поставено следново равенство:
каде: Neff – број на ефективни подови, кој покажува колку пати аналитот се
распределува меѓу мобилната и стационарната фаза во текот на неговото
поминување низ колоната; t’r – разлика помеѓу ретенционото време на
аналитот (време потребно аналитот да помине низ колоната) и
ретенционото време на мобилната фаза (време потребно незадржаните
молекули да поминат низ празниот волумен на колоната).
 По пресметката на бројот на ефективни подови, се пристапува кон
пресметка на висина на теоретски под, според следново равенство:
каде: H – висина на теоретски под, односно параметар кој покажува колкава

должина на колоната е потребна за да настане една распределба на
аналитот меѓу мобилната и стационарната фаза; L – вкупна должина на
колоната; Neff – број на ефективни подови.
ПАРАМЕТРИ ЗА ПРЕСМЕТКА НА ЕФИКАСНОСТ НА
КОЛОНАТА
РЕЗОЛУЦИЈА НА КОЛОНАТА
 Под поимот резолуција на колоната се подразбира способност на
колоната да раздвојува два соседни пикови, кои потекнуваат од
соодветни компоненти.
 Резолуцијата на колоната за дадени компоненти А и В, може да се
пресмета според следново равенство:
каде: RS – резолуција на колоната; (tr)В – ретенционо време на

компонентата В; (tr)А – ретенционо време на компонентата А; (W1/2)A
– ширина на пикот од компонентата А, на половина висина; (W1/2)В –
ширина на пикот од компонентата В, на половина висина.
 Од круцијално значење е да се напомене дека, до колку е поголема
ефикасноста на колоната, до толку ќе се постигне подобра
резолуција помеѓу два соседни пикови, односно, ако пресметаната
вредност за резолуцијата на колоната е > 1,2, може да се заклучи
дека колоната ефикасно ги раздвоила соседните пикови, но ако
ваквата вредност е < 0,8, тогаш не станува збор за задоволителен
степен на резолуција.
РЕЗОЛУЦИЈА НА КОЛОНАТА
АСИМЕТРИЈА НА ПИК
 Асиметријата на пикот се изразува преку асиметричниот фактор,
кој се дефинира како однос помеѓу ширината на втората половина
од пикот со ширината на првата половина од пикот, така што обете
ширини се измерени на 10 % од вкупната висина на пикот.
Математички, асиметричниот фактор може да се претстави со
следново равенство:
каде: a – ширина на првата половина на пикот, измерена на 10 % од

вкупната висина на пикот; b – ширина на втората половина на пикот,
измерена на 10 % од вкупната висина на пикот.
 Идеално, асиметричниот фактор треба да се движи во опсег помеѓу
0,95 и 1,15.
 Лошата симетрија на пикот може да се јави како резултат на:
 инјектирање на големо количество на примерок во колоната;
 декомпозиција на примерокот;
 силна адсорпција на аналитот на активните места од стационарната
фаза во колоната;
 недоволно задржување на аналитот од страна на колоната.
АСИМЕТРИЈА НА ПИК
 На пример, при хроматографска анализа на комплексен примерок,
добиени се пикови за компонентата А и компонентата В:
 Притоа, констатирано е дека асиметричниот фактор на пикот за

компонентата А изнесува 0,97 и истиот се должи на појава на мала
опашка (tailing) на првата половина од пикот. Ваквиот случај може
да се јави ако при инјектирањето на примерокот за анализа, истиот
неефикасно се задржува на врвот од колоната.
 Исто така, констатирано е дека асиметричниот фактор на пикот за
компонентата В изнесува 1,77, а истиот се должи на појава на
голема опашка (tailing) на втората половина од пикот. Ваквиот
случај пак, може да се јави како резултат на силна атсорпција на
аналитот на активните места од стационарната фаза во колоната.
ТЕНКОСЛОЈНА
ХРОМАТОГРАФИЈА (THIN–LAYER
CHROMATOGRAPHY – TLC)
ВОВЕД ВО ТЕНКОСЛОЈНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Имајќи предвид дека TLC претставува една од првите
хроматографски техники, голем дел од фармакопејските тестови
се базираат токму на употребата на оваа техника. Денес, истата
е развиена како фундаментална техника за контрола на
квалитет на онечистувањата во трагови, но и како една од
основните техники за идентификација на различни видови на
соединенија.
 Софистицираноста на TLC се должи на неколку фактори. Имено,
со помош на оваа техника може да се детектираат различни
органски, па дури и одредени неоргански соединенија. Исто така,
постои широка палета на стационарни и мобилни фази, односно
средства за визуелизација, кои дополнително придонесуваат за
зголемување на софистицираноста на оваа техника.
 Во основа, дури и најразвиените форми на TLC и тенкослојна
хроматографија со високи перформанси (HPTLC), претставуваат
релативно едноставни системи.
ПРИНЦИП НА ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Заедно со мобилната фаза (вообичаено, смеса од органски
растворувачи), аналитот мигрира по површината на
стационарната фаза (вообичаено, силика гел), така што
ваквото мигрирање се остварува под дејство на
капиларните сили.
 Во зависност од релативниот афинитет за стационарната,
односно мобилната фаза, движењето на аналитот може да
биде со поголема или со помала брзина.
ИНСТРУМЕНТАЦИЈА ЗА ТЕНКОСЛОЈНА
ХРОМАТОГРАФИЈА
 Најчесто употребуваниот систем за TLC вклучува стаклена или
пластична плоча, обложена со силика гел. За рутинска примена,
големината на честиците на силика гелот се движи во опсег помеѓу
2 – 25 µm.
 TLC се изведува во три чекори:
1. Неколку µL од растворот на примерокот внимателно се накапуваат
на стартната линија од хроматографската плоча. Доколку се накапи
повеќе од 1 µL течност, постои опасност од брзо ширење на капката.
Притоа, помеѓу секое накапување на течност од 1 µL, потребно е
капката да се остави одредено време со цел истата да се исуши.
Вообичаено, концентрацијата на растворот изнесува 20 µg / µL;
2. Долните 0,5 cm од хроматографската плоча се потопуваат во
мобилната фаза, која се наоѓа во соодветен сад, при што мобилната
фаза започнува да се движи по површината на стационарната фаза,
под дејство на капиларните сили.
3. Поларните компоненти се адсорбираат на стационарната фаза,
обложена со силика гел, што значи дека истите помалку време се
задржуваат во мобилната фаза, како резултат на што, изминуваат
пократок пат во одредено време.
ХРОМАТОГРАМ КАЈ ТЕНКОСЛОЈНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Растојанието што го изминува мобилната фаза
(растворувачот) на хроматографската плоча, почнувајќи од
стартната линија, а завршувајќи до местото кадешто истата
доспева (фронт на растворувачот), се означува како пат на
мобилната фаза (S).
 Односот помеѓу растојанието што го изминува дадена
компонента на хроматографската плоча, почнувајќи од
стартната линија, а завршувајќи до местото кадешто истата
доспева и патот на мобилната фаза, се означува како Rf
вредност за дадената компонента или математички:
 Доколку се анализира прикажаниот хроматограм, може да
се забележи дека компонентата А е помалку поларна во
споредба со компонентата В бидејќи истата изминала
поголем пат во однос на компонентата В.
 Според тоа, Rf вредностите за овие компоненти би можеле
да се пресметаат според следниве формули:
за компонентата А: за компонентата В:
каде: a – растојание што го изминува компонентата А; b –

растојание што го изминува компонентата В; S – пат на
мобилната фаза.
 Вообичаено, Rf вредностите се изразуваат во проценти, па
затоа добиениот резултат треба да се помножи со 100.
СТАЦИОНАРНА ФАЗА КАЈ ТЕНКОСЛОЈНА
 Силика гелот е најчесто употребуван адсорбент во TLC.
Степенот со кој компонентите се движат по површината на
стационарната фаза, обложена со силика гел, пред сѐ, зависи од
нивната поларност. Така, во текот на одреден временски период,
пополарните компоненти се движат побавно, за разлика од
помалку поларните компоненти кои се движат побрзо.
 Покрај силика гелот, постојат и други поларни адсорбенти кои
може да се употребуваат во фармакопејските тестови. Примери
за тоа се целулозата (која може да се користи при
идентификација на тетрациклини) и Kieselguhr G, односно
дијатомејска земја која содржи калциум сулфат како врзувачки
агенс (која може да се користи како цврста поддршка на
стационарните фази од типот на течен парафин).
 Дополнително, како адсорбент може да се користи и силика гел
во модифицирана форма. Примери за тоа се силика гел G
(силика гел со просечна големина на честици од 15 µm, кој
содржи околу 13 % калциум сулфат како врзувачки агенс) и
силика гел GF254 (силика гел G со флуоресцентен агенс).
ПОВРШИНА НА СИЛИКА ГЕЛ КАКО ПРИМЕР ЗА
АДСОРБЕНТ ВО ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
МОБИЛНА ФАЗА КАЈ ТЕНКОСЛОЈНА
 Јачината на мобилната фаза, пред сѐ, зависи од смесата на
растворувачи кои се користат како мобилна фаза. До колку е
поголема поларноста на растворувачот или смесата на
растворувачи, до толку побрзо ќе се движат поларните
компоненти по површината на стационарната фаза, обложена со
силика гел. Меѓутоа, при анализа на неполарни компоненти, со
зголемување на поларноста на мобилната фаза не доаѓа до
зголемување на брзината на движење на компонентите кои се
предмет на анализа.
 Иако водата претставува пример за поларна компонента, сепак
чистата вода не се користи често како растворувач во мобилната
фаза бидејќи голем дел од органските компоненти многу слабо
или воопшто не се раствараат во вода. Токму поради оваа
причина, водата може да се користи само во состав на мобилни
фази кои содржат органски растворувачи мешливи со вода, каков
што е на пример, метанолот.
ПРИМЕРИ ЗА РАСТВОРУВАЧИ КОИ СЕ КОРИСТАТ КАКО
МОБИЛНА ФАЗА КАЈ ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
Растворувач Индекс на поларност

Хексан 0
Толуен 2,4
Диетилетер 2,8
Дихлорометан 3,1
Бутанол 3,9
Хлороформ 4,1
Етил ацетат 4,4
Ацетон 5,1
Метанол 5,1
Етанол 5,2
Ацетонитрил 5,8
Оцетна киселина 6,2
Вода 9,0
МОДИФИКАЦИЈА НА АДСОРБЕНТОТ ВО
ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Модификацијата на адсорбентот во TLC може да се врши

на три начини и тоа:
1. Третман на силика гелот со калиум хидроксид;
2. Силанизација на силика гелот;
3. Употреба на дијатомејска земја како инертна поддршка.
ТРЕТМАН НА СИЛИКА ГЕЛОТ СО КАЛИУМ ХИДРОКСИД
 При анализа на базни лекови, препорачливо е силика гелот да се
третира со раствор на калиум хидроксид во метанол. Ваквиот
пристап овозможува базните лекови да бидат присутни во
нивната слободна форма, а не во форма на соли. Имено, солите
на базните лекови (на пример, амините) се одликуваат со многу
ниска подвижност во мобилни фази кои содржат органски
растворувачи. Ваквото својство се должи на способноста на
базните лекови да стапуваат во силна интеракција со
силанолните групи од површината на силика гелот. Имајќи
предвид дека калиум хидроксидот може да ги блокира ваквите
типови на интеракции, неговата употреба како средство за
третман на силика гелот при анализа на базни лекови е сосема
оправдана.
 Слично на тоа, и мобилните фази кои се користат кај овој тип на
системи за TLC, вообичаено содржат базни компоненти.
Примери за таков тип на мобилни фази се:
 метанол / амонијачен раствор (100:1,5);
 циклохексан / толуен / диетиламин (75:15:10);
 хлороформ / метанол (90:10).
СИЛАНИЗАЦИЈА НА СИЛИКА ГЕЛОТ
 При третман со дихлородиметилсилан, површината на силика
гелот може да се трансформира во неполарна.
Силанизација на силика гел со дихлородиметилсилан

 Покрај ова соединение, за силанизација на силика гел плочите
може да се користат и некои други реагенси, како на пример,
октадецилсиланите, со кои може да се добијат октадецилсилан
силика гел плочи за TLC, аналогни со колоните обложени со
октадецилсилан за HPLC.
СИЛАНИЗАЦИЈА НА СИЛИКА ГЕЛОТ
 Според Британската фармакопеја, силанизираните силика гел плочи
за TLC се користат во идентификационите тестови на одредени
пеницилини, каков што е на пример, ампицилинот. За таа цел, се
подготвуваат три раствори:
 раствор 1 (0,25 % w/v раствор на ампицилин тест супстанција);
 раствор 2 (0,25 % w/v раствор на ампицилин референтен стандард);
 раствор 3 (смеса од 0,25 % w/v раствори на ампицилин и амоксицилин
трихидрат референтни стандарди).
 Откако ќе се нанесат сие три раствори на стартната линија од
силанизираната гел плоча, истата се развива со помош на мобилна
фаза, која се состои од раствор на амониум ацетат, подесен на
рН = 5,0 со помош на смеса од оцетна киселина и ацетон (90:10). По
развивањето, плочата се бои со јод.
 За да се прифати идентификациониот тест, треба да се исполнат
два основни критериуми:
 прво, ампицилин тест супстанцијата од раствор 1 да даде еквивалентна
точка (со иста Rf вредност) како и точката која ќе ја произведе ампицилин
референтниот стандард од раствор 2;
 второ, ампицилин и амоксицилин трихидрат референтните стандарди од
раствор 3, треба да дадат две одвоени точки.
УПОТРЕБА НА ДИЈАТОМЕЈСКА ЗЕМЈА КАКО ИНЕРТНА
ПОДДРШКА
 Дијатомејската земја не поседува силни апсорптивни својства, но може да
биде обложена со течна или восочна стационарна фаза. Така, дијатомејска
земја, обложена со течен парафин, се користи во фармакопејскиот тест за
триацилглицероли и масни киселини во масла. За таа цел, плочата со
дијатомејска земја се импрегнира со раствор на течен парафин во петрол
етер и нејзината површина станува хидрофобна.
 Маслениот примерок, кој е предмет на анализа, се нанесува на плочата и
истата се развива со мобилната фаза, која се состои од оцетна киселина.
Имајќи предвид дека оцетната киселина е силно поларна, стационарната
фаза, импрегнирана со течен парафин, нема да се раствори во мобилната.
 Триацилглицеролите од маслениот примерок за анализа, кои се слабо
поларни, лесно партиционираат помеѓу двете фази. Имено, до колку е
подолг јаглеводородниот ланец на масните киселини во состав на
триацилглицеролите, до толку ќе биде помала Rf вредноста на соодветниот
триацилглицерол.
 За визуелизација на плочата, прво се врши боење со јод, а потоа и
перманентна фиксација на јодните дамки со помош на раствор на скроб.
 Исто така, за импрегнирање на плоча со дијатомејска земја, може да се
користат и други агенси, како на пример, формамид или пропан–1,2–диол.
Доколку се користат токму овие импрегнирачки агенси, тогаш мобилните
фази треба да се одликуваат со ниска поларност за да се спречи
потенцијалното испирање на агенсот од плочата.
ДЕТЕКЦИЈА НА КОМПОНЕНТИТЕ ОД ПЛОЧАТА ЗА
ТЕНКОСЛОЈНА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОСЛЕ НЕЈЗИНО
РАЗВИВАЊЕ СО МОБИЛНАТА ФАЗА
 За детекција на компонентите од плочата за TLC после нејзино

развивање со мобилната фаза, може да се користат различни
методи, од кои најчесто користени се:
1. Методот со ултравиолетова светлина;
2. Методите кои вклучуваат употреба на реагенси за
визуелизација.
 Реагенсите за визуелизација може да бидат специфични за
точно одреден аналит или пак, истите може да детектираат
аналити со различна хемиска природа.
 Карактеристични примери за реагенси за визуелизација се:
 пареа од јод;
 калиум перманганат;
 нинхидрински раствор;
 драгендорфов реагенс;
 алкално тетразолинско сино;
 етанол сулфурна киселина (20 %).
МЕТОД СО УЛТРАВИОЛЕТОВА СВЕТЛИНА ЗА ДЕТЕКЦИЈА НА
КОМПОНЕНТИТЕ ОД ПЛОЧАТА ЗА TLC ПОСЛЕ НЕЈЗИНО
РАЗВИВАЊЕ СО МОБИЛНАТА ФАЗА
 Со цел визуелизација на можноста на одредени аналити да

апсорбираат ултравиолетова светлина, плочата за TLC треба да
биде обложена со силика гел, импрегниран со флуоресцентен
материјал.
 Понатаму, за осветлување на плочата се користи светлина со
бранова должина од 254 nm и доколку аналитот ја апсорбира
ултравиолетовата светлина, на местата од плочата кадешто истиот
е присутен, ќе се јават црни дамки на жолта позадина, односно
дамки кои ја гасат флуоресценцијата на површината на плочата.
 Ваквиот метод за визуелизација се користи во многу фармакопејски
тестови бидејќи голем дел од лековите поседуваат хромофори.
 Во случај компонентата да е природно флуоресцентна, за нејзина
визуелизација од површината на плочата, може да се користи
светлина со бранова должина повисока од 365 nm.
 На пример, во фармакопејскиот тест за содржина на антрахинони
во алое, за визуелизација на флуоресценцијата на овие соединенија
се користи ултравиолетова светлина со бранова должина од 365 nm.
РЕАГЕНСИ ЗА ВИЗУЕЛИЗАЦИЈА НА КОМПОНЕНТИТЕ ОД
ПЛОЧАТА ЗА TLC ПОСЛЕ НЕЈЗИНО РАЗВИВАЊЕ СО
МОБИЛНАТА ФАЗА
 Пареа од јод
 Плочата за TLC се поставува во сад кој содржи кристали од јод. Поради
присуството на јод во садот, на површината на плочата, на местата кадешто
се наоѓаат органски соединенија, се создаваат карактеристични кафеави
дамки. Ваквото боење е реверзибилно, па доколку после лоцирањето на
одредена органска компонента е потребна и нејзина изолација, плочата се
изложува на воздух, при што јодот од површината на плочата испарува, а со
внимателно гребење на дамките кои ја содржат компонентата од интерес,
истата ефикасно се изолира. Од друга страна, доколку е потребно
зачувување на плочата, за да се спречи испарувањето на јодот, плочата
може да се покрие или пак, да се испрска со раствор на скроб со цел да се
постигне перманентна фиксација на дамките. Меѓу другото, јодот како
реагенс за визуелизација во TLC, се користи во фармакопејските тестови на
одредени масла и цетримид.
 Калиум перманганат
 Калиум перманганатот обезбедува метод за детекција на: шеќери, молекули
слични на шеќери и лекови кои содржат алифатични двојни врски. Истиот
може да се користи во TLC за проверка на идентитетот на одредени
антибиотици (клиндамицин, линкомицин), но и за проверка на сродни
супстанции на други антибиотици (спектиномицин).
 Нинхидрински раствор
 Нинхидринскиот раствор произведува розови дамки со
примарните амини и жолти дамки со терциерните амини. Како
таков, истиот може да се употребува во фармакопејските
идентификациони тестови на одредени аминогликозидни
антибиотици, каков што е на пример, гентамицинот, во лимит
тестот за аминобутанол за етамбутол, а во комбинација со
драгендорфовиот реагенс, може да се користи при испитување
на лекови кои содржат азот.
 Драгендорфов реагенс
 Драгендорфовиот реагенс може да произведе портокалови
дамки со терциерните амини, па според тоа, може да се користи
за повторно прскање на плочи, кои претходно биле третирани со
нинхидрин како средство за визуелизација.
 Алкално тетразолинско сино

 Алкалното тетразолинско сино претставува реагенс за
визуелизација, кој е многу специфичен за кортикостероиди. Како
таков, овој реагенс може да произведува сини дамки на бела
позадина. Истиот се користи во тестот за сродни страни
супстанции во флуклоролон ацетонид.
 Драгендорфов реагенс
 Овој реагенс се користи за добивање флуоресцентни дамки од
кортикостероиди, како на пример, дексаметазон или
преднизолон. За таа цел, најпрво плочата се прска со реагенсот,
а потоа се загрева на 120оС и на крај, дамките се забележуваат
со помош на ултравиолетова ламба на бранова должина од 365
nm.
ПРИМЕНА НА ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Методот може да се користи за одредување на
онечистувањата во фармацевтските суровини или во веќе
формулирани фармацевтски производи;
 Честопати се користи како основен метод за потврда на
идентитетот на фармацевтските суровини;
 Потенцијално може да се користи при валидација на
процесот на прочистување, кој претставува составен дел
од производството на лековите.
ПРИМЕНА НА ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА КАКО
КВАЛИТАТИВЕН ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН ТЕСТ
 TLC честопати е наведена во монографиите на Британската
фармакопеја како еден од бројните тестови за идентификација
на чисти супстанции.
 Притоа, за потврда на идентитетот на овие супстанции, може да
се користи повеќе од еден систем на растворувачи, како и
различни реагенси за визуелизација.
 Карактеристични примери за ваков тип на примена на TLC се
идентификационите тестови во фармакопејските монографии на:
 аминогликозидниот антибиотик фрамицетин сулфат;
 кортикостероидот метилпреднизолон;
 инхибиторот на одредени протеолитички ензими – апротинин;
 антихелминтикот левамисол.
 Без разлика на тоа за кој примерок за анализа станува збор,
идентитетот на истиот се потврдува преку споредба на Rf
вредноста и бојата на дамката од примерокот за анализа со Rf
вредноста и бојата на дамката од чистиот стандард.
КВАЛИТАТИВЕН ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН ТЕСТ –
КОНКРЕТНИ ПРИМЕРИ
 Фрамицетин сулфат
 Кога станува збор за идентификациониот тест на фрамицетин
сулфат со TLC, треба да се напомене дека како стационарна
фаза се користи силика гел, импрегниран со карбомер како
средство за врзување, како мобилна фаза се користи 10 % w/v
раствор на монокалиум фосфат, а како реагенс за визуелизација
се користи смеса од нафтален диол и сулфурна киселина.
 Метилпреднизолон
 При идентификација на метилпреднизолонот со помош на TLC,
во функција на стационарна фаза се јавува силика гел GF254, во
функција на мобилна фаза се јавува смеса од етер, толуен и
бутан–1–ол, заситен со вода, во меѓусебен сооднос 85:10:5, а
визуелизацијата на дамките се врши со помош на
ултравиолетова светлина на бранова должина од 254 nm, по што
плочата се прска со етанол / сулфурна киселина (20 %) и се
загрева на 120оС.
КВАЛИТАТИВЕН ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН ТЕСТ –
КОНКРЕТНИ ПРИМЕРИ
 Апротинин
 При квалитативна анализа на апротинин со помош на TLC,
силика гелот се користи како стационарна фаза, ацетатниот
пуфер се користи како мобилна фаза, а нинхидринскиот раствор
се користи како реагенс за визуелизација.
 Левамисол
 TLC како идентификационен тест на левамисолот вклучува
употреба на силика гел Н со флуоресцентен индикатор како
стационарна фаза, смеса од толуен, ацетон и 13,5 М амонијак во
меѓусебен сооднос 60:40:1 како мобилна фаза, а
визуелизацијата на дамките се врши со помош на
ултравиолетова светлина на бранова должина од 254 nm.
ЛИМИТ ТЕСТ КОГА СТРУКТУРАТА НА ОНЕЧИСТУВАЊЕТО
Е ПОЗНАТА
 TLC може да се користи за изведба на лимит тестови за

онечистувања во многу фармакопејски монографии.
 Ваквиот тип на тестови се базираат на споредба на
концентриран раствор на аналит и разреден раствор на
онечистување. Притоа, интензитетот на дамките кои
потекнуваат од онечистувањата во аналитот се споредува
со интензитетот на дамката или дамките кои потекнуваат
од стандардите, нанесени одвоено, на истата плоча.
 На пример, при изведба на лимит тест за хидрокортизон
(онечистување) во хидрокортизон ацетат, на одредена
позиција од стартната линија на плочата за TLC, се
накапуваат 5 µL од 1 % w/v раствор на хидрокортизон
ацетат, а на друга позиција од стартната линија на истата
плоча, се накапуваат 5 µL од 0,01 % w/v раствор на
хидрокортизон референтен стандард.
Е ПОЗНАТА
 По развивање на плочата со соодветна мобилна фаза,

истата се осветлува со помош на ултравиолетова ламба,
при што се добива следниов изглед на плочата за TLC:
Е ПОЗНАТА
 На плочата за TLC може да се забележи дека мала дамка

од хидрокортизон (онечистување), е лоцирана веднаш
под најголемата дамка, односно дамката од
хидрокортизон ацетат, кој претставува главна компонента
во примерокот за анализа.
 Согласно позицијата на која е нанесен хидрокортизон
референтниот стандард, се забележува присуство на
бледа дамка од ова соединение.
 Во конкретниот случај, дамката од хидрокортизон
(онечистување) е поинтензивна, односно поголема, во
споредба со дамката од хидрокортизон референтниот
стандард, што значи дека онечистувањето е присутно во
примерокот за анализа над дозволениот лимит.
ЛИМИТ ТЕСТОВИ ЗА ПОЗНАТИ ОНЕЧИСТУВАЊА ВО
ФАРМАЦЕВТСКИ СУРОВИНИ
Дозволен лимит
Тест супстанција Онечистување
(%)
Клотримазол Хлоротританол 0,20
Клотримазол Имидазол 0,20
Циклизин N–метилпиперазин 0,50
Декспантенол 3–аминопропанол 0,50
Етинилестрадиол Естрон 1,00
Лопразолам месилат N–метилпиперазин 0,25
Мефенаминска киселина 2,3–диметил анилин 0,01
Мексилетин хидрохлорид 2,3–диметил фенол 0,20
Феноксиметилпеницилин Фенилоцетна киселина 0,50
НЕ Е ПОЗНАТА
 Во случај кога идентитетот на онечистувањата не е познат

во целост, може да се изведуваат модифицирани лимит
тестови, кои во основа, се базираат на TLC.
 Ваквиот тип на тестови може да се применуваат на
примероци од природно или полусинтетско потекло, кои
може да содржат бројни сродни супстанции со
супстанцијата од интерес и кои сродни супстанции, биле
екстрахирани заедно со супстанцијата од интерес.
 Исто така, кај овој тип на лимит тестови, се претпоставува
дека сродните супстанции, нанесени во еднакви
концентрации, ќе прозведат дамки со сличен интензитет,
како и дамката која ќе ја произведе супстанцијата од
интерес.
 При изведба на лимит тестот за сродни супстанции на кодеин, на
плочата за TLC може да се јават дамки од други алкалоиди,
односно дамки од онечистувања со непознат идентитет.
 За да се изведе тестот, потребно е да се подготват три раствори:
 раствор 1 (4,0 % w/v раствор на кодеин);
 раствор 2 (0,06 % w/v раствор на кодеин);
 раствор 3 (0,04 % w/v раствор на кодеин).
 Во овој тест, разредените раствори на кодеин се употребуваат како
стандарди за визуелна споредба со потенцијално присутни
онечистувања во примерокот за анализа.
 Откако ќе се подготват овие раствори, од нив се земаат по 10 µL и
одвоено се нанесуваат на стартната линија од плочата за TLC.
 Во продолжение, плочата се развува со употреба на соодветна
мобилна фаза, односно смеса од етанол, циклохексан и 13,5 М
амонијак во меѓусебен сооднос 72:30:6.
 Откако ќе се развие плочата, истата се суши и се прска со
јодобизмутат, односно специфичен реагенс за визуелизација на
соединенија кои содржат азот, какви што се алкалоидите.
 По сушењето и прскањето на плочата со соодветниот

реагенс за визуелизација, се добива следниов изглед на
плочата за TLC:
 Со цел лимит тестот да биде успешен, потребно е да се

исполнат два основни критериуми:
1. Секундарните дамки од хроматограмот добиен со раствор
1, не треба да бидат со појак интензитет во споредба со
интензитетот на дамката од хроматограмот добиен со
раствор 2.
2. На плочата за TLC не треба да се јави повеќе од една
дамка со поголема Rf вредност во споредба со Rf
вредноста на кодеинот, при што таквата дамка не треба да
биде со појак интензитет во споредба со интензитетот на
дамката од хроматограмот добиен со раствор 3.
ПРЕДНОСТИ НА ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Детекцијата на молекулите може да се врши преку едноставна хемиска
реакција со средство за визуелизација. Според тоа, секоја молекула,
помалку или повеќе, може да биде детектирана доколку се користи
соодветно средство за визуелизација;
 Методот е робустен и евтин;
 Во комбинација со дензитометриска детекција, може да се користи како
метод за квантитативна анализа на молекули, кои поради отсуството на
хромофор, многу тешко или воопшто не може да се анализираат со други
хроматографски методи;
 Со оглед на фактот што сите молекули може да се визуелизираат на
хроматографската плоча, не постои опасност, каков што е случајот кај
гасната хроматографија или течната хроматографија под висок притисок,
дека молекулите кои се предмет на анализа не елуирале од
хроматографскиот систем;
 Методот овозможува истовремена анализа на повеќе примероци,
скратување на времето потребно за една анализа и дополнително,
истиот може да биде автоматизиран;
 Методот е флексибилен бидејќи хроматографските плочи може да се
третираат со различни хемиски агенси, како резултат на што се овозможува
менување на особините на стационарната фаза.
НЕДОСТАТОЦИ НА ТЕНКОСЛОЈНАТА
 Бројот на достапни теоретски подови за сепарација во

рутинските системи за TLC е лимитиран. Меѓутоа, кога
станува збор за системите за тенкослојна хроматографија
со високи перформанси, вредно е да се напомене дека со
нив може да се постигне речиси иста ефикасност како и
ефикасноста постигната со течна хроматографија под
висок притисок;
 Честопати сензитивноста на методот е лимитирана;
 Методот не е соодветен за испарливи молекули;
 Дури и за оптимална примена на методот, неопходен е
оператор специјалист.
ТЕНКОСЛОЈНА ХРОМАТОГРАФИЈА
СО ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ (HIGH–
PERFORMANCE THIN–LAYER
CHROMATOGRAPHY – HPTLC)
ВОВЕД ВО ТЕНКОСЛОЈНА ХРОМАТОГРАФИЈА СО
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ
 HPTLC се изведува на идентични плочи како и плочите кои се
користат за изведба на класичната TLC.
 Единствената разлика е во тоа што плочите за изведба на
HPTLC се обложени со прочистен силика гел, чијашто големина
на честици се движи во опсег помеѓу 2 и 10 µm, а големината на
честиците од силика гелот, користен за подготовка на
комерцијалните плочи за TLC, се движи во опсег помеѓу 2 и
25 µm.
 Потесниот опсег во однос на големината на честиците од силика
гелот резултира со појава на поголем број достапни теоретски
подови за сепарација, што е од особено значење бидејќи
дамките на плочата остануваат компактни.
 Ваквиот тип на плочи може да се развиваат во стандарден сад за
TLC, но за да се добијат високи перформанси, неопходно е да се
користи инструментација која вклучува хоризонтално
развивање на плочите.
ХРОМАТОГРАФИЈА СО ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ
ПРИМЕНА НА ТЕНКОСЛОЈНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА СО
 Во комбинација со дензитометри кои се користат за одредување
на интензитетот на дамките од површината на плочата, HPTLC
може да се користи како квантитативна техника.
 Принципот на квантификација на компонентите во примерокот за
анализа се должи на способноста на дензитометрите да ја
одредуваат флуоресценцијата или апсорпцијата на
ултравиолетовата светлина на таквите компоненти.
 Имено, HPTLC во комбинација со флуоресцентен дензитометар
може да се користи за анализа на фармаколошки активни тиоли,
вклучително и инхибиторот на ангиотензин конвертирачкиот
ензим – каптоприл.
 Имајќи предвид дека каптоприлот и останатите тиоли не
поседуваат јаки хромофори, за истите ефикасно да се
анализираат, неопходно е да бидат дериватизирани. За таа цел,
тиолите реагираат со тиол – специфичен реагенс, при што се
добиваат флуоресцентни деривати, кои понатаму се
анализираат со помош на HPTLC.
ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА (GAS

2 CHROMATOGRAPHY – GC)

ВОВЕД ВО ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Како резултат на брзиот развој на HPLC и високата софистицираност на
оваа техника, употребата на GC како квантитативна техника во
фармацевтските анализи значително се намалила. Сепак, иако HPLC е
доминантна техника кога станува збор за квантитативните анализи, вредно
е да се напомене дека GC сѐ уште игра круцијална улога во одредени
видови на квантитативни, но и квалитативни фармацевтски анализи. Доказ
за тоа е капиларната GC со помош на која може да се постигне поефикасно
раздвојување на одредени компоненти од комплексен примерок, во
споредба со раздвојувањето на таквите компоненти, кое би се постигнало
со помош на HPLC.
 Како и да е, главно ограничување на GC претставува фактот што со оваа
техника може да се анализираат само испарливи, термостабилни или
неиспарливи компоненти кои со соодветна дериватизација може да се
трансформираат во лесно испарливи.
 Генерално, GC широко се употребува во прехрамбената, козметолошката и
петрохемиската индустрија, но и како техника од избор за одредени видови
на анализи од областа на микробиологијата и клиничката биохемија. Кога
станува збор за фармацевтските анализи, иако GC која вклучува употреба
на капиларни колони е помодифицирана техника, сепак, GC која вклучува
употреба на пакувани колони, почесто се применува.
ПРИНЦИП НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Гасна мобилна фаза протекува под притисок преку загреана
колона, која може да биде обложена со течна стационарна фаза
или пак, пакувана со течна стационарна фаза нанесена на цврста
поддршка.
 На почетокот, аналитот се воведува во врвот од колоната преку
загреан отвор на инјекторот, при што, истиот испарува. Во
продолжение, аналитот кондензира во врвот од колоната бидејќи во
овој дел од колоната, споредено со загреаниот отвор на инјекторот,
температурата е пониска.
 Колоната се наоѓа во печка, која може да биде температурно
програмирана за одржување на константна температура или пак, за
линеарно зголемување на температурата.
 Откако ќе бидат воведени во системот за GC, компонентите од
примерокот за анализа меѓусебно се раздвојуваат согласно нивните
ретенциони времиња, односно времиња на задржување во
стационарната фаза од колоната.
 На крај, за детекција на компонентите од примерокот за анализа,
може да се користат различни видови на детектори.
ИНСТРУМЕНТАЦИЈА ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Кога станува збор за системот за GC, вредно е да се напомене
дека примерокот за анализа се инјектира со помош на рачен или
автоматизиран инјектор, кој поминува преку гумен септум.
 Откако ќе се инјектира, примерокот за анализа испарува во
загреаниот отвор од инјекторот, а потоа кондензира во врвот од
колоната.
 Колоната во системот за GC може да биде пакувана или
капиларна. За придвижување на примерокот за анализа по
должината на колоната, вообичаено се користат азот или
хелиум како гасни мобилни фази.
 Колоната е затворена во печка, така што температурата во
печката може да се движи во опсег помеѓу собна температура и
температура од 400оС.
 Најчесто, во функција на детектор се јавува пламен
јонизирачкиот детектор.
ИНСТРУМЕНТАЦИЈА ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
ШПРИЦОВИ ЗА ИНЈЕКТИРАЊЕ НА ПРИМЕРОЦИТЕ ЗА
АНАЛИЗА ВО СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Вообичаено, волуменот на примероците за анализа, кој се
инјектира во системот за GC, се движи во опсег од 0,5 до 2 µL, а
волуменот на цилиндарот на шприцовите кои се користат за
инјектирање на примероците за анализа, се движи во опсег од
5 до 10 µL.
 Доколку во системот за GC е употребена капиларна колона,
потребно е во цилиндарот од шприцот внимателно да се
вовлечат 0,5 µL растворувач, пред истиот да биде наполнет со
примерокот за анализа. Дополнително, и примерокот за анализа
се вовлекува во цилиндарот од шприцот со цел да се создаде
слободен воздушен простор под него.
 Во продолжение, иглата од шприцот се воведува во отворот на
инјекторот и се остава неколку секунди за да се загрее, пред да
се притисне клипот од шприцот. По притискањето на клипот од
шприцот, самиот шприц веднаш се отстранува од отворот на
инјекторот.
ШПРИЦОВИ ЗА ИНЈЕКТИРАЊЕ НА ПРИМЕРОЦИТЕ ЗА
АНАЛИЗА ВО СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
СИСТЕМИ ЗА ИНЈЕКТИРАЊЕ НА ПРИМЕРОЦИТЕ ЗА
АНАЛИЗА ВО КОЛОНАТА ОД ГАСНИОТ ХРОМАТОГРАФ
 За инјектирање на примероците за анализа во колоната од

гасниот хроматограф, може да се користат четири системи
за инјектирање:
1. Систем за инјектирање во пакувана колона;
2. Систем за поделено / неподелено инјектирање;
3. Систем за директно (ладно) инјектирање во колона;
4. Систем со температурно програмиран испарувач.
СИСТЕМ ЗА ИНЈЕКТИРАЊЕ ВО ПАКУВАНА КОЛОНА
 Системот за инјектирање во пакувана колона вклучува директно
инјектирање на примерокот за анализа преку гумен септум.
 Во зависност од степенот на испарливост на примерокот за
анализа, отворот на инјекторот се одржува во температурен
оспег помеѓу 150 и 250оС, при што, 0,1 – 10 µL од примерокот за
анализа, директно се инјектираат во врвот од колоната.
 Имајќи предвид дека целиот примерок за анализа, директно се
инјектира во пакувана колона, може да се заклучи дека кај овој
тип на инјектирање, веројатноста за појава на одреден проблем
е многу помала во споредба со веројатноста за појава на ист
ваков проблем при инјектирањето во капиларна колона. Ова
воедно претставува и главна предност на пакуваните колони.
 Како и да е, со помош на овој тип на колони, не може да се
постигне висок степен на резолуција во системот за GC.
СИСТЕМ ЗА ПОДЕЛЕНО / НЕПОДЕЛЕНО ИНЈЕКТИРАЊЕ
 Системот за поделено / неподелено инјектирање се користи во комбинација
со капиларна колона. Вообичаено, внатрешниот дијаметар на капиларните
колони се движи во опсег помеѓу 0,2 и 0,5 mm, а нивната должина може да
варира во опсег помеѓу 12 и 50 m. За разлика од системот за инјектирање
во пакувана колона, кај системот за поделено / неподелено инјектирање,
инјектирањето се одвива во загреано стакло или кварц.
 Доколку е активиран „SPLIT“ (поделено) режимот, примерокот за анализа
се дели на два нееднакви делови, во меѓусебен сооднос, кој се движи во
опсег помеѓу 10:1 и 100:1. Притоа, само помалиот дел се инјектира во
колоната. Како таков, овој режим на инјектирање се користи кога се работи
со концентрирани примероци.
 Доколку е активиран „SPLIT LESS“ (неподелено) режимот, целиот примерок
за анализа се воведува во колоната, при што отворот на инјекторот, по
инјектирањето на примерокот за анализа, останува затворен во временски
период од 30 секунди до 1 минута.
 Главен недостаток на системот за поделено / неподелено инјектирање во
капиларната колона, претставува малата веројатност за постигнување
добра прецизност при самиот процес на инјектирање.
СИСТЕМ ЗА ДИРЕКТНО (ЛАДНО) ИНЈЕКТИРАЊЕ ВО
КОЛОНА
 Системот за директно (ладно) инјектирање во капиларна колона
функционира на принцип, аналоген на функционирањето на системот за
инјектирање во пакувана колона. Притоа, за ефективна примена на овој
систем, неопходен е шприц со многу фина фузирана силика игла.
 Главни предности на системот за директно (ладно) инјектирање во
капиларна колона се:
 намалување на можноста, разликите помеѓу компонентите од комплексниот
примерок, да влијаат негативно врз целокупната анализа;
 спречување на можноста за појава на деградација на примерокот за
анализа во топлиот инјектор;
 спречување на можноста за зголемување на волуменот на растворувачот,
како резултат на негово испарување, поради што, се спречува можноста за
враќање на примерокот за анализа во отворот на инјекторот.
 Покрај предностите, системот за директно (ладно) инјектирање во
капиларна колона, поседува и одредени недостатоци:
 примероците за анализа мора да бидат чисти бидејќи во спротивно,
остатоци од истите може да се задржат на површината од колоната и да
интерферираат со следната анализа;
 инјекторот е механички покомплексен, па токму поради оваа причина,
истиот треба да се одржува повнимателно;
 иглата од шприцот може да предизвика оштетување на врвот од
капиларната колона.
СИСТЕМ СО ТЕМПЕРАТУРНО ПРОГРАМИРАН
ИСПАРУВАЧ
 Системот со температурно програмиран испарувач претставува
понов тип на инјектор, кој е дизајниран за да овозможи
воведување на голем волумен од примерокот за анализа во
капиларната колона од системот за GC.
 Мобилната фаза (растворувачот) се пропушта преку вентил за
прочистување со висока стапка на проток, а 5 – 10 µL од
примерокот за анализа, се инјектираат во капиларната колона,
при што, инјекторот се одржува на ниска температура. Помалку
испарливите компоненти од примерокот за анализа се
задржуваат во отворот на инјекторот, по што вентилот за
прочистување се затвара, а температурата на инјекторот нагло
се зголемува.
 Со цел инјекторот да функционира правилно, вредноста на
точката на вриење на компонентата од примерокот, која се
одликува со најниска точка на вриење, треба да биде за 100оС
повисока во споредба со точката на вриење на растворувачот.
ПЕЧКА ВО СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Во печките во системот за GC има инсталирано
вентилатор, кој служи за униформна дистрибуција на
топлината во печката.
 Секоја печка од системот за GC треба да биде
температурно програмирана.
 Температурните програми може да бидат прости и
сложени.
 Простите температурни програми вклучуваат:
 одржување на константна температура;
 одржување на изотермни услови;
 линеарно зголемување на температурата.
 Притоа, опсегот за промена на температурата во печката
од системот за GC, се движи од 1оС / минута до 40оС /
минута.
ПЕЧКА ВО СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Сложените температурни програми претставуваат комбинација
од прости температурни програми.
 На пример, одржување на изотермни услови на точно одредени
временски интервали, помеѓу кои, настанува линеарно
зголемување на температурата и повторно воспоставување на
изотермни услови.
 Температурно програмирање на печките од системот за GC е
значајно поради две главни предности.
 Прво, може да се постигне лесна и сепарација во разумен
временски период на компонентите од примерокот за анализа,
кои меѓусебно се разликуваат според степенот на испарување.
 Второ, инјектирањето на примерокот за анализа може да се
врши на ниска температура, при што, истиот се задржува на
почетокот од колоната, а со зголемување на температурата,
компонентите од примерокот за анализа, започнуваат да се
елуираат од колоната.
ВИДОВИ КОЛОНИ ВО СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА
ХРОМАТОГРАФИЈА – ПАКУВАНИ КОЛОНИ
 Најчесто, пакуваните колони се изработени од стакло, кое на
површината е силанизирано со цел да се отстранат поларните
силанолни (Si–OH) групи, кои може да придонесат за појава на опашка
на пиковите од поларните аналити.
 Внатрешниот дијаметар на пакуваните колони се движи во опсег помеѓу
2 и 5 mm.
 Самите колони се пакувани со честици кои образуваат цврста подлога,
која пак, е обложена со течна стационарна фаза. Таквата цврста
подлога најчесто се состои од честици од дијатомејска земја, главно,
честици од калциум силикат.
 Притоа, неопходно е цврстата подлога да се промие со киселина за да
се отстранат потенцијално присутните минерални онечистувања, а на
крај истата да се силанизира, како би се спречила можноста за појава
на опашка на пиковите од компонентите од примерокот.
 На крај, цврстата подлога механички се обложува со течна стационарна
фаза.
 Кога станува збор за пакувани колони за GC, најчесто

употребуван гас во функција на мобилна фаза, претставува
азотот, чија брзина на проток изнесува 20 mL / минута.
 Во однос на степенот на резолуција, треба да се напомене дека
со помош на пакуваните колони се постигнува релативно понизок
степен на резолуција во споредба со капиларните колони за GC.
 Исто така, највисокиот температурен лимит на пакуваните
колони изнесува 280оС. Над оваа температура, течната
стационарна фаза испарува и како резултат на тоа, се создава
позадински сигнал.
 Како и да е, кога станува збор за спроведување на рутински
контроли на квалитет, употребата на пакуваните колони како
колони во системот за GC, е сосема оправдана.
ХРОМАТОГРАФИЈА – КАПИЛАРНИ КОЛОНИ
 Капиларните колони се изработени од фузирана силика. За да се
обезбеди еластичност на капиларната колона, истата од
надворешната страна се обложува со полиамид, а доколку печката
за GC е програмирана на температура повисока од 400оС, тогаш од
надворешната страна, капиларната колона, дополнително се
обложува со алуминиум.
 Внатрешниот дијаметар на капиларните колони се движи во опсег
помеѓу 0,15 и 0,5 mm.
 Од внатрешната страна, ѕидот на капиларната колона е обложен со
течна стационарна фаза, чија дебелина се движи во опсег помеѓу
0,1 и 5 µm. За обложување на внатрешниот ѕид од капиларната
колона, најчесто се користат органски силиконски полимери, кои
од една страна, хемиски се поврзани со Si–OH групите од
површината на ѕидот на капиларната колона, а од друга страна,
ланците на овие органски полмери, вкрстено се поврзани.
 Генерално, овие фази се стабилни на температура од 325оС, па
дури, некои фази за обложување на внатрешниот ѕид од
капиларната колона, покажуваат стабилност и на температура од
370оС.
 Несиликонски полимери, како на пример, полиетилен гликол,
не стапуваат во интеракција со внатрешниот ѕид на капиларната
колона на начин, аналоген на начинот на кој силиконските
полимери го остваруваат ваквиот тип на интеракција.
 Имено, капиларните колони, чиишто внатрешни ѕидови се
обложени со одреден несиликонски полимер, покажуваат помала
стабилност на високи температури. На пример, температурниот
лимит на капиларната колона, чијшто внатрешен ѕид е обложен
со полиетилен гликол, изнесува 240оС.
 Кога станува збор за капиларни колони за GC, најчесто
употребуван гас во функција на мобилна фаза, претставува
хелиумот, чија брзина на проток се движи во опсег помеѓу 0,5 и
20 mL / минута.
 Имајќи предвид дека брзината на проток на крајот од
капиларната колона е помала во споредба со брзината на проток
во останатите делови од колоноата, за ефективно придвижување
на примерокот за анализа кон детекторот, неопходно е да се
користи т.н. „make–up“ гас.
СЕЛЕКТИВНОСТ НА ТЕЧНИТЕ СТАЦИОНАРНИ ФАЗИ –
KOVATS – ОВИ ИНДЕКСИ (I–ВРЕДНОСТИ) И
ПОЛАРНОСТ НА КОЛОНАТА
 Kovats – овите индекси (I–вредности) се базираат на споредба на
ретенционото време на аналитот со ретенционите времиња на серија од n–
алкани.
 Како такви, n–алканите поседуваат најголем афинитет кон неполарните
колони, што значи дека истите тежнеат побрзо да се елуираат од поларните
колони. Обратно, доколку станува збор за поларен аналит, истиот би се
елуирал значително побавно од одредена поларна колона.
 Според тоа, ретенционото време на поларните аналити, а со тоа и нивните
Kovats – ови индекси, во однос на овие параметри за n–алканите, ќе се
зголемуваат со зголемување на поларноста на колоната во системот за GC.
 Основна мерка за поларноста на колоната претставува нејзината
McReynold – ова константа. Оваа константа се заснова на ретенционите
времиња на: бензен, n–бутанол, пентан–2–он, нитропропан и пиридин во
одредена колона.
 Притоа, вредноста за McReynold – овата константа и поларноста на
колоната зависат правопропорционално, односно, до колку е повисока
вредноста за McReynold – овата константа, до толку е пополарна колоната
и обратно.
KOVATS – ОВИ ИНДЕКСИ (I–ВРЕДНОСТИ) И
ПОЛАРНОСТ НА КОЛОНАТА
 Во услови кога температурата во печката од системот за GC
линеарно се зголемува во текот на анализата, на пример, за 10оС /
минута, кривата која ја покажува зависноста помеѓу бројот на
јаглеродни атоми во n–алканите и нивните ретенциони времиња,
претставува права линија.
 Во услови кога печката во системот за GC е програмирана да
одржува изотермни услови во текот на анализата, кривата која ја
покажува зависноста помеѓу бројот на јаглеродни атоми и
логаритмот од ретенционите времиња на n–алканите, претставува
права линија.
 Ваквиот тип на калибрациони криви овозможува претворба на
ретенционите времиња на дадени компоненти во нивните Kovats –
ови индекси.
 Имајќи предвид дека постојат готови табели во кои се наведени
Kovats – овите индекси на голем број компоненти, може да се
заклучи дека со помош на овие вредности се овозможува
идентификација, односно карактеризација на одредени непознати
компоненти.
ХИРАЛНА СЕЛЕКТИВНОСТ
 Со оглед на фактот што сродните енантиомери поседуваат
идентични физички карактеристики, тие не може да се
раздвојуваат со помош на конвенционалните колони за GC.
 Меѓутоа, доколку на ваквите хирални аналити им се овозможи да
стапат во интеракција со колона обложена со хирална фаза,
тогаш истите ќе формираат транзиторни дијастереоизомерни
комплекси. Токму поради оваа причина, хиралните аналити
различно би биле задржани во колоната, а како резултат на тоа,
истите би се елуирале и во различни временски интервали.
 Ваквиот тип на селективност, кој се однесува на дистинкција на
сродни енантиомери, се означува како хирална селективност.
 Имено, како што се зголемува бројот на фармацевтски
формулации во кои се вклучува само фармаколошки активниот
енантиомер кој не предизвикува појава на несакани ефекти, така
се зголемува и значењето на овој тип на селективност.
 Една од првите хирални фази за обложување на колоните во
системот за GC, е Chirasil Val. Оваа хирална фаза поседува само
еден хирален центар и како таква, истата најдобро е прилагодена за
сепарација на енантиомери на аминокиселини, додека за сепарација
на други соединенија, таа не поседува голема ефикасност.
 Во поново време, како хирални фази се употребуваат
алкализираните циклодекстрини. Во основа, овие фази се
состојат од циклични структури кои се добиваат со поврзување на 6,
7 или 8 глукозни единици, по што се врши алкализација на нивните
хидроксилни групи, која ќе резултира со намалување на точките на
топење на циклодекстрините, што пак, ги прави погодни за употреба
како хирални фази во системот за GC.
 Ако се земе предвид дека циклодекстрините поседуваат повеќе
хирални центри, логично е дека истите би можеле да се
употребуваат за сепарација на енантиомери на лекови. Ваквиот
начин на сепарација се базира на механизмот, преку кој
енантиомерите на лековите се инкорпорираат во хиралните
празнини, образувани од страна на циклодекстринските единици.
 Имајќи предвид дека хиралните фази за обложување на колоните од
системот за GC не се економски исплатливи, истите алтернативно може да
се заменат со хирални дериватизациони реагенси. Генерално, овие
реагенси претставуваат соединенија од природно потекло, кои се
употребуваат како чисти енантиомери.
 Понекогаш, со помош на хиралните дериватизациони реагенси се
постигнува подобра сепарација во споредба со сепарацијата која се
постигнува со хиралните колони за GC. Меѓутоа, ако се создадат многу
силни реакциони услови, постои опасност од рацемизација на аналитот
т.е. конверзија на (+) енантиомерот во неговата (–) форма или обратно.
 Принципот на сепарација со употреба на овој тип на реагенси се темели на
реакцијата помеѓу смесата на енантиомери, од една страна и хиралниот
дериватизационен реагенс, од друга страна. Како резултат на ваквата
реакција, ќе се создаде пар од дијастереоизомери.
 Пример за ваков тип на сепарација е сепарацијата на естрите на ментолот
со помош на (+) хризантеминска киселина како хирален
дериватизационен реагенс. И покрај тоа што естрите на ментолот
претставуваат енантиомери, со додавање на (+) хризантеминска киселина
во оваа смеса, настанува ацилација на енантиомерите, при што се
образуваат дијастереоизомери со различни физички карактеристики,
поради кои, истите многу лесно може да се сепарираат.
ПАРАМЕТРИ КОИ ВЛИЈААТ ВРЗ ПЕРФОРМАНСИТЕ НА
КАПИЛАРНАТА КОЛОНА ОД СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА
 Параметри кои влијаат врз перформансите на капиларната

колона од системот за GC се:
1. Вид и проток на гасот носач;
2. Температура на колоната;
3. Должината на колоната;
4. Дебелина на филмот од стационарната фаза;
5. Внатрешен дијаметар на колоната.
ВЛИЈАНИЕ НА ВИДОТ И ПРОТОКОТ НА ГАСОТ НОСАЧ ВРЗ
ПЕРФОРМАНСИТЕ НА КАПИЛАРНАТА КОЛОНА ОД СИСТЕМОТ
ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Најчесто употребувани видови на гасови носачи во системот за
GC се: водородот, хелиумот и азотот.
 Споредено со азотот, водородот и хелиумот покажуваат
поголема ефикасност при поголема брзина на проток. Имено,
нивната брзина на проток се движи во опсег помеѓу 30 и 50 cm /
s, за разлика од азотот, чијашто брзина на проток се движи во
опсег помеѓу 10 и 20 cm / s. Токму поради оваа причина, при
изведба на практични анализи со помош на капиларна колона,
како гасови носачи, почесто се употребуваат водородот и
хелиумот, отколку азотот.
 Брзината на проток на гасот носач во капиларната колона од
системот за GC зависи обратнопропорционално од
температурата. Тоа значи дека со зголемување на
температурата, доаѓа до намалување на брзината на проток на
гасот носач. Со цел да се спречи ваквата појава, модерните
инструменти може да се програмираат да одржуваат константна
брзина на проток, независно од промената, односно
зголемувањето на температурата.
ВЛИЈАНИЕ НА ТЕМПЕРАТУРАТА И ДОЛЖИНАТА НА
КОЛОНАТА ВРЗ ПЕРФОРМАНСИТЕ НА КАПИЛАРНАТА КОЛОНА
ОД СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Температурата на колоната зависи обратнопропорционално од степенот
на резолуција помеѓу дадени компоненти од примерокот за анализа. Имено,
со зголемување на температурата на колоната, доаѓа до намалување на
степенот на резолуција помеѓу таквите компоненти. Според тоа, доколку е
потребно да се постигне повисок степен на резолуција, подобро е
анализата да се врши на пониска температура.
 Математички, моќноста на колоната да раздвојува два соседни пикови од
хроматограмот (резолуција на колоната), може да се претстави како
квадратен корен од нејзината должина. Според тоа, за да настане двојно
зголемување на резолуцијата на колоната, потребно е четирикратно
зголемување на нејзината должина, како резултат на што пак, би настанало
и четирикратно зголемување на времето потребно за анализа.
 Од причина што зголемувањето на резолуцијата преку зголемување на
должината на колоната не е практично, за постигнување повисока
резолуција може да се намали температурата на колоната. Ваквиот пристап
овозможува полесна интеракција помеѓу компонентите од примерокот за
анализа и стационарната фаза, а дополнително, доколку се избере
стационарна фаза со селективен афинитет кон одредени компоненти, се
овозможува и нивно полесно раздвојување.
ВЛИЈАНИЕ НА ДЕБЕЛИНАТА НА ФИЛМОТ ОД СТАЦИОНАРНАТА ФАЗА И
ВНАТРЕШНИОТ ДИЈАМЕТАР НА КОЛОНАТА ВРЗ ПЕРФОРМАНСИТЕ НА
КАПИЛАРНАТА КОЛОНА ОД СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Волуменот на стационарната фаза, која се користи за

обложување на колоната од нејзината внатрешна страна, зависи
правопропорционално со степенот на партиционирање на
аналитот во неа. Тоа значи дека, до колку е подебел филмот,
односно до колку е поголемо полнењето на стационарната фаза,
до толку ќе се зголемува и ретенционото време на аналитот во
колоната.
 Според тоа, за да се зголеми ретенционото време, односно
степенот на резолуција помеѓу лесно испарливите аналити,
неопходно е да се употребуваат подебели филмови од
стационарната фаза, без притоа да се промени должината на
колоната.
 До колку е помал внатрешниот дијаметар на колоната, до
толку ќе биде поголема нејзината ефикасност за соодветно
дебел филм од стационарната фаза, обложена на внатрешниот
ѕид од колоната.
ДЕТЕКТОРИ ВО СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА
 Иако постојат голем број на детектори кои се употребуваат во
системот за GC, сепак, најчесто употребуван детектор, особено во
контролата на квалитет на фармацевтските производи, претставува
пламен јонизирачкиот детектор.
 Покрај пламен јонизирачкиот детектор, во поново време, во
системите за GC, сѐ почесто се употребуваат и плазма
емисиониот детектор (при анализа на онечистувања во трагови),
но и инфрацрвениот детектор со Fourier – ова трансформација
(при структурна карактеризација на компоненти во комплексни
смеси).
 Кога станува збор за сензитивни биоаналитички методи за анализа
на траги од аналит во присуство на други, односно интерферирачки
компоненти, тогаш неопходно е да се употребуваат детектори кои се
одликуваат со висок степен на селективност.
 Покрај наведените, други примери за детектори кои се користат во
системот за GC се: детекторот со електронски зафат, азотно
фосфорниот детектор, термално спроводливиот детектор и
радиохемискиот детектор.
ДЕТЕКТОРИ ВО СИСТЕМОТ ЗА ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА –
ПЛАЗМА ЈОНИЗИРАЧКИ ДЕТЕКТОР И ДЕТЕКТОР СО
ЕЛЕКТРОНСКИ ЗАФАТ
 Пламен јонизирачки детектор

 Принципот на функционирање на овој тип на детектор се базира на
детекција на јони кои се создаваат при согорување на органски компоненти
во пламен, при што произведените јони ќе предизвикаат зголемување на
електричната струја помеѓу млазот и колекторот. Од круцијално значење е
да се напомене дека продукцијата на јони е правопропорционална со
концентрацијата на органските компоненти, присутни во примерокот за
анализа. Како таков, пламен јонизирачкиот детектор, единствено може да се
користи за детекција на јаглеводородни соединенија, односно соединенија
кои се состојат од јаглерод и водород, но истиот не е чувствителен за
детекција на соединенија кои се состојат од јаглеродни атоми, поврзани со
кислород, азот или хлор.
 Детектор со електронски зафат
можноста соединенијата со висока електронегативност (способност да
привлекуваат електрони), да навлезат во детекторот и да ги акцептираат
електроните кои се прозведени од страна на одреден радиоактивен извор.
Како резултат на тоа, настанува намалување на електричната струја на
колекторот. Вообичаено, овој тип на детектор се употребува при анализа на
лекови во телесни течности.
АЗОТНО ФОСФОРЕН И ТЕРМАЛНО СПРОВОДЛИВ ДЕТЕКТОР
 Азотно фосфорен детектор
можноста соединенијата кои содржат азот или фосфор, да стапуваат во
реакција со алкална метална сол, присутна во детекторот, како резултат на
што, се формираат различни видови на честици (цијанидни јони, различни
видови на фосфорни анјони, електрони). Вака создадените честици
предизвикуваат зголемување на електричната струја, при што се генерира
соодветен сигнал. Од самото име на детекторот може да се заклучи дека
истиот е високоселективен за соединенија кои содржат азот или фосфор и
како таков, азотно фосфорниот детектор најчесто се употребува при
анализа на лекови и нивни метаболити во ткива и телесни течности.
 Термално спроводлив детектор
неговата можност да реагира на ефектот на ладење, предизвикан од страна
на аналитот откако ќе помине над филаментот од детекторот, при што се
создава сигнал. Во споредба со пламен јонизирачкиот детектор, термално
спроводливиот детектор е помалку чувствителен за детекција на органски
соединенија. Од друга страна пак, термално спроводливиот детектор не е
деструктивен, па поради тоа, ако е неопходно, после детекцијата на
компонентите од примерокот за анализа, истите може да бидат зачувани.
Според Британската фармакопеја, овој тип на детектор, како составен дел
од системот за GC, се користи во фармакопејските анализи за одредување
на вода во дадени пептиди: менотрофин, гонадорелин и салкатонин.
РАДИОХЕМИСКИ И ПЛАЗМА ЕМИСИОНЕН ДЕТЕКТОР
 Радиохемиски детектор
можноста за детекција на 14СО2 и 3Н, добиени од 14С и 3Н, присутни во
молекулите на компонентите од примерокот за анализа. Со оглед на фактот
што радиохемискиот детектор поседува голем внатрешен простор, при
конструирање на системот за GC, овој тип на детектор подобро е да се
комбинира со пакувана, отколку со капиларна колона. Како таков,
радиохемискиот детектор може да се користи при анализи на радиоактивно
обележани метаболити на лекови, така што неговата чувствителност, пред
сѐ, зависи од степенот на радиоактивност на аналитот.
 Плазма емисионен детектор
 Загревањето на аргон на температура повисока од 6 000оС ќе резултира со
појава на плазма емисија, која пак, ќе предизвика ексцитација на атомите од
хемиските елементи, кои се наоѓаат во примерокот за анализа. Понатаму,
секој од присутните хемиски елементи ќе произведе индивидуални
емисиони линии, кои се насочуваат кон решетки за дифракција, за да на
крај, финално се детектираат од страна на diode array детектор. Како таков,
плазма емисиониот детектор може да се користи за детекција на
индивидуални елементи во комплексни примероци. На пример, истиот може
да се користи за детекција на хлор во органохлорни пестициди или за
детекција на метали во органометални соединенија.
ИНФРАЦРВЕН ДЕТЕКТОР СО FOURIER – ОВА
ТРАНСФОРМАЦИЈА
 Инфрацрвен детектор со Fourier – ова трансформација

 Во суштина, овој тип на детектор претставува инфрацрвен
инструмент со Fourier – ова трансформација, вклучен во
системот за GC. Значи, со помош на инфрацрвениот детектор со
Fourier – ова трансформација, при елуирање на компонентите,
присутни во примерокот за анализа, од колоната во системот за
GC, може да се добијат нивните инфрацрвени спектри. Според
тоа, овој тип на детектор наоѓа поширока примена во
квалитативните (идентификациони), отколку во квантитативните
анализи. Како и да е, постојат примери за употреба на
инфрацрвениот детектор со Fourier – ова трансформација во
квантитативните анализи, а еден од таквите примери е
одредувањето на пропандиол во ацикловир крем.
ПРИМЕНА НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Гасната хроматографија наоѓа широка примена како
техника за:
 карактеризација на некои неформулирани лекови, особено
во поглед на одредување на процесните онечистувања;
 карактеризација на одредени суровини кои се користат при
производството на лекови;
 карактеризација на испарливи масла кои може да се
употребуваат како ексципиенси при производството на
лекови;
 квантификација на лекови во формулации, особено доколку
лековите не поседуваат хромофори;
 одредување на лекови и нивни метаболити во биолошки
течности;
 спроведување лимит тестови за остатоци од растворувачи
или други испарливи онечистувања, присутни во лековите.
ПРИМЕНА НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
КВАНТИТАТИВНИТЕ АНАЛИЗИ
 Генерално, за квантитативна анализа на соединенија кои поседуваат
хромофори, првенствено се применуваат методи базирани на HPLC.
Меѓутоа, ако соединенијата кои се испитуваат, не поседуваат хромофори,
истите не може да се анализираат со помош на методи базирани на оваа
техника, туку за нивна квантитативна анализа се применуваат методи
базирани на GC. Примери за такви соединенија се: аминокиселините,
масните киселини и шеќерите.
 Во Британската, Американската и Европската фармакопеја, постојат бројни
фармакопејски анализи базирани на примена на GC, меѓутоа, изборот на
соединенијата кои се анализираат на ваков начин е сосема случаен, па
истовремено, овие фармакопејски анализи може да се спроведат и со
примена на HPLC.
 Независно од тоа дали станува збор за фармакопејски анализи базирани на
GC или HPLC, според Британската фармакопеја, за спроведување на овие
анализи, неопходно е да се подготват три типа на раствори:
 раствор 1: калибрационен стандард, кој помалку или повеќе, содржи еднакво
количество на чист и внатрешен стандард;
 раствор 2: екстракт од примерокот за анализа, кој не содржи внатрешен
стандард, а се користи за проверка на интерференциите кои потекнуваат од
формулациониот матрикс;
 раствор 3: екстракт од примерокот за анализа, кој содржи еднакво количество на
внатрешен стандард, како и количеството на внатрешен стандард во раствор 1.
ПРИМЕНА НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ВО
 На пример, при анализа на содржината на метилтестостерон во
таблетна формулација, како внатрешен стандард се користи
тестостерон, а за правилно спроведување на анализата,
неопходно е да се подготват следниве раствори:
 раствор 1: калибрационен стандард, кој содржи 0,04 % w/v
метилтестостерон и 0,04 % w/v тестостерон во етанол;
 раствор 2: екстракт од таблетната формулација, кој содржи 20 mg
метилтестостерон во 50 mL етанол;
 раствор 3: екстракт од таблетната формулација, кој содржи 20 mg
метилтестостерон во 50 mL етанол во кој, концентрацијата на
тестостерон е идентична како и концентрацијата на тестостерон во
раствор 1.
 На крај, по 0,5 µL од секој од подготвените раствори се
инјектираат во системот за GC, при што се добиваат
хроматограми за секој од инјектираните раствори.
 Со правилна интерпретација на овие хроматограми може да се
добијат информации за содржината на метилтестостерон во
таблетната формулација.
 Кога е потребна квантификација на лесно испарливи соединенија,
GC претставува техника од избор. Притоа, за ефикасна
квантификација на лесно испарливи соединенија, неопходно е во
системот за GC, да се вклучи колона која силно ќе ги задржува лесно
испарливите соединенија.
 Пример за лесно испарливо соединение е етанолот, кој се користи
за подготовка на раствори и тинктури со антисептичен, односно
дезинфициентен ефект. Вообичаено, етанолот може да се
квантифицира во однос на некој сроден алкохол.
 На пример, во фармакопејската анализа на хлороксиленол
раствор, квантификацијата на етанолот се врши во однос на
пропан–1–ол, кој во конкретниот случај се користи како внатрешен
стандард. Со цел ефикасно задржување на етанолот за
стационарната фаза, потребно е колоната од системот за GC да
биде пакувана со Poropak Q.
 Poropak Q претставува пример за порозна и полимерна стационарна
фаза, која силно ги задржува нискомолекуларните соединенија.
Истата е ефикасна и кога станува збор за сепарација на одредени
гасови: јаглероден диоксид, амонијак и ацетилен.
ПРИМЕНА НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ЗА ОДРЕДУВАЊЕ
НА ПРОИЗВОДСТВЕНИ И ДЕГРАДАЦИОНИ ОСТАТОЦИ
 Гасната хроматографија може да се користи за одредување

на производствени и деградациони остатоци, како на
пример:
 пивалинска киселина во дипивефрин капки за очи;
 диметиланилин во бупивакаин инјекции;
 N,N–диметиланилин во пеницилини;
 остатоци од глутаралдехид во полимерен филм.
ОДРЕДУВАЊЕ НА ПИВАЛИНСКА КИСЕЛИНА ВО
ДИПИВЕФРИН КАПКИ ЗА ОЧИ
 Кога станува збор за процена на испарливите
деградациони продукти, тогаш како техника од избор може
да се користи GC.
 На пример, при хидролиза на дипивефринот, формулиран
како капки за очи, кои се користат за третман на глауком, се
добива пивалинска киселина, чија процена може да се
направи со помош на GC.
 Притоа, за квантификација на оваа киселина, како
внатрешен стандард се користи изовалеријанската
киселина.
 Од круцијално значење е да се напомене дека веројатноста
за појава на деградациони продукти на естрите е многу
поголема кога станува збор за водени формулации, какви
што се на пример, капките за очи или инјекциите.
ОДРЕДУВАЊЕ НА ПИВАЛИНСКА КИСЕЛИНА ВО
ДИПИВЕФРИН КАПКИ ЗА ОЧИ
ОДРЕДУВАЊЕ НА ДИМЕТИЛАНИЛИН ВО БУПИВАКАИН
ИНЈЕКЦИИ
 Диметиланилинот претставува пример за производствено

онечистување во бупивакаинот, но имајќи предвид дека станува
збор за инјекциона формулација, истовремено, ова соединение
може да се јави и како потенцијален деградационен продукт, и
покрај тоа што хидролизата на амидите се одвива многу побавно
во споредба со хидролизата на естрите.
ОДРЕДУВАЊЕ НА ДИМЕТИЛАНИЛИН ВО БУПИВАКАИН
ИНЈЕКЦИИ
 Иако според Британската фармакопеја, за анализа на ова

онечистување се користи спектрофотометриски метод, сепак,
со помош на GC може да се обезбеди почувствителен, но и
поспецифичен метод за овој тип на анализа.
ОДРЕДУВАЊЕ НА N,N–ДИМЕТИЛАНИЛИН ВО
ПЕНИЦИЛИНИ
 Имајќи предвид дека N,N–диметиланилинот се користи како
спротивен јон при прочистувањето на пеницилините со помош
на рекристализација, може да се заклучи дека истиот ќе биде
присутен во примерокот за анализа.
 Како и да е, ваквиот јон лесно може да биде отстранет со помош
на блага алкализација и екстракција.
 За таа цел, потребно е пеницилинот да се алкализира со 1 М
натриум хидроксид, а потоа да се примени екстракција со
циклохексан кој содржи нафтален како внатрешен стандард. Од
слојот со циклохексан се зема случаен примерок за анализа и
истиот се инјектира во колоната за GC.
 Пикот добиен од N,N–диметиланилинот кој потекнува од
примерокот за анализа, се споредува со пикот добиен од
стандардниот раствор на диметиланилин, третиран на ист
начин како и примерокот за анализа.
 Дозволениот лимит, пропишан во Британската фармакопеја, за
N,N–диметиланилинот во пеницилини, изнесува 20 ppm.
ОДРЕДУВАЊЕ НА N,N–ДИМЕТИЛАНИЛИН ВО
ПЕНИЦИЛИНИ
ОДРЕДУВАЊЕ НА ОСТАТОЦИ ОД ГЛУТАРАЛДЕХИД ВО
ПОЛИМЕРЕН ФИЛМ
 Со помош на дериватизациони реакции може да се развие високо
специфична метода за детекција на онечистувања.
 На пример, нискомолекуларното онечистување глутаралдехид не е
доволно стабилно за да може директно да се анализира со помош
на GC, па токму поради оваа причина, истото треба да се
дериватизира, при што како реагенс за дериватизација се користи
високомолекуларното соединение пентафлуоробензилоксим.
 Како резултат на ваквата реакција, настанува стабилизација на
аналитот, но и зголемување на неговото ретенционо време, без
можност за појава на интерференции од други компоненти,
екстрахирани од матриксот на примерокот.
 Ваквиот пристап може да се применува и при одредување на
формалдехидот и ацеталдехидот како реакциони остатоци во
одредени пластични материјали за пакување.
 Дополнително, овој пристап може да се користи и за одредување на
хидразинот како производствено онечистување во лекот
хидралазин. За таа цел, хидразинот стапува во реакција со
бензалдехид, при што се добива лесно испарлив дериват, кој
понатаму се анализира со помош на GC.
ПРИМЕНА НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ВО ОДРЕДУВАЊЕ
РЕЗИДУАЛНИ РАСТВОРУВАЧИ ВО ПРИМЕРОК ЗА АНАЛИЗА
 Со цел утврдување на идентитетот и количеството на резидуални
растворувачи во примерокот за анализа, неопходно е растворувачите да
бидат меѓусебно одвоедни, од една страна, но и одвоени од соодветниот
матрикс, од друга страна.
 Имајќи предвид дека системот за GC овозможува раздвојување на
компонентите од примерокот за анализа, врз основа на нивната можност да
испаруваат на различни температури, ваквиот систем претставува метод од
избор кога станува збор за одредување на резидуални растворувачи во
примерок за анализа.
 Имено, повеќето растворувачи кои се користат во производствениот процес
на лековите, се одликуваат со ниски температури на вриење, поради што,
истите лесно испаруваат и како резултат на тоа, лесно се раздвојуваат по
должината на хроматографската колона.
 Кога станува збор за системите за GC, вредно е да се напомене дека
постојат различни механизми за инјектирање на примероците за анализа,
различни стационарни и мобилни фази, како и различни детектори, кои
овозможуваат многу лесно да се развие метод, базиран на GC, кој
првенствено би се користел за сепарација, а потоа и за квантификација
на резидуалните растворувачи во одреден примерок за анализа.
 Клучен фактор на кој мора да се посвети внимание во системот за GC, е
методот кој ќе се развие за сепарација и квантификација на резидуалните
растворувачи во примерокот за анализа, да биде репродуцибилен во
однос на инјектирањето на примероците и стандардите за анализа. Во
спротивно, методот, но и системот за GC, би се сметале за несоодветни.
 При развој на метод, базиран на GC, за сепарација и квантификација на
резидуални растворувачи во примерок за анализа, неопходно е
стационарната фаза и температурниот интервал соодветно да бидат
комбинирани за да се овозможи сепарација на сите компоненти од интерес.
 Исто така, треба да се работи во рамките на нормалната брзина на
колоната, но и во рамките на дозволениот температурен опсег на
инструментот.
 Дополнително, избраниот детектор мора да биде способен за детекција на
компонентите од интерес, односно да поседува соодветен оперативен
опсег. Кога станува збор за органски растворувачи, вообичаено, овие
критериуми ги исполнува пламен јонизирачкиот детектор.
 На крај, откако ќе се дефинираат условите во системот за GC, неопходно е
да се избере соодветен механизам за инјектирање на примероците и
стандардите за анализа.
 Тековните методи од Британската фармакопеја за

одредување на резидуални растворувачи кои потекнуваат
од производствениот процес на лековите, се базираат на
директно инјектирање на примерокот за анализа,
растворен во соодветен растворувач (на пример, вода), во
системот за GC, во кој е употребена пакувана колона.
 Примери за такви методи на одредување резидуални
растворувачи се:
 одредување на дихлорометан и диметиланилин во
ампицилин натриум;
 одредување на етил ацетат и хлороформ во колхицин;
 одредување на метанол во гентамицин сулфат;
 одредување на вода во менотрофин;
 одредување на пропан–2–ол во варфарин натриум.
БИОАНАЛИЗИ
 Со цел да се одреди оптималниот дозен режим на одреден лек, односно да
се одреди механизмот според кој лекот би се метаболизирал во организмот,
неопходно е да се развијат методи за анализа на лековите и нивните
метаболити во биолошките течности (крв, плазма, урина) и ткивата. Таквите
методи може да се базираат на употреба на GC во комбинација со одреден
детектор (масен спектрофотометар, пламен јонизирачки детектор,
селективен детектор за одредени атоми или атомски групи).
 Пример за примена на GC како техника за одредување на лекови во крвна
плазма, претставува одредувањето на антиепилептикот валпроична
киселина, после негова цврсто – фазна екстракција од крвната плазма, при
што како детектор се користи пламен јонизирачкиот детектор. Во
протоколот за работа е наведено дека каприлната киселина (изомер на
валпроичната киселина) се користи како внатрешен стандард, а лимитот на
детекција на лекот е 1 µg / mL плазма.
 Пример за употреба на GC во комбинација со селективен детектор за
одредени атоми или атомски групи, претставува одредувањето на
анестетикот бупивакаин. Имајќи предвид дека во структурата на
бупивакаинот се забележува присуство на два азотни атоми, во функција на
детектор се јавува азотно фосфорниот детектор. Притоа, лимитот на
детекција на лекот, кој може да се постигне со овој тип на детектор, е многу
подобар во споредба со лимитот на детекција, кој би се постигнал со
помалку селективниот пламен јонизирачки детектор.
ПРЕДНОСТИ НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Кога станува збор за предностите на гасната хроматографија,
пред сѐ, треба да се напомене дека:
 со помош на GC, особено доколку истата вклучува примена на
внатрешен стандард, може да се постигне иста точност и
прецизност при квантитативни анализи, како и точноста и
прецизноста, кои би се постигнале за ваков тип на анализи, при
примена на HPLC;
 доколку во системот за GC се вклучени капиларни колони,
тогаш ваквата техника поседува многу поголема моќ за
раздвојување во споредба со HPLC;
 GC лесно може да се автоматизира;
 GC претставува техника од избор кога станува збор за
одредување на соединенија кои не поседуваат хромофори;
 мобилната фаза која се користи во системот за GC не варира и
не се отстранува по завршувањето на анализата, па според тоа,
дури и кога се користи хелиум како мобилна фаза, истата
економски е поисплатлива во споредба со органските
растворувачи, кои пак, се користат како мобилна фаза во
системот за HPLC.
НЕДОСТАТОЦИ НА ГАСНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА
 Покрај предностите, GC поседува и одредени недостатоци.
Имено:
 со помош на GC може да се анализираат само
термостабилни и испарливи соединенија;
 во одредени случаи, примерокот за анализа мора да се
дериватизира за да истиот се трансформира во испарлива
форма, а ваквото воведување на дополнителен чекор во
протоколот за работа, ја зголемува можноста за појава на
различни видови интерференции;
 имајќи предвид дека во колоната за GC се инјектира мал
волумен од примерок за анализа, спроведувањето на
квантитативни анализи значително е отежнато;
 водени раствори и соли не може да се инјектираат во
колоната за GC, па според тоа, ваквите формулации не може
да се анализираат со помош на GC.
ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД

ВИСОК ПРИТИСОК (HIGH–
3 PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY – HPLC)

ВОВЕД ВО ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД ВИСОК
ПРИТИСОК
❖ Течната хроматографија под висок притисок (HPLC)

претставува најчесто употребувана техника кога станува
збор за квантификација на активни компоненти во
формулација.
❖ Иако фармакопејските анализи, во голема мера се
базираат на примена на UV / VIS спектроскопијата, сепак,
во фармацевтската индустрија, пред да се изврши
детекција со помош на оваа техника, неопходно е
компонентите од примерокот за анализа да се сепарираат,
вообичаено со HPLC.
ПРИНЦИП НА ТЕЧНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД ВИСОК
ПРИТИСОК
❖ Течна мобилна фаза протекува под притисок преку колона од

не’рѓосувачки челик, која е исполнета со честици од
стационарната фаза, така што дијаметарот на овие честици се
движи во опсег помеѓу 3 и 10 µm.
❖ Со помош на специјален инјектор, примерокот за анализа се
полни во врвот од колоната, а компонентите присутни во ваквиот
примерок, меѓусебно се раздвојуваат согласно нивните
ретенциони времиња, односно времиња на задржување во
стационарната фаза од колоната.
❖ Од круцијално значење е да се напомене дека сите компоненти
од примерокот за анализа, се задржуваат помалку или повеќе, со
цел да бидат елуирани од колоната со мобилната фаза,.
❖ На крај, за детекција на компонентите од примерокот за анализа,
може да се користат различни видови на детектори.
ИНСТРУМЕНТАЦИЈА ЗА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД
ВИСОК ПРИТИСОК
❖ Резервоар за снабдување со мобилната фаза
➢ Во резервоарот е вронета цевка, која овозможува проток на мобилната
фаза од самиот резервоар до пумпата.
➢ Вообичаено, резервоарите се изработени од не’рѓосувачки челик или
стакло, а нивниот вкупен волумен изнесува 1 L.
❖ Пумпа со уред за програмирање на составот на мобилната фаза
➢ Најчесто, пумпите за внесување на мобилната фаза се клипни, со два
цилиндри, кои работат истовремено, но наизменично, со единствена цел да
се избегнат било какви промени во притисокот поради пулсирачката работа
на пумпата, а со тоа и појава на шум на детекторот.
➢ Вообичаено, пумпите се изработени од не’рѓосувачки челик.
➢ Брзината на проток на пумпите изнесува 10 mL / минута.
➢ Максималниот притисок кај повеќето пумпи се движи до 40 MPa, а ова
ограничување, пред сѐ, се должи на фактот што при поголеми притисоци се
ослободува топлина, која влијае на ефикасноста на колоната.
➢ Пумпите се снабдени со уред за програмирање на составот на мобилната
фаза, кој може да се употреби на два начини: избирање на одреден состав
на растворувачи за да се изврши раздвојувањето со константен состав на
мобилната фаза (изократско елуирање) и дефинирање на составот на
мобилната фаза и начинот на изменување на нејзиниот состав во текот на
раздвојувањето (градиентно елуирање).
❖ Инјектор
➢ Инјекторот претставува уред за внесување на примерокот за
анализа во системот за HPLC.
❖ Колона
➢ Колоната претставува цевка од не’рѓосувачки челик, најчесто
исполнета со силанизиран силика гел, на пример, октадецилсилан
силика гел.
➢ Просечниот дијаметар на честиците од силика гелот може да биде:
3, 5 или 10 µm.
➢ Во одредени случаи, колоната може да биде лоцирана во печка, при
што, со нејзино загревање се намалуваат вискозноста на мобилната
фаза, односно притисокот, а како резултат на тоа пак, се
овозможува поголем проток. Дополнително, зголемената
температура овозможува и подобра резолуција бидејќи настанува
забрзување на дифузијата на компонентите од примерокот за
анализа. Од друга страна пак, работењето на висока температура
не е препорачливо бидејќи се јавува побрзо разградување на
стационарната фаза, а поради тоа се скратува животниот век на
колоната.
❖ Цевки за поврзување на колоната со инјекторот и детекторот
➢ Колоната од системот за HPLC е поврзана со инјекторот и
детекторот со помош на систем од цевки кои поседуваат мал
внатрешен дијаметар (0,2 mm).
➢ Малиот внатрешен дијаметар е потребен за да се минимизира
„мртвиот волумен“ т.е. празниот простор од системот за HPLC во кој
не се одвива хроматографскиот процес.
❖ Детектор
➢ Најчесто, но не и единствено употребувани детектори во системот
за HPLC се UV и UV / VIS детекторите.
➢ Ваквите детектори може да бидат со фиксна бранова должина (254
nm), со променлива бранова должина или со низа од диоди (diode
array detector – DAD).
❖ Систем за прикажување на хроматограмите и обработка на
податоците
➢ Ваквиот систем се состои од компјутерски интегратор или
персонален компјутер, со соодветно инсталиран софтвер за
прикажување на хроматограмите и обработка на податоците.
ВИДОВИ КОЛОНИ ВО СИСТЕМОТ ЗА ТЕЧНА
ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД ВИСОК ПРИТИСОК
❖ Постојат два видови на пакувања на колоната во системот за HPLC:
1. Нормално – фазно пакување на колоната
➢ Кај нормално – фазното пакување на колоната од системот за HPLC, во
функција на стационарна фаза се јавува силика гел.
➢ Механизмот на задржување на компонентите од примерокот за анализа кај
овој тип на пакување на колоната се базира на атсорпција на поларните
групи од молекулите од интерес на поларните групи од стационарната фаза
(водородни врски).
2. Реверзно – фазно пакување на колоната
➢ Кај реверзно – фазното пакување на колоната од системот за HPLC, во
функција на стационарна фаза се јавува силанизиран силика гел, односно
октадецилсилан силика гел.
➢ Механизмот на задржување на компонентите од примерокот за анализа кај
овој тип на пакување на колоната се базира на партиционирање на
липофилните делови од молекулите од интерес во стационарната фаза
(Van der Waals – ови интеракции).
❖ Покрај овие видови на пакувања на колоната во системот за HPLC,
постојат и други видови, кои главно се базираат на хемиска
модификација на површината од силика гелот или пак, во поново време,
се користат стационарни фази базирани на органски полимери.
❖ Во случај на нормално – фазно пакување, степенот на задржување на
компонентата од интерес во хроматографската колона, првенствено ќе
зависи од поларноста на самата компонента. Дополнително, влијание
врз ваквиот степен ќе има и природата на мобилната фаза. Имено, до
колку е пополарна мобилната фаза, до толку компонентата побрзо ќе се
елуира од колоната пакувана со силика гел.
❖ Во случај на реверзно – фазно пакување, степенот на задржување на
компонентата од интерес во хроматографската колона, првенствено ќе
зависи од липофилноста на самата компонента. Дополнително,
влијание врз ваквиот степен ќе има и природата на мобилната фаза.
Имено, до колку е полипофилна мобилната фаза, до толку
компонентата побрзо ќе се елуира од колоната пакувана со
октадецилсилан силика гел.
❖ Имајќи предвид дека во структурата на голем број фармаколошки
активни компоненти се забележува присуство како на поларни, така и на
липофилни функционални групи, слободно може да се заклучи дека
HPLC претставува техника од избор кога станува збор за издвојување
на фармаколошки активните компоненти од комплексни формулации.
ЕЛУИРАЊЕ НА НЕУТРАЛНИ КОМПОНЕНТИ ОД
КОЛОНИТЕ ОД СИСТЕМОТ ЗА HPLC
❖ При елуирање на неутрални компоненти, времето потребно

истите да се елуираат од хроматографската колона, пред сѐ,
зависи од рамнотежата помеѓу поларноста и липофилноста
на ваквите компоненти, додека рН – вредноста на мобилната
фаза не влијае врз времето на елуција.
❖ Во случај на реверзно – фазно пакување, до колку е
полипофилна компонентата од интерес, до толку подолго истата
ќе биде задржана во хроматографската колона.
❖ Во случај на нормално – фазно пакување, до колку е пополарна
компонентата од интерес, до толку подолго истата ќе биде
задржана во хроматографската колона.
❖ Вообичаено, поларноста директно се поврзува со бројот и
јачината на водородните врски на хидроксилните (ОН) групи,
присутни во молекулата од интерес.
❖ Зависноста меѓу поларноста и бројот, односно јачината на водородните врски на OH
групите, најдобро се воочува при елуирање на серија од кортикостероиди од колона со
реверзно – фазно пакување, со помош на смеса од метанол и вода во меѓусебен
сооднос 75:25, како мобилна фаза.
❖ Кортикостероидите ќе се елуираат според следниов редослед:
1. Преднизолон (се елуира прв бидејќи не поседува липофилна метилна група на позиција 16);
2. Бетаметазон (се елуира втор поради присуството на метилна група на позиција 16 и флуор,
кои заеднички допринесуваат за липофилноста на оваа молекула);
3. Бетаметазон–17–валеријанат и Бетаметазон–21–валеријанат (овие молекули поседуваат
липофилни естерски групи, кои прикриваат по една од нивните хидроксилни групи;
естерификацијата на позиција 21 повеќе го зголемува ретенционото време во однос на
естерификацијата на позиција 17, а како резултат на тоа, прво ќе се елуира бетаметазон–17–
валеријанат, а потоа и бетаметазон–21–валеријанат);
4. Бетаметазон дипропионат (дипропионатот на бетаметазонот поседува две липофилни
естерски групи, кои прикриваат две соодветни хидроксилни групи, а како резултат на тоа,
оваа молекула најдолго ќе се задржува во колоната, односно ќе се елуира последна).
❖ Кога станува збор за местото на делување на кортикостероидите, одлучувачки фактор
претставува нивната липофилност. Имајќи предвид дека кожата е липофилна
бариера, полипофилните кортикостероиди полесно би ја минувале ваквата бариера, а
со тоа би манифестирале подлабински ефект, за разлика од помалку липофилните
кортикостероиди, кои потешко би ја минувале кожата, што значи дека истите главно би
манифестирале површински ефект.
❖ Во случај на колона со нормално – фазно пакување, редоследот на елуирање на
кортикостероидите, помалку или повеќе, би бил спротивен во однос на редоследот на
елуирање на истите молекули од колона со реверзно - пакување.
КОНТРОЛА НА БРЗИНАТА НА ЕЛУИРАЊЕ НА ЈОНИЗИРАНИ
КОМПОНЕНТИ ПРЕКУ РЕГУЛИРАЊЕ НА РН – ВРЕДНОСТА НА
МОБИЛНАТА ФАЗА ОД СИСТЕМОТ ЗА HPLC
❖ Контрола на брзината на елуирање на јонизираните компоненти од
колоната од системот за HPLC, може да се врши преку регулирање на рН –
вредноста, при што се менува моќноста на мобилната фаза.
❖ Вообичаено, ваквиот пристап се применува кај колони со реверзно –
фазно пакување, но моќноста на мобилната фаза може да се менува и
кога станува збор за колони со нормално – фазно пакување, каде
јонизацијата на аналитот е потисната. Во овој случај, базните компоненти
ќе се придвижуваат, односно сепарираат, со помош на базна мобилна
фаза, а киселите компоненти ќе се придвижуваат, односно сепарираат, со
помош на кисела мобилна фаза.
❖ Контролата на брзината на елуирање на јонизираните компоненти од
колоната од системот за HPLC, преку регулирање на рН – вредноста на
мобилната фаза, е применлива само за компоненти, чиишто степени на
јонизација директно зависат од рН – вредноста. Такви компоненти се
всушност, најголемиот дел од секојдневно употребуваните лекови.
❖ Имајќи предвид дека екстремните рН – вредности предизвикуваат
растварање на силика гелот или пак, раскинување на врските помеѓу
средствата за силанизација на силика гелот и самиот силика гел, рН –
вредноста на мобилната фаза треба да се регулира во опсег од 2 до 8,5 рН
– единици. Сепак, со воведување на постабилни средства за силанизација,
опсегот на варијација на рН – вредноста, значително може да се зголеми.
СЕЛЕКТИВНОСТ НА МОБИЛНАТА ФАЗА ВО КОЛОНИТЕ СО
РЕВЕРЗНО – ФАЗНО ПАКУВАЊЕ ОД СИСТЕМОТ ЗА HPLC
❖ Во случај кога се користи колона со реверзно – фазно пакување,
наједноставниот фактор кој може да влијае врз селективноста на мобилната
фаза, претставува нејзиниот хемиски состав.
❖ Притоа, метанолот, ацетонитрилот и тетрахидрофуранот претставуваат
најчесто употребуваните органски растворувачи кои се јавуваат во функција
на мобилна фаза кај колона со реверзно – фазно пакување.
❖ Генерално, со намалување на количеството на органски растворувач во
состав на мобилната фаза во текот на хроматографската процедура, која се
одвива во колона со реверзно – фазно пакување, доаѓа до зголемување на
ретенционото време, а со тоа и факторот на капацитет на компонентите од
интерес.
❖ Според Dolan – овиот закон, со намалување на количеството на метанол
во состав на мобилната фаза за 10 %, доаѓа до трикратно зголемување на
факторот на капацитет, а со намалување на количеството на ацетонитрил
во состав на мобилната фаза за 10 %, доаѓа до двојно зголемување на
факторот на капацитет.
❖ Покрај разликите во моќта на елуирање, овие растворувачи меѓусебно се
разликуваат и според механизмот на интеракција со компонентите од
примерокот за анализа.
❖ Кога е потребно одредување на онечистувањата во дадена формулација,
неопходно е да се дефинира селективноста на мобилната фаза.
❖ Доколку одредено онечистување има многу слична хемиска структура, како
и хемиската структура на фармаколошки активната компонента, тогаш
обете молекули ќе поседуваат приближно еднакви вредности за нивните
ретенциони времиња, односно ќе се елуираат во многу блиски временски
интервали од хроматографската колона, што секако е неповолно.
❖ За да се минимизира оваа појава, треба да се избере соодветен систем на
растворувачи, кој би се користел како мобилна фаза. Вообичано, таквиот
систем на растворувачи се состои од три до четири компоненти.
❖ На пример, во формулација во која фармаколошки активна компонента е
хидрокортизон, процентуалната застапеност на сродната супстанција
кортизон, е 5 % во однос на вкупната концентрација на хидрокортизонот.
❖ За сепарација на овие молекули биле користени три различни системи на
растворувачи и тоа:
➢ мобилна фаза А (ацетонитрил:вода = 30:70);
➢ мобилна фаза В (ацетонитрил:метанол:вода = 15:15:70);
➢ мобилна фаза С (ацетонитрил:тетрахидрофуран:вода = 15:15:70).
❖ Со помош на мобилната фаза А се постигнува сепарација помеѓу
двете компоненти, така што прв се елуира хидрокортизонот, а втор
се елуира кортизонот.
❖ Во состав на мобилната фаза В, дополнително е вклучен метанол
во однос на мобилната фаза А. Меѓутоа, и покрај вклучувањето на
метанол, кој го зголемува ретенционото време, со помош на оваа
мобилна фаза не се овозможува ефикасна сепарација на
хидрокортизонот и кортизонот.
❖ При употреба на мобилната фаза С, настанува промена во
редоследот на елуирање на компонентите во однос на мобилната
фаза А, така што прв се елуира кортизонот, а втор се елуира
хидрокортизонот. Ваквиот случај, при кој прво се елуира помалку
застапената компонента, која е потенцијално онечистување
(кортизон), а потоа се елуира главната компонента (хидрокортизон),
претставува посакувана цел, од причина што кога прва би се
елуирала главната компонента, дури и минимална појава на опашка
на пикот кој соодветствува за оваа компонента, може да предизвика
проблеми во отчитувањето на последователните пикови.
ДЕТЕКТОРИ ВО СИСТЕМОТ ЗА ТЕЧНА
❖ Најчесто употребувани детектори во анализите на фармаколошки активните
компоненти во формулациите, претставуваат UV детекторот со променлива
бранова должина и UV детекторот со низа од диоди.
❖ Типичен UV детектор поседува тесна ќелија со дијаметар од околу 1 mm,
вкупна должина од 10 mm и внатрешен волумен од 8 µL. Имајќи предвид дека
апсорпциониот опсег на ваквиот тип на детектори се движи помеѓу 0,0001 и 2
апсорпциони единици, неопходно е примероците за анализа да бидат
доволно разредени, како истите би можеле да влезат во границите на овој
опсег.
❖ Одредени молекули, како на пример, шеќери, липиди, аминокиселини или
сурфактанти, поседуваат многу слаби хромофори, а други молекули пак, како
на пример, антихолинергичните лекови, воопшто не поседуваат хромофори.
Токму поради оваа причина, при испитување на овие соединенија, наместо UV
детектор, треба да се користи некој друг тип на детектор.
❖ Вообичаено, селективните детектори се користат кога во примерокот за
анализа, аналитот е присутен во мало количество. На пример, кога станува
збор за биоанализите, покрај аналитот, од примерокот за анализа, може да се
екстрахираат и некои други компоненти, кои понатаму ќе предизвикаат појава
на интерференции.
ДЕТЕКТОРИ ВО СИСТЕМОТ ЗА HPLC – UV ДЕТЕКТОР СО
ФИКСНА ИЛИ ПРОМЕНЛИВА БРАНОВА ДОЛЖИНА И ДЕТЕКТОР
СО НИЗА ОД ДИОДИ
❖ UV детектор со фиксна или променлива бранова должина
➢ Во минатото почесто се употребувале UV детектори со фиксна бранова должина
(вообичаено, бранова должина од 254 nm), а денес, покрај овие, достапни се и
UV детектори кои може да се подесат на различни бранови должини кои
влегуваат во опсегот на UV / VIS регионот. Независно од тоа дали станува збор
за UV детектор со фиксна или променлива бранова должина, принципот на
функционирање на овие детектори се темели на апсорпција на ултравиолетова
светлина од страна на аналитот. Покрај тоа што се робустни, UV детекторите со
фиксна или променлива бранова должина се одликуваат и со добра
чувствителност, која делумно зависи од специфичната апсорбанца на аналитот.
❖ Детектор со низа од диоди
➢ Детекторот со низа од диоди овозможува континуирано следење на UV или
UV/VIS спектарот на сите компоненти кои излегуваат од колоната, како резултат
на што, компонентите од примерокот за анализа може да се идентификуваат
онолку колку што дозволува спектарот. Исто така, овој детектор може да се
употреби за визуелизација на хроматограмот на различни бранови должини т.е.
секоја од компонентите може да се определи на брановата должина на која
покажува максимална апсорпција. Детекторот со низа од диоди снима UV/VIS
апсорпциони спектри во милисекунди додека компонентите се елуираат од
колоната, при што овозможува детекција на широк опсег на бранови должини од
UV/VIS регионот. Користи деутериумова или ксенонска ламба, која емитира
светлина со UV спектрално подрачје. Светлината од ламбата е фокусирана на
ахроматска леќа преку ќелија за примерокот, но и во холографска решетка.
Дисперзираната светлина од решетката се распоредува врз низата од диоди.
ДЕТЕКТОРИ ВО СИСТЕМОТ ЗА HPLC – ЕВАПОРАТИВЕН
ДЕТЕКТОР СО РАСЕЈУВАЊЕ НА СВЕТЛИНАТА И
ЕЛЕКТРОХЕМИСКИ ДЕТЕКТОР
❖ Евапоративен детектор со расејување на светлината
➢ Принципот на функционирање на евапоративниот детектор со расејување
на светлината се базира на расејување на сноп од светлина, кое настанува
како резултат на директен судир со честици, кои потекнуваат од
соединение, кое се задржува во системот, после испарувањето на
мобилната фаза. Овој универзален детектор не бара присуство на
хромофори во структурата на молекулата која е предмет на анализа, па
истиот може да се користи во анализите на: шеќери, липиди, аминокиселини
и сурфактанти. Како и да е, евапоративниот детектор со расејување на
светлината не може да се користи заедно со неиспарливи компоненти, како
на пример, пуфери во мобилна фаза, ниту пак, може да се користи за
детекција на многу испарливи аналити.
❖ Електрохемиски детектор
➢ Електрохемискиот детектор е многу осетлив на супстанции кои учествуваат
во оксидоредукциски процеси, како на пример, феноли, ароматични амини,
пероксиди, алдехиди, кетони итн. Вообичаено, овој детектор претставува
триелектроден систем, кој се состои од: Ag/AgCl референтна електрода,
помошна електрода од не’рѓосувачки челик и индикаторска електрода околу
која, на определен потенцијал, поминува елуатот. Струјата се мери меѓу
индикаторската и помошната електрода. Индикаторските електроди се
направени од стаклест графит за супстанции кои се оксидираат, односно од
капка жива за супстанции кои се редуцираат. Ваквите детектори се осетливи
на промени на протокот и температурата.
ДЕТЕКТОРИ ВО СИСТЕМОТ ЗА HPLC – ДЕТЕКТОР НА
ИНДЕКС НА ПРЕКРШУВАЊЕ И ФЛУОРЕСЦЕНТЕН ДЕТЕКТОР
❖ Детектор на индекс на прекршување
➢ Принципот на функционирање на овој тип на детектор се базира на промена на
индексот на прекршување, која настанува кога аналитот ќе помине преку ќелијата
за примерок, за разлика од референтната ќелија, која останува наполнета со
мобилната фаза. Овој универзален детектор се одликува дури и со помала
селективност во споредба со селективноста на евапоративниот детектор со
расејување на светлината. Дополнително, детекторот на индексот на
прекршување е многу чувствителен на промени на температурата, поради што,
неопходно е термостатирање. Исто така, чувствителен е и на промена на
притисокот, протокот и составот на мобилната фаза, што го прави неупотреблив
при градиентно елуирање.
❖ Флуоресцентен детектор
➢ Принципот на функционирање на флуоресцентниот детектор се базира на
флуоресцентна емисија, која настанува како резултат на ексцитација на
флуоресцентна молекула на соодветна бранова должина. Како таков, овој тип на
детектор не реагира на промени на температурата, притисокот и протокот, па
според тоа, може да се користи при градиентно елуирање. Заради можноста да
издвојува супстанција која флуоресцира, меѓу други супстанции кои не
флуоресцираат, овој тип на детектор се одликува и со висок степен на
селективност. Иако флуоресцентниот детектор е многу чувствителен, сепак,
неговиот одговор е линеарен само при определен опсег на концентрации.
Поголем дел од супстанциите природно не флуоресцираат, што претставува
сериозен недостаток на овој тип на детектор. Ваквиот недостаток се решава со
преведување на компонентите што не флуоресцираат, во форма што
флуоресцира, со помош на реагенси за дериватизација.
ПРИМЕНА НА ТЕЧНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД ВИСОК
ПРИТИСОК
❖ Течната хроматографија под висок притисок наоѓа широка
примена како техника за:
➢ обезбедување точни и прецизни квантитативни анализи на
фармацевтските производи, при што, за оваа цел, течната
хроматографија под висок притисок се користи во
комбинација со UV/VIS детектор, а ваквиот систем е еден од
најчесто употребуваните во фармацевтската индустрија;
➢ мониторирање на стабилноста на чисти фармаколошки
активни компоненти или пак, фармаколошки активни
компоненти во состав на фармацевтски формулации, со
можност за квантификација на деградационите продукти;
➢ одредување на лекови и нивни метаболити во биолошки
течности;
➢ одредување на партициониот коефициент и pKa –
вредностите на лековите, вклучително и лековите врзани за
протеини.
ПРИМЕНА НА ТЕЧНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД ВИСОК
ПРИТИСОК ВО КВАНТИТАТИВНИТЕ АНАЛИЗИ
❖ HPLC претставува најчесто употребувана техника за анализа на лекови во
формулации.
❖ Навидум, ваквите анализи изгледаат доста комплицирано, но споредени со
анализите на лекови во биолошки течности или пак, анализите за
разјаснување на деградационите патишта на лековите, овој тип на
анализи се значително поедноставни.
❖ При анализа на лекови во формулации, во текот на анализата може да
дојде до појава на интерференции кои потекнуваат од присутните
конзерванси и бои во формулацијата или пак, од потенцијалните
деградациони продукти на лекот.
❖ Одредени формулации може да содржат повеќе од една фармаколошки
активна компонента, па анализата на овие формулации претставува
исклучителен предизвик бидејќи различните фармаколошки активни
компоненти поседуваат различни хемиски карактеристики, поради што,
истите се елуираат во различни временски интервали од колоната од
системот за HPLC.
❖ Анализите на лековите во формулации со помош на HPLC може да бидат:
➢ анализи базирани на калибрација во однос на надворешен стандард;
➢ анализи базирани на калибрација во однос на внатрешен стандард.
АНАЛИЗИ БАЗИРАНИ НА КАЛИБРАЦИЈА ВО ОДНОС НА
НАДВОРЕШЕН СТАНДАРД: ТЕОРЕТСКИ ОСНОВИ
❖ Честопати, анализата на одреден лек во дадена формулација со
помош на HPLC, се изведува во однос на надворешен стандард за
лекот кој е предмет на анализа.
❖ Инструментацијата за овој тип на анализи, сама по себе,
овозможува висока прецизност и одвојување на лекот од
формулациониот матрикс.
❖ Притоа, доколку лекот е комплетно одвоен од формулациониот
матрикс, површината под пикот, која соодветствува со позната
количина на формулацијата, директно се споредува со
калибрациона крива, конструирана со помош на серија од раствори
кои содржат различни концентрации на чист стандард на аналитот.
❖ Имајќи предвид дека во анализите од областа на контрола на
квалитет, содржината на формулацијата не варира повеќе од ± 10 %
од декларираната содржина, при анализа на лек во формулација,
може да се користи и единечна точка на калибрација.
❖ Според Американската администрација за храна и лекови, при
анализа на лек во формулација, калибрацијата треба да се врши во
опсег од ± 20 % од очекуваната концентрација на лекот во
формулацијата.
ПРИМЕР ЗА АНАЛИЗИ БАЗИРАНИ НА КАЛИБРАЦИЈА ВО ОДНОС
НА НАДВОРЕШЕН СТАНДАРД: АНАЛИЗА НА ПАРАЦЕТАМОЛ
ТАБЛЕТИ СО ПОМОШ НА КАЛИБРАЦИОНА КРИВА
❖ Пример за анализа базирана на калибрација во однос на надворешен
стандард претставува анализата на парацетамол таблети со помош на
калибрациона крива.
❖ Парацетамол таблетите содржат 500 mg парацетамол и 5 mg
фенилпропаноламин.
❖ Дури и без ефикасна хроматографска резолуција, малата количина на
фенилпропаноламин, присутна во парацетамол таблетите, може да се
отфрли бидејќи специфичната апсорбанца на фенилпропаноламинот на
бранова должина од 243 nm, користена во текот на оваа анализа, изнесува
4, за разлика од специфичната апсорбанца на парацетамолот на оваа
бранова должина, која изнесува 668.
❖ За овој тип на анализа, во системот за HPLC се користи колона со
реверзно – фазно пакување, а како мобилна фаза се користи смеса од
0,05 M оцетна киселина и ацетонитрил во меѓусебен сооднос 85:15.
❖ До колку е повисока содржината на вода во мобилната фаза, до толку
повеќе колоната ќе го задржува парацетамолот бидејќи во овој случај,
мобилната фаза ќе биде помалку кисела, а како резултат на тоа, се
намалува можноста за јонизација на фенолната група на парацетамолот
(pKа = 9,5).
❖ Екстрактот од таблетата треба да биде доволно разреден за да истиот
влегува во опсегот на UV детекторот.
НА НАДВОРЕШЕН СТАНДАРД: АНАЛИЗА НА ПАРАЦЕТАМОЛ
ТАБЛЕТИ СО ПОМОШ НА КАЛИБРАЦИОНА КРИВА
АНАЛИЗИ БАЗИРАНИ НА КАЛИБРАЦИЈА ВО ОДНОС НА
ВНАТРЕШЕН СТАНДАРД: ТЕОРЕТСКИ ОСНОВИ
❖ Во случај кога инструментот, потребен за спроведување на анализата, дава
висока прецизност или пак, кога приносот на аналитот во текот на
анализата е добар, нема потреба од примена на внатрешен стандард.
❖ Пример за инструмент кој дава висока прецизност, но само за одредени
примероци, е HPLC инструментот, а примери за формулации кај кои може
да се јават проблеми поврзани со приносот на аналитот, се современите
системи за испорака на лекот, кои вообичаено се базираат на полимерни
матрикси во кои лекот е диспергиран, но и мастите и кремите, кај кои е
потребна поекстензивна екстракција на аналитот пред анализата, со цел да
се надминат проблемите поврзани со неговиот принос.
❖ Внатрешниот стандард претставува сродна молекула на аналитот, која се
додава во формулацијата, пред екстракција на аналитот од истата.
❖ Квантификација на аналитот е возможна само ако се воспостави фактор за
аналитот во однос на внатрешниот стандард. На пример, ваков фактор
може да претставува односот помеѓу површините на хроматографските
пикови, добиени од еднакви количества на аналит и внатрешен стандард.
Идеално, овој однос треба да изнесува 1, ако навистина станува збор за
еднакви количества аналит и внатрешен стандард. Факторот може да се
базира на единечна точка на калибрација, каков што е случајот со сите
анализи од овој тип, содржани во Британската фармакопеја или пак, може
да се базира на конструкција на цела калибрациона крива.
НА ВНАТРЕШЕН СТАНДАРД: АНАЛИЗА НА ХИДРОКОРТИЗОН
КРЕМ СО ЕДИНЕЧНА ТОЧКА НА КАЛИБРАЦИЈА
❖ HPLC е техника од избор за сепарација на кортикостероиди. Притоа, за
постигнување ефикасна сепарација, потребно е да се користи колона со реверзно –
фазно пакување и смеса од метанол и вода во соодветен сооднос како мобилна
фаза.
❖ Анализата на хидрокортизон крем со единечна точка на калибрација е
модификација на фармакопејската анализа на оваа формулација според Британската
фармакопеја. Во оваа анализа, хидрокортизонот се квантифицира во однос на
бетаметазонот, кој се користи како внатрешен стандард. Хемиските структури на
овие соединенија се многу слични, но имајќи предвид дека бетаметазонот е
полипофилен, истиот од колоната би се елуирал по хидрокортизонот.
❖ Во текот на анализата, подобро е внатрешниот стандард да се додаде на почетокот
од екстракцијата, отколку по нејзиното завршување. На овој начин, потенцијалните
загуби кои би можеле да се јават при подготовката на примерокот, целосно се
компензираат.
❖ Кога станува збор за креми, екстракцијата на аналитот е потребна од причина што
присуството на масни ексципиенси би можело да предизвика блокирање на колоната.
❖ При екстракцијата, кортикостероидите се доволно поларни за да останат во слојот од
метанол и вода, а поради нивната слаба растворливост во хексан, во овој слој,
единствено остануваат масните ексципиенси. За да се спречи формирањето емулзија
помеѓу двата слоја, во текот на екстракцијата, потрено е да се додаде NaCl.
❖ Покрај екстрактот со аналитот, потребно е да се подготви и втор раствор во кој не се
додава внатрешен стандард. Имено, овој раствор се подготвува за да се провери
дали во примерокот за анализа останале ексципиенси кои би можеле да
интерферираат.
НА ВНАТРЕШЕН СТАНДАРД: АНАЛИЗА НА ХИДРОКОРТИЗОН
КРЕМ СО ЕДИНЕЧНА ТОЧКА НА КАЛИБРАЦИЈА
АНАЛИЗА НА ПЕПТИДИ СО ПОМОШ НА ТЕЧНА
❖ Кога станува збор за сепарација на макромолекули, како на
пример, пептиди, за да се олесни процесот на партиционирање
на овие молекули во стационарната фаза, потребно е да се
користат колони со хроматографски пакувања со широки пори.
За таа цел, најчесто користени колони се колоните со реверзно
– фазно пакување, при што димензијата на порите на
октадецилсилан силика гелот изнесува 0,0003 µm.
❖ Имајќи предвид дека хромофорите во состав на пептидите се
многу слаби, потребно е UV детекторот од системот за HPLC да
биде подесен на пократки бранови должини.
❖ Мобилните фази кои се употребуваат за ваков тип на сепарација,
се многу слични како и мобилните фази кои се употребуваат за
сепарација на мали молекули со помош на колони со реверзно –
фазно пакување.
❖ На пример, во анализата на инсулин според Европската
фармакопеја, во функција на мобилна фаза се користи смеса од
фосфатен пуфер со рН = 2,3 и ацетонитрил, а детекцијата се
врши со помош на UV детектор на бранова должина од 214 nm.
АНАЛИЗА НА ПЕПТИДИ СО ПОМОШ НА ТЕЧНА
❖ Како онечистувања во состав на пептидните лекови може да се јават
одредени сродни пептиди.
❖ И покрај тоа што сродните пептиди може да се разликуваат само по
една или две аминокиселини во однос на главниот терапевтски
пептид или пак, во формулацијата може да бидат присутни во многу
мала количина, сепак, ваквите сродни пептиди може да поседуваат
висок биолошки потенцијал и како резултат на тоа, да предизвикаат
посериозни проблеми при администрација во човековиот организам.
❖ Според Британската фармакопеја, при анализа на хуманиот
инсулин, потребно е да се направи тест за присуство на свински
инсулин, кој од хуманиот инсулин се разликува само по една
аминокиселина. Притоа, во тестот е наведено дека факторот на
резолуција помеѓу хроматографските пикови, добиени за хуманиот
и свинскиот инсулин, треба да изнесува минимум 1,2, доколку тест
растворот содржи еднакви количества од двата типови на инсулин.
❖ Како резултат на зголемената употреба на терапевтските пептиди,
се наметнува и потребата од вклучување на различни
фармакопејски методи, базирани на хроматографија, кои би
овозможиле карактеризација на ваквите пептиди.
ДЕРИВАТИЗАЦИЈА ВО АНАЛИЗИТЕ БАЗИРАНИ НА
ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД ВИСОК ПРИТИСОК
❖ Дериватизацијата во фармацевтските анализи најчесто се користи за да се
подобри селективноста на биоаналитичкиот метод. Меѓутоа, во
одредени случаи, неопходно е да се примени метод на дериватизација со
цел да се детектираат компоненти кои не поседуваат хромофори.
❖ На пример, аминогликозидните антибиотици не поседуваат хромофори и
претставуваат смеси од неколку компоненти. Токму поради овие причини,
истите пред да се анализираат, неопходно е да се дериватизираат.
❖ Според Британската фармакопеја, анализата на неомицин капките за очи
вклучува проверка на идентитетот на неомицин В и неомицин С, кои
претставуваат составен дел од оваа формулација, преку нивна
дериватизација со флуородинитробензен, при што се добиваат деривати
кои лесно може да се детектираат со помош на UV детектор.
❖ Со процесот на дериватизација, до одреден степен се намалува поларноста
на високополарните амино шеќери, при што ваквите молекули понатаму
може да се анализираат со помош на колона со нормално – фазно
пакување и смеса од хлороформ и етанол како мобилна фаза.
❖ Во овој случај, добро е што се употребува колона пакувана со силика гел
бидејќи истата овозможува вишокот на неполарен флуородинитробензен да
се елуира пред поларните дериватизирани гликозиди.
❖ Дополнително, дериватизационите реакции широко се користат и при
анализи на аминокиселини.
ДЕРИВАТИЗАЦИЈА ВО АНАЛИЗИТЕ БАЗИРАНИ НА
ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД ВИСОК ПРИТИСОК
МОДИФИКАЦИЈА НА HPLC: ХИРАЛНА ТЕЧНА
❖ Хиралната HPLC се базира на
формирање транзиторни
дијастереоизомерни комплекси
со хиралната стационарна фаза,
а како резултат на тоа,
енантиомерите, кои генерално,
идентично партиционираат во
нехирална стационарна фаза, ќе
партиционираат различно во
хиралната стационарна фаза.
❖ Во основа, енантиомерите не
може да стапат на ист начин во
интеракција со трите точки на
контакт од површината на
хиралната стационарна фаза, па
како резултат на тоа, истите ќе се
елуираат во различни временски
интервали од колоната.
❖ Често употребувана хирална стационарна фаза е стационарната фаза,
базирана на присуство на циклодекстрини, врзани за површината на
силика гелот.
❖ Циклодекстрините се состојат од 6, 7 или 8 глукозни единици, меѓусебно
поврзани во форма на прстен, при што се формираат празнини во кои
навлегува хидрофобниот дел од аналитот.
❖ За постигнување на ефикасно партиционирање на аналитот во
стационарната фаза, хиралниот центар од аналитот мора да се изедначи со
хиралните центри на позиција 2 и 3 од глукозните единици. Потоа,
хидроксилните групи, врзани за хиралните центри од глукозните единици,
стапуваат во интеракција со атомските групи, врзани за хиралниот центар
од аналитот, според моделот на трите точки на контакт.
❖ Други примери за хирални стационарни фази кои се користат во хиралната
HPLC, се стационарните фази, базирани на присуство на протеини,
целулоза триацетат, аминокиселини комплексирани со бакар итн.
❖ Постојат две други стратегии за сепарација на енантиомери. Првата
вклучува додавање хирални модификатори на мобилната фаза, а
втората стратегија вклучува формирање деривати со хирални чисти
реагенси, кои понатаму би можеле да произведат различни
дијастереоизомери кога ќе реагираат со спротивните енантиомери на една
иста компонента.
МОДИФИКАЦИЈА НА HPLC: ЈОНСКА
❖ Покрај фармаколошки активната, во фармацевтските формулации може да се
забележат и одредени анјонски и катјонски компоненти. Со цел обезбедување на
квалитетна фармацевтска анализа, неопходно е јонските компоненти да бидат
отстранети. Техника од избор за отстранување на анјонски или катјонски компоненти
од примерок, претставува јонската хроматографија.
❖ Во овој тип на хроматографија, колоните се пакуваат со јоноизменувачки смоли,
односно полимерни соединенија, кои на површината поседуваат анјонски или
катјонски групи, способни да стапат во интеракција со јоните на аналитот.
❖ Доколку станува збор за катјонска размена, во функција на мобилна фаза се користи
водена метансулфонска киселина, а доколку станува збор за анјонска размена, во
функција на мобилна фаза се користи воден натриум хидроксид.
❖ Притоа, до колку е поголем полнежот на јонот, до толку ќе биде подолго
ретенционото време на истиот тој јон. На пример, Ca2+ јоните ќе се елуираат после
Na+ јоните. Исто така, до колку е поголем јонскиот радиус на даден јон, до толку ќе
биде подолго ретенционото време на истиот тој јон. На пример, поголемите Ca2+ јони
ќе се елуираат после помалите Mg2+ јони.
❖ Детекторот во јонската хроматографија ја мери спроводливоста на мобилната фаза
кога истата ќе помине низ него. Притоа, кога анјон или катјон ќе помине преку
детекторот, спроводливоста на мобилната фаза ќе расте. Со цел правилно мерење
на спроводливоста на мобилната фаза, потребно е присутните анјони и катјони во
мобилната фаза, соодветно да бидат отстранети со помош на хемиски потиснувач.
Како резултат на тоа, единствено анјоните и катјоните, присутни во примерокот за
анализа, ќе предизвикуваат зголемување на спроводливоста.
МОДИФИКАЦИЈА НА HPLC: ГЕЛ – ФИЛТРАЦИОНА
❖ Во последните години, за одредување на молекулската маса на
високомолекуларни соединенија, како техника од избор се користи
гел – филтрационата хроматографија.
❖ Механизмот на партиционирање на аналитот во стационарната
фаза, пред сѐ, зависи од степенот до кој аналитот ќе навлезе во
порите од стационарната фаза, главно, порозен полимер (гел).
❖ Притоа, најголемите молекули не навлегуваат во порите и како
резултат на тоа, се елуираат први, а најмалите молекули
слободно навлегуваат во порите, во нив се задржуваат извесно
време и на крај, се елуираат последни.
❖ За правилно одредување на молекулската маса, потребно е
колоните од системот за гел – филтрациона хроматографија, да
бидат соодветно калибрирани со помош на полимерни стандарди
со позната молекулска маса.
❖ Имајќи предвид дека постојат разлики во тридимензионалниот
облик, па колоната за одредување на молекулската маса на одреден
тип на полимер, може да се калибрира со помош на друг полимерен
стандард, неопходно е да се направат корекции во поглед на
вискозноста на аналитот.
МОДИФИКАЦИЈА НА HPLC: ГЕЛ – ФИЛТРАЦИОНА
ПРЕДНОСТИ НА ТЕЧНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД
❖ Кога станува збор за предностите на HPLC, пред сѐ, треба да се
напомене дека:
➢ од една страна, можноста за лесна контрола на инструментот, а
од друга страна, прецизното инјектирање на примерокот за
анализа, обезбедуваат висока прецизност при употреба на
HPLC за квантитативни анализи;
➢ HPLC претставува хроматографска техника која бележи
најинтензивен развој во однос на останатите хроматографски
техники, па според тоа, колоните, детекторите и софтверската
контрола, кои се применуваат во системот за HPLC, ќе бидат
многу пософистицирани во споредба со ваквите составни
делови на останатите хроматографски системи;
➢ HPLC лесно може да се автоматизира;
➢ широкиот опсег на комерцијално достапни колони и детектори,
обезбедува лесно прилагоување на селективноста на методот;
➢ споредено со GC, кај HPLC не постои ризик од појава на
деградација на примерокот бидејќи во текот на оваа
хроматографска процедура, нема потреба од загревање.
НЕДОСТАТОЦИ НА ТЕЧНАТА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД
❖ Покрај предностите, HPLC поседува и одредени

недостатоци. Имено:
➢ сѐ уште постои потреба од сигурен и евтин детектор, кој би
можел да детектира и компоненти кои не поседуваат
хромофори;
➢ пред да се анализираат со помош на HPLC, фармаколошки
активните компоненти треба да бидат екстрахирани од
нивните формулациони матрикси;
➢ на крајот од хроматографската процедура се исфрла големо
количество на органски растворувачи, што од една страна
не е економски исплатливо, а од друга страна се загадува
животната средина.
МАСЕНА СПЕКТРОМЕТРИЈА (MS);

4 КАПИЛАРНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА СО
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ (CE)

МАСЕНА СПЕКТРОМЕТРИЈА
(MASS SPECTROMETRY – MS)
ВОВЕД ВО МАСЕНАТА СПЕКТРОМЕТРИЈА
 Масената спектрометрија претставува моќна аналитичка техника,
која може да се користи за:
 квантификација на познати молекули;
 идентификација на непознати молекули во даден примерок за анализа;
 разјаснување на структурата и хемиските карактеристики на различни
молекули.
 На пример, течната хроматографија во комбинација со масен
детектор, претставува најдобрата аналитичка техника за
проучување на одредени макромолекули во примерок за анализа,
односно најефективната алатка за проучување на хемиската
структура на таквите макромолекули.
 Во основа, масената спектрометрија се состои од два посебни
процеси и тоа:
 генерирање на јони (трансформација на молекулите од аналитот во јони,
со или без нивна фрагментација);
 сепарирање на јони (одредување на односот помеѓу масата и полнежот на
произведените јони, врз основа на кој, истите се сепарираат).
ПРИНЦИП НА МАСЕНАТА СПЕКТРОМЕТРИЈА
 Принципот на масената спектрометрија се темели на
трансформација на неутралните молекули од примерокот
за анализа во соодветни јони – процес означен како
јонизација, при што, ваквиот процес, пред сѐ, зависи од
физичко – хемиските карактеристики на неутралните
молекули.
 Преку континуирано следење како траекториите на
произведените јони во регион со висок вакуум, реагираат
на различни комбинации од електрични или магнетни
полиња, може да се одреди масата на секој јон,
поединечно.
 Врз основа на одредениот однос помеѓу масата и
полнежот (m/z) на секој јон, поединечно, јоните меѓусебно
се раздвојуваат.
ГЕНЕРИРАЊЕ НА ЈОНИ (ЈОНИЗАЦИЈА)
 Изборот на јонизациона метода, пред сѐ, зависи од физичко –
хемиските карактеристики на аналитот од интерес
(испарливост, молекулска маса, термолабилност), но и од
комплексноста на формулациониот матрикс во кој се наоѓа
аналитот од интерес.
 Јонизационите методи може да се поделат во две групи:
 jонизациони методи кои бараат примерокот за анализа да биде
во гасовита фаза, пред да се примени процесот на јонизација;
 jонизациони методи кои се применуваат на примероци за
анализа кои поседуваат ниска испарливост и голема
молекулска маса.
 Најчесто применуван метод од првата група е електронската
јонизација (EI), а од втората група, најчесто применувани
методи се електроспреј јонизацијата (ESI) и јонизацијата со
помош на матрикс / ласерска десорпција (MALDI).
ЕЛЕКТРОНСКА ЈОНИЗАЦИЈА (EI)
 Електронската јонизација (EI) претставува јонизациона метода, која
генерално, се користи во комбинација со GC.
 На почетокот од оваа метода, аналитот се воведува во изворот на
инструментот со помош на загревање на крајот од сондата, при што
аналитот испарува. Ваквиот процес е овозможен поради високиот вакуум
во самиот инструмент.
 Штом ќе се создаде пареа од аналитот, истиот веднаш се бомбардира со
електрони од рениумски или волфрамови филаменти, така што,
електроните се забрзуваат кон позитивен таргет со енергија од +70 eV.
 Аналитот, кој сега се наоѓа помеѓу филаментот и таргетот, подлежи на
електронска јонизација, па поради губењето на електрон од молекулата на
аналитот, истата ќе резултира со формирање на молекулски јон – M+•:
M + e → M+• + 2e
 Имајќи предвид дека употребените електрони за јонизација, поседуваат
многу поголема енергија во споредба со енергијата на врските во
молекулата на аналитот, голема е веројатноста дека ќе настане
молекуларна фрагментација на аналитот.
 Молекулските јони и молекуларните фрагменти од аналитот, со помош на
одбивач со ист полнеж, како и нивниот, прво се насочуваат кон отвор на
плоча, преку кој, понатаму продолжуваат кон инструментот за
сепарирање на јони.
ЕЛЕКТРОНСКА ЈОНИЗАЦИЈА (EI)
ЕЛЕКТРОСПРЕЈ ЈОНИЗАЦИЈА (ESI)
 Електроспреј јонизацијата (ESI) претставува најчесто користена
јонизациона метода бидејќи истата е компатибилна со HPLC.
 На почетокот, елуентот од системот за HPLC поминува преку кварцна или
метална игла, на која се применува висок електричен потенцијал.
 Доколку применетиот електричен потенцијал е позитивен, негативните јони
од елуентот се задржуваат за внатрешната површина од иглата, а
позитивно наелектризираните капки, се распрскуваат кон загреаната
капилара. Исто така, со помош на ESI може да се произведуваат и
негативно наелектризирани капки, доколку на иглата се применува
негативен електричен потенцијал, кој би ги задржувал позитивните јони на
внатрешната површина на самата игла.
 Под дејство на коаксијален проток на азот, распрсканите капки
започнуваат да испаруваат и во текот на овој процес, настануваат
наелектризирани судири помеѓу нив, при што истите се распаѓаат и се
добиваат гасовити јони.
 Гасовитите јони се насочуваат кон влезот на загреана капилара со помош
на негативен потенцијал, кој дејствува на самиот влез од капиларата.
 По должината на капиларата постои бавен проток на атмосферски
притисок и висок вакуум, при што, гасовитите јони финално се насочуваат
кон инструментот за сепарирање на јони.
ЕЛЕКТРОСПРЕЈ ЈОНИЗАЦИЈА (ESI)
ЈОНИЗАЦИЈА СО ПОМОШ НА МАТРИКС / ЛАСЕРСКА
ДЕСОРПЦИЈА (MALDI)
 Јонизациониот метод MALDI (јонизација со помош на матрикс /
ласерска десорпција) се темели на употреба на азотен ласер, кој
предизвикува јонизација на молекулите од аналитот, пред да
настане сепарирање на произведените јони од аналитот во
масениот спектрометар.
 Вообичаено, оваа јонизациона метода се користи во комбинација со
сепарацијата базирана на времето на прелетување (TOF) на
генерираните јони.
 Со цел аналитот ефикасно да биде јонизиран, потребно е да се
раствори во матрикс, кој пак, ќе го апсорбира UV зрачењето,
произведено од азотниот ласер, на бранова должина од околу 337
nm. Карактеристичен пример за таков тип на матрикс претставува
дихидроксибензоевата киселина.
 Најпрво, растворот на аналитот се меша со растворот на матриксот,
при што, оваа смеса се нанесува на соодветна метална плоча.
 Пред да биде внесена во инструментот, металната плоча се остава
да се исуши, а потоа зракот од азотниот ласер се насочува кон
исушената смеса на површината од металната плоча и како
резултат на тоа, настанува јонизација на молекулите од аналитот.
ЈОНИЗАЦИЈА СО ПОМОШ НА МАТРИКС / ЛАСЕРСКА
ДЕСОРПЦИЈА (MALDI)
СЕПАРИРАЊЕ НА ЈОНИ
 Најчесто, за сепарирање на јони може да се користат три
техники:
1. Магнетен сектор масена спектрометрија;
2. Сепарација базирана на времето на прелетување (TOF)
на јони;
3. Сепарација базирана на заробување на јони.
МАГНЕТЕН СЕКТОР МАСЕНА СПЕКТРОМЕТРИЈА –
ИНСТРУМЕНТ БАЗИРАН НА МАГНЕТЕН СЕКТОР
 Инструментот базиран на магнетен сектор вклучува употреба
на одбивач на генерираните јони, кој поседува ист полнеж, како
и полнежот на самите јони.
 По одбивањето на јоните, истите, преку електростатски леќи, се
забрзуваат кон електростатско поле со тесен опсег на
кинетички енергии. На крај, јоните финално се насочуваат во
магнетно поле.
 Во зависност од односот помеѓу масата и полнежот (m/z), секој
јон во магнетното поле, зазема соодветна траекторија, така што
поголемите јони, помалку се отклонуваат од магнетното поле,
односно:
каде: H – јачина на магнетно поле; r – радиус на кружната

траекторија на јонот; V – забрзувачки напон.
ИНСТРУМЕНТ БАЗИРАН НА МАГНЕТЕН СЕКТОР
КВАДРИПОЛЕН ИНСТРУМЕНТ
 Слично како и инструментот базиран на магнетен сектор, така и
квадриполниот инструмент, за сепарирање на генерираните јони, го
користи односот помеѓу масата и полнежот (m/z) на секој јон, поединечно.
 Единствената разлика е во тоа што, принципот на функционирање на
инструментот базиран на магнетен сектор, се темели на употреба на
магнетно поле, додека принципот на функционирање на квадриполниот
инструмент, се темели на употреба на две електрични полиња, односно
еднонасочна струја и радиофрекфентно поле, кои се применуваат под
точно одреден агол, едно во однос на друго.
 Како резултат на примена на две ортогонални електростатски полиња под
точно одреден агол, доаѓа до создавање на резонантна фрекфенција за
секој јон со специфичен однос помеѓу неговата масата и неговиот полнеж
(m/z). Според тоа, јоните кои резонираат на фрекфенцијата на квадриполот,
многу лесно ќе поминат преку него и на тој начин ќе бидат детектирани.
 Имајќи предвид дека со помош на квадриполниот инструмент може да се
опфатат јони со поширок опсег на кинетички енергии во споредба со
инструментот базиран на магнетен сектор, може да се заклучи дека
квадриполниот инструмент се одликува со повисока чувствителност.
КВАДРИПОЛЕН ИНСТРУМЕНТ
СЕПАРАЦИЈА БАЗИРАНА НА ВРЕМЕТО НА
ПРЕЛЕТУВАЊЕ (TOF) НА ЈОНИТЕ
 Принципот на сепарацијата базирана на времето на прелетување
(TOF) на јоните се темели на фактот што помалите јони, побрзо се
движат во споредба со поголемите јони, а како резултат на тоа,
помалите јони побрзо ќе дојдат во контакт со детекторот.
 Сепарацијата базирана на TOF на јоните, овозможува издвојување
на сигналите од инструментот за генерирање на јони. Имајќи
предвид дека на различни сетови јони им е потребно различно
време за да дојдат во контакт со детекторот, може да се заклучи
дека со издвојувањето на посебни сигнали за посебни сетови јони,
се оневозможува појавата на преклопување на времето на
прелетување на различните сетови јони.
 По напуштањето на инструментот за генерирање на јони,
произведените јони поседуваат различни кинетички енергии. Како
резултат на тоа, се јавуваат проблеми поврзани со резолуцијата на
инструментот за сепарирање на јони. Токму поради оваа причина,
постарите инструменти за сепарирање јони, произведувале
пошироки пикови за масата на единечен јон.
 Проблемот поврзан со резолуцијата на инструментот за
сепарирање на јони, бил надминат со воведување на
дополнителен инструмент, означен како рефлектрон. Ваквиот
инструмент се спротивставува на движењето на јоните, така што
истите ги пренасочува во спротивниот правец на движење.
 За разлика од јоните кои се движат побавно, јоните кои се движат
побрзо, подлабоко ќе навлезат во рефлектронот, па според тоа,
слободно може да се заклучи дека ефектот на задоцнување,
единствено ќе биде карактеристичен за побрзите јони.
 Пренасочувањето на јоните во спротивниот правец на движење,
ефективно ја зголемува траекторијата на јоните, а како резултат
на тоа, се зголемува и резолуцијата на инструментот за
сепарирање на јони.
 Дополнително, резолуцијата на овој инструмент, може да се
зголеми со употреба на т.н. W–конфигурација, која овозможува
јоните да се движат напред – назад, двапати минувајќи во два
рефлектрони.
СЕПАРАЦИЈА БАЗИРАНА НА ЗАРОБУВАЊЕ НА ЈОНИ
 Јоните се воведуваат во замката, а потоа се заробуваат во
радиофрекфентно поле, кое се применува на кружна електрода.
 Замката се полни со хелиум, кој ја намалува кинетичката енергија
на јоните.
 Преку примена на еднонасочна струја на електродата, јоните се
исфрлуваат од замката, така што при исфрлувањето на јоните,
предвид треба да се земе нивната маса, со цел да се утврди
специфичниот редослед, според кој, истите ќе бидат исфрлени.
 Доколку е потребно да се направи фрагментација на точно одреден
јон, неопходно е замката да се прилагоди, така што ќе ги исфрла
сите јони, освен јонот од интерес.
 Понатаму, напонот на радиофрекфентното поле се менува и како
резултат на тоа, јонот од интерес се доведува во возбудена
состојба, при што, истиот започнува да се судира со атомите на
хелиум и на тој начин, во замката се добиваат посакуваните јонски
фрагменти.
 Во продолжение, произведените јонски фрагменти од јонот од
интерес, може да се исфрлат од замката и финално да се
детектираат.
СЕПАРАЦИЈА БАЗИРАНА НА ЗАРОБУВАЊЕ НА ЈОНИ
ПРИМЕНА НА МАСЕНАТА СПЕКТРОМЕТРИЈА
 Масената спектрометрија наоѓа широка примена и тоа:
 обезбедува високо специфичен метод за одредување или
потврдување на идентитетот или структурата на лековите
или пак, суровините кои се користат во нивното
производство;
 во комбинација со гасната (GC–MS) или пак, течната
хроматографија (LC–MS), обезбедува методи за
карактеризација на онечистувања во лекови или
формулациони матрикси;
 GC–MS и LC–MS обезбедуваат високо чувствителни и
специфични методи за одредување на лекови и нивни
метаболити во биолошки течности или ткива;
 претставува важна алатка во протеомиката, наука која се
занимава со проучување на протеините, со акцент на
нивната структура и функција, која пак, е значајна за
откривањето на нови лекови.
ПРЕДНОСТИ НА МАСЕНАТА СПЕКТРОМЕТРИЈА
 Кога станува збор за предностите на MS, пред сѐ, треба да
се напомене дека:
 MS со висока резолуција во комбинација со хроматографска
сепарација, обезбедува метод за брза идентификација на
онечистувањата во трагови, односно детекција на
елементарните компоненти во состав на фармацевтската
формулација;
 имајќи ги предвид чувствителноста и селективноста на MS,
може да се заклучи дека истата претставува метод од избор
кога станува збор за мониторирање на лекови и нивни
метаболити во биолошки течности;
 со текот на времето, MS базирана на електроспреј
јонизација, односно MS базирана на времето на
прелетување на јоните, се издигнуваат како техники од
избор кога станува збор за контролата на квалитет на
терапевтските антитела и терапевтските пептиди.
НЕДОСТАТОЦИ НА МАСЕНАТА СПЕКТРОМЕТРИЈА
 Покрај предностите, MS поседува и одредени недостатоци.
Имено:
 во моментот, MS не се користи во рутинската контрола на
квалитет;
 потребната инструментација за изведба на MS е скапа, бара
регуларно одржување и со неа може да управува
единствено високо обучен персонал.
 Како и да е, недостатоците поврзани со инструментацијата
за изведба на MS постепено се надминиваат бидејќи сѐ
почесто се употребуваат инструменти со отворен
пристап.
КАПИЛАРНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА СО
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ (HIGH–
PERFORMANCE CAPILLARY
ELECTROPHORESIS – CE)
ПРИНЦИП НА КАПИЛАРНАТА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА СО
 Принципот на раздвојување на компонентите од примерокот за
анализа со помош на СЕ, се темели на примена на висок
потенцијал (10 – 30 kV) во тесна фузирана силика капилара,
исполнета со соодветна мобилна фаза.
 Во состав на мобилната фаза задолжително треба да биде
вклучен електролит, а покрај тоа, мобилната фаза, вообичаено,
содржи и хидрофилна компонента.
 Компонентите од примерокот за анализа мигрираат во
применетото електрично поле, така што брзината на движење
на овие компоненти зависи од нивниот полнеж и нивниот јонски
радиус.
 Дури и неутралните компоненти од примерокот за анализа,
мигрираат преку капиларата, благодарение на постоењето на
електроосмотски проток, кој генерално, ги придвижува кон
катодата.
ТЕОРЕТСКИ ОСНОВИ НА КАПИЛАРНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА СО
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ – ЕЛЕКТРОФОРЕТСКА ПОДВИЖНОСТ
 CE е една од најчесто употребуваните сепарациони техники во

фармацевтските анализи и како таква, во однос на генералната
примена, претставува директен ривал на HPLC.
 Принципот на раздвојување на компонентите од примерокот за
анализа со помош на CE, се темели на нивните различни
брзини на движење во дадено електрично поле.
 Притоа, брзината на движење на определен јон може да се
претстави со следново равенство:
каде: ν – брзина на движење на јонот; μe – електрофоретска

подвижност на јонот; E – применето електрично поле.
 Електричното поле зависи од должината на употребената
капилара и јачината на применетиот потенцијал.
 Електрофоретската подвижност (µе) на сферичен јон

може да се претстави со следново равенство:
каде: q – полнеж на јонот; η – вискозност на медиумот во

кој се одвива СЕ; r – радиус на јонот.
 Од равенството може да се изведат следниве заклучоци:
 до колку е поголем полнежот на јонот, до толку ќе биде
поголема и неговата електрофоретска подвижност;
 до колку е помал јонот, до толку ќе биде поголема неговата
електрофоретска подвижност;
 до колку повеќе јонот се доближува до идеален сферичен
облик, до толку ќе биде поголема и неговата
електрофоретска подвижност.
 Електрофоретската подвижност на јоните зависи и од нивните pKa –
вредности. Имено, до колку е поголем степенот на јонизација на јонот, до
толку ќе биде поголема и неговата електрофоретска подвижност.
 Имајќи ја предвид зависноста помеѓу електрофоретската подвижност и pKa
– вредностите на јоните, може да се заклучи дека промената на рН –
вредноста на медиумот во кој се одвива СЕ, има значително влијание врз
електрофоретската подвижност на одредени лекови.
 На пример, ако се претпостави дека при максимален полнеж, две бази –
морфин и кодеин, кои поседуваат сличен облик и големина, но различни
pKa – вредности – се одликуваат со иста електрофоретска подвижност,
може да се заклучи дека со промена на рН – вредноста на медиумот во кој
се одвива СЕ, ќе се променат и нивните електрофоретски подвижности.
 Притоа, најголема бројна разлика во електрофоретските подвижности на
овие соединенија, ќе се јави кога рН – вредноста на медиумот во кој се
одвива СЕ, ќе биде еднаква со pKa – вредноста на послабата база.
 Како и да е, односот помеѓу електрофоретските подвижности на базите, се
менува со менување на рН – вредноста на медиумот во кој се одвива СЕ.
На пример, при рН = 8,9, електрофоретската подвижност на кодеинот ќе
биде двапати поголема во споредба со електрофоретската подвижност на
морфинот.
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ – ЕЛЕКТРООСМОТСКИ ПРОТОК
(EOF)
 Ѕидот на фузираната силика капилара од системот за СЕ е многу сличен со
површината на силика гелот од системот за HPLC со нормално – фазно
пакување.
 pKa – вредностите на киселите силанолни групи од површината на ѕидот
на капиларата се движат во интервал од 4,0 до 9,0. Како такви, овие групи
се носители на негативен полнеж и количеството на негативен полнеж на
ѕидот на капиларата ќе се зголемува со зголемување на рН – вредноста.
 Катјоните, присутни во пуферот за сепарирање, поседуваат афинитет кон
негативниот полнеж на ѕидот на капиларата. Како катјоните се
придвижуваат кон него, така доаѓа до зголемување на позитивниот
потенцијал, што пак, ќе резултира со привлекување на повеќе молекули
вода кон ѕидот на капиларата.
 Доколку во капиларата се примени одреден потенцијал, катјоните, присутни
во растворот, ќе започнат да се движат кон катодата. Притоа, катјоните кои
се наоѓаат во концентрираниот слој во близина на ѕидот на капиларата, се
одликуваат со релативно повисока подвижност (кондуктивност) во
споредба со останатите катјони, присутни во пуферот за сепарирање.
 Имено, катјоните, заедно со себе, кон катодата ќе ги придвижуваат и
молекулите на вода, како резултат на што, се создава електроосмотски
проток (EOF).
(EOF)
(EOF)
 Со оглед на фактот што негативниот полнеж на силанолните групи се зголемува
со зголемување на рН – вредноста, може да се заклучи дека вредноста на EOF
директно зависи од pH – вредноста. Според тоа, кога рН – вредноста се движи
во опсег помеѓу 3 и 8, вредноста на EOF се зголемува десеткратно.
 Обратно, вредноста на EOF се намалува со намалување на јачината на
пуферот за сепарирање. Имено, до колку е поголема концентрацијата на
анјоните во пуферот за сепарирање, до толку повеќе ќе се редуцира
позитивниот потенцијал на ѕидот на капиларата. Како резултат на тоа, ќе се
намали интеракцијата помеѓу водата од пуферот за сепарирање, од една страна
и катјоните од ѕидот на капиларата, од друга страна, што пак, значи, дека се
намалува и EOF.
 EOF, карактеристичен за CE, овозможува добивање потесни пикови во споредба
со ламинарниот проток, карактеристичен за HPLC.
ТЕОРЕТСКИ ОСНОВИ НА КАПИЛАРНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА
СО ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ – МИГРАЦИЈА ВО СЕ
 Постоењето на EOF овозможува сите видови во растворот, без
разлика на нивниот полнеж, да се движат кон катодата. Притоа,
анјоните и катјоните се движат со брзина, одредена од нивната
електрофоретска подвижност и EOF, а неутралните видови се
движат со брзина, одредена од EOF.
 Од круцијално значење е да се напомене дека брзината на движење
кон катодата, одредена од EOF, апроксимативно е десетпати
поголема во споредба со брзината на движење на анјоните кон
анодата.
 Катјоните во растворот се движат најбрзо, така што најмалите
катјони први ќе пристигнат до катодата.
 Неутралните видови во растворот се движат со иста брзина, како и
брзината одредена од EOF.
 Анјоните во растворот се движат најбавно, така што најмалите
анјони последни ќе пристигнат до катодата.
 Од една страна, EOF е значаен бидејќи овозможува анализа на сите
видови во растворот, без разлика на нивниот полнеж, но од друга
страна, го прави методот покомплексен бидејќи е потребно негово
балансирање во однос на електрофоретската подвижност на јоните.
ТЕОРЕТСКИ ОСНОВИ НА КАПИЛАРНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА
СО ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ – МИГРАЦИЈА ВО СЕ
ИНСТРУМЕНТАЦИЈА ЗА КАПИЛАРНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА
СО ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ
 Вообичаено, инјектирањето на примерокот за анализа во системот за СЕ е
автоматизирано, така што вијалата која го содржи самиот примерок, се
придвижува со помош на притисок од воздух.
 Откако ќе биде наполнета со примерокот за анализа, капиларата се
префрлува во друга вијала, која го содржи пуферот за сепарирање.
Брзината на проток на пуферот за сепарирање преку капиларата се
изразува во нанолитри / минута.
 Капиларите кои се употребуваат во системот за СЕ се идентични како и
капиларните колони кои се употребуваат во системот за GC и како такви,
истите се обложени со полиамид од надворешната страна. Должината на
капиларите се движи во опсег од 50 до 100 cm, а нивниот внатрешен
дијаметар се движи во опсег од 0,025 до 0,050 mm. Вообичаено, капиларите
се обвиткани околу специјален држач, со цел, истите полесно да се воведат
во системот за СЕ.
 На крајот од капиларата кадешто се наоѓа детекторот, во самата капилара
има вградено прозорец, кој служи за пропуштање на зрачење, кое се
користи за детекција на компонентите од примерокот за анализа.
 Најчесто користени детектори во системот за СЕ се детекторот со низа од
диоди и брзо – скенирачкиот UV детектор. Како и да е, покрај овие, може
да се употребуваат и други детектори, како на пример, флуоресцентен,
кондуктометриски или масен спектрометриски детектор.
ИНСТРУМЕНТАЦИЈА ЗА КАПИЛАРНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА
СО ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ
КОНТРОЛА НА СЕПАРИРАЊЕТО ВО СИСТЕМОТ ЗА СЕ
 Влијание врз сепарирањето во системот за СЕ имаат
следниве фактори:
1. Миграционо време;
2. Дисперзија;
 лонгитудинална дифузија;
 интеракции помеѓу ѕидот на капиларата и компонентите
од примерокот за анализа;
 загревање;
 должина на делот за инјектирање;
 електродисперзија.
КОНТРОЛА НА СЕПАРИРАЊЕТО ВО СИСТЕМОТ ЗА СЕ –
МИГРАЦИОНО ВРЕМЕ; ЛОНГИТУДИНАЛНА ДИФУЗИЈА
 Миграционо време
 За да се постигне ефикасно раздвојување на компонентите од
примерокот за анализа, од една страна, потребно е да помине
доволно време за да настане ефикасното раздвојување, а од друга
страна, EOF треба да биде усогласен со електрофоретската
подвижност на јоните. Покрај овие, друг фактор кој треба да се
оптимизира, претставува должината на капиларата. Имено, до колку
е подолга капиларата, при применет фиксен потенцијал, до толку ќе
биде пониско електричното поле. Имајќи предвид дека детекторот
се наоѓа на крајот од капиларата, растојанието помеѓу детекторот и
излезот од капиларата, не треба да биде премногу големо бидејќи
на тој начин се намалува ефективната должина на капиларата.
 Лонгитудинална дифузија
 Лонгитудиналната дифузија зависи од должината на времето кое
аналитот го поминува во капиларата, но и од дифузиониот
коефициент на аналитот во мобилната фаза. Макромолекулите,
како на пример, протеините и олигонуклеотидите, се одликуваат со
мали дифузиони коефициенти. Токму поради оваа причина, со
помош на СЕ може да се постигне лесно и ефикасно раздвојување
на овие молекули.
ИНТЕРАКЦИИ ПОМЕЃУ ЅИДОТ НА КАПИЛАРАТА И
КОМПОНЕНТИТЕ ОД ПРИМЕРОКОТ ЗА АНАЛИЗА; ЗАГРЕВАЊЕ
 Интеракции помеѓу ѕидот на капиларата и компонентите од
примерокот за анализа
 Аналитите може да се апсорбираат на ѕидот на капиларата преку интеракција со
негативно наелектризираните силанолни групи или пак, со помош на хидрофобни
интеракции. Од една страна, пуферите за сепарирање со висока јонска јачина, го
блокираат негативниот полнеж на ѕидот на капиларата и го намалуваат EOF, но
од друга страна, истите го зголемуваат загревањето. Доколку е потребно да се
анализираат само катјони, рН – вредноста на пуферот за сепарирање треба да
се намали, на пример, истата треба да изнесува 2. Ваквата ниска рН – вредност
го потиснува полнежот на силанолните групи, го редуцира EOF, но обезбедува
потполна електрофоретска подвижност на катјоните, кои слободно ќе мигрираат
кон катодата, без дополнителна помош од EOF. Доколку аналитите целосно се
јонизирани, тогаш разликите во pKа – вредностите не може да се искористат како
основен критериум за сепарирање на аналитите.
 Загревање
 Имајќи предвид дека во капиларата од системот за СЕ постои можност за
конверзија на електричната енергија во топлина, јачината на применетото
електрично поле на капиларата, треба да се движи во опсег на дозволениот
лимит. Локализираното создавање на топлина може да резултира со појава на
промени во вискозитетот на пуферот за сепарирање или пак, локализирано
зголемување на дифузијата на аналитот. Ваквиот ефект може да се минимизира
на два начини и тоа: употреба на тесни капилари, во кои губењето на топлината
настанува релативно брзо и обезбедување на систем за контрола на
температурата по должината на капиларата.
ДОЛЖИНА НА ДЕЛОТ ЗА ИНЈЕКТИРАЊЕ
 Должина на делот за инјектирање
 Доколку капиларата во системот за СЕ поседува вкупна должина од
100 cm и внатрешен дијаметар од 50 µm, при инјектирање на
примерок за анализа со вкупен волумен од 0,02 µL, ќе се окупира
само 1 cm од вкупната должина на капиларата.
 За да се надминат проблемите поврзани со репродуцибилноста при
инјектирањето на примероци за анализа со мал волумен, потребно
е да се воспостави автоматизирано инјектирање на ваквите
примероци за анализа.
 Како и да е, во одредени случаи, поради специфичниот лимит на
детекција, потребно е да се инјектираат примероци за анализа со
поголем волумен. За таа цел, при полнењето на примерокот за
анализа во капиларата, неопходно е да се примени притисок на
крајот од полнењето.
 Во случаи кога концентрацијата на аналитот во примерокот за
анализа е многу ниска за истиот ефикасно да биде детектиран,
потребно е да се зголеми неговата концентрација во капиларата. За
таа цел, примерокот за анализа, кој го содржи аналитот, се префрла
во раствор, чијашто јонска јачина е сигнификантно помала во
споредба со јонската јачина на пуферот за сепарирање.
ЕЛЕКТРОДИСПЕРЗИЈА
 Електродисперзија
 Подвижноста на јоните од пуферот за сепарирање треба да биде
приближно иста, како и подвижноста на јоните од примерокот за анализа.
 Доколку подвижноста на јоните од примерокот за анализа е поголема во
споредба со подвижноста на јоните од пуферот за сепарирање, доаѓа до
појава на фронтален пик. Ваквата појава се должи на фактот што јоните
пред зоната на примерокот имаат тенденција да дифундираат во пуферот
за сепарирање, каде истите се под влијание на поголемо електрично поле,
односно се забрзуваат надвор од зоната на примерокот. Овој ефект може
да се минимизира доколку концентрацијата на пуферот за сепарирање е
многу поголема во споредба со концентрацијата на примерокот за анализа.
 Доколку подвижноста на јоните од примерокот за анализа е помала во
споредба со подвижноста на јоните од пуферот за сепарирање, доаѓа до
појава на опашка на пикот. Ваквата појава се должи на фактот што јоните
позади зоната на примерокот имаат тенденција да дифундираат во пуферот
за сепарирање, каде истите се под влијание на помало електрично поле,
односно заостануваат зад зоната на примерокот. Овој ефект може да се
минимизира доколку концентрацијата на пуферот за сепарирање е многу
помала во споредба со концентрацијата на примерокот за анализа.
ПРИМЕНА НА КАПИЛАРНАТА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА СО
 Капиларната електрофореза со високи перформанси наоѓа

широка примена како:
 техника со висока точност и прецизност за квантификација
на лекови во различни видови на фармацевтски
формулации;
 техника за контрола на контрола на квалитет на пептидни
лекови;
 високо селективна и ефикасна техника за сепарација на
енантиомери;
 многу ефикасна техника за одредување на онечистувања;
 техника за одредување на лекови и нивни метаболити во
биолошки течности.
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ ВО ФАРМАЦЕВТСКИТЕ АНАЛИЗИ
 Наједноставната форма на капиларната електрофореза се

означува како зонска капиларна електрофореза.
 Условите кои треба да се оптимизираат при изведба на
зонската капиларна електрофореза се релативно
едноставни.
 Мобилната фаза која се користи кај овој тил на
електрофореза се состои од пуфер за сепарирање со
различни додатоци. Во многу случаи, ефектите кои ги
предизвикуваат додатоците од пуферот, не можат во
целост да се објаснат.
 Вообичаено, СЕ се применува за:
 сепарација базирана на електричниот полнеж;
 сепарација базирана на јонскиот радиус;
 сепарација на пептиди.
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ ВО ФАРМАЦЕВТСКИТЕ АНАЛИЗИ
 Сепарација базирана на електричниот полнеж
 Поради големата сличност во хемиските структури, сродните онечистувања на
атенолол, не може да се раздвојат од активната компонента со помош на HPLC.
Затоа, искористени се различните степени на јонизација, односно разликите во
електричниот полнеж на активната компонента и онечистувањата, со цел истите
меѓусебно да бидат сепарирани со помош на СЕ.
 Сепарација базирана на јонскиот радиус
 Нестероидните антиинфламаторни лекови (НСАИЛ) содржат карбоксилна група,
па кога истите се јонизирани, се однесуваат како анјони. При употреба на
немодифицирана капилара во системот за СЕ, EOF условува движење кон
катодата и како таков, ги придвижува НСАИЛ анјоните со различна брзина кон
катодата, врз основа на што, настанува нивна сепарација.
 Сепарација на пептиди
 Поради големите димензии и поларноста на пептидите, честопати се јавуваат
проблеми во поглед на нивната сепарација. Имајќи предвид дека пептидите
поседуваат два или повеќе полнежи, најзначајни фактори за оптимизација на
нивната сепарација, се рН – вредноста и концентрацијата на пуферот за
сепарирање. Под поимот изоелектрична точка (pI – вредност) се подразбира рН –
вредност при која позитивниот и негативниот полнеж на пептидот се
избалансирани. Притоа, високите рI – вредности укажуваат дека во пептидот има
поголем број на базни остатоци, како на пример, лизин и аргинин, додека ниските
рI – вредности укажуваат дека во пептидот има поголем број на кисели остатоци,
како на пример, глутаминска и аспарагинска киселина.
УПОТРЕБА НА ЦИКЛОДЕКСТРИНИТЕ КАКО ДОДАТОЦИ ВО
ПУФЕРИТЕ ЗА СЕПАРИРАЊЕ
 Кога со помош на системот за СЕ не може да се постигне ефикасна
сепарација на компонентите од примерокот за анализа, потребно е
во пуферот за сепарирање да се вклучат одредени додатоци, кои
ќе придонесат за зголемување на селективноста.
 Карактеристичен пример за додатоци кои се додаваат во пуферот за
сепарирање претставуваат циклодекстрините.
 Циклодекстрините претставуваат неутрални компоненти кои
мигрираат со иста брзина, како и брзината одредена од EOF. Како
такви, истите образуваат хидрофобни празнини во кои може да се
инкорпорираат други молекули, при што, ваквото инкорпорирање,
пред сѐ, зависи од стереохемијата на другите молекули.
 Циклодекстрините може да се употребуваат како додатоци во
пуферот за сепарирање и кога станува збор за хирално, но и кога
станува збор за нехирално сепарирање.
 Карактеристични примери за сепарациони методи во кои се
употребуваат циклодекстрините како додатоци во пуферот за
сепарирање се:
 сепарацијата на пилокарпин од неговиот епимер;
 сепарацијата на хирални локални анестетици.
МОДИФИКАЦИЈА НА КАПИЛАРНАТА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА СО
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ: МИЦЕЛАРНА ЕЛЕКТРОКИНЕТИЧКА
ХРОМАТОГРАФИЈА (MEKC)
 MEKC, како модификација на СЕ, може да се користи за сепарација на неутрални
компоненти, но истовремено, може да се користи и за сепарација на јонски
компоненти.
 Принципот на MEKC се темели на додавање сурфактант во мобилната фаза во
концентрација над неговата критична мицеларна концентрација. Притоа,
сурфактантот кој се употребува може да биде: анјонски, катјонски или неутрален.
 Образуваните мицели се однесуваат на аналоген начин, како и начинот на кој се
однесува стационарната фаза од системот за HPLC. Имено, анјонските мицели
мигрираат во спротивен правец во однос на EOF, катјонските мицели мигрираат во
ист правец, како и правецот на EOF, а неутралните мицели мигрираат со иста
брзина, како и брзината одредена од EOF.
 Исто така, сурфактантот во пуферот за сепарирање, преку специфични интеракции со
ѕидот на капиларата, може да влијае врз брзината и правецот на EOF. Според тоа,
сепарирањето на компонентите од примерокот за анализа со помош на MEKC, се
должи на различни механизми.
 Интеракцијата помеѓу аналитот и мицелите може да се модифицира со употреба на
органски растворувачи како адитиви во пуферот за сепарирање. Како резултат на
тоа, се намалува партиционирањето на аналитот во мицелите, а во исто време, се
редуцира и EOF.
 MEKC може да се употребува за:
 сепарација на цефотаксим од сродни онечистувања;
 анализа на флавоноиди.
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ: МИЦЕЛАРНА ЕЛЕКТРОКИНЕТИЧКА
ХРОМАТОГРАФИЈА (MEKC)
ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ: КАПИЛАРНА
ЕЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИЈА (CEC)
 Капиларата која се користи во CEC е пакувана со хроматографска
стационарна фаза.
 Според тоа, принципот на сепарација со помош на СЕС се темели на
комбинација од два ефекти: електроосмотски проток и
партиционирање во стационарната фаза.
 Кога станува збор за СЕС, најголем проблем од техничка природа,
претставува пакувањето на тесната капилара со соодветна стационарна
фаза. Најперспективниот начин за надминување на овој проблем е
формирање на пакувањето in situ (на оригиналното место) преку
одредена хемиска реакција, на пример, хидролиза на тетраметил
ортосиликат.
 Вака образуваните пакувања се познати како монолитни колони и како
такви, истите се комерцијално достапни како колони кои се
употребуваат во системот за HPLC.
 Главни предности на монолитните колони се нивната висока
порозност и фактот што овозможуваат високи брзини на проток.
 Според тоа, со примена на релативно мал притисок во системот за
СЕС, се активира режим кој претставува комбинација од
електроосмотскиот проток и протокот кој настанува под дејство на
притисокот, како резултат на што, се овозможува брза сепарација.
ПРЕДНОСТИ И НЕДОСТАТОЦИ НА КАПИЛАРНАТА
ЕЛЕКТРОФОРЕЗА СО ВИСОКИ ПЕРФОРМАНСИ
ПРЕДНОСТИ НЕДОСТАТОЦИ
 потенцијално многупати  моментално, помалку

поефикасна техника од робустна техника во
HPLC во однос на споредба со HPLC;
сепарационата моќ;  помала чувствителност во
 потребно е пократко време споредба со HPLC;
за анализа во споредба со  потребна е оптимизација на
HPLC; повеќе параметри во
 поевтини колони во споредба со HPLC.
споредба со HPLC;
 занемарлива потрошувачка
на растворувачи.
ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ НА
5 ЦВРСТИ ДОЗИРАНИ ФОРМИ

ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ НА ЦВРСТИ ДОЗИРАНИ
ФОРМИ
 Цврстите дозирани форми претставуваат најчесто користени
дозирани форми во фармацевтската пракса. Токму поради
оваа причина, се наметнува потреба од нивно испитување и
контрола на нивниот квалитет.
 Сите фармацевтски суровини, независно од тоа дали се
фармаколошки активни или помошни, треба да поминат низ
серија од физички тестови, со цел да се утврди начинот на
кој истите би се однесувале во текот на: мешањето,
гранулирањето, сушењето, компресирањето или било кој друг
процес, вклучен во производството на цврстите дозирани
форми.
 Според тоа, потребно е да се направи физичка
карактеризација на фармаколошки активните, помошните
супстанции и нивните смеси, пред истите да бидат вклучени во
производствениот процес.
ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ НА ЦВРСТИ ДОЗИРАНИ
ФОРМИ
 Со цел ефикасно испитување и контрола на квалитет на
цврстите дозирани форми, акцент треба да се стави на
нивните физички својства.
 Игнорирањето на физичките својства може да резултира со
негативни последици за фармацевтската формулација, пред
сѐ, поради можноста за појава на несакани реакции, кои би ја
нарушиле стабилноста на фармаколошки активната
супстанција во соодветниот матрикс.
 Единствен начин да се надмине овој проблем е да се стекнат
што е можно поголем број на информации за физичките
својства на цврстите дозирани форми. Токму поради оваа
причина, ваквите својства може да се класифицираат во три
поголеми групи:
 физички својства на молекуларно ниво;
 физички својства на ниво на честици;
 физички својства на ниво на прашок.
ФИЗИЧКИ СВОЈСТВА НА
МОЛЕКУЛАРНО НИВО
I. UV / VIS дифузно рефлективна
спектроскопија;
II. Вибрациона спектроскопија;
III. NMR спектроскопија.
УЛТРАВИОЛЕТОВА / ВИДЛИВА (UV / VIS) ДИФУЗНО
РЕФЛЕКТИВНА СПЕКТРОСКОПИЈА
 Од причина што повеќето цврсти дозирани форми не се доволно
транспарентни, истите не може да се анализираат со помош на
конвенционалната UV / VIS спектроскопија. Токму поради оваа
причина, за анализа на цврстите дозирани форми, потребно е да се
користи UV / VIS дифузно рефлективната спектроскопија.
 UV / VIS дифузно рефлективната спектроскопија претставува моќна
техника за карактеризација на интеракциите помеѓу составните
компоненти во цврстата дозирана форма.
 Покрај интеракциите помеѓу фармаколошки активната компонента и
ексципиенсите во состав на фармацевтската формулација,
спроведените анализи со помош на оваа техника, а под соодветно
дизајнирани стрес услови, се покажале како особено корисни и за
проучување на:
 деградационите патишта на фармаколошки активната компонента;
 промените во биорасположливоста, настанати како резултат на
адсорпција на фармаколошки активната компонента на некоја друга
компонента во состав на фармацевтската формулација.
ВИБРАЦИОНА СПЕКТРОСКОПИЈА: ИНФРАЦРВЕНА
СПЕКТРОСКОПИЈА СО FOURIER – ОВА ТРАНСФОРМАЦИЈА
(FTIR)
 Вибрационата спектроскопија се темели на апсорпција на енергија со
бранова должина во опсег помеѓу 400 и 4 000 cm–1, опсег на бранова
должина, еквивалентен на средниот инфрацрвен регион, како резултат
на што, настанува транзиција помеѓу вибрационите енергетски нивоа.
Според тоа, со анализа на апсорбанцата во инфрацрвениот регион од
спектарот, директно може да се проучува природата на ваквиот тип на
транзиции. За таа цел, техника од избор претставува инфрацрвената
спектроскопија со Fourier – ова трансформација (FTIR).
 FTIR претставува моќна техника за физичка карактеризација на
цврстите дозирани форми. Оваа техника може да се користи и за
анализа на содржината на вода во состав на хидратите. Исто така,
врз основа на добиениот спектар со FTIR, може да се направи и
евалуација на полиморфизмот на дадена фармаколошки активна
компонента.
 Честопати, спектарот на одреден прашочен материјал од цврста
дозирана форма, може да се добие со комбинирање на FTIR со
дифузно рефлективна техника. Доколку постојат одредени фактори,
како на пример, полиморфизмот, кои може да влијаат врз транзициите
помеѓу вибрационите енергетски нивоа, тогаш промените во добиениот
спектар, може да се искористат за проучување на овие фактори.
ВИБРАЦИОНА СПЕКТРОСКОПИЈА: РАМАН
СПЕКТРОСКОПИЈА
 Транзициите помеѓу вибрационите енергетски нивоа може да
се анализираат и со помош на други техники, како на пример,
раман спектроскопијата. Според тоа, покрај FTIR, за физичка
карактеризација на цврстите дозирани форми, може да се
користи и раман спектроскопијата.
 Имено, монохроматско ласерско зрачење се насочува кон
аналитот, а како резултат на нееластичното расејување на
зрачењето, се конструира карактеристичен вибрационен
спектар на аналитот. Имајќи предвид дека многу
фармаколошки активни компоненти поседуваат низок степен
на симетрија, овој спектар во голема мера ќе наликува на
спектарот добиен со FTIR.
 Во основа, неполарните функционални групи произведуваат
најинтензивен раман ефект, за разлика од поларните
функционални групи, кои покажуваат најинтензивни
апсорпции во инфрацрвениот регион.
НУКЛЕАРНО МАГНЕТНА РЕЗОНАНТНА (NMR)
 NMR спектроскопија претставува техника од избор за карактеризација на
фармацевтски суровини на молекуларно ниво.
 Предностите на инструментацијата за изведба на оваа техника, како и
компјутеризираните пулсни секвенции, овозможуваат истата рутински да се
користи при анализа на фармацевтски суровини кои се наоѓаат во цврста
агрегатна состојба.
 Најчесто применувани форми на NMR спектроскопија претставуваат 1Н NMR
спектроскопија и 13С NMR спектроскопија.
 Кога станува збор за анализа на фармацевтски суровини кои се наоѓаат во
цврста агрегатна состојба, најголем дел од анализите се вршат со помош на 13С
NMR спектроскопија, додека 1H NMR спектроскопија ретко се применува, од
причина што резултатите кои се добиваат со оваа техника се одликуваат со
средна резолуција.
 Доколку со кристалографска анализа е утврдено дека јадрата на две
полиморфни супстанции не се магнетно еквивалентни, тогаш и нивната
резонанција нема да биде еквивалентна. Во ваков случај, потребно е да се
направи детална анализа на спектарот на овие супстанции, добиен со помош на
NMR спектроскопија, со цел утврдување на природата на полиморфните
варијации, особено доколку станува збор за конформационен полиморфизам.
Вака добиените информации може да послужат во развојните фази на голем број
фармаколошки активни компоненти.
 Локалното магнетно поле (Bloc) кај 13С јадрата во состав

на органски соединенија кои се наоѓаат во цврста
агрегатна состојба, може да се претстави со следново
равенство:
каде: γH – гиромагнетен однос на протоните; r –

интрануклеарно растојание во С–Н врските, односно
растојание помеѓу јаглеродот и врзаните протони; θ –
агол помеѓу С–Н врските и надворешно применетото
поле (Во); ± (плус / минус) – со овој знак се означува дека
локалното магнетно поле може да се додаде или да се
одземе од надворешно применетото поле, во зависност
од тоа дали соседниот протонскиот дипол е усогласен
или не со насоката на надворешно применетото поле.
 Кога станува збор за микрокристална органска супстанција, која се
наоѓа во цврста агрегатна состојба, треба да се напомене дека со
сумирање на вредностите за θ и r, се јавува проширување на
протонскиот дипол за многу килохерци.
 Брзите ротации на интрануклеарните вектори во С–Н врската, слично
на молекуларните движења кои настануваат во соединенијата кои се
наоѓаат во течна агрегатна состојба, може да го намалуваат
ваквото проширување.
 Меѓутоа, кај соединенијата кои се наоѓаат во цврста агрегатна
состојба, ваквите брзи ротации не се возможни. Сепак, доколку,
θ = cos–13–½ (или апроксимативно, 55о44’), тогаш 3cos2θ–1 = 0.
Според тоа, ротацијата под агол од 55о44’ ќе резултира со појава на
анизотропија.
 Имајќи предвид дека ваквата анизотропија претставува главниот
фактор кој влијае врз спектралното проширување кај 13С NMR
спектроскопија, при постигнување на ротација под посакуваниот агол,
ќе се добие спектар со висока резолуција.
 При изведба на NMR спектроскопијата, покрај проблемот

поврзан со спектралното проширување, се јавува и проблем
поврзан со потребното време за добивање на резултатите.
 За да се добијат резултатите, потребно е релативно подолго
време поради две основни причини. Прво, јадрата се ниско
чувствителни и второ, истите се карактеризираат со долго
време на релаксација.
 Ваквиот проблем може да се надмине со примена на вкрстена
поларизација, односно ортогонална поларизација во однос на
поларизацијата која вообичаено настанува.
 Вкрстената поларизација ќе резултира со четирикратно
подобрување на 13С магнетизацијата, што пак, ќе придонесе
за намалување на времето потребно помеѓу пулсирањата.
ФИЗИЧКИ СВОЈСТВА НА НИВО
НА ЧЕСТИЦИ
I. Микроскопија;
II. Рендгенска кристалографија;
III. Термални аналитички техники.
МИКРОСКОПИЈА
 Преку микроскопска анализа на прашочниот материјал
може да се направи евалуација на неговата
морфолофија, која пак, може да влијае и на некои други
својства на прашокот.
 Исто така, микроскопската анализа овозможува и
процена на дистрибуцијата на честиците од
прашочниот материјал според нивната големина, при
што, за изведба на ваков тип на анализа, потребно е
предвид да се земе кристалната форма на прашокот.
 Дополнително, врз основа на микроскопските
карактеристики, честопати може да се направи и
идентификација на непознатите честици, присутни во
прашочниот материјал.
МИКРОСКОПИЈА: СВЕТЛОСНА И ЕЛЕКТРОНСКА
МИКРОСКОПИЈА
 Светлосните и електронските микроскопи се најчесто користени инструменти за
карактеризација на цврстите дозирани форми.
 Горната граница на зголемување на светлосниот микроскоп изнесува 600 пати
и како таква, истата е доволна за микроскопска анализа на најголем дел од
цврстите фармацевтски суровини. Со помош на светлосната микроскопија може
да се добијат информации за внатрешните карактеристики на малите честици,
влакна и филмови.
 За разлика од светлосниот, границата на зголемување на електронскиот
микроскоп е значително поголема, односно изнесува 90 000 пати. Притоа, од
сликата која се добива со помош на електронскиот микроскоп, може да се
извлечат тридимензионални информации, како на пример, топографски
информации или информации за формата на прашочниот материјал.
 Информациите кои се добиваат со помош на светлосната микроскопија, не може
да се добијат со помош на електронската микроскопија и обратно. Токму поради
оваа причина, светлосната и електронската микроскопија се пример за
комплементарни техники. Покрај тоа, нивната комбинирана употреба
овозможува целосна карактеризација на цврстите дозирани форми, што е од
круцијално значење кога станува збор за раните фази од развојот на лековите
бидејќи во овие фази, достапни се само мали количества од лековите кандидати.
МИКРОСКОПИЈА: ПОЛАРИЗАЦИОНА МИКРОСКОПИЈА
 Најзначајна модификација на светлосната микроскопија претставува
поларизационата микроскопија. Имено, доколку при светлосната
микроскопија се користи поларизирана светлина, тогаш техниката се
означува како поларизациона микроскопија.
 Поларизационата микроскопија се темели на проучување на начинот
на кој кристалот од аналитот влијае врз својствата на пропуштената
светлина.
 Инструментот кој се користи за изведба на поларизационата
микроскопија се означува како поларизационен микроскоп.
 Во основа, поларизациониот микроскоп претставува светлосен
микроскоп, кој поседува два поларизатори: линеарен и
дополнителен. Линеарниот поларизатор се наоѓа под
кондензаторот, а дополнителниот поларизатор се наоѓа на врвот
од окуларот.
 Со помош на овој тип на микроскоп, може да се добијат информации
за оптичките карактеристики на кристалите од аналитот.
МИКРОСКОПИЈА: ТЕРМАЛНА МИКРОСКОПИЈА
 Микроскопската техника која овозможува проучување на оптичките
карактеристики на кристалите од аналитот во текот на нивното загревање или
ладење, се означува како термална микроскопија. Како таква, оваа техника е
особено значајна за анализа на полиморфите и солватополиморфите.
 Вообичаено, кристалните полиморфи поседуваат различни точки на топење.
Преку редоследот на менување на точките на топење на кристалните
полиморфи, може да се одреди редоследот на менување на нивната стабилност
во услови на зголемена температура.
 Во зависност од тоа дали трансформацијата на една полиморфна форма во
друга е реверзибилна или не, овие кристални форми може да се класифицираат
во две групи и тоа: енантиотропни и монотропни кристални форми.
 Енантиотропните полиморфни форми може да се трансформираат реверзибилно
една во друга, при што, ваквата трансформација се случува во т.н. точка на
транзиција. Секоја енантиотропна полиморфна форма е стабилна само во
специфичен температурен опсег.
 Секоја монотропна полиморфна форма поседува хипотетска точка на
транзиција, која е температурно повисока во споредба со точката на топење на
полиморфната форма. Имено, едната монотропна полиморфна форма е
стабилна на сите температури под точката на топење, а другата полиморфна
форма е метастабилна на сите температури.
МИКРОСКОПИЈА: СКЕНИРАЧКА ЕЛЕКТРОНСКА
МИКРОСКОПИЈА (SCANNING ELECTRON MICROSCOPY – SEM)
 ЅЕМ претставува техника од избор кога потребните информации може
да се добијат единствено со помош на значително зголемување или пак,
кога треба да се добие тридимензионална слика од површината на
честиците од прашокот, кој е предмет на анализа.
 Имајќи предвид дека изворот на светлина се наоѓа над примерокот за
анализа, електронскиот сноп се фокусира со помош на серија од леќи,
а сликата се конструира врз основа на расеаното електромагнетно
зрачење, слободно може да се констатира дека ЅЕМ е многу слична
техника со инвертната светлосна микроскопија.
 За да се редуцираат штетните ефекти од електричното полнење на
површината на примерокот за анализа, потребно е честиците од истиот
да бидат обложени со електроспроводливи материјали, што претставува
главен недостаток на ЅЕМ. Како и да е, поновите системи за ЅЕМ не се
ограничени во овој поглед.
 ЅЕМ во комбинација со рендген анализа обезбедува метод преку кој
може да се определат составните елементи од даден хетероген
примерок за анализа.
РЕНДГЕНСКА КРИСТАЛОГРАФИЈА (РЕНДГЕНСКА
ДИФРАКЦИЈА, X–RAY ДИФРАКЦИЈА)
 Рендгенската кристалографија претставува една од најчесто
употребуваните аналитички техники во фармацевтските
анализи, со која може да се добијат фундаментални
информации за: кристалната структура, хемискиот состав и
физичките особини на материјалот, без притоа материјалот
да претрпи било какви промени.
 Покрај тоа, оваа аналитичка техника може да се користи и за:
евалуација на полиморфизмот, евалуација на степенот на
кристализација и проучување на фазните промени.
 Со текот на времето се развиле различни модификации на
рендгенската кристалографија, од кои, најзначајни се:
 техниката која се базира на расејување на рендгенски зраци на
монокристал (single – crystal X–ray diffraction – SCD);
 техниката која се базира на расејување на рендгенски зраци на
прашочен материјал (X–ray powder diffraction – XRPD).
 Под поимот кристал се подразбира цврсто тело кое се состои

од атоми, молекули или јони, кои правилно се распоредени во
просторот, според точно дефинирана законитост.
 Математичкиот модел на кристалот претставува кристална
решетка, која е дефинирана со посебна единица, означена
како кристална единица.
 Под поимот кристална единица се подразбира најмалото
подмножество простор, со чија транслација во три линеарно
независни насоки, се добива целиот кристал.
 Формата и големината на кристалната единица се дефинирани
со помош на векторите a, b и c, односно со нивните должини
(a, b и c) и аглите помеѓу нив (α, β и γ). Овие вектори уште се
означуваат и како вектори на транслација.
 За правилно опишување на кристалните решетки, потребно е да се
применува посебен концепт, кој ги вклучува поединечните рамнини на
кристалните решетки, но и збирот од таквите рамнини. Секоја
рамнина на кристалната решетка може да се конструира со поврзување
на најмалку три различни точки на кристалната решетка.
 Ориентацијата на рамнината може да се претстави како збир од три
цели броеви, означени како Miller – ови индекси. Во основа, Miller –
овите индекси се реципрочни вредности од добиените фракции од
должините на пресекот на рамнината, кога истата ја сече оската на
кристалната единица. На пример, доколку овие фракции ги имаат
вредностите: 1 / h, 1 / k и 1 / l, тогаш Miller – овите индекси може да се
претстават како hkl. Во случај кога рамнината е паралелна со некоја од
оските, пресекот на оската на кристалната единица може да се јави во
бесконечност, што значи дека Miller – овиот индекс ќе изнесува нула.
 Покрај тоа што ја опишуваат ориентацијата на рамнините на
кристалните решетки, Miller – овите индекси може да се користат и за
опишување на растојанието помеѓу збир на рамнини на кристалните
решетки. Притоа, растојанието помеѓу две соседни рамнини во рамките
на збирот од рамнини, се означува како d–растојание.
 За опишување на шемата на расејување на рендгенските
зраци во кристал, се користи посебен закон, означен како
Bragg – ов закон.
 Како таква, шемата на расејување на рендгенските зраци, пред
сѐ, зависи од геометријата и структурата на кристалот.
 Влезните рендгенски зраци паѓаат на рамнините на
кристалните решетки под точно одреден агол, означен како
влезен агол (θ), а потоа се рефлектираат под друг агол,
означен како агол на рефлексија (θ).
 Максимално расејување се забележува кога е задоволен
Bragg – овиот услов:
каде: λ – бранова должина; d – растојание помеѓу два соседни

рамнини во рамките на збирот на рамнините (d – растојание);
θ – агол на Bragg, под кој настанува максимално расејување;
n – ред на рефлексија (претставува цел број).
 Доколку е задоволен Bragg – овиот услов, доаѓа до
максимално расејување на рендгенските зраци, кое се
регистрира како интензитет на расеаните рендгенски зраци
во однос на 2 θ агли, а се означува со I.
 Прикажано на график, максималното расејување на
рендгенските зраци има облик на ѕвоно, конструирано со
заоблена линија.
 Проширувањето на заоблената линија може да настане како
резултат на:
 несовршеност на кристалот;
 несоврешеност на инструментот;
 промена на температурата.
 Највисоката точка на заоблената линија го дава
максималниот интензитет (IMAX), а ширината на линијата се
дефинира преку одредување на ширината на половина
висина (FWHM).
РЕНДГЕНСКА КРИСТАЛОГРАФИЈА: ТЕХНИКА БАЗИРАНА НА
РАСЕЈУВАЊЕ НА РЕНДГЕНСКИ ЗРАЦИ НА МОНОКРИСТАЛ
(SCD)
 Анализата базирана на SCD се изведува во три фази.
 Првата фаза уште се означува и како геометриска анализа и
врз основа на оваа анализа, се одредува просторната
дистрибуција на рефлектираните рендгенски зраци, а како
резултат на тоа пак, се пресметуваат големината и формата
на кристалната единица.
 Втората фаза вклучува проучување на интензитетите на
различните рефлектирани рендгенски зраци, врз основа на
што, се одредува и дистрибуцијата на атомите во рамките на
кристалната единица.
 Во третата фаза се врши анализа на рендгенскиот дијаграм со
цел да се добијат информации за квалитетот на кристалот,
како и степенот на внатрешно уредување на цврстиот
материјал.
РАСЕЈУВАЊЕ НА РЕНДГЕНСКИ ЗРАЦИ НА МОНОКРИСТАЛ
(SCD)
 SCD наоѓа широка примена за одредување на структурата на
монокристалите, односно претставува најмоќна и директна техника
за одредување на должината и аглите на врските во молекулите кои
учествуваат во градбата на цврстата материја.
 Вака добиените информации се од круцијално значење, особено кога
станува збор за проучување на:
 полиморфизмот (способност на цврстата материја да егзистира во
повеќе од една кристална структура);
 псевдополиморфизмот (способност на цврстата материја да егзистира
во повеќе од една кристална структура, како резултат на нејзина
хидратација или растварање).
 Кога полиморфизмот се јавува како резултат на разлика во
кристалното пакување, тогаш истиот се означува како
полиморфизам на пакување.
 Кога полиморфизмот се јавува како резултат на постоење на
различни конформациони изомери на една иста молекула, тогаш
истиот се означува како конформационен полиморфизам.
РАСЕЈУВАЊЕ НА РЕНДГЕНСКИ ЗРАЦИ НА ПРАШОЧЕН
МАТЕРИЈАЛ (XRPD)
 Иако SCD претставува моќна техника за проучување на

полиморфите и псевдополиморфите, сепак, истата не е
соодветна за рутинска евалуација на кристалната состојба
на прашочен материјал. Имено, за таа цел се користи XRPD.
 Дијаграмот на прашочниот материјал, добиен со помош на
XRPD, се состои од серија од пикови со различен интензитет,
детектирани преку различни агли на расејување.
 Аглите на расејување, заедно со нивните релативни
интензитети, се во директна корелација со d – растојанијата,
при што, се обезбедува целосна кристалографска
карактеризација на прашочниот материјал.
 Дополнително, од дијаграмот на прашочниот материјал може
да се извлечат и други кристалографски информации, како на
пример, димензиите на кристалната единица.
ТЕРМАЛНИ АНАЛИТИЧКИ ТЕХНИКИ
 Термалните аналитички техники се дефинираат како техники кои
овозможуваат одредување на својствата на аналитот како функција од
надворешно применетата температура.
 Како такви, овие техники може да се користат за:
 карактеризација на чистотата на соединенијата;
 проучување на полиморфизмот, растворливоста и деградацијата на
соединенијата;
 одредување на компатибилноста помеѓу супстанциите во фармацевтската
формулација.
 Покрај тоа, термалните аналитички техники може да се користат за
мониторирање, како на ендотермни процеси (топење, вриење,
сублимација, испарување, десолватација, хемиска деградација), така и
на егзотермни процеси (кристализација, оксидативна декомпозиција).
 Дополнително, термалните аналитички техники се од круцијално
значење кога станува збор за спроведување на преформулациони
студии. Имено, во текот на преформулационите студии, со помош на
овие техники може да се детектираат потенцијални интеракции помеѓу
фармаколошки активната компонента и ексципиенсите.
ТЕРМАЛНИ АНАЛИТИЧКИ ТЕХНИКИ
 Термалните аналитички техники може да се користат за одредување на точките
на топење преку анализа на т.н. криви на фузија. За таа цел, примерокот за
анализа се поставува во соодветен сад, кој пак, се загрева на водена бања со
зголемување на температурата до одреден степен, при што се мониторира
температурата на примерокот.
 Сѐ додека примерокот за анализа се наоѓа во цврста агрегатна состојба,
истиот ќе поседува фиксен топлински капацитет, така што неговата
температура линеарно ќе се зголемува, во согласност со стапката на проток на
топлина.
 Откако примерокот за анализа ќе започне да се топи, вредностите на неговиот
топлински капацитет ќе тежнеат кон бесконечност бидејќи апсорбираната
топлина единствено се користи за трансформација на цврстата во течна
агрегатна состојба. Имајќи ги предвид бесконечната вредност на топлинскиот
капацитет и фактот дека присутната топлина во системот, единствено се користи
за меѓусебна трансформација на агрегатните состојби, слободно може да се
констатира дека температурата на примерокот во текот на оваа фаза нема да
се промени.
 Штом ќе се стопи целиот примерок за анализа, истиот ќе се наоѓа во течна
агрегатна состојба, што значи дека повторно ќе поседува фиксен топлински
капацитет. Дополнителното загревање на примерокот за анализа ќе резултира
со линеарно зголемување на неговата температура, сѐ до следната
трансформација на агрегатната состојба.
ТЕРМАЛНИ АНАЛИТИЧКИ ТЕХНИКИ: ДИФЕРЕНЦИЈАЛНА
ТЕРМАЛНА АНАЛИЗА (DIFFERENTIAL THERMAL ANALYSIS –
DTA)
 DTA се темели на одредување на температурната разлика помеѓу примерокот
за анализа и референтниот стандард, како функција од температурата. Сѐ
додека не се јават извесни температурни промени, температурата на примерокот
за анализа и температурата на референтниот стандард, ќе поседуваат еднакви
вредности бидејќи и нивните топлински капацитети им се приближно еднакви.
Меѓутоа, доколку примерокот за анализа и референтниот стандард поминат низ
идентичен термален циклус, на пример, циклус на ладење или циклус на
загревање, ќе се јави одредена температурна разлика помеѓу нив.
 Доколку промената на енталпијата (ΔH) е позитивна вредност, односно станува
збор за ендотермна реакција, температурата на примерокот за анализа ќе биде
пониска во споредба со температурата на референтниот стандард бидејќи
примерокот за анализа ќе апсорбира поголемо количество на топлина во
споредба со референтниот стандард. Затоа, ваквата појава на термограмот ќе
биде регистрирана како негативно насочен пик.
 Доколку промената на енталпијата (ΔH) е негативна вредност, односно станува
збор за егзотермна реакција, температурата на примерокот за анализа ќе биде
повисока во споредба со температурата на референтниот стандард бидејќи
примерокот за анализа, сам по себе, ќе претставува извор на дополнителна
топлина. Затоа, ваквата појава на термограмот ќе биде регистрирана како
позитивно насочен пик.
 Според тоа, DTA претставува одлична квалитативна техника за одредување на
температурните интервали на различни термални процеси, односно
одредување дали овие процеси се ендотермни или егзотермни.
ТЕРМАЛНИ АНАЛИТИЧКИ ТЕХНИКИ: ДИФЕРЕНЦИЈАЛНА
СКЕНИРАЧКА КАЛОРИМЕТРИЈА (DIFFERENTIAL SCANNING
CALORIMETRY – DSC)
 DSC се темели на одредување на преносот на топлина, потребна за
одржување на примерокот за анализа и референтниот стандард на
еднаква температура.
 За одржување на еднаква температура помеѓу примерокот за анализа и
референтниот стандард, во ќелиите, во кои се наоѓаат истите, се
поставуваат различни грејни елементи, при што, потребно е да се
мониторира и контролира степенот на загревање, кој го произведуваат
овие грејни елементи. Ваквата модификација на DSC се означува како
моќност – компензациона DSC. Со помош на оваа техника се добиваат
позитивно насочени пикови за ендотермни процеси и негативно
насочени пикови за егзотермни процеси, што е спротивно од упатствата
на IUPAC.
 Одржување на еднаква температура помеѓу примерокот за анализа и
референтниот стандард може да се постигне кога во ќелиите, во кои се
наоѓаат истите, ќе се постават исти грејни елементи, при што се
мониторира насоката и количеството на топлина, која се пренесува
помеѓу двете ќелии. Ваквата модификација на DSC се означува како
топлотна – флукс DSC и како таква, истата е хармонизирана со
упатствата на IUPAC бидејќи произведува негативно насочени пикови за
ендотермни процеси и позитивно насочени пикови за егзотермни
процеси.
ТЕРМАЛНИ АНАЛИТИЧКИ ТЕХНИКИ: ТЕРМОГРАВИМЕТРИСКА
АНАЛИЗА (THERMOGRAVIMETRIC ANALYSIS – TGA)
 TGA се темели на одредување на промената, односно

зголемување или намалување на масата на примерокот за
анализа, како функција од температурата.
 Како таква, оваа аналитичка техника наоѓа широка примена во
студиите кои вклучуваат проучување на процесите на
десолватација и декомпозиција. На пример, анализата на
декомпозицијата на соединенијата со помош на TGA, може да
се користи за споредба на стабилноста на сличните
соединенија. Имено, до колку е повисока вредноста на
температурата при која настанува декомпозиција на дадено
соединение, до толку повеќе негативна ќе биде ΔG вредноста.
Според тоа, стабилноста на испитуваното соединение би била
значително поголема.
 Покрај тоа, TGA може да се користи и за квантификација на
вкупната испарлива содржина во рамките на цврст примерок
за анализа.
ФИЗИЧКИ СВОЈСТВА НА НИВО
НА ПРАШОК
I. Дистрибуција на честиците според нивната
големина;
II. Микромеритика;
III. Карактеризација на прашоци.
ДИСТРИБУЦИЈА НА ЧЕСТИЦИТЕ СПОРЕД НИВНАТА
ГОЛЕМИНА
 Без разлика дали станува збор за честици од фармаколошки
активната компонента или честици од ексципиенсите,
дистрибуцијата според нивната големина, може да има
значително влијание врз процесот на мешање, но и можноста
за појава на нивна сегрегација. Имено, доколку не постојат
електростатски ефекти и доколку индивидуалните честици од
компонентите во состав на прашокот, меѓусебно се мешливи и
поседуваат еднаква големина, тогаш многу лесно може да се
добие хомогена смеса од прашочните компоненти.
 Исто така, дистрибуцијата на честиците според нивната
големина, може да влијае како врз биорасположливоста на
фармаколошки активната компонента, така и врз проточните
својства на прашокот. Токму поради оваа причина, потребно е
сите цврсти дозирани форми да бидат униформно
произведени, а за постигнување на униформна содржина,
неопходно е внимателно да се контролира големината на
честиците.
ГОЛЕМИНА
 За дистрибуција на честиците од прашочниот материјал според нивната
големина, може да се користат најразлични методи, како на пример:
 светлосна микроскопија (вообичаено, во комбинација со анализа на слика);
 сито анализа;
 анализа на расеана ласерска светлина од суспендирани честици;
 анализа на сензорни електрични зони.
 Изборот на метод за дистрибуција на честиците од прашочниот
материјал според нивната големина, треба да се врши во согласност со:
 видот на примерокот кој се анализира;
 природата на информациите кои треба да се добијат.
 Имајќи предвид дека анализата на расеана ласерска светлина од
суспендирани честици и анализата на сензорните електрични зони,
вообичаено се применуваат кога станува збор за диспергирани честици
во инертен растворувач, може да се заклучи дека овие методи се
најпогодни за дистрибуција на честиците од суспензиите според
нивната големина.
 Од друга страна пак, светлосната микроскопија и сито анализата,
вообичаено се применуваат кога станува збор за суви прашочни
материјали, па токму поради тоа, овие методи претставуваат посигурни
индикатори за вистинската големина на честиците од прашокот.
ГОЛЕМИНА: СВЕТЛОСНА МИКРОСКОПИЈА (ВО КОМБИНАЦИЈА
СО АНАЛИЗА НА СЛИКА)
 Метод од избор за дистрибуција на честиците според нивната големина,
претставува микроскопијата. Притоа, за да се зголеми ефикасноста на овој
метод, потребно е истиот да се комбинира со анализа на добиените слики.
 Доколку методот е автоматизиран, тогаш параметрите на микроскопот ќе бидат
така подесени за да се оптимизира контрастот помеѓу позадината и честиците
кои треба да се дистрибуираат според нивната големина.
 Калибрацијата на добиените слики се врши со помош на микрометри и откако
еднаш ќе се изврши калибрација, нема потреба од повторување на овој процес.
Добиените слики од анализираниот прашочен материјал, се пренесуваат во
компјутерски софтвер, со чија помош се одредува бројот на пиксели кои
градат една честица. Понатаму, големината на секој пиксел се конвертира во
µm, при што, може да се добијат информации за:
 просечната големина на честиците;
 дистрибуцијата на честиците според нивната маса;
 формата на честиците.
 Главната предност на светлосната микроскопија е тоа што со помош на овој
метод директно се добиваат информации за честиците кои треба да се
карактеризираат. Од друга страна, главен недостаток на светлосната
микроскопија претставува фактот што се добиваат информации само за
честиците земени за анализа, односно честиците нанесени на предметното
стакло.
ГОЛЕМИНА: СИТО АНАЛИЗА
 Во основа, сито анализата претставува наједноставниот
метод за дистрибуција на честиците според нивната големина,
па токму поради оваа причина, овој метод и најчесто се
применува за оваа цел.
 Прво, честиците се просејуваат низ сита со различни
димензии на порите, а потоа се одредува количеството на
прашочен материјал, кое го поминало, односно количеството
на прашочен материјал, кое се задржало на површината на
ситото.
 Честиците кои поминуваат низ порите на ситото, се означуваат
како фини честици, а честиците кои се задржуваат на
површината на ситото, се означуваат како груби честици.
Доколку пак, се користат повеќе сита, фракцијата од честици,
која поминува низ повеќето, но се задржува на едно сито, се
означува како средна фракција од честици.
ГОЛЕМИНА: СИТО АНАЛИЗА
 За да се олесни поминувањето на честиците преку порите на ситата,
за време на процесот на просејување, може да се применуваат
различни пристапи, како на пример, примена на:
 вибрации;
 ултразвук;
 воздушно суспендирање.
 За правилна дистрибуција на честиците според нивната големина,
потребно е да се користат пет до шест сита. Димензиите на овие
сита треба да бидат така дефинирани, како би се добиле
апроксимативно еднакви количества на фракции од честици на
површината на секое сито, вклучително и фракцијата од фини
честици, која го поминува ситото со најмали пори.
 Добиените податоци од сито анализата може да се изразуваат како:
 количество на задржана фракција на површината на ситото;
 кумулативен процент на задржана фракција на површината на
ситото;
 процент на фракција која го поминува ситото.
ГОЛЕМИНА: АНАЛИЗА НА РАСЕАНА ЛАСЕРСКА СВЕТЛИНА ОД
СУСПЕНДИРАНИ ЧЕСТИЦИ
 Доколку големината на честиците се движи во опсег помеѓу 1 и 200
µm, тогаш за нивна дистрибуција според големината, може да се
користи специфичен метод, означен како метод на Fraunhofer – ово
расејување.
 Без разлика дали примероците за анализа доаѓаат во форма на
суспензии во инертен растворувач или во форма на суви прашоци,
потребно е истите да стапат во интеракција со ласерскиот зрак.
Како резултат на таквата интеракција, честиците од примерокот за
анализа, предизвикуваат расејување на ласерската светлина.
Вообичаено, ваквите честици поседуваат сферичен облик. Понатаму,
со помош на детектор, кој се состои од низа концентрични прстени,
се одредува интензитетот на расејувањето, а согласно ваквиот
интензитет, се врши и дистрибуција на честиците според нивната
големина.
 За добивање на информации за дистрибуцијата на честиците според
нивната големина, системот може да користи три различни методи:
 унимодален модел – зависен метод;
 унимодален модел – независен метод;
 мултимодален модел – независен метод.
ГОЛЕМИНА: АНАЛИЗА НА СЕНЗОРНИ ЕЛЕКТРИЧНИ ЗОНИ
 Дистрибуцијата на честиците од прашочен материјал

според нивната големина, може да се врши и со помош
на анализа на сензорни електрични зони.
 Ваквиот метод се темели на одредување на
електричните пулсирања, кои настануваат како
резултат на поминување на честиците преку сензорна
зона. Врз основа на електричните пулсирања, се врши
дистрибуција на честиците од прашочниот материјал
според нивната големина.
 Главен недостаток на овој метод е тоа што за да се
добијат информации за дистрибуцијата на честиците од
непознат прашочен материјал, според нивната големина,
потребно е да се изврши калибрација со фини честици,
чиишто големина, форма и состав се униформни.
МИКРОМЕРИТИКА
 Под поимот микромеритика се подразбира проучување
на фундаменталните и стекнатите карактеристики на
индивидуални или група на честици.
 Од сите карактеристики на прашочниот материјал, за
најзначајни од фармацевтски аспект, се сметаат:
1. Површината на прашочниот материјал;
2. Порозноста на прашочниот материјал;
3. Густината на прашочниот материјал.
МИКРОМЕРИТИКА: ПОВРШИНА НА ПРАШОЧЕН
МАТЕРИЈАЛ
 Површината на прашочниот материјал е значајна од два аспекти. Прво, преку
анализа на површината на прашочниот материјал, може да се добијат
информации за достапните празнини на самата површина. Второ, стапката на
дисолуција на цврстите дозирани форми, делумно зависи од нивната површина.
 Површината на прашочен материјал може да се анализира во два чекори:
 атсорпција на единечен слој на инертен гас на намалена температура;
 десорпција на адсорбираниот инертен гас на собна температура.
 За интерпретација на сорпциските изотерми се користат специфични равенки,
развиени од страна на Brunauer, Emmett и Teller. Токму поради оваа причина,
оваа техника се означува како BET метода. Според оваа метода, за изразување
на површината се користи мерната единица метар на квадрат површина на
грам прашочен материјал, односно m2/g.
 И покрај тоа што за изведба на BET методот може да се користи секој инертен
гас со способност за кондензација, постојат препораки дека за оваа цел, најдобро
е да се користат азотот или криптонот. Имено, доколку станува збор за
примероци чиишто површини се 2 m2/g или поголеми, тогаш како инертен гас
треба да се користи азотот, а доколку станува збор за примероци со помали
површини, тогаш истите треба да се анализираат со помош на криптон. Притоа,
атсорбатот, односно гасот кој треба да се атсорбира, пред процесот на
атсорпција, потребно е да се измеша со гас носач без способност за
кондензација, а во функција на таков, вообичаено се користи хелиумот.
МИКРОМЕРИТИКА: ПОВРШИНА НА ПРАШОЧЕН
МАТЕРИЈАЛ
 Информации за врската помеѓу површината и карактеристиките на
таблетата може да се добијат преку карактеризација на различни
таблетни компакти со лактоза.
 За таа цел, анхидрична α–лактоза се просејува низ сита со
дефинирана димензија на порите, при што се добиваат различни
фракции од анхидрична α–лактоза. Понатаму, секоја од фракциите
подлежи на компресија под притисок од 37,5 mPa, како резултат на
што, се добиваат таблетни компакти.
 За евалуација на површината на таблетите и одредување на силата
на нивно дробење, се користи ВЕТ методата.
 Притоа, било утврдено дека силата на дробење на таблетите зависи
правопропорционално и речиси линеарно од нивната површина.
 Дополнително, било утврдено дека таблетните компакти, подготвени
од погрубите фракции, поседуваат значително помали површини во
споредба со таблетните компакти, подготвени од пофините
фракции.
МИКРОМЕРИТИКА: ПОРОЗНОСТ НА ПРАШОЧЕН
МАТЕРИЈАЛ
 И покрај тоа што постојат различни методи за карактеризација на
порозноста на честиците, сепак, најчесто применуван метод за оваа
цел, претставува порозиметријата.
 Под поимот порозиметрија се подразбира аналитичка техника која се
користи за одредување на параметри, поврзани со порозноста на
честиците, како на пример, дијаметарот и вкупниот волумен на
порите.
 Порозиметријата се темели на употреба на неквасечки флуид, а
имајќи предвид дека контактниот агол на живата со стаклото,
апроксимативно изнесува 140о, може да се заклучи дека истата
претставува одличен пример за флуид, кој може да се користи во
порозиметријата.
 Под дејство на надворешен притисок, флуидот навлегува во
порите, како резултат на што, се одредува дијаметарот, односно
големината на порите. Притоа, до колку е помала пората, до толку е
потребен повисок притисок за да истата се исполни со соодветниот
флуид и обратно.
 На навлегувањето на флуидот во порите се спротивставува силата
на површинскиот напон на флуидот.
МИКРОМЕРИТИКА: ГУСТИНА НА ПРАШОЧЕН
МАТЕРИЈАЛ
 Густината на прашочниот материјал се дефинира како

однос помеѓу масата и волуменот на прашокот.
 Врз основа на волуменот кој го зафаќа прашочниот
материјал, постојат три различни категории на густини:
1. Привидна густина на прашочен материјал;
2. Привидна густина на прашочен материјал по тапкање;
3. Вистинска густина.
МИКРОМЕРИТИКА: ПРИВИДНА ГУСТИНА НА ПРАШОЧЕН
МАТЕРИЈАЛ
 Привидната густина се добива со мерење на волуменот

на позната маса прашочен материјал во соодветен сад
за мерење волумен.
 Доколку за оваа цел се користи градуиран цилиндар,
односно мензура, тогаш отчитувањето на вредноста за
волуменот се врши согласно најблискиот mL.
 На крај, привидната густина се пресметува како
количник од масата на прашочниот материјал и
отчитаниот волумен.
МИКРОМЕРИТИКА: ПРИВИДНА ГУСТИНА НА ПРАШОЧЕН
МАТЕРИЈАЛ ПО ТАПКАЊЕ
 Привидната густина по тапкање се одредува на ист

начин како и привидната густина, така што, во овој случај,
волуменот на прашочниот материјал не се отчитува
веднаш, туку по изложување на прашокот на
контролирани механички стресови.
 Под дејство на овие стресови, прашочниот материјал ќе
се распореди во помал волумен.
 При одредување на односот помеѓу масата и отчитаниот
волумен на прашокот, секогаш ќе се добиваат поголеми
вредности за привидната густина по тапкање во
споредба со вредностите добиени за привидната густина.
МИКРОМЕРИТИКА: ВИСТИНСКА ГУСТИНА НА
ПРАШОЧЕН МАТЕРИЈАЛ
 Вистинската густина се дефинира како просечна маса

на прашочен материјал на единица волумен.
 При одредувањето на вистинската густина, не треба да
се земат предвид празнините кои не претставуваат
составен дел од молекуларното пакување.
 Вообичаено, за одредување на овој тип на густина се
користи посебна метода, која се означува како
хелиумска пикнометрија.
 Оваа метода се базира на одредување на волуменот на
прашочниот материјал преку волуменот на гасот,
расеан низ прашокот.
КАРАКТЕРИЗАЦИЈА НА ПРАШОЦИ
 Евалуацијата на механичките карактеристики на даден прашок е од
круцијално значење кога станува збор за обработка на овој тип на
материјал. Вакви податоци може да се добијат:
 пред било каква обработка на прашокот;
 во текот на компактирањето на прашочниот материјал;
 после компресирањето на прашокот во таблетни компакти.
 Евалуацијата на механичките карактеристики на прашокот, пред истиот
да се обработи, е важна заради одредување на проточните својства
на прашокот. Податоците кои се добиваат во текот на компактирањето
на прашочниот материјал пак, се значајни за оптимизација на процесот
на консолидација, додека анализите на таблетните компакти треба да
претставуваат составен дел од анализите кои се спроведуваат заради
контрола на квалитет.
 Како и да е, при карактеризација на прашоците, акцент треба да се стави
и на интеракциите кои настануваат помеѓу честиците присутни во
прашокот. Токму поради оваа причина, методите за карактеризација на
прашоците треба да бидат дизајнирани на начин, преку кој истите ќе
овозможуваат добивање на информации за овој тип на интеракции.
 При изработка на цврстите дозирани форми, параметар на кој треба
да се посвети исклучително внимание, претставува проточноста на
прашокот.
 Ефикасноста на компресијата на таблетите, пред сѐ, зависи од
брзината со која прашокот се воведува во апаратурата за
компресија. Според тоа, до колку е поголема брзината на компресија
на таблетите, до толку треба да биде поголема и брзината со која
прашочниот материјал се воведува во апаратурата за компресија.
Меѓутоа, ако прашочниот материјал се одликува со ниска проточност,
тогаш ваквата висока брзина не може да се постигне.
 Имајќи предвид дека голем број фармаколошки активни компоненти
поседуваат кохезивна природа, може да се заклучи дека истите се
одликуваат со незадоволителни проточни својства. Токму поради
оваа причина, една од главните цели на процесот на гранулација, е
да се намали кохезивната природа на фармаколошки активните
компоненти, со цел да се добие материјал со погодни физички
карактеристики за понатамошна обработка.
 За евалуација на проточноста на прашочниот материјал бил воведен
посебен систем, кој обединува четири главни параметри:
1. Агол на мирување
 Аголот на мирување се дефинира како агол кој се формира во однос на
хоризонтална површина, врз која внимателно се истура прашочен
материјал. Притоа, аголот на мирување може да се одреди само откако
прашочниот материјал ќе формира конус кој не се распаѓа.
2. Агол на шпатула
 Во основа, аголот на шпатула претставува агол на мирување, кој се
формира во однос на површината на шпатулата, со која се зема
одредено количество прашок од вкупното количество прашок.
3. Компресибилност
 Компресибилноста се проценува преку одредување на привидната
густина и привидната густина по тапкање.
4. Кохезија
 Кохезијата директно се поврзува со постоењето на сили на
привлекување на површината на честиците.
AНАЛИТИКА НА ЛЕКОВИ 2 1
Фармација, 2020
Вежба бр.1
Испитување и контрола на финални фармацевтски дозирани форми
ЦВРСТИ ДОЗИРАНИ ФОРМИ
- ТАБЛЕТИ –
1. Вовед
Таблетите се цврсти, еднодозни препарати кои содржат една или повеќе активни
супстанции. Тие се добиваат со компресија на воедначен волумен на честички или со
друга производствена техника. Таблетите се наменети за орална администрација,
некои се за џвакање, некои се раствораат или се диспергираат во вода пред употреба.
Обично се мазни, округли, цврсти, цилиндрични, на површината рамни или

конвексни и на краевите може да бидат закосени. Може да имаат фалцета на краевите,
симболот на брендот или други ознаки. Таблетите може да бидат и обложени.
Се разликуваат неколку категории на таблети:
- Необложени таблети
- Обложени таблети
- Ефеверсцентни таблети
- Растворливи таблети
- Дисперзибилни таблети
- Гастро – резистентни таблети
- Таблети со модифицирано ослободување
- Таблети за орална употреба
• Сублингвални
• Букални
• Мукоадхезивни
• За џвакање
• Пастили (за шмучкање)
2. Тестови за испитување на таблети

Општи испитувања
✓ Содржина
✓ Униформност на маса (2.9.5)
✓ Униформност на содржина (2.9.6) Според Европска
✓ Униформност на дозирани единици (2.9.40) Фармакопеја и
✓ Растворливост (2.9.3) насоките на ICH
Специфични испитувања водичи
✓ Распадливост (2.9.1)
✓ Содржина на вода
✓ Микробиолошка чистота
✓ Цврстина/фријабилност
3. Монографија на Парацетамол таблети, BP 2011
3.1 Содржина на Британска Фарамакопеја
Vol 1-2 Medicinal and

Pharmaceutical Substances
Vol 3 Formulated
preparation
Vol 4 Herbal drugs and

radiopharmaceuticals
Vol 5 Spectra and

Appendices
British Pharmacopoeia, Volume III

Formulated Preparations: Specific Monographs
Paracetamol Tablets
ACTION AND USE
Analgesic; antipyretic.
DEFINITION
Paracetamol Tablets contain Paracetamol.
With the exception of the requirements for shape, the tablets comply with the requirements
stated under Tablets and with the following requirements.
Content of paracetamol, C8H9NO2

95.0 to 105.0% of the stated amount.
IDENTIFICATION
Extract a quantity of the powdered tablets containing 0.5 g of Paracetamol with 20 ml of
acetone, filter, evaporate the filtrate to dryness and dry at 105°. The residue complies with the
following tests.
A. The infrared absorption spectrum, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum
of paracetamol (RS 258).
B. Boil 0.1 g with 1 ml of hydrochloric acid for 3 minutes, add 10 ml of water and cool; no
precipitate is produced. Add 0.05 ml of 0.0167M potassium dichromate; a violet colour is
produced slowly which does not turn red.
C. Melting point, about 169°, Appendix V A.

TESTS
Dissolution
Comply with the dissolution test for tablets and capsules, Appendix XII B1, using Apparatus
II. Use as the medium 900 ml of phosphate buffer pH 5.8 and rotate the paddle at 50
revolutions per minute. Withdraw a sample of 20 ml of the medium and filter. Dilute the filtrate
with 0.1M sodium hydroxide to give a solution expected to contain about 0.00075% w/v of
Paracetamol. Measure the absorbance of this solution, Appendix II B, at the maximum at 257
nm using 0.1M sodium hydroxide in the reference cell. Calculate the total content of
paracetamol, C8H9NO2, in the medium taking 715 as the value of A (1%, 1 cm) at the maximum
at 257 nm.
Related substances
Carry out the method for liquid chromatography, Appendix III D, using the following solutions.
Prepare the solutions immediately before use and protect from light. For solution (1) disperse
a quantity of powdered tablets containing 0.2 g of Paracetamol in 8 ml of the mobile phase
with the aid of ultrasound, add sufficient mobile phase to produce 10 ml, mix well and filter.
For solution (2) dilute 1 volume of solution (1) to 20 volumes with mobile phase and dilute 1
volume of this solution to 20 volumes with mobile phase. Solution (3) contains 0.002% w/v
each of 4-aminophenol and paracetamol BPCRS in the mobile phase. Solution (4) contains
0.00002% w/v of 4'- chloroacetanilide in the mobile phase.
The chromatographic procedure may be carried out using (a) a stainless steel column packed
with octylsilyl silica gel for chromatography (5 μm) (Zorbax Rx C8 is suitable), (b) as the mobile
phase with a flow rate of 1.5 ml per minute, at a temperature of 35°C, a mixture of 250 volumes
of methanol containing 1.15 g of a 40% v/v solution of tetrabutylammonium hydroxide with 375
volumes of 0.05M disodium hydrogen orthophosphate and 375 volumes of 0.05M sodium
dihydrogen orthophosphate and (c) a detection wavelength of 245 nm.
The test is not valid unless, in the chromatogram obtained with solution (3), the resolution
factor between the two principal peaks is at least 4.0.
Inject solution (1) and allow the chromatography to proceed for 12 times the retention time of
the principal peak. In the chromatogram obtained with solution (1) the area of any peak
corresponding to 4-aminophenol is not greater than the area of the co - chloroacetanilide is
not greater than the area of the principal peak in solution (4) (10 ppm) and no other impurity
is greater than the area of the principal peak obtained with solution (2) (0.25%).
ASSAY
Weigh and powder 20 tablets. Add a quantity of the powder containing 0.15 g of Paracetamol
to 50 ml of 0.1M sodium hydroxide, dilute with 100 ml of water , shake for 5 minutes and add
sufficient water to produce 200 ml. Mix, filter and dilute 10 ml of the filtrate to 100 ml with
water. Add 10 ml of the resulting solution to 10 ml of 0.1M sodium hydroxide, dilute to 100 ml
with water and measure the absorbance of the resulting solution at the maximum at 257 nm,
Appendix II B. Calculate the content of C8H9NO2 taking 715 as the value of A (1%, 1 cm) at
the maximum at 257 nm.
STORAGE
Paracetamol Tablets should be protected from light.
4. Спецификација за квалитет
Спецификацијата е документ кој служи како основа за проценка на квалитетот,

предложен од производителот, а потврден од регулаторните органи во нашата држава
и тоа: лабораторијата за контрола на лекови при Институтот за Јавно здравје во Скопје,
и Центарот за испитување и контрола на лекови при Фармацевтскиот факултет во
Скопје. Спецификација треба да има за почетните супстанции, материјалот за пакување
и за готовите производи.
Спецификацијата за готовите фармацевтски производи, содржи податоци за:
1) Заштитено име на производот и незаштитено меѓународно име и шифра (доколку

е потребно);
2) Состав (формула) или нивна референца;
3) Фармацевтски облик и податоци за пакувањето;
4) Упатство за узорцирање и испитување или референца на постапките;
5) Квалитативни и квантитативни барања со дозволени гранични вредности;
6) Услови на чување и посебни мерки на претпазливост во тек на ракувањето, кога
е применливо;
7) Рок на траење.
Име на препаратот, јачина и дозирана форма:__________________________________

Серија бр.: ______________________ Пакување: _______________________________
Произведено: ______________________ Рок на траење: _________________________
Аналитички Гранични
Параметар
Метод вредности
1. Изглед Визуелно
2. Идентификација А,В,С
90-105,0% од
3. Содржина Спектрофотометриски
декларираната содржина
Дисолуција на цврсти
Да не е помалку од
4. Растворливост ФДФ (таблети и капсули),
Q+5%
BP 2011, Appendix XII B1
4-aminophenol
5. Онечистувања
4'- chloroacetanilide
5. Сертификат за квалитет на готовиот фармацевтски производ
Гранични
Барање за квалитет Резултати
вредности
1. Изглед
2. Идентификација
3. Содржина
4. Растворливост
Заклучок:
Датум: Изработил:
Одобрил:
* Ph.Eur 8.0, Општа монографија на фармацевтски дозирани форми, Таблети
Вежба бр. 2
- ФИЛМ ОБЛОЖЕНИ ТАБЛЕТИ –
1. Интерпретација на монографија по Британска Фармакопеја
Официјалното име на производот во Велика Британија. Аспирин е британско

одобрено име (БАН), т.е. незаштитено име за ацетилсалицилна киселина во
Велика Британија (Appendix XXI B Одобрени синоними).
Општи насоки:
• обезбедува корисни информации за користење на BP
• објаснува дека производот треба да биде во согласност со
монографијата, кога се тестира
• објаснува кои делови од монографиите се задолжителни и кои се
советодавни
• објаснува дека може да се користат алтернативни тестови на оние кои
се опишани во монографијата
Ова е дополнителен наслов, кој исто така е официјален наслов за продуктот

што треба да бидат во согласност со оваа монографија. Ова име не треба
да се користи при продажба на продуктот во Велика Британија.
Дополнителни информации за најчестите индикации. Ова не е опсежно

објаснето и обично е усогласено со записот во изданието на британските
одобрени имиња (БАН).
Лековата супстанција што се користи за производство на таблетата мора да

биде во согласност со релевантната монографија Ph Eur или BP за таа
супстанција. Во овој случај, монографијата на Аспирин (Ph. Eur. монографија
0309, Ацетилсалицилна киселина).
Таблетите мора да бидат во согласност со Општата монографија за

Таблети.
Таблетите мора да содржат 95,0 до 105,0% од декларираната содржина на

етикетата додека е рокот на траење на производот. Содржината е напишана
во однос на побарувачката за етикетата на производот, што може да не
одговара на целосниот наслов на монографијата на лековите. Ова е
вообичаено кога лековитата супстанција што се користи за производство на
производот е во форма на сол.
BP монографиите се дизајнирани за производи што се произведуваат во рамките на

квалитет на медицински продукти. Кога се применува во оваа рамка, тестот за
идентификација (или тестовите) во монографијата се доволни за да се потврди дека
лековитиот продукт ја содржи лековитата супстанција која е запишана на етикетата.
Онаму каде што зборот / фразата е во italics, значи дека е поврзано со друг дел од
BP. Во овој случај, содржината за апсолутен етанол во Appendix I A. Употребениот
реагенс треба да биде во согласност со критериумите наведени во додатокот.
Тестовите во овој дел од монографијата се користат за да ги определат

карактеристиките за квалитет на продуктот. Продуктот мора да одговара на барањата
на овие тестови.
Методите во монографијата се официјални методи кои го поддржуваат стандардот.
Сепак, може да се користат и алтернативни методи доколку корисникот може да
докаже дека дава еквивалентни мерење на барањата. Ова е наведено во General
Notices Part II, во делот 'Assays and Tests'.
Граничните вредности на Q не беа применети во монографиите објавени пред БП

2008 година; барањата од Appendix XII B. Монографиите на Британската фармакопеја
кои се применуваат во овој случај и засегнатите монографии, се наведени во SC I E
Dissolution Testing of Solid Oral Dosage Forms.
Монографиите кои за прв пат се објавени во BP 2008 година или покасно, треба да
бидат во согласност со Appendix XII. Растворливоста и Q граничните вредност ќе
бидат дадени во монографијата.
Кога во монографијата не постои делот „Limits“ кој следи по делот 'Determination of

content', проверете го делот 3.4 од Supplementary Chapter I E Dissolution Testing of
Solid Oral Dosage Forms. Ако името на монографијата е наведен таму, граничните
вредности не треба да бидат помали од 70% од декларираната содржина за време
од 45 минути.
Ако монографијата не е наведена во SC I E, следете го ‘’decision tree’’ во делот 3.3
од истото дополнително поглавје.
Овој тест е повеќе дизајниран да обезбеди границите за потенцијални онечистувања

поврзани со лековитата супстанција, а не и за сите можни онечистувања, како што се
онечистувања од загадувачи.
Информативните летоци за BPCRS можат да бидат добар водич, на пр. за

референтни хроматограми. Информационите летоци се достапни бесплатно во
каталогот за референтни стандарди преку Интернет:
https://www.pharmacopoeia.com/Catalogue/Products. Референтен материјал со
суфиксот EPCRS и CRS може да се види и од Европската дирекција за квалитет на
лекови и здравствена заштита (EDQM): https://www.edqm.eu/en/ph-eur-reference-
standards-ords-catalogue
Appendix III Техники за раздвојување со хроматографија вклучуваат детали за

прилагодување на хроматографските услови.
Дадена како информација е Марката/производителот на колоната што се користела

при воспоставување на методот од монографијата.
General notices бараат да, освен ако не е поинаку пропишано, Содржина и Тестовите
да се изведуваат на температура помеѓу 15 до 25 ° C. Амбиенталната температура
треба да биде во просек од 15 до 25 ° C.
Важно е да се забележи зборот „about“. Доколку се исполнети условите за

соодветност на системот – system suitability (подолу) и да може да видат
идентификувани онечистувањата, тогаш retention time не мора да биде точно 5
минути. Веројатно ќе има варијација заради употреба на различна опрема и колони.
Проверете го делот More resources во онлајн верзијата на BP на пример, за резултати
од тестот на примерокот (ако има некои достапни).
Appendix III Техники за хроматографско раздвојување дава детали за тоа како да се

измери резолуцијата.
Водич за контрола на онечистувањата и за пресметување на граничните вредности

може да се најде во SC I А. Контрола на онечистувања и SC VI A. Фармакопејски
пресметки.
Граничните вредности се мерат според површината на пикот добиен од растворот за

гранични вредности, во овој случај раствор (3).
Во овој пример, границата на онечистување е определена во однос на надворешниот

стандард на онечистување.
Сепак, најчесто е растворот за определување на граничните вредности да се добие

со разредување на тест-растворот.
Разредувањето на тест-растворот (раствор (1)) е уште еден чест начин за
подготвување на растворот за определување на гранични вредности.
Бројот (3%) ја означува границата во процент што се однесува на количината на
Аспирин во тест-растворот и е дадена за да се користи како информации. Тоа не е
нумеричка граница.
Ако е дадена граница со бројка, бројката ќе биде дадена во делот за гранични
вредности без заграда на пр. „вкупните онечистувања да не се поголеми од 2,0%“.,
Секундарните пикови не ги вклучуваат лековитите супстанции, реагенсите,

внатрешните стандарди и агенсите за добивање. Пиковите што се резултат на
мобилната фаза, матрицата на примерокот, ексципиенсите и counter-јони, исто така,
може да се занемарат. Било кој друг секундарен пик, се однесува на пик на сродна
сустанција во хроматограмот, освен сите нечистотии веќе наведени во делот за
ограничувања. Повеќе детали за секундарните пикови може да се најдат во Appendix
III Техники за хроматографско раздвојување – Quantification и Appendix III D Течна
хроматографија – Additional points for monographs of the British Pharmacopeia.
Ако во делот лимит е напишано како 'the sum of the area of any secondary peaks', тогаш
збирот треба да ги вклучува сите сродни онечистувања кои се детектирани над
границата земена во обзир. Ако во делот лимит е напишано како „the sum of the areas
of any other secondary peaks“, тогаш сумата не треба вклучува никакви сродни
онечистувања кои имаат специфични граници што се применуваат за нив. Во овој
случај, ако има пик што одговара на онечистување С во примерокот, тој не треба да
биде вклучен во збирот на било кои „други секундарни пикови“.
Бидејќи монографиите на BP, во повеќето случаи, можат да се применат на различни

јачини на продуктот, границата која е земена во обзир обично се заснова на
максималната дневна доза за лековитата супстанца и упатствата за ICH водичите.
20 единици традиционално се прифаќа како статистички репрезентативен примерок

на серија.
Декларираната содржина на BPCRS може да се пронајде во каталогот достапен online

и во брошурата.
Барањата за етикетирање во монографиите не се сеопфатни и треба да бидат

исполнети барањата на регулаторниот орган каде се продава производот. Повеќе
информации за состојбата и толкувањето на делот за етикетирање може да се најде
во Supplementary Chapter I G Labelling.
Ова значи дека со тестот за Сродни супстанции може да се детектираат и

контролираат онечистувањата наведени во монографијата за лекови за Аспирин (Ph.
Eur. монографија 0309, Ацетилсалицилна Киселина).
*Преземено од https://www.pharmacopoeia.com/how-to-use-the-bp
2. Монографија на Диазепам обложени таблети, BP 2011

Diazepam Tablets
Action and use

Benzodiazepine.
DEFINITION
Diazepam Tablets contain Diazepam.
The tablets comply with the requirements stated under Tablets and with the following requirements .
Content of diazepam, C16H13ClN2O

IDENTIFICATION
A. The light absorption , Appendix II B, in the range 230 to 350 nm of the final solution obtained
in the Assay exhibits two maxima, at 242 nm and 284 nm.
B. Carry out the method for thin-layer chromatography, Appendix III A, using the following
solutions in methanol.
(1) Shake a quantity of the powdered tablets with sufficientsolvent to produce a solution
containing 0.50% w/v of Diazepam, allow to settle and decant the supernatant liquid.
(2) 0.5% w/v of diazepam BPCRS.
CHROMATOGRAPHIC CONDITIONS
(a) Use as the coating silica gel G.
(b) Use the mobile phase as described below.
(c) Apply 2 μL of each solution.
(d) Develop the plate to 15 cm.
(e) After removal of the plate, spray it with a 10% v/v solution of sulfuric acid in absolute
ethanol, heat at 105° for 10 minutes and examine under ultraviolet light (365 nm).
MOBILE PHASE
10 volumes of methanol and 100 volumes of chloroform.
CONFIRMATION
The principal spot in the chromatogram obtained with solution (1) corresponds to that in the
chromatogram obtained with solution (2).
TESTS
Related substances and decomposition products
Carry out the procedure in subdued light. Carry out the method for thin-layer chromatography,
Appendix III A, using the following solutions in ethanol (96%).
(1) Shake a quantity of the powdered tablets containing 50 mg of Diazepam with 5 mL of

solvent, filter and use immediately.
(2) Dilute 1 volume of solution (1) to 50 volumes and use immediately.
(a) Use as the coating silica gel F254.

(b) Use the mobile phase as described below.
(c) Apply 20 uL of solution (1) and 5 uL of solution (2).
(d) Develop the plate to 12 cm.
(e) After removal of the plate, allow the solvent to evaporate and examine under ultraviolet
light (254 nm).
MOBILE PHASE
Equal volumes of ethyl acetate and hexane.
LIMITS
Any secondary spot in the chromatogram obtained with solution (1) is not more intense than
the spot in the chromatogram obtained with solution (2).
Dissolution
Comply with the requirements for Monographs of the British Pharmacopoeia in the dissolution
test for tablets and capsules, Appendix XII B1.
TEST CONDITIONS
(a) Use Apparatus 1, rotating the basket at 100 revolutions per minute.
(b) Use 900 ml of 0.1M hydrochloric acid, at a temperature of 37º, as the medium.
PROCEDURE
(1) After 45min withdraw a sample of the medium and measure the absorbance of a layer of
suitable thickness of the filtered sample, suitably diluted with 0.1M hydrochloric acid if
necessary, at the maximum at 286 nm, Appendix II B, using 0.1M hydrochloric acid in the
reference cell.
DETERMINATION OF CONTENT
Calculate the total content of diazepam, C16H13ClN2O, in the medium taking 488 as the value
of A(1%, 1 cm) at the maximum at 286 nm.
Uniformity of content
Tablets containing less than 2 mg and/or less than 2% w/w of Diazepam comply with the
requirement stated under Tablets using the following method of analysis. To one tablet add 1
mL of water, allow the tablet to disintegrate and stand for 15 minutes. Add 80 mL of a 0.5%
w/v solution of sulfuric acid in methanol, shake for 15 minutes, add sufficient of the methanolic
sulfuric acid to produce 100 mL and filter. Measure the absorbance of the filtrate at the
maximum at 284 nm, Appendix II B. Calculate the content of C16H13ClN2O taking 450 as the
value of A(1%, 1 cm) at the maximum at 284 nm.
ASSAY
Weigh and powder 20 tablets. To a quantity of the powder containing 10 mg of Diazepam add
5 mL of water, mix and allow to stand for 15 minutes. Add 70 mL of a 0.5% w/v solution of
sulfuric acid in methanol, shake for 15 minutes, add sufficient of the methanolic sulfuric acid
to produce 100 mL and filter. Dilute 10 mL of the filtrate to 50 mL with the same solvent and
measure the absorbance of the resulting solution at the maximum at 284 nm, Appendix II B.
Calculate the content of C16H13ClN2O taking 450 as the value of A(1%, 1 cm) at the maximum
at 284 nm.
STORAGE
Diazepam Tablets should be protected from light.

Параметар
Жолто, портокалови, со мазна
1. Изглед Визуелно површина, филм обложени
таблети
А – исто како определување на
А – спектрофотометриски
2. Идентификација параметар содржина
В – тенкослојна хроматографија
В – по пропис
92-107,5% од
3. Содржина Спектрофотометриски
Дисолуција на цврсти ФДФ S1 ниво
4. Растворливост (таблети и капсули), (Да не е помалку од
BP 2011, Appendix XII B1 Q+5%)
По монографија,
BP 2011
Метод на воедначеност на Индивидуална содржина да е
Воедначеност на
6. содржина помеѓу 85 - 115 % од просечната
содржина
BP 2011, Appendix XII C3 содржина
Тест за дезинтеграција на
Да нема остаток за време од
7. *Распадливост таблети и капсули,
max. 60 min
BP 2011, Appendix XII А1
Барање за Гранични
Резултати
квалитет вредности
Жолто, портокалови, со мазна
1. Изглед површина, филм обложени
таблети
А – исто како определување на
2. Идентификација параметар содржина
В – по пропис
92-107,5% од
3. Содржина
S1 ниво
4. Растворливост (Да не е помалку од
Q+5%)
Индивидуална содржина да е
Воедначеност на
6. помеѓу 85 - 115 % од
содржина
просечната содржина
7. *Распадливост
max. 60 min
Заклучок:
Одобрил:
* BP 2016, Општа монографија за воедначеност на содржина, еднодозни
препарати - Таблети
Appendix XII C, V-A377
3. Uniformity of Content
(Ph Eur method 2.9.6)
The test for uniformity of content of single-dose preparations is based on the assay of the
individual contents of active substance(s) of a number of single-dose units to determine
whether the individual contents are within limits set with reference to the average content of
the sample. The test is not required for multivitamin and trace-element preparations and in
other justified and authorised circumstances.
Method Using a suitable analytical method, determine the individual contents of active
substance(s) of 10 dosage units taken at random.
Apply the criteria of test A, test B or test C as specified in the monograph for the dosage form
in question.
TEST A
Tablets, powders for parenteral administration, ophthalmic inserts, suspensions for
injection
The preparation complies with the test if each individual content is between 85 per cent and
115 per cent of the average content. The preparation fails to comply with the test if more than
one individual content is outside these limits or if one individual content is outside the limits of
75 per cent to 125 per cent of the average content.
If one individual content is outside the limits of 85 per cent to 115 per cent but within the limits
of 75 per cent to 125 per cent, determine the individual contents of another 20 dosage units
taken at random. The preparation complies with the test if not more than one of the individual
contents of the 30 units is outside 85 per cent to 115 per cent of the average content and none
1s outside the limits of 75 per cent to 125 per cent of the average content.
*BP 2016, Општа монографија за Ултравиолетова и Видлива спектрофотометрија
Appendix II B, V-A170
B. Ultraviolet and Visible Absorption Spectrophotometry
(Ph Eur method 2.2.25)
Determination of absorbance
The absorbance (A) of a solution is defined as the logarithm to base 10 of the reciprocal of
the transmittance (T) for monochromatic radiation:
1 𝐼0
A = log10 ( ) = log10 ( )
𝑇 𝐼
T = I/l0
I0 = intensity of incident monochromatic radiation
I = intensity of transmitted monochromatic radiation
In the absence of other physico-chemical factors, the absorbance (A) is proportional to the
path length (b) through which the radiation passes and to the concentration (c) of the
substance in solution in accordance with the equation:
A = εcb
ε = molar absorptivity, if b is expressed in centimetres and c in moles per litre.

1 𝑝𝑒𝑟 𝑐𝑒𝑛𝑡
The expression A representing the specific absorbance of a dissolved substance
1 𝑐𝑚
refers to the absorbance of a 10 g/L solution in a 1 cm cell and measured at a defined
wavelength so that:
1 𝑝𝑒𝑟 𝑐𝑒𝑛𝑡 10𝜀

A =
1 𝑐𝑚 𝑀𝑟
Unless otherwise prescribed, measure the absorbance at the prescribed wavelength using a
path length of 1 cm. Unless otherwise prescribed, the measurements are carried out with
reference to the same solvent or the same mixture of solvents. The absorbance of the solvent
measured against air and at the prescribed wavelength shall not exceed 0.4 and is preferably
less than 0.2. Plot the absorption spectrum with absorbance or function of absorbance as
ordinate against wavelength or function of wavelength as abscissa.
Where a monograph gives a single value for the position of an absorption maximum, it is
understood that the value obtained may differ by not more than ± 2 nm.
Apparatus Spectrophotometers suitable for measuring in the ultraviolet and visible range of
the spectrum consist of an optical system capable of producing monochromatic radiation in
the range of 200-800 nm and a device suitable for measuring the absorbance.
Control of wavelengths Verify the wavelength scale using the absorption maxima of holmium
perchlorate solution R, the line of a hydrogen or deuterium discharge lamp or the lines of a
mercury vapour arc shown in Table 2.2.25.-1.
The permitted tolerance is ± 1 nm for the ultraviolet range and ± 3 nm for the visible range.
Suitable certified reference materials may also be used.
Control of absorbance Check the absorbance using suitable filters or a solution of potassium
dichromate R at the wavelengths indicated in Table 2.2.25.-2, which gives for each wavelength
the exact values and the permitted limits of the specific absorbance. The table is based on a
tolerance for the absorbance of ± 0.01.
For the control of absorbance, use solution of potassium dichromate R that has been
previously dried to constant mass at 130 °C. For the control of absorbance at 235 nm, 257
nm, 313 nm and 350nm, dissolve 57,0-63,0 mg of potassium dichromate R in 0.005 M
sulphuric acid and dilute to 1000.0 ml with the same acid. For the control of absorbance at
430 nm, dissolve 57,0-63,0 mg of potassium dichromate R in 0.005 M and dilute to 100.0 ml
with the same acid. Suitable certified reference materials may also be used.
Limit of stray light Stray light may be detected at given wavelength with suitable filters or
solution: for example, the absorbance of a 12g/L solution of potassium chloride R in a 1 cm
cell increases steeply between 220 nm and 200 nm and is greater than 2.0 at 198 nm when
compared with water as compensation liquid. Suitable certified reference materials may also
be used.
Resolution (for qualitative analysis) When prescribed in a monograph, measure the

resolution of the apparatus as follows: record the spectrum of a 0.02 per cent V/V solution of
toluene R in hexane R. The minimum ratio of the absorbance at the maximum at 269 nm to
that at the minimum at 266 nm is stated in the monograph. Suitable certified reference
materials may also be used.
Spectral slit-width (for quantitative analysis) To avoid errors due to spectral slit-width,
when using an instrument on which the slit-width is variable at the selected wavelength, the
slit-width must be small compared with the half-width of the absorption band but it must be as
large as possible to obtain a high value of I0. Therefore, a slit-width is chosen such that further
reduction does not result in a change in absorbance reading
Cells The tolerance on the path length of the cells used is ± 0.005 cm. When filled with the
same solvent, the cells intended to contain the solution to be examined and the compensation
liquid must have the same transmittance.
If this is not the case, an appropriate correction must be applied.
The cells must be cleaned and handled with care.
Вежба бр. 3
- КАПСУЛИ –
1. Општа монографија за КАПСУЛИ, Ph.Eur
Дефиниција
Капсули претставуваат цврсти препарати со тврди или меки обвивки со различни форми
и големини, кои вообичаено содржат единечна доза на активна супстанција/и. Наменети
се за орална администрација.
Капсулните обвивки се направени од желатин или други супстанции, а нивната

конзистенција може да се подесува со додавање на супстанции, како глицерол или
сорбитол. Може да се додаваат ексципиенси, како површинско – активни агенси,
антимикробна заштита, засладувачи, средства за боење или коригирање на вкус,
доколку се одобрени од регулаторните органи. Капсулите може да се носачи на
површински ознаки.
Содржината на капсулите може да е од цврста, течна или пастеста конзистенција. Може

да содржи една или повеќе активни супстанции, со или без ексципиенси, како
растворувачи, разредувачи, средства за подмачкување или средства за подобрување
на распаѓањето. Содржината на капсулата не смее да предизвика распаѓање на
обвивката. Обвивката се распаѓа под дејство на дигестивните течности, при што се
ослободува содржината.
Каде што е применливо, обвивката на капсулите треба да одговара на барањата за

Materials used for the manufacture of containers (3.1 и подсекциите) и Containers (3.2 и
подсекциите).
Постојат неколку категории на капсули:
− Тврди капсули
− Меки капсули
− Гастро-резистентни
− Капсули со модифицирано ослободување на активната супстанција
− Cachets
Производство
При производство, пакување, чување и дистрибуција на капсулите мора да се преземат

мерки за да се осигура нивната микробиолошка чистота, согласно препораките дадени
во делот “Микробиолошки квалитет на не стерилните фармацевтски препарати и
супстанции за фармацевтска употреба“ (5.1.4 Microbiological quality of non-sterile
pharmaceutical preparations and substances for pharmaceutical use).
Тестови
Воедначеност на дозирани единици (Ph.Eur 2.9.40)
Капсулите мора да одговараат на тестот за воедначеност на дозирани единици (2.9.40),
или ако е поинаку пропишано, на тестот за воедначеност на содржина и/или
воедначеност на маса.
Воедначеност на содржина (Ph.Eur 2.9.6)

Ако не е поинаку пропишано, капсулите во кои содржина на активната супстанца е
помала од 2 mg или помалку од 2 % од масата на полнење, треба да одговараат на
барањата на тест В за военаченост на содржина на еднодозни препарати. Ако
препаратот содржи повеќе од една активна супстанција, тогаш барањата се
применуваат само на оние компоненти кои одговараат на горенаведените услови.
Воедначеност на маса (Ph.Eur 2.9.5)

Капсулите одговараат на тестот за воедначеност на маса на еднодозни препарати. Ако
е пропишан тестот за воедначеност на содржина за сите активни супстанциии, тогаш
тестот за воедначеност на маса не е потребен.
Растворливост (Ph.Eur 2.9.3)

Се изведува аналогниот тест за капсули за да се покаже соодветното ослободување на
активната супстанција или супстанции, на пример тестот кој е опишан во Тест за
дисолуција на цврсти дозирани форми (2.9.3)
Доколку е пропишан параметарот растворливост, не е неопходно да се изведува тест
на распадливост.
Чување
Се чуваат на температура која не надминува 30°С.
Означување
На етикетата е наведено името на било кој додаден антимикробен конзерванс.
Цврсти капсули
Цврстите капсули имаат обвивка која се состои од два цилиндрични дела кои се
составуваат, секој од нив има еден заоблен крај за затворање и еден крај за отворање.
Активната супстанција/и која најчесто е во цврста форма (прашок или гранули) се полни
во едниот дел - капсулно тело, кој потоа се затвора со вториот дел - капсулна капа.
Сигурноста на затворањето може да се зајакне со соодветни средства.
ТЕСТОВИ
Распадливост (Ph.Eur 2.9.1)
Цврстите капсули треба да одговараат на тестот. Се користи вода R како течен медиум.
Кога е пропишано, како течни медиуми може да се користат 0,1 M hydrochloric acid или
artificial gastric juice R. Ако капсулите плотнуваат на површината, може да се користат и
дискови. Работи со апаратот за време од 30 мин, освен ако не е поинаку пропишано.
2. Општа монографија за КАПСУЛИ, според BP
Содржина на активна компонента во капсулите

Опсегот за содржина на активната компонента наведена во монографијата се базира
на барањата за 20 капсули или друга бројка на капсули која може да е наведена во
монографијата, опишана во делот Assay. Во услови кога не може да се обезбедат 20
капсули, може да се користат и по мал број на капсули, но не помалку од 5, при што ќе
се земе во предвид поголема толеранција на грешките при земање на примерок во
согласност со Табела 1.
Барањата во табела 1 се применуваат кога наведените граници се од 90-100%. За
граници различни од овие, дозволени се пропорционално помали или поголеми
отстапувања.
Распадливост
Одговараат на тестот за распадливост на таблети и капсули, Appendix XII A1, освен
ако не е поинаку пропишано во индивидуалната монографија.
За Цврсти или Меки капсули за кои во барањата на индивидуалната монографија е
наведен тест за растворливост, барањата за распадливост не мора да бидат изведени.
Воедначеност на содржина
Деталите за аналитичкиот метод кои се применуваат за да се определи содржината на
активната супстанција се обично наведени во монографијата. Ако не е поинаку
пропишано во монографијата, границите се дадени во тест В за воедначеност на
содржина, Appendix XII С3.
3. Монографија на Цефаклор капсули, BP 2016

Cefaclor Capsules
Action and use

Cephalosporin antibacterial.
DEFINITION
Cefaclor Capsules contain Cefaclor.
The capsules comply with the requirements stated under Capsules and with the following
requirements.
Content of anhydrous cefaclor, C15H14CIN304S
IDENTIFICATION
A. Shake a quantity of the contents of the capsules containing the equivalent of 0.3 g of
anhydrous cefaclor with 100 mL of water, filter and dilute 1 mL of the filtrate to 100 mL with
water. The light absorption, Appendix II B, in the range 190 nm to 310 nm, of the final solution
exhibits a maximum only at 264 nm.
B. In the Assay, the chromatogram obtained with solution (1) shows a peak with the same
retention time as the principal peak in the chromatogram obtained with solution (2).
TESTS
Dissolution
Comply with the requirements for Monographs of the British Pharmacopoeia in the dissolution
test for tablets and capsules, Appendix XII B1.
TEST CONDITIONS
(a) Use Apparatus 2, rotating the paddle at 50 revolutions. Per minute.
(b) Use 900 mL of water, at a temperature of 37º, as the medium.
PROCEDURE
(1) After 45 minutes withdraw a 10 mL sample of the medium, filter and dilute the filtered
solution, if necessary, with sufficient water to produce a solution expected to contain
the equivalent of about 0.025% w/v of anhydrous cefaclor. Measure the absorbance of
filtered sample at the maximum at 264 nm, Appendix II B, using water in the reference
cell.
(2) Measure the absorbance of a 0.025 % w/v solution of cefaclor BPCRS in water using
water in the reference cell.
Calculate the total content of anhydrous cefaclor, C15H14CIN304S, in the medium from
the absorbances obtained and using the declared content of C15H14CIN304S in cefaclor
BPCRS.
Related substances
Carry out the method for liquid chromatography, Appendix III D, using the following solutions
in a 0.27% w/v solution of sodium dihydrogen orthophosphate which has been adjusted to pH
2.5, if necessary, with orthophosphoric acid (solution A). The solutions should be freshly
prepared.
(1) Shake a quantity of the contents of the capsules containing the equivalent of 0.5 g of
anhydrous cefaclor with 200 mL of solution A, add sufficient of solution A to produce 250 mL
and filter.
(2) 0.002% w/v of cefaclor BPCRS.
(3) 0.0025% w/v of cefaclor BPCRS and 0.005% w/v of delta-3-cefaclor BPCRS.
(a) Use a stainless steel column (25 cm x 4.6 mm) packed with end-capped octadecylsilyl
silica gel for chromatography (5 um) (Spherisorb ODS-2 is suitable).
(b) Use gradient elution and the mobile phase described below.
(c) Use a flow rate of 1 mL per minute.
(d) Use an ambient column temperature.
(e) Use a detection wavelength of 220 nm.
(f) Inject 20 wL of each solution.
MOBILE PHASE
Mobile phase A A 0.78% w/v solution of sodium dihydrogen orthophosphate adjusted to
pH 4.0 with ortophosphoric acid.
Mobile phase B Mix 450 volumes acetonitrile with 550 volumes of mobile phase A.
Equlibrate the column with mixture of 5 volumes od mobile phase B and 95 volumes of mobile
phase A for at least 15 minutes. Inject the solutions and carry out the following gradient elution.
SYSTEM SUITABILITY
The test is not valid unless, in the chromatogram obtained with solution (3), the resolution
factor between the peaks due to cefaclor and delta-3-cefaclor is at least 2.0. If necessary,
adjust the proportion of acetonitrile in the mobile phase.
LIMITS
In the chromatogram obtained with solution (1): the area of any secondary peak 1s not greater
than half the area of the principal peak in the chromatogram obtained with solution (2) (0.5%);
the sum of the areas of any such peaks is not greater than twice the area of the principal peak
in the chromatogram obtained with solution (2) (2%).
Disregard any peak with an area less than 0.1 times the area of the principal peak in the
chromatogram obtained with solution (2) (0.1%).
ASSAY
(1) Shake a quantity of the powdered, mixed contents of 20 capsules containing the equivalent
of 75 mg of anhydrous cefaclor with the mobile phase, add sufficient mobile phase
to produce 250 mL and filter.
(2) 0.03% w/v of cefaclor BPCRS in the mobile phase.
(3) 0.03% w/v of each of cefaclor BPCRS and delta-3-cefaclor BPCRS in the mobile phase.
(a) Use a stainless steel column (25 cm x 4.6 mm) packed with end-capped octadecylsilyl
silica gel for chromatography (5 um) (Beckman Ultrasphere ODS and Supelcosil LC-18-DB
are suitable).
(b) Use isocratic elution and the mobile phase described below.
(c) Use a flow rate of 1.5 mL per minute.
(d) Use an ambient column temperature.
(e) Use a detection wavelength of 265 nm.
(f) Inject 20 uL of each solution.
MOBILE PHASE
Dissolve 1 g of sodium pentanesulfonate in a mixture of 780 mL of water and 10 mL of

triethylamine, adjust the pH to 2.5 using orthophosphoric acid, add 220 mL of methanol and
mix.
SYSTEM SUITABILITY
The Assay is not valid unless, in the chromatogram obtained with solution (3), the resolution
factor between the peaks due to cefaclor and delta-3-cefaclor is at least 2.5 and the symmetry
factor of the peak due to cefaclor is at most 1.5.
Calculate the content of C15H14CIN304S in the capsules from the chromatograms obtained and
using the declared content of C15H14CIN304S in cefaclor BPCRS.
STORAGE
Cefaclor Capsules should be stored at a temperature not exceeding 30°.
LABELLING
The quantity of active ingredient is stated in terms of the equivalent amount of anhydrous
cefaclor.

Параметар
Бело-сини тврди, желатинозни
1. Изглед Визуелно капсули, исполнети со кремасто -
жолт прашок
А – по пропис
А – спектрофотометриски
2. Идентификација В – споредба на ретенциони
В – течна хроматографија
времиња на пиковите
95-105,0% од
3. Содржина Течна хроматографија
Дисолуција на цврсти ФДФ S1 ниво
4. Растворливост (таблети и капсули), (Да не е помалку од
BP 2016, Appendix XII B1 Q+5%)
5. Онечистувања Течна хроматографија По монографија ВР 2016
По метод на воедначеност на
Воедначеност на L1 (n=10): AV < 15
6. маса
дозирани единици L2 (n=30): AV < 25
BP 2016, Appendix XII C4
Тест за распадливост на таблети
7. *Распадливост и капсули,
max. 60 min
BP 2016, Appendix XII А1
Резултати
Бело-сини тврди, желатинозни
1. Изглед капсули, исполнети со кремасто
- жолт прашок
А – по пропис
2. Идентификација В – споредба на ретенциони
времиња на пиковите
95-105,0% од
3. Содржина
S1 ниво
4. Растворливост (Да не е помалку од
Q+5%)
По пропис во
монографија
Воедначеност на L1 (n=10): AV < 15

6. содржина L2 (n=30): AV < 25

7. *Распадливост
max. 60 min
Заклучок:
Одобрил:
* BP 2016, Општа монографија за воедначеност на маса и воедначеност на
содржина, еднодозни препарати - капсули
1. UNIFORMITY OF WEIGHT (MASS) OF SINGLE-DOSE PREPARATIONS
Weigh individually 20 units taken at random or, for single-dose preparations presented in
individual containers, the contents of 20 units, and determine the average mass. Not more
than 2 of the individual masses deviate from the average mass by more than the percentage
deviation shown in Table 2.9.5.-1 and none deviates by more than twice that percentage.
For capsules and powders for parenteral administration, proceed as described below.
CAPSULES
Weigh an intact capsule. Open the capsule without losing any part of the shell and remove the
contents as completely as possible. For soft shell capsules, wash the shell with a suitable
solvent and allow to stand until the odour of the solvent is no longer perceptible. Weigh the
shell. The mass of the contents is the difference between the weighings. Repeat the procedure
with another 19 capsules.
2. UNIFORMITY OF WEIGHT (MASS) OF DELIVERED DOSES FROM MULTIDOSE

CONTAINERS
3. UNIFORMITY OF CONTENT (Ph Eur method 2.9.6)
The test for uniformity of content of single-dose preparations is based on the assay of the
individual contents of active substance(s) of a number of single-dose units to determine
whether the individual contents are within limits set with reference to the average content of
the sample. The test is not required for multivitamin and trace-element preparations and in
other justified and authorised circumstances.
Method Using a suitable analytical method, determine the individual contents of active
substance(s) of 10 dosage units taken at random.
Apply the criteria of test A, test B or test C as specified in the monograph for the dosage form
in question.
TEST B
Capsules, powders other than for parenteral administration, granules, suppositories,

pessaries. The preparation complies with the test if not more than one individual content is
outside the limits of 85 per cent to 115 per cent of the average content and none is outside
the limits of 75 per cent to 125 per cent of the average content. The preparation fails to comply
with the test if more than 3 individual contents are outside the limits of 85 per cent to 115 per
cent of the average content or if one or more individual contents are outside the limits of 75
per cent to 125 per cent of the average content.
If 2 or 3 individual contents are outside the limits of 85 per cent to 115 per cent but within the
limits of 75 per cent to 125 per cent, determine the individual contents of another 20 dosage
units taken at random. The preparation complies with the test if not more than 3 individual
contents of the 30 units are outside the limits of 85 per cent to 115 per cent of the average
content and none is outside the limits of 75 per cent to 125 per cent of the average content.
Вежба бр. 4
ПАРЕНТЕРАЛНИ ПРЕПАРАТИ
- ИНФУЗИИ –
1. Општа монографија за парентерални препарати, Ph.Eur 0520
Стерилни препарати наменети за апликација со инјектирање, инфузија или
имплантација во телото на човекот или животните.
Парентералните препарати може да содржат ексципиенти, на пример за да се подготват

како изотонични раствори во однос на крвта, за да се подеси рН, да се зголеми
растворливоста, да се спречи распаѓање на активната супстанција или да се обезбеди
соодветна антимикробна заштита, а притоа не смее да влијае негативно на
медицинското дејство на препаратот, не смее да предизвика токсичност или локална
иритација доколку се користи во пропишаната концентрација.
Контејнери за парентерални препарати се прават колку што е можно, од материјали што

се доволно транспарентни за да има можност за визуелна преглед на содржината,
освен за изработка на импланти и во други оправдани и овластени случаи.
Каде што е применливо, контејнерите за парентерални препарати одговараат на

барањата за материјали што се користат за производство на контејнери (Materials used
for the manufacture of containers) (3.1 и подточки) и контејнери (Containers) (3.2 и под-
дел).
Парентерални препарати наменети за хронична употреба или за целосна парентерална
исхрана треба да имаат соодветни граници за специфични компоненти или елементи,
земајќи ја во предвид долготрајната токсичност.
Парентералните препарати се испорачуваат во стаклени садови (3.2.1) или во други

контејнери, како што се пластични садови (3.2.2, 3.2.2.1 и 3.2.9) и шприцови. Цврстината
на садот е обезбеден со соодветни средства. Затворања обезбедете добар заптивка,
спречете го пристапот на микроорганизмите и други загадувачи и обично дозволуваат
повлекување на дел или целата содржина без отстранување на затворање.
Пластичните материјали или еластомерите (3.2.9) порано производството на
затворачите се доволно цврсти и еластични за дозволи поминување на игла со најмалку
можно пролевање на честички. Затворачите за повеќекратни контејнери се доволно
еластични за да се осигури дека пункцијата е повторно откриена кога игла е повлечена.
Се разликуваат неколку категории на парентерални препарати
− препарати за инјектирање
− интравенски инфузии
− концентрати за интравенски инфузии и инјекции
− прашоци за инјекции или интравенски инфузии
− импланти
За време на развојот на парентералните препарати, формулацијата која содржи
антимикробни конзерванси, која е ефективноста на избраниот конзерванс, треба да се
демонстрира пред надлежниот орган. Соодветниот метод на тестирање, заедно со
критериумите за оценување на антимикробните својствата на конзервансот на
формулацијата се опишани во Ефикасност на антимикробните конзерванси (Efficacy of
antimicrobial preservation Ph.Eur.5.1.3).
Парентералните препарати се подготвуваат со користење на материјали и методи со
цел да се обезбеди стерилност и да се избегне навлегување на контаминенти и раст на
микроорганизми. Препораките се предвидени во текстот Методи за подготовка на
стерилни производи (Methods of preparation of sterile products Ph.Eur. 5.1.1).
Водата која се користи за производството на парентерални препарати е во согласност
со барањата за вода за инјекции ‘’in bulk’’ наведени во монографијата за Вода за
инјекции (Water for injections 0169).
Тестови
Контаминација од честички: суб-видливи честички (2.9.19).
За препарати за човечка употреба, растворите за инфузија или растворите за инјекции
треба да одговараат со тестот.
Во случај на препарати за субкутана или интрамускуларна инјекција, соодветни се
пошироки граници.
Радиофармацевтските препарати се ослободени од овие барања. Препарати за кои на
етикетата се наведува дека за производот што треба да се користи финален филтер,
се ослободени од овие барања, под услов да се докаже дека филтерот одговара на
барањата што е во согласност со тестот.
За препаратите за ветеринарна употреба, кога се доставуваат во пакувања со
номинална содржина повеќе од 100 ml и кога содржината е еквивалентна на доза на
повеќе од 1,4 ml на килограм телесна маса, растворот за инфузија или растворот за
инјекција мора да одговара на тестот за контаминација со честички: суб-видливи
честички.
Стерилност (2.6.1). Парентералните препарати одговараат на тестот за стерилност.
Чување
Да се чуваат во стерилни, херметички затворени садови и садови кои го штитат
производот од расипување.
Сигнатурата содржи:
− Име и концентрацијата на кој било кој додаден антимикробен конзерванс,
− Каде што е применливо, растворот треба да се користи треба да се користи
заедно со финалниот филтер,
− Каде што е применливо, препаратот е ослободен од бактериски ендотоксини или
дека е апироген.
Инфузии
Инфузии се стерилни, водени раствори или емулзии со вода како континуирана фаза.
Најчесто се приготвуваат изотонични со крвта. Главно се наменети за администрирање
во голем волумен. Инфузиите не содржат никаков додаден антимикробен конзерванс.
Растворите за инфузија, испитувани под соодветни услови на видливост, се бистри и

практично ослободени од честички.
Емулзиите за инфузија не треба да покажуваат никаква фазна сепарација.
При производството на инфузии кои содржат дисперзирани честички, се преземаат

мерки за да се обезбеди соодветна и контролирана големина на честички во однос на
намената.
Волуменот на инфузија во пакувањето е доволно за да овозможи повлекување и

администрирање на номинална доза со користење на нормална техника (2.9.17).
Тестови
Бактериски ендотоксини – пирогени.

Треба да одговараат на барањата со тестот за бактериски ендотоксини (2.6.14) или каде
што е оправдано и пропишано со тестот за пирогени (2.6.8). За вториот тест,
инјектирајте 10 ml на килограм телесна маса во секој зајак, освен ако поинаку не е
поинаку пропишано.
2. Општа монографија за парентерални препарати, според BP
Покрај наведените барања во Европската Фармакопеја, следните барања треба да

се применат на било кои инјекции, инфузии, прашоци за инјекции или концентрирани
раствори кои се дел од индивидуалните монографии во Британската Фармакопеја.
ДЕФИНИЦИЈА
Дефиницијата за одреден Парентерален препарат како раствор, емулзија или

суспензија во вода за инјекции, не исклучува воведување на соодветни ексципиенси
каде е неопходно со цел да одговараат на наведените барањата на Европската
фармакопеја. Особено, водените Парентерални препарати за субкутана,
интрадермални, интрамускулна дминистрација или, во случај да е можно, големи
количини за интравенски пат, ако е возможно треба да се направат изотонични со
крвта со додавање на натриум хлорид или други соодветни супстанции. Меѓутоа,
ако се користат супстанции за пуферирање во препарати наменети за
интраокуларна или интракардијална инјекција или во препарати што можат да бидат
во контакт со цереброспинална течност, треба особено да се внимава на природата
и концентрацијата на избраната супстанција да се соодветни за предвидениот пат
на администрација.
Онаму каде активната состојка е подложна на оксидативна деградација, треба да се

преземат соодветни мерки на претпазливост, како што е додавање на соодветен
антиоксиданс или чување под сфера од азот ослободен од кислород или друг
погоден инертен гас.
Методите на стерилизација што можат да се користат во производството на
парентералните препарати се опишани во Appendix XVIII.
Кога е дадена насока да се користи Вода за инјекции во производство на

парентералните препарати, се користи in bulk вода за инјекции. Кога е нагласено да
се употребува на вода за инјекции ослободена од од растворен воздух или вода за
инјекции ослободена од растворен воздух или Вода за инјекции ослободена од
јаглероден диоксид, вода која свежо е подготвена со процесот опишан под Вода за
инјекции се врие најмалку 10 минути, со што е можно помала изложеност на воздух,
се лади претпазливо за да не се изложи на воздух и јаглероден диоксид, се и
стерилизира со загревање во автоклав.
Чување
Системите за затворање кои се користат како контејнери за масните парентерални
препарати треба да бидат изработени од материјали резистентни на масла.
ИНФУЗИИ
Сигнатурата наведува дека инјекцијата не треба да се користи доколку се присутни
видливи честички.
3. Монографија на Глукоза инфузионен раствор, BP 2016

Glucose Infusion
Glucose Injection
Glucose Intravenous Infusion
DEFINITION
Glucose Infusion is a sterile solution of Anhydrous Glucose or Glucose. It is supplied as a

ready-to-use solution.
The intravenous infusion complies with the requirements stated under Parenteral Preparations and with
the following requirements.
Content of glucose, C6H12O6

CHARACTERISTICS
A colourless solution. Solutions containing the equivalent of 200 g per litre or more of glucose,
C6H12O6, may be not more than faintly yellow in colour.
IDENTIFICATION
A. Heat with cupri-tartaric solution R1. A red precipitate is produced.
B. The solution prepared as directed in the Assay is dextrorotatory.
TESTS
Acidity
pH, 3.5 to 6.5, Appendix V L, when determined on a solution diluted, if necessary, with water
for injections, to contain not more than the equivalent of 5% w/v of glucose, C6H12O6, and to
which 0.30 mL of a saturated solution of potassium chloride has been added for each 100 ml
of solution.
5-Hydroxymethylfurfural and related substances

Dilute a volume containing the equivalent of 1.0 g of glucose, C6H12O6, to 250 ml with water .
The absorbance of the resulting solution at the maximum at 284 nm is not more than 0.25,
Appendix II B.
Bacterial endotoxins
The endotoxin limit concentration is 0.25 IU per mL, Appendix XIV C. Dilute infusions
containing more than 5% w/v (50 g per litre) of Glucose with water BET to contain 5% w/v.
ASSAY
To a volume containing the equivalent of 2 g to 5 g of glucose, C6H12O6 add 0.2 mL of 5M
ammonia and sufficient water to produce 100 mL. Mix well, allow to stand for 30 minutes and
determine the optical rotation in a 2-dm tube, Appendix V F. The observed rotation in degrees
multiplied by 0.9477 represents the weight in g of glucose, C6H12O6 in the volume taken for
assay.
LABELLING
The strength is stated as the equivalent number of grams of glucose, C6H12O6 per litre.
When Glucose Infusion is required as a diluent for Injections or Infusions of the

Pharmacopoeia, Glucose Infusion (50 g per litre) shall be used.

Параметар
Бистар, безбоен или слабо жолт
воден раствор за инфузија
А – формирање на црвен
А – квалитативно
2. Идентификација перципитат
В – по пропис за содржина
В – р-рот да е декстрогирен
Оптичка ротација 95-105,0% од
3. Содржина
Appendix V F, BP 2016 декларираната содржина
Киселост
4. Appendix V L, BP 2016 рН 3,5 – 6,5
(Ацидитет)
5-
Спектрофотометриски,
5. Hydroxymethylfurfural Ab < 0,25
Appendix II B, BP 2016
и сродни супстанции
Бактериски
6. Appendix XIV C, BP 2016 0.25 IU per mL
ендотоксини
*Воедначеност на По метод варијација на маса, L1 (n=10): AV < 15

7.
дозирани единици Appendix XII C, BP 2016 L2 (n=30): AV < 25
*Екстрактибилен За еднодозни препарати, V да не е помал

8.
волумен Appendix XII C, BP 2016 од номиналниот V
Според метод 1. Просечниот број
на честички да не надминува 25
за еден милилитар еднакви или
поголеми од 10 μm и да не
Суб-видливи честички, надминува повеќе од 3 честички
Метод 1. Броење на честички за милилитар еднакви или
*Контаминација со под пригушена светлина поголеми од 25 μm.
9.
честички Метод 2. Броење на честички Според метод 2. Просечниот број
под микроскоп на присутни честички да не
Appendix XIII A, BP 2016 надминува 12 за еден милилитар
еднакви или поголеми од 10 μm и
да не надминува
2 за еден милилитар еднакви
или поголеми од 25 μm.

Резултати
Бистар, безбоен или слабо
1. Изглед
жолт воден раствор за инфузија
А – формирање на црвен
2. Идентификација перципитат
В – р-рот да е декстрогирен
95-105,0% од
3. Содржина
Киселост
4. рН 3,5 – 6,5
(Ацидитет)
5-Hydroxymethylfurfural
5. Ab < 0,25
и сродни супстанции
6. 0.25 IU per mL
*Воедначеност на L1 (n=10): AV < 15

7.
*Екстрактибилен V да не е помал
8.
волумен од номиналниот V
Според метод 1. Просечниот
број на честички да не
надминува 25 за еден
милилитар еднакви или
надминува повеќе од 3
честички за милилитар еднакви
*Контаминација со или поголеми од 25 μm.
9.
честички Според метод 2. Просечниот
број на присутни честички да не
надминува
Заклучок:
Одобрил:
* BP 2016, Општа монографија за воедначеност на дозирани единици
4. Uniformity of dosage units (Ph Eur method 2.9.40)
To ensure the consistency of ddosage units, each unit in a batch should have an active substance
content within a narrow range around the label claim. Dosage units are defined as dosage forms
containing single dose or a part or a dose of an active substance in each dosage unit. Unless otherwise
stated, the uniformity of dosage units specification is not intended to apply to suspensions, emulsions
or gels in single-dose containers intended for cutaneous administration.
The test for content uniformity is not required for multivitamin and trace-element preparations.
The term ‘uniformity of dosage unit’ is defined as the degree of uniformity in the amount of the active
substance among dosage units. Therefore, the requirements of this chapter apply to each active
substance being comprised in dosage units containing one or more active substances, unless otherwise
specified elsewere in this Pharmacopoeia.
The uniformity of dosage units can be demonstrated by either of 2 methods: content uniformity or mass
variation (see ‘Table 2.9.40.-1).
The test for content uniformity of preparations presented in dosage units is based on the assay of the
individual contents of active substance(s) of a number of dosage units to determine whether the
individual contents are within the. limits set. The content uniformity method may be applied all cases.
The test for mass variation is applicable for the following dosage forms:
(1 ) solutions enclosed in single-dose containers and in soft capsules;
(2) solids (including powders, granules and sterile solids) that are packaged in single-dose containers
and contain no added active or inactive substances;
(3) solids (including sterile solids) that are packaged in single-dose containers, with or without added
active or inactive substances, that have been prepared from true solutions and freeze-dried in the final
containers and are labelled to indicate this method of preparation;
(4) hard capsules, uncoated tablets, or film-coated tablets, containing 25 mg or more of an active
substance comprising 25 per cent or more, by mass, of the dosage unit or, in the case of hard capsules,
the capsule contents, except that uniformity of other active substances present in lesser proportions is
demonstrated by meeting content uniformity requirements.
The test for content uniformity is required for all dosage forms not meeting the above conditions for the
mass variation test. Alternatively, products that do not meet the 25 mg/25 per cent threshold limit may
be tested for uniformity of dosage units by mass variation instead of the content uniformity test on the
following condition: the concentration Relative Standard Deviation (RSD) of the active substance in the
final dosage units is not more than 2 per cent, based on process validation data and development data,
and if there has been regulatory approval of such a change. The concentration RSD is the RSD of the
concentration per dosage unit (m/m or m/V), where concentration per dosage unit equals the assay
result per dosage unit divided by the individual dosage unit mass. See the RSD formula in Table 2.9.40.-
2.
CONTENT UNIFORMITY
Select not fewer than 30 units,and proceed as follows for the dosage form designated. Where different
procedures are used for assay of the preparation and for the content uniformity test, it may be necessary
to establish a correction factor to be applied to the results of the latter.
Solid dosage forms Assay 10 units individually using an appropriate analytical method. Calculate the
acceptance value (see Table 2.9.40-2).
Liquid or semi-solid dosage forms Assay 10 units individually using an appropriate analytical method.
Carry out the assay on the amount of well-mixed material that is removed from an individual container
in conditions of normal use. Express the results as delivered dose. Calculate the acceptance value (see
Table 2.9.40-2).
Calculation of Acceptance Value
Calculate the Acceptance Value (AV) using the formula:
I M-Ẍ I + ks
for which the terms are as defined in Table 2.9.4
MASS VARIATION
Carry out an assay for the active substance(s) on a representative sample of the batch using an
appropriate analytical method. This value is result A, expressed as percentage of label claim (see
Calculation of Acceptance Value). Assume that the concentration (mass of active substance per mass
of dosage unit) is uniform. Select not fewer than 30 dosage units, and proceed as follows for the
dosage form designated.
Uncoated or film-coated tablets Accurately weigh 10 tablets individually. Calculate the active
substance content, expressed as percentage of label claim, of each tablet from the mass of the
individual tablets and the result of the assay. Calculate the acceptance value.
Hard capsules Accurately weigh 10 capsules individually, taking care to preserve the identity of each
capsule. Remove the contents of each capsule by suitable means. Accurately weigh the emptied shells
individually, and calculate for each capsule the net mass of its contents by subtracting the mass of the
shell from the respective gross mass. Calculate the active substance content in each capsule from the
mass of product removed from the individual capsules and the result of the assay. Calculate the
acceptance value.
Soft capsules Accurately weigh 10 intact capsules individually to obtain their gross masses, taking
care to preserve the identity of each capsule. Then cut open the capsules by means of a suitable clean,
dry cutting instrument such as scissors or a sharp open blade, and remove the contents by washing
with a suitable solvent. Allow the occluded solvent to evaporate from the shells at room temperature
over a period of about 30 min, taking precautions to avoid uptake or loss of moisture. Weigh the
individual shells, and calculate the net contents. Calculate the active substance content in each capsule
from the mass of product removed from the individual capsules and the result of the assay. Calculate
the acceptance value.
Solid dosage forms other than tablets and capsules Proceed as directed for hard capsules, treating
each unit as described therein. Calculate the acceptance value.
Liquid or semi-solid dosage forms Accurately weigh the amount of liquid or semi-solid that is removed
from each of 10 individual containers in conditions of normal use. If necessary, compute the equivalent
volume after determining the density. Calculate the active substance content in each container from the
mass of product removed from the individual containers and the result of the assay. Calculate the
acceptance value.
Calculations of Acceptance Value Calculate the acceptance value (AV) as shown in content uniformity,
except that the individual contents of the units are replaced with the individual estimated contents
defined below.
X1, x2,…… , xn = individual estimated contents of the dosage units tested, where
𝐴
Xi = wi ∙
𝑊
w1, w2,…… , wn = individual masses of the dosage units tested
A = content of active substance (percentage of label claim) obtained using an appropriate analytical
method (assay);
W = mean of individual masses (w1, w2,…… , wn)

CRITERIA
Apply the following criteria, unless otherwise specified.
Solid, semi-solid and liquid dosage forms The requirements for dosage uniformity are met if the
acceptance value of the first 10 dosage units is less than or equal to L1 per cent. If the acceptance
value is greater than L1 per cent, test the next 20 dosage units and calculate the acceptance value.
The requirements are met if the final acceptance value of the 30 dosage units is less than or equal to
L1 per cent and no individual content of the dosage unit is less than (1 —L2 x 0.01)M or more than (1
+ L2 x 0.01)M in calculation of acceptance value under content uniformity or under mass variation.
Unless otherwise specified, L1 is 15.0 and L2 is 25.0.
* BP 2016, Општа монографија за екстрактибилен волумен на
парентерални препарати
5. Extractable Volume of Parenteral Preparations (Ph Eur method 2.9.17)
Suspensions and emulsions are shaken before withdrawal of the contents and before the determination
of the density. Oily and viscous preparations may be warmed according to the instructions on the label,
if necessary, and thoroughly shaken immediately before removing the contents.
The contents are then cooled to 20-25 °C before measuring the volume.
SINGLE-DOSE CONTAINERS
Select 1 container if the nominal volume is 10 mL or more, 3 containers if the nominal volume is more
than 3 mL and less than 10 mL, or 5 containers if the nominal volume is 3 mL or less. Take up
individually the total contents of each container selected into a dry syringe of a capacity not exceeding
3 times the volume to be measured, and fitted with a 21-gauge needle not less than 2.5 cm in length.
Expel any air bubbles from the syringe and needle, then discharge the contents of the syringe without
emptying the needle into a standardised dry cylinder (graduated to contain rather than to deliver the
designated volumes) of such size that the volume to be measured occupies at least 40 per cent of its
graduated volume. Alternatively, the volume of the contents in millilitres may be calculated as the mass
in grams divided by the density.
For containers with a nominal volume of 2 mL or less, the contents of a sufficient number of containers
may be pooled to obtain the volume required for the measurement provided that a separate, dry syringe
assembly is used for each container. The contents of containers holding 10 mL or more may be
determined by opening them and emptying the contents directly into the graduated cylinder or tared
beaker.
The volume is not less than the nominal volume in case of containers examined individually, or, in case
of containers with a nominal volume of 2 mL or less, is not less than the sum of the nominal volumes of
the containers taken collectively.
MULTIDOSE CONTAINERS
For injections in multidose containers labelled to yield a specific number of doses of a stated volume,
select one container and proceed as directed for single-dose containers using the same number of
separate syringe assemblies as the number of doses specified. The volume is such that each syringe
delivers not less than the stated dose.
CARTRIDGES AND PREFILLED SYRINGES
Select 1 container if the nominal volume is 10 mL or more, 3 containers if the nominal volume is more
than 3 mL and less than 10 mL, or 5 containers if the nominal volume is 3 mL or less. If necessary, fit
the container with the accessories required for their use (needle, piston, syringe) and transfer the entire
contents of each container without emptying the needle into a dry tared beaker by slowly and constantly
pressing the piston. Determine the volume in milliliters calculated as the mass in grams divided by the
density.
The volume measured for each of the containers is not less than the nominal volume.
PARENTERAL INFUSION
Select one container. Transfer the contents into a dry measuring cylinder of such a capacity that the
volume to be determined occupies at least 40 per, of the nominal volume of the cylinder. Measure the
volume transferred. The volume is not less than the nomina{ volume.
* BP 2016, Општа монографија за загадување со честички
Appendix XIII B V-A401
2.9.19. PARTICULATE CONTAMINATION: SUB-VISIBLE PARTICLES
Particulate contamination of injections and infusions consists of extraneous, mobile undissolved

particles, other than gas bubbles, unintentionally present in the solutions.
For the determination of particulate contamination 2 procedures, Method 1 (Light Obscuration Particle
Count Test) and Method 2 (Microscopic Particle Count Test), are specified hereinafter. When examining
injections and infusions for sub-visible particles, Method 1 is preferably applied. However, it may be
necessary to test some preparations by the light obscuration particle count test followed by the
microscopic particle count test to reach a conclusion on conformance to the requirements.
Not all parenteral preparations can be examined for sub-visible particles by one or both of these
methods. When Method 1 is not applicable, e.g. in case of preparations having reduced clarity or
increased viscosity, the test is carried out according to Method 2. Emulsions, colloids, and liposomal
preparations are examples. Similarly, products that produce air or gas bubbles when drawn into the
sensor may also require microscopic particle count testing. If the viscosity of the preparation to be tested
is sufficiently high so as to preclude its examination by either test method, a quantitative dilution with
an appropriate diluentmay bemade to decrease viscosity, as necessary, to allow the analysis to be
performed.
The results obtained in examining a discrete unit or group of units for particulate contamination cannot
be extrapolated with certainty to other units that remain untested. Thus, statistically sound sampling
plans must be developed if valid inferences are to be drawn from observed data to characterise the
level of particulate contamination in a large group of units.
METHOD 1. LIGHT OBSCURATION PARTICLE COUNT TEST
Use a suitable apparatus based on the principle of light blockage which allows an automatic
determination of the size of particles and the number of particles according to size.
The apparatus is calibrated using suitable certified reference materials consisting of dispersions of
spherical particles of known sizes between 10 μm and 25 μm. These standard particles are dispersed
in particle-free water R. Care must be taken to avoid aggregation of particles during dispersion.
General precautions
The test is carried out under conditions limiting particulate contamination, preferably in a laminar-flow
cabinet.
Very carefully wash the glassware and filtration equipment used, except for the membrane filters, with
a warm detergent solution and rinse with abundant amounts of water to remove all traces of detergent.
Immediately before use, rinse the equipment from top to bottom, outside and then inside, with particle-
free water R.
Take care not to introduce air bubbles into the preparation to be examined, especially when fractions
of the preparation are being transferred to the container in which the determination is to be carried out.
In order to check that the environment is suitable for the test, that the glassware is properly cleaned
and that the water to be used is particle-free, the following test is carried out: determine the particulate
contamination of 5 samples of particle-free water R, each of 5 mL, according to the method described
below. If the number of particles of 10 μm or greater size exceeds 25 for the combined 25 mL, the
precautions taken for the test are not sufficient. The preparatory steps must be repeated until the
environment, glassware and water are suitable for the test.
Method
Mix the contents of the sample by slowly inverting the container 20 times successively. If necessary,
cautiously remove the sealing closure. Clean the outer surfaces of the container opening using a jet of
particle-free water R and remove the closure, avoiding any contamination of the contents. Eliminate
gas bubbles by appropriate measures such as allowing to stand for 2 min or sonicating.
For large-volume parenterals, single units are tested. For small-volume parenterals less than 25 mL in
volume, the contents of 10 or more units are combined in a cleaned container to obtain a volume of not
less than 25 mL; where justified and authorised, the test solution may be prepared by mixing the
contents of a suitable number of vials and diluting to 25 mL with particle-free water R or with an
appropriate solvent without contamination of particles when particle-free water R is not suitable. Small-
volume parenterals having a volume of 25 mL or more may be tested individually.
Powders for parenteral administration are reconstituted with particle-free water R or with an appropriate
solvent without contamination of particles when particle-free water R is not suitable.
The number of test specimens must be adequate to provide a statistically sound assessment. For large-
volume parenterals or for small-volume parenterals having a volume of 25 mL or more, fewer than 10
units may be tested, based on an appropriate sampling plan.
Remove 4 portions, each of not less than 5 mL, and count the number of particles equal to or greater
than 10 μm and 25 μm. Disregard the result obtained for the first portion, and calculate the mean number
of particles for the preparation to be examined.
Evaluation
For preparations supplied in containers with a nominal volume of more than 100 mL, apply the criteria
of test 1.A.
For preparations supplied in containers with a nominal volume of less than 100 mL, apply the criteria of
test 1.B.
♦For preparations supplied in containers with a nominal volume of 100 mL, apply the criteria of test
1.B.♦
If the average number of particles exceeds the limits, test the preparation by the microscopic particle
count test.
Test 1.A – Solutions for infusion or solutions for injection supplied in containers with a nominal content
of more than 100 mL
The preparation complies with the test if the average number of particles present in the units tested
does not exceed 25 per millilitre equal to or greater than 10 μm and does not exceed 3 per millilitre
equal to or greater than 25 μm.
Test 1.B – Solutions for infusion or solutions for injection supplied in containers with a nominal content
of less than 100 mL
does not exceed 6000 per container equal to or greater than 10 μm and does not exceeд 600 per
container equal to or greater than 25 μm.
METHOD 2. MICROSCOPIC PARTICLE COUNT TEST
Use a suitable binocular microscope, filter assembly for retaining particulate contamination and
membrane filter for examination.
The microscope is equipped with an ocular micrometer calibrated with an objective micrometer, a
mechanical stage capable of holding and traversing the entire filtration area of the membrane filter, 2
suitable illuminators to provide episcopic illumination in addition to oblique illumination, and is adjusted
to 100 ± 10 magnifications.
The ocular micrometer is a circular diameter graticule (see Figure 2.9.19.-1.) and consists of a large
circle divided by crosshairs into quadrants, transparent and black reference circles 10 μm and 25 μm
in diameter at 100 magnifications, and a linear scale graduated in 10 μm increments. It is calibrated
using a stage micrometer that is certified by either a domestic or international standard institution. A
relative error of the linear scale of the graticule within ± 2 per cent is acceptable. The large circle is
designated the graticule field of view (GFOV).
2 illuminators are required. One is an episcopic brightfield illuminator internal to themicroscope, the
other is an external, focusable auxiliary illuminator adjustable to give reflected oblique illumination at an
angle of 10-20°.
The filter assembly for retaining particulate contamination consists of a filter holder made of glass or
other suitable material, and is equipped with a vacuum source and a suitable membrane filter.
The membrane filter is of suitable size, black or dark grey in colour, non-gridded or gridded, and 1.0 μm
or finer in nominal pore size.
General precautions
The test is carried out under conditions limiting particulate contamination, preferably in a laminar-flow
cabinet.
Very carefully wash the glassware and filter assembly used, except for the membrane filter, with a warm
detergent solution and rinse with abundant amounts of water to remove all traces of detergent.
Immediately before use, rinse both sides of the membrane filter and the equipment from top to bottom,
outside and then inside, with particle-free water R.
In order to check that the environment is suitable for the test, that the glassware and the membrane
filter are properly cleaned and that the water to be used is particle-free, the following test is carried out:
determine the particulate contamination of a 50 mL volume of particle-free water R according to the
method described below. If more than 20 particles 10 μm or larger in size or if more than 5 particles 25
μm or larger in size are present within the filtration area, the precautions taken for the test are not
sufficient. The preparatory steps must be repeated until the environment, glassware, membrane filter
and water are suitable for the test.
Method
Mix the contents of the samples by slowly inverting the container 20 times successively. If necessary,
autiously remove the sealing closure. Clean the outer surfaces of the container opening using a jet of
particle-free water R and remove the closure, avoiding any contamination of the contents.
For large-volume parenterals, single units are tested. For small-volume parenterals less than 25 mL in
volume, the contents of 10 or more units are combined in a cleaned container; where justified and
authorised, the test solution may be prepared by mixing the contents of a suitable number of vials and
diluting to 25 mL with particle-free water R or with an appropriate solvent without contamination of
particles when particle-free water R is not suitable. Small-volume parenterals having a volume of 25 mL
or more may be tested individually.
Powders for parenteral administration are constituted with particle-free water R or with an appropriate
solvent without contamination of particles when particle-free water R is not suitable.
The number of test specimens must be adequate to provide a statistically sound assessment. For large-
volume parenterals or for small-volume parenterals having a volume of 25 mL or more, fewer than 10
units may be tested, based on an appropriate sampling plan.
Wet the inside of the filter holder fitted with the membrane filter with several millilitres of particle-free
water R. Transfer to the filtration funnel the total volume of a solution pool or of a single unit, and apply
vacuum. If needed, add stepwise a portion of the solution until the entire volume is filtered. After the
last addition of solution, begin rinsing the inner walls of the filter holder by using a jet of particle-free
water R. Maintain the vacuum until the surface of the membrane filter is free from liquid. Place the filter
in a Petri dish and allow the filter to air-dry with the cover slightly ajar. After the filter has been dried,
place the Petri dish on the stage of the microscope, scan the entire membrane filter under the reflected
light from the illuminating device, and count the number of particles that are equal to or greater than 10
μm and the number of particles that are equal to or greater than 25 μm. Alternatively, partial filter count
and determination of the total filter count by calculation is allowed. Calculate the mean number of
particles for the preparation to be examined.
The particle sizing process with the use of the circular diameter graticule is carried out by transforming
mentally the image of each particle into a circle and then comparing it to the 10 μm and 25 μm graticule
reference circles. Thereby the particles are not moved from their initial locations within the graticule field
of view and are not superimposed on the reference circles for comparison. The inner diameter of the
transparent graticule reference circles is used to size white and transparent particles, while dark
particles are sized by using the outer diameter of the black opaque graticule reference circles. In
performing the microscopic particle count test do not attempt to size or enumerate amorphous, semi-
liquid, or otherwise morphologically indistinct materials that have the appearance of a stain or
discoloration on the membrane filter. These materials show little or no surface relief and present a
gelatinous or film-like appearance. In such cases the interpretation of enumeration may be aided by
testing a sample of the solution by the light obscuration particle count test.
Evaluation
For preparations supplied in containers with a nominal volume of more than 100 mL, apply the criteria
of test 2.A.
For preparations supplied in containers with a nominal volume of less than 100 mL, apply the criteria of
test 2.B.
♦For preparations supplied in containers with a nominal volume of 100 mL, apply the criteria of test
2.B.♦
Test 2.A – Solutions for infusion or solutions for injection supplied in containers with a nominal content
of more than 100 mL
does not exceed 12 per millilitre equal to or greater than 10 μm and does not exceed 2 per millilitre
equal to or greater than 25 μm.
Test 2.B – Solutions for infusion or solutions for injection supplied in containers with a nominal content
of less than 100 mL
does not exceed 3000 per container equal to or greater than 10 μm and does not exceed 300 per
container equal to or greater than 25 μm.
Вежба бр. 5
ПАРЕНТЕРАЛНИ ПРЕПАРАТИ
- ИНЈЕКЦИИ –
1. Општа монографија за парентерални препарати, Ph.Eur 0520
Стерилни препарати наменети за апликација со инјектирање, инфузија или
имплантација во телото на човекот или животните.
Парентералните препарати може да содржат ексципиенти, на пример за да се подготват

како изотонични раствори во однос на крвта, за да се подеси рН, да се зголеми
растворливоста, да се спречи распаѓање на активната супстанција или да се обезбеди
соодветна антимикробна заштита, а притоа не смее да влијае негативно на
медицинското дејство на препаратот, не смее да предизвика токсичност или локална
иритација доколку се користи во пропишаната концентрација.
Контејнери за парентерални препарати се прават колку што е можно, од материјали што

се доволно транспарентни за да има можност за визуелна преглед на содржината,
освен за изработка на импланти и во други оправдани и овластени случаи.
Каде што е применливо, контејнерите за парентерални препарати одговараат на

барањата за материјали што се користат за производство на контејнери (Materials used
for the manufacture of containers) (3.1 и подсекции) и контејнери (Containers) (3.2 и
подсекции).
Парентерални препарати наменети за хронична употреба или за целосна парентерална
исхрана треба да имаат соодветни граници за специфични компоненти или елементи,
земајќи ја во предвид долготрајната токсичност.
Парентералните препарати се испорачуваат во стаклени садови (3.2.1) или во други

контејнери, како што се пластични садови (3.2.2, 3.2.2.1 и 3.2.9) и шприцови. Цврстината
на садот е обезбеден со соодветни средства. Затворања обезбедете добар заптивка,
спречете го пристапот на микроорганизмите и други загадувачи и обично дозволуваат
повлекување на дел или целата содржина без отстранување на затворање.
Пластичните материјали или еластомерите (3.2.9) порано производството на
затворачите се доволно цврсти и еластични за дозволи поминување на игла со најмалку
можно пролевање на честички. Затворачите за повеќекратни контејнери се доволно
еластични за да се осигури дека пункцијата е повторно откриена кога игла е повлечена.
Се разликуваат неколку категории на парентерални препарати
− препарати за инјектирање
− интравенски инфузии
− концентрати за интравенски инфузии и инјекции
− прашоци за инјекции или интравенски инфузии
− импланти
За време на развојот на парентералните препарати, формулацијата која содржи
антимикробни конзерванси, која е ефективноста на избраниот конзерванс, треба да се
демонстрира пред надлежниот орган. Соодветниот метод на тестирање, заедно со
критериумите за оценување на антимикробните својствата на конзервансот на
формулацијата се опишани во Ефикасност на антимикробните конзерванси (Efficacy of
antimicrobial preservation Ph.Eur.5.1.3).
Парентералните препарати се подготвуваат со користење на материјали и методи со
цел да се обезбеди стерилност и да се избегне навлегување на контаминенти и раст на
микроорганизми. Препораките се предвидени во текстот Методи за подготовка на
стерилни производи (Methods of preparation of sterile products Ph.Eur. 5.1.1).
Водата која се користи за производството на парентерални препарати е во согласност
со барањата за вода за инјекции ‘’in bulk’’ наведени во монографијата за Вода за
инјекции (Water for injections 0169).
Тестови
Контаминација од честички: суб-видливи честички (2.9.19).
За препарати за човечка употреба, растворите за инфузија или растворите за инјекции
треба да одговараат со тестот.
Во случај на препарати за субкутана или интрамускуларна инјекција, соодветни се
пошироки граници.
Радиофармацевтските препарати се ослободени од овие барања. Препарати за кои на
етикетата се наведува дека за производот што треба да се користи финален филтер,
се ослободени од овие барања, под услов да се докаже дека филтерот одговара на
барањата што е во согласност со тестот.
За препаратите за ветеринарна употреба, кога се доставуваат во пакувања со
номинална содржина повеќе од 100 ml и кога содржината е еквивалентна на доза на
повеќе од 1,4 ml на килограм телесна маса, растворот за инфузија или растворот за
инјекција мора да одговара на тестот за контаминација со честички: суб-видливи
честички.
Стерилност (2.6.1). Парентералните препарати одговараат на тестот за стерилност.
Чување
Да се чуваат во стерилни, херметички затворени садови и садови кои го штитат
производот од расипување.
Сигнатурата содржи:
− Име и концентрацијата на кој било кој додаден антимикробен конзерванс,
− Каде што е применливо, растворот треба да се користи треба да се користи
заедно со финалниот филтер,
− Каде што е применливо, препаратот е ослободен од бактериски ендотоксини или
дека е апироген.
Инјекции
Инјекциите се стерилни раствори, емулзии или суспензии.
Тие се подготвуваат со растворање, емулгирање или суспендирање на активната

супстанција (а) и сите додадени ексципиенси во вода, во соодветна не- водена течност,
која може да биде не стерилна, каде што е оправдано, или во мешавина од овие
подлоги.
Растворите за инјектирање, испитани под соодветни услови на видливост, се бистри и

практично ослободени од честички.
Емулзиите за инјектирање не покажуваат промени кои би укажувале на фаза

раздвојување. Суспензиите за инјектирање може да покажат талог што лесно се
диспергира при протресување за да даде суспензија која што останува доволно
стабилна за да се овозможи да се земе точната доза.
Мултидозни препарати Мултидозните водни инјекции содржат соодветен

антимикробен конзерванс во соодветна концентрација, освен кога самиот препарат
покажува соодветни антимикробни својства. Кога препаратот за парентерална
администрацијата е подготвен во повеќедозен контејнер, треба да се преземат мерки
на претпазливост за нејзино администрирање и многу повеќе посебно за неговото
складирање помеѓу последователни земања на дози.
Антимикробни конзерванси Водни препарати кои се подготвени при асептични

мерки на претпазливост и кои не можат да бидат термички стерилизирани може да
содржат соодветен антимикробен конзерванс во соодветна концентрација.
Не се додава антимикробен конзерванс кога:
− волуменот што треба да се инјектира во единечна доза надминува 15 ml, освен

ако не е поинаку пропишано;
− кога препаратот е наменет за администрација по пат каде што, од медицински
причини, антимикробен конзерванс не е дозволен, како на пример епидурална,
интратекална или преку било кој друг начин при кој има допир со
цереброспиналната течност, или интра- или ретро-окуларно
Овие препарати се пакуваат во едно-дозни контејнери.
При производството на инјекции кои содржат дисперзирани честички, се преземаат

мерки за да се обезбеди соодветна и контролирана големина на честички во однос на
намената.
Едно-дозни препарати Волуменот на инјекции во едно-дозен контејнер е доволно

за да овозможи повлекување и администрирање на номинална доза со користење на
нормална техника (2.9.17).
Тестови
Воедначеност на дозирани единици

Еднодозните суспензии за инјектирање се во согласност со тестот за воедначеност на
дозирани единици (2.9.40) или, кога е пропишано, со тестот за воедначеност на
содржина кој е опишан подолу. Хербални лекови и препарати од лековити билки
присутни во оваа дозирана форма не подлежат на одредбите од овој пасус.
Воедначеност на содржина (2.9.6)

Освен ако не е поинаку пропишано или оправдано, еднодозните суспензии за
инјектирање со содржина на активната супстанција помала од 2 mg или помалку од 2%
од вкупната маса треба да одговараат со тестот А за униформност на содржината на
едно-дозни препарати. Доколку препаратот содржи повеќе од една активна супстанција,
барањето се однесува само на оние супстанции што одговараат на горенаведените
услови.
Бактериски ендотоксини – пирогени

Спроведен е тест за бактериски ендоксиксини (2.6.14) или, таму каде што е оправдано
и одобрено, тест за пирогени (2.6.8). Препораки за границите за бактериски
ендоксиксини се даден во општо поглавје 5.1.10.
Препарати за хумана употреба Препаратот одговара на барањата на тестот

за бактериски ендоксиксини (2.6.14) или на тестот за пирогени (2.6.8).
Препарати за ветеринарна употреба Кога волуменот што треба да се инјектира

како единечна доза е 15 ml или повеќе и е еквивалентно на доза од 0,2 ml или повеќе за
килограм телесна маса, препаратот одговара на барањата на тестот за бактериски
ендотоксини (2.6.14) или на тестот за пирогени (2.6.8).
Било кој препарат Кога сигнатурата наведува дека препаратот е ослободени од

бактериски ендоксиксини или апирогени, соодветно, препаратот одговара со тестот за
бактериски ендотоксини (2.6.14) или со тест за пирогени (2.6.8), соодветно.
2. Општа монографија за парентерални препарати, според BP
Покрај наведените барања во Европската Фармакопеја, следните барања треба да се

применат на било кои инјекции, инфузии, прашоци за инјекции или концентрирани
раствори за инјектирање кои се дел од индивидуалните монографии во Британската
Фармакопеја.
ДЕФИНИЦИЈА
Дефиницијата за одреден Парентерален препарат како раствор, емулзија или

суспензија во вода за инјекции, не исклучува воведување на соодветни ексципиенси
каде е неопходно со цел да одговараат на наведените барањата на Европската
фармакопеја. Особено важно е, водените Парентерални препарати за субкутана,
интрадермални, интрамускулна администрација или, во случај да е можно, големи
количини за интравенски пат, ако е возможно треба да се направат изотонични со крвта
со додавање на натриум хлорид или други соодветни супстанции. Меѓутоа, ако се
користат супстанции за пуферирање во препарати наменети за интраокуларна или
интракардијална инјекција или во препарати што можат да бидат во контакт со
цереброспинална течност, треба особено да се внимава на природата и
концентрацијата на избраниот агенс да биде соодветен за предвидениот пат на
администрација.
Онаму каде активната супстанца е подложна на оксидативна деградација, треба да се

преземат соодветни мерки на претпазливост, како што е додавање на соодветен
антиоксиданс или чување под сфера од азот ослободен од кислород или друг погоден
инертен гас.
Методите на стерилизација што можат да се користат при производството на
парентералните препарати се опишани во Appendix XVIII.
Кога е дадена насока да се користи Вода за инјекции во производство на

парентералните препарати, се користи in bulk вода за инјекции. Кога е нагласено да се
употребува вода за инјекции ослободена од растворен воздух или Вода за инјекции
ослободена од јаглероден диоксид, водата која свежо е подготвена со процесот опишан
под Вода за инјекции се врие најмалку 10 минути, со што е можно помала изложеност
на воздух, се лади претпазливо за да не се изложи на воздух и јаглероден диоксид, и се
стерилизира со загревање во автоклав.
Чување
Системите за затворање кои се користат како контејнери за масните парентерални
препарати треба да бидат изработени од материјали резистентни на масла.
ИНЈЕКЦИИ
Сигнатурата наведува дека инјекцијата не треба да се користи доколку се присутни
видливи честички.
3. Монографија на Атенолол инјекции, BP 2016

Atenolol Injection
Action and use

Beta-adrenoceptor antagonist.
DEFINITION
Atenolol Injection is a sterile solution of Atenolol in Water for Injections containing Citric Acid
Monohydrate and Sodium Chloride.
The injection complies with the requirements stated under Parenteral Preparations and with
the following requirements.
Content of atenolol, C14H22N2O3

IDENTIFICATION
To a volume of the injection containing 5 mg of Atenolol add sufficient 1M sodium hydroxide
to make it alkaline (about 0.5 ml) and extract with three 10 ml quantities of a mixture of 1
volume of propan-2-ol and 3 volumes of chloroform. Filter the combined extracts through
anhydrous sodium sulphate and evaporate to dryness in a current of nitrogen. The infrared
absorption spectrum of the residue, Appendix II A, is concordant with the reference spectrum
of atenolol (RS 015).
TESTS
Acidity
pH, 5.5 to 6.5, Appendix V L.
Related substances
For solution (1) use the injection being examined. For solution (2) dilute 1 volume of solution
(1) to 200 volumes with the mobile phase. For solution (3) dissolve 10 mg of atenolol impurity
standard BPCRS in 0.1 ml of dimethyl sulphoxide, with the aid of gentle heat, and dilute to 20
ml with the mobile phase.
The chromatographic procedure may be carried out using (a) a stainless steel column (15 cm
× 4.6 mm) packed with end-capped octadecylsilyl silica gel for chromatography (5 μm)
(Spherisorb ODS 2 is suitable), (b) as the mobile phase with a flow rate of 1.0 ml per minute
a mixture of 20 volumes of tetrahydrofuran, 180 volumes of methanol and 800 volumes of
0.025M potassium dihydrogen orthophosphate containing 1.0 g of sodium octanesulphonate
and 0.4 g of tetrabutylammonium hydrogen sulphate per litre and adjusted to pH 3.0 with
orthophosphoric acid and (c) a detection wavelength of 226 nm.
The test is not valid unless the chromatogram obtained with solution (3) resembles the
reference chromatogram provided with atenolol impurity standard BPCRS in that the peak due
to bis ether precedes, and is separated from, that due to tertiary amine, which is normally a
doublet. If necessary, adjust the concentration of sodium octanesulphonate in the mobile
phase; increasing the concentration increases the retention time of the tertiary amine.
In the chromatogram obtained with solution (1) the area of any peak corresponding to blocker
acid is not greater than the area of the peak in the chromatogram obtained with solution (2)
(0.5%) and the area of any peak corresponding to either tertiary amine or bis ether is not
greater than half of the area of the peak in the chromatogram obtained with solution (2)
(0.25%).
ASSAY
Dilute a volume of the injection containing 10 mg of Atenolol to 100 ml with methanol and
measure the absorbance at the maximum at about 275 nm, Appendix II B. Calculate the
content of C14H22N2O3 taking 53.7 as the value of A(1%, 1 cm) at the maximum at 275 nm.
STORAGE
Atenolol Injection should be protected from light.

Параметар
Бистар, безбоен раствор за
инјектирање
Инфрацрвена спектроскопија Споредба со референтен

Appendix II А, BP 2016 спектар на Атенолол RS015
Спектрофотометриски, 90-110,0% од
3. Содржина
Appendix II B, BP 2016 декларираната содржина
Киселост
4. Appendix V L, BP 2016 рН 5,5 – 6,5
(Ацидитет)
Течна хроматографија
5. Сродни супстанции Споредба на пикови
Appendix III D, BP 2016
6. Appendix XIV C, BP 2016 0.25 IU per mL
1. мембранска филтрација или
Да нема раст на
7. Стерилност 2. директно засадување на
микроорганизми
подлога
*Воедначеност на По метод варијација на маса, L1 (n=10): AV < 15
8.
дозирани единици Appendix XII C, BP 2016 L2 (n=30): AV < 25
Според метод 1. Просечниот
број на честички да не
Суб-видливи честички, надминува повеќе од 3 честички
Метод 1. Броење на честички за милилитар еднакви или
*Контаминација со под пригушена светлина поголеми од 25 μm.
9.
честички Метод 2. Броење на честички Според метод 2. Просечниот
под микроскоп број на присутни честички да не
Appendix XIII A, BP 2016 надминува 12 за еден
надминува
*Ектрактибилен За еднодозни препарати, V да не е помал
10.
волумен Appendix XII C, BP 2016 од номиналниот V

Гранични
Барање за квалитет Резултати
вредности
Бистар, безбоен раствор за
1. Изглед
инјектирање
Споредба со референтен спектар
на Атенолол RS015
90-110,0% од
3. Содржина
Киселост
4. рН 5,5 – 6,5
(Ацидитет)
5. Сродни супстанции Споредба на пикови
6. Бактериски ендотоксини 0.25 IU per mL
7. Стерилност Да нема раст на микроорганизми
*Воедначеност на L1 (n=10): AV < 15

8.
Според метод 1. Просечниот број
на честички да не надминува 25
за еден милилитар еднакви или
надминува повеќе од 3 честички
за милилитар еднакви или
*Контаминација со поголеми од 25 μm.
9.
честички Според метод 2. Просечниот број
на присутни честички да не
надминува 12 за еден милилитар
еднакви или поголеми од 10 μm и
да не надминува
2 за еден милилитар еднакви или
поголеми од 25 μm.
V да не е помал
10. *Ектрактибилен волумен
од номиналниот V
Заклучок:
Одобрил:
* BP 2016, Општа монографија за бактериски ендотоксини (LAL тест)
Appendix XIV C V-A411
C. Test for Bacterial Endotoxins (LAL Test) (Ph Eur method 2.6.14)
The test for bacterial endotoxins (BET) is used to detect or quantify endotoxins from gram-
negative bacteria using amoebocyte lysate from the horseshoe crab (Limulus polyphemus or
Tachypleus tridentatus). ‘There are 3 techniques for this test: the gel-clot technique, which is
based on gel formation; the turbidimetric technique, based on the development of turbidity
аfter cleavage of an endogenous substrate; and the chromogenic technique, based on the
development of colour after cleavage of a synthetic peptidechromogen complex.
The following 6 methods are described in the present chapter:
Method A. Gel-clot method: limit test
Method B. Gel-clot method: quantitative test
Method C. Turbidimetric kinetic method
Method D. Chromogenic kinetic method
Method E. Chromogenic end-point method
Method F. Turbidimetric end-point method
Proceed by any of the 6 methods for the test. In the event of doubt or dispute, the final decision
is made based upon method A unless otherwise indicated in the monograph.
The test is carried out in a manner that avoids endotoxin contamination.
1. APPARATUS
Depyrogenate all glassware and other heat-stable apparatus in a hot-air oven using a
validated process. A commonly used minimum time and temperature is 30 minutes at 250 °C.
If employing plastic apparatus, such as microtitre plates and pipette tips for automatic
pipetters, use apparatus shown to be free of detectable endotoxin and which does not interfere
in the test.
NOTE: in this chapter, the term ‘tube’ includes all types of receptacles, for example microtiter
plate wells.
2. REAGENTS, TEST SOLUTIONS
(1) Amebocyte lysate Amoebocyte lysate is a lyophilised product obtained from amoebocyte
lysate from the horseshoe crab (Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus). This reagent
refers only to a product manufactured in accordance with tehe regulations of the competent
authority.
NOTE: amoebocyte lysate reacts with some β-glucans in addition to endotoxins. Amoebocyte
lysate preparations which do not react with glucans are available; they are prepared by
removing from amoebocyte lysate the G factor, which reacts with glucans, or by inhibiting the
G factor reacting system of amoebocyte lysate. These preparations may be used for endotoxin
testing in the presence of glucans.
(2) Lysate solution
Dissolve amoebocyte lysate in water for BET or in a buffer, as recommended by the lysate
manufacturer, by gentle stirring. Store the reconstituted lysate, refrigerated or frozen, as
indicated by the manufacturer.
(3) Water for BET (water for bacterial endotoxins test)
Water for injections R or water produced by other procedures that shows no reaction with the
lysate employed at the detection limit of the reagent.
3. PREPARATION OF THE STANDARD ENDOTOXIN STOCK SOLUTION
The standard endotoxin stock solution is prepared from an endotoxin reference standard that
has been calibrated against the International Standard, for example endotoxin standard BRP.
Endotoxin is expressed in International Units (IU). The equivalence in IU of the International

Standard is stated by the World Health Organization.
NOTE: one International Unit (IU) of endotoxin is equal to one Endotoxin Unit (E.U.).
Follow the specifications in the package leaflet and on the label for preparation and storage of
the standard endotoxin stock solution.
4. PREPARATION OF THE STANDARD ENDOTOXIN SOLUTIONS
After vigorously mixing the standard endotoxin stock solution, prepare appropriate serial
dilutions of this solution using water for BET.
Use the solutions as soon as possible to avoid loss of activity by adsorption.
5. PREPARATION OF THE TEST SOLUTIONS
Prepare the test solutions by dissolving or diluting active substances or medicinal products
using water for BET.
Some substances or preparations may be more appropriately dissolved or diluted in other

aqueous solutions. If necessary, adjust the pH of the test solution (or dilution thereof) so that
the pH of the mixture of the lysate and test solution falls within the pH range specified by the
lysate manufacturer, usually 6.0 to 8.0. The pHmay be adjusted by the use of acid, base or a
suitable buffer, as recommended by the lysate manufacturer. Acids and bases may be
prepared from concentrates or solids with water for BET in containers free of detectable
endotoxin. Buffers must be validated to be free of detectable endotoxin and interfering factors.
6. DETERMINATION OF THE MAXIMUM VALID DILUTION
The Maximum Valid Dilution (MVD) is the maximum allowable dilution of a sample at which
the endotoxin limit can be determined. Determine the MVD using the following formulae:
𝑒𝑛𝑑𝑜𝑡𝑜𝑥𝑖𝑛 𝑙𝑖𝑚𝑖𝑡 𝑥 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑜𝑓 𝑡𝑒𝑠𝑡 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛

MVD =
𝜆
Endotoxin limit: the endotoxin limit for active substances administered parenterally, defined
on the basis of dose, is equal to :
𝐾
𝑀
K = threshold pyrogenic dose of endotoxin per kilogram of body mass,
M = maximum recommended bolus dose of product per kilogram of body mass.
When the product is to be injected at frequent intervals or infused continuously, M is the

maximum total dose administered in a single hour period.
The endotoxin limit for active substances administered parenterally is specified in units such
as IU/mL, IU/mg, IU/Unit of biological activity, etc., in monographs.
Concentration of test solution:
– mg/mL if the endotoxin limit is specified by mass (IU/mg),
– Units/mL if the endotoxin limit is specified by unit of biological activity (IU/Unit),
– ml/mL if the endotoxin limit is specified by volume (IU/mL).
λ = the labelled lysate sensitivity in the gel-clot technique (IU/mL) or the lowest concentration
used in the standard curve of the turbidimetric or chromogenic techniques.
7. GEL-CLOT TECHNIQUE (METHODS A AND B)
The gel-clot technique allows detection or quantification of endotoxins and is based on clotting
of the lysate in the presence of endotoxins. The minimum concentration of endotoxins required
to cause the lysate to clot under standard conditions is the labelled lysate sensitivity. To ensure
both the precision and validity of the test, confirm the labelled lysate sensitivity and perform
the test for interfering factors asdescribed under 1. Preparatory testing.
1. PREPARATORY TESTING
(i) Confirmation of the labelled lysate sensitivity
Confirm in 4 replicates the labelled sensitivity λ, expressed in IU/mL, of the lysate solution
prior to use in the test.
Confirmation of the lysate sensitivity is carried out when a new lot of lysate is used or when
there is any change in the test conditions which may affect the outcome of the test.
Prepare standard solutions of at least 4 concentrations equivalent to 2λ, λ, 0.5λ and 0.25
λ by diluting the standard endotoxin stock solution with water for BET.
Mix a volume of the lysate solution with an equal volume of 1 of the standard solutions (such
as 0.1 mL aliquots) in each tube. When single test vials or ampoules containing lyophilised
lysate are employed, add solutions of standards directly to the vial or ampoule. Incubate the
reaction mixture for a constant period according to the recommendations of the lysate
manufacturer (usually at 37 ± 1 °C for 60 ± 2 min), avoiding vibration. Test the integrity of the
gel: for tubes, take each tube in turn directly from the incubator and invert it through
approximately 180° in one smooth motion. If a firm gel has formed that remains in place upon
inversion, record the result as positive. A result is negative if an intact gel is not formed.
The test is considered valid when the lowest concentration of the standard solutions shows a
negative result in all replicate tests.
The end-point is the lowest concentration in the series of decreasing concentrations of

standard endotoxin that clots the lysate. Determine the geometric mean end-point
concentration by calculting the mean of the logarithms of the end-point concentrations of the
4 dilution series, take the antilogarithm of this value, as indicated by the following expression:
∑𝑒
Geometric mean end-point concentration = antilog
𝑓
∑e = sum of the log10 end-point concentrations of the dilution series used,
f = number of replicates.
The geometric mean end-point concentration is the measured sensitivity of the lysate solution
(IU/mL). If this is not less than 0.5λ and not more than 2λ, the labelled sensitivity is confirmed
and is used in the tests performed with this lysate.
(ii) Test for interfering factors
Prepare solutions A, B, C and D as shown in Table 2.6.14.-1, and use the test solutions at a
dilution less than the MVD, not containing any detectable endotoxins, operating as described
under 1. Preparatory testing, (i) Confirmation of the labelled lysate sensitivity.
The geometric mean end-point concentrations of solutions B and C are determined using the
expression described in 1. Preparatory testing, (i) Confirmation of the labelled lysate
sensitivity.
The test for interfering factors must be repeated when any changes are made to the
experimental conditions that are likely to influence the result of the test.
The test is considered valid when all replicates of solutions A and D show no reaction and the
result of solution C confirms the labelled lysate sensitivity.
If the sensitivity of the lysate determined with solution B is not less than 0.5λ and not greater
than 2λ, the test solution does not contain interfering factors under the experimental
conditions used. Otherwise, the test solution interferes with the test.
If the preparation being examined interferes with the test at a dilution less than the MVD,
repeat the test for interfering factors using a greater dilution, not exceeding the MVD. The use
of a more sensitive lysate permits a greater dilution of the preparation being examined and
this may contribute to the elimination of interference.
Interference may be overcome by suitable validated treatment, such as filtration,

neutralisation, dialysis or heat treatment. To establish that the treatment chosen effectively
eliminates interference without loss of endotoxins, repeat the test for interfering factors using
the preparation being examined to which the standard endotoxin has been added and which
has then been submitted to the chosen treatment.
2. LIMIT TEST (METHOD A)
(i) Procedure
Prepare solutions A, B, C and D as shown in Table 2.6.14.-2, and performthe test on these
solutions following the procedure described under 1. Preparatory testing, (i) Confirmation of
the labelled lysate sensitivity.
Prepare solution A and solution B (positive product control) using a dilution not greater than
the MVD and treatments as described in 1. Preparatory testing, (ii) Test for interfering factors.
Solutions B and C (positive controls) contain the standard endotoxin at a concentration
corresponding to twice the labelled lysate sensitivity. Solution D (negative control) consists of
water for BET.
(ii) Interpretation
The test is considered valid when both replicates of solution B and C are positive and those
of solution D are negative.
When a negative result is found for both replicates of solution A, the preparation being
examined complies with the test.
When a positive result is found for both replicates of solution A, the preparation being
examined does not comply with the test.
When a positive result is found for one replicate of solution A and a negative result is found
for the other, repeat the test. In the repeat test, the preparation being examined complies with
the test if a negative result is found for both replicates of solution A. The preparation does not
comply with the test if a positive result is found for one or both replicates of solution A.
However, if the preparation does not comply with the test at a dilution less than the MVD, the
test may be repeated using a greater dilution, not exceeding the MVD.
3. QUANTITATIVE TEST (METHOD B)
(i) Procedure
The test quantifies bacterial endotoxins in the test solution by titration to an end-point. Prepare
solutions A, B, C and D as shown in Table 2.6.14.-3, and test these solutions according to the
procedure described under 1. Preparatory testing, (i) Confirmation of the labelled lysate
sensitivity.
(ii) Calculation and interpretation
The test is considered valid when the following 3 conditions are met:
(a) both replicates of solution D (negative control) are negative,

(b) both replicates of solution B (positive product control) are positive,
(c) the geometric mean end-point concentration of solution Cis in the range of 0.5λ to 2λ.
To determine the endotoxin concentration of solution A, calculate the end-point concentration

for each replicate, by multiplying each end-point dilution factor by λ.
The endotoxin concentration in the test solution is the end-point concentration of the
replicates. If the test is conducted with a diluted test solution, calculate the concentration of
endotoxin in the original solution by multiplying the result by the dilution factor.
If none of the dilutions of the test solution is positive in a valid test, report the endotoxin
concentration as less than λ (or, if a diluted sample was tested, report as less than the lowest
dilution factor of the sample × λ). If all dilutions are positive, the endotoxin concentration is
reported as equal or greater than the largest dilution factor multiplied by λ (e.g. in Table
2.6.14.-3, the initial dilution factor × 8 × λ).
The preparation being examined meets the requirements of the test if the endotoxin
concentration in both replicates is less than that specified in the monograph.
8. PHOTOMETRIC QUANTITATIVE TECHNIQUES (METHODS C, D, E AND F)
1. TURBIDIMETRIC TECHNIQUE (METHODS C AND F)
This technique is a photometric test to measure the increase in turbidity. Based on the test
principle employed, this technique may be classified as being either the end-point-turbidimetric
test or the kinetic-turbidimetric test.
The end-point-turbidimetric test (Method F) is based on the quantitative relationship between

the endotoxin concentration and the turbidity (absorbance or transmission) of the reaction
mixture at the end of an incubation period.
The kinetic-turbidimetric test (Method C) is a method to measure either the time (onset time)
needed for the reaction mixture to reach a predetermined absorbance or transmission, or the
rate of turbidity development.
The test is carried out at the incubation temperature recommended by the lysate manufacturer
(usually 37 ±1 °C).
2. CHROMOGENIC TECHNIQUE (METHODS D AND E)
This technique is used to measure the chromophore released from a suitable chromogenic
peptide by the reaction of endotoxins with the lysate. Depending on the test principle
employed, this technique may be classified as being either the end-point-chromogenic test or
the kinetic-chromogenic test.
The end-point-chromogenic test (Method E) is based on the quantitative relationship between

the endotoxin concentration and the quantity of chromophore released at the end of an
incubation period.
The kinetic-chromogenic test (Method D) measures either the time (onset time) needed for
the reaction mixture to reach a predetermined absorbance, or the rate of colour development.
The test is carried out at the incubation temperature recommended by the lysate manufacturer
(usually 37 ± 1 °C).
3. PREPARATORY TESTING
To assure the precision or validity of the turbidimetric and chromogenic techniques,

preparatory tests are conducted to show that the criteria for the standard curve are satisfied
and that the test solution does not interfere with the test.
Validation of the test method is required when any changes are made to the experimental
conditions that are likely to influence the result of the test.
(i) Assurance of criteria for the standard curve
The test must be carried out for each lot of lysate reagent.
Using the standard endotoxin solution, prepare at least 3 endotoxin concentrations within the
range indicated by the lysate manufacturer to generate the standard curve. Perform the test
using at least 3 replicates of each standard endotoxin solution as recommended by the lysate
manufacturer (volume ratios, incubation time, temperature, pH, etc.).
If the desired range is greater than 2 log10 in the kinetic methods, additional standards must
be included to bracket each log10 increase in the range of the standard curve.
The absolute value of the correlation coefficient, | r |, must be greater than or equal to 0.980,
for the range of endotoxin concentrations set up.
(ii) Test for interfering factors
Select an endotoxin concentration at or near the middle of the endotoxin standard curve.
Prepare solutions A, B, C and D as shown in Table 2.6.14.-4. Perform the test on at least 2
replicates of these solutions as recommended by the lysate manufacturer (volume of test
solution and lysate solution, volume ratio of test solution to lysate solution, incubation time,
etc.). Table 2.6.14.-4.
The test is considered valid when the following conditions are met:
– the absolute value of the correlation coefficient of the standard curve generated using
solution C is greater than or equal to 0.980;
– the result with solution D does not exceed the limit of the blank value required in the
description of the lysate reagent employed, or it is less than the endotoxin detection limit of
the lysate reagent employed.
Calculate the mean recovery of the added endotoxin by subtracting the mean endotoxin
concentration in the solution (if any) (solution A, Table 2.6.14.-4) from that in the solution
containing the added endotoxin (solution B, Table 2.6.14.-4).
The test solution is considered free of interfering factors if under the conditions of the test, the
measured concentration of the endotoxin added to the test solution is within 50-200 per cent
of the known added endotoxin concentration, after subtraction of any endotoxin detected in
the solution without added endotoxin.
When the endotoxin recovery is out of the specified range, the test solution is considered to
contain interfering factors. Repeat the test using a greater dilution, not exceeding the MVD.
Furthermore, interference of the test solution or diluted test solution not to exceed the MVD
may be eliminated by suitable validated treatment, such as filtration, neutralisation, dialysis or
heat treatment. To establish that the treatment chosen effectively eliminates interference
without loss of endotoxins, repeat the test for interfering factors using the preparation being
examined to which the standard endotoxin has been added and which has then been
submitted to the chosen treatment.
4. TEST
(i) Procedure
Follow the procedure described in 3. Preparatory testing, (ii) Test for interfering factors.
(ii) Calculation
Calculate the endotoxin concentration of each replicate of solution A using the standard curve
generated by the positive control solution C.
The test is considered valid when the following 3 requirements are met:
(1) the results obtained with solution C comply with the requirements for validation defined
under 3. Preparatory testing, (i) Assurance of criteria for the standard curve,
(2) the endotoxin recovery, calculated from the endotoxin concentration found in solution B
after subtracting the endotoxin concentration found in solution A, is within the range of 50-200
per cent,
(3) the result obtained with solution D (negative control) does not exceed the limit of the blank
value required in the description of the lysate employed, or it is less than the endotoxin
detection limit of the lysate reagent employed.
(iii) Interpretation
The preparation being examined complies with the test if the mean endotoxin concentration
of the replicates of solution A, after correction for dilution and concentration, is less than the
endotoxin limit for the product.
Guidelines on the test for bacterial endotoxins are given in general chapter 5.1.10.
* BP 2016, Општа монографија за пирогени
2.6.8. PYROGENS
The test consists of measuring the rise in body temperature evoked in rabbits by the
intravenous injection of a sterile solution of the substance to be examined.
Selection of animals. Use healthy, adult rabbits of either sex weighing not less than 1.5 kg,
fed a complete and balanced diet not containing antibiotics, and not showing loss of body
mass during the week preceding the test. A rabbit is not be used in a pyrogen test:
a) if it has been used in a negative pyrogen test in the preceding 3 days, or
b) if it has been used in the preceding 3 weeks in a pyrogen test in which the substance under
examination failed to pass the test.
Animals’ quarters. Keep the rabbits individually in a quiet area with a uniform appropriate
temperature. Withhold food from the rabbits overnight and until the test is completed; withhold
water during the test. Carry out the test in a quiet room where there is no risk of disturbance
exciting the animals and in which the room temperature is within 3 °C of that of the rabbits’
living quarters, or in which the rabbits have been kept for at least 18 h before the test.
Materials. Glassware, syringes and needles. Thoroughly wash all glassware, syringes and
needles with water for injections and heat in a hot-air oven at 250 °C for 30 min or at 200 °C
for 1 h.
Retaining boxes. The retaining boxes for rabbits whose temperature is being measured by an
electrical device are made in such a way that the animals are retained only by loosely fitting
neck-stocks; the rest of the body remains relatively free so that the rabbits may sit in a normal
position. They are not restrained by straps or other similar methods which may harm the
animal. The animals are put into the boxes not less than 1 h before the first record of the
temperature and remain in them throughout the test.
Thermometers. Use a thermometer or electrical device which indicates the temperature with
a precision of 0.1 °C and insert into the rectum of the rabbit to a depth of about 5 cm. The
depth of insertion is constant for any one rabbit in any one test. When an electrical device is
used it may be left in position throughout the test.
Preliminary test. After selection of the animals, one to three days before testing the product to
be examined, treat those animals that have not been used during the previous 2 weeks by
intravenous injection of 10 mL per kilogram of body mass of a pyrogen-free 9 g/L solution of
sodium chloride R warmed to about 38.5 °C. Record the temperatures of the animals,
beginning at least 90 min before injection and continuing for 3 h after the injection of the
solution. Any animal showing a temperature variation greater than 0.6 °C is not used in the
main test.
Main test. Carry out the test using a group of three rabbits.
Preparation and injection of the product. Warm the liquid to be examined to approximately
38.5 °C before the injection. The product to be examined may be dissolved in, or diluted with,
a pyrogen-free 9 g/L solution of sodium chloride R or another prescribed liquid. Inject the
solution slowly into the marginal vein of the ear of each rabbit over a period not exceeding 4
min, unless otherwise prescribed in the monograph. The amount of the product to be injected
varies according to the product to be examined and is prescribed in the monograph. The
volume injected is not less than 0.5 mL per kilogram and not more than 10 mL per kilogram of
body mass.
Determination of the initial and maximum temperatures
The “initial temperature” of each rabbit is the mean of two temperature readings recorded
for that rabbit at an interval of 30 min in the 40 min immediately preceding the injection of the
product to be examined. The “maximum temperature” of each rabbit is the highest
temperature recorded for that rabbit in the 3 h after the injection. Record the temperature of
each rabbit at intervals of not more than 30 min, beginning at least 90 min before the injection
of the product to be examined and ontinuing 3 h after the injection. The difference between
the maximum temperature and the initial temperature of each rabbit is taken to be its response.
When this difference is negative, the result is counted as a zero response.
Rabbits showing a temperature variation greater than 0.2 °C between two successive readings
in the determination of the initial temperature are withdrawn from the test. In any one test, only
rabbits having initial temperatures which do not differ from one another by more than 1 °C are
used. All rabbits having an initial temperature higher than 39.8 °C or less than 38.0 °C are
withdrawn from the test.
Interpretation of results. Having carried out the test first on a group of three rabbits, repeat
if necessary on further groups of three rabbits to a total of four groups, depending on the
results obtained. If the summed response of the first group does not exceed the figure given
in the second column of the Table 2.6.8.-1, the substance passes the test. If the summed
response exceeds the figure given in the second column of the table but does not exceed the
figure given in the third column of the table, repeat the test as indicated above. If the summed
response exceeds the figure given in the third column of the table, the product fails the test.
Rabbits used in a test for pyrogens where the mean rise in the rabbits’ temperature has
exceeded 1.2 °C are permanently excluded.

Analitika 2 Kolokvium 1 PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Analitika 2 Kolokvium 1 PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Универзитет „Гоце Делчев“ – Штип

Факултет за медицински науки

Д–р Биљана Ѓорѓеска, редовен професор

каде: Vo – празен волумен на колоната; Vr – ретенционен волумен на

Молекулата со поголем фактор на капацитет (В)

каде: n – број на теоретски подови; tr – ретенционо време (време

каде: ЕС – ефикасност на колоната, измерена како број на теоретски

каде: H – висина на теоретски под, односно параметар кој покажува колкава

каде: RS – резолуција на колоната; (tr)В – ретенционо време на

каде: a – ширина на првата половина на пикот, измерена на 10 % од

 Притоа, констатирано е дека асиметричниот фактор на пикот за

каде: a – растојание што го изминува компонентата А; b –

Растворувач Индекс на поларност

 Модификацијата на адсорбентот во TLC може да се врши

Силанизација на силика гел со дихлородиметилсилан

 За детекција на компонентите од плочата за TLC после нејзино

 Со цел визуелизација на можноста на одредени аналити да

 Алкално тетразолинско сино

 TLC може да се користи за изведба на лимит тестови за

 По развивање на плочата со соодветна мобилна фаза,

 На плочата за TLC може да се забележи дека мала дамка

 Во случај кога идентитетот на онечистувањата не е познат

 По сушењето и прскањето на плочата со соодветниот

 Со цел лимит тестот да биде успешен, потребно е да се

 Бројот на достапни теоретски подови за сепарација во

ГАСНА ХРОМАТОГРАФИЈА (GAS

Д–р Биљана Ѓорѓеска, редовен професор

 За инјектирање на примероците за анализа во колоната од

 Кога станува збор за пакувани колони за GC, најчесто

 Параметри кои влијаат врз перформансите на капиларната

 Волуменот на стационарната фаза, која се користи за

 Пламен јонизирачки детектор

 Инфрацрвен детектор со Fourier – ова трансформација

 Гасната хроматографија може да се користи за одредување

 Диметиланилинот претставува пример за производствено

 Иако според Британската фармакопеја, за анализа на ова

 Тековните методи од Британската фармакопеја за

ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЈА ПОД

Д–р Биљана Ѓорѓеска, редовен професор

❖ Течната хроматографија под висок притисок (HPLC)

❖ Течна мобилна фаза протекува под притисок преку колона од

❖ При елуирање на неутрални компоненти, времето потребно

❖ Покрај предностите, HPLC поседува и одредени

МАСЕНА СПЕКТРОМЕТРИЈА (MS);

Д–р Биљана Ѓорѓеска, редовен професор

каде: H – јачина на магнетно поле; r – радиус на кружната

 CE е една од најчесто употребуваните сепарациони техники во

каде: ν – брзина на движење на јонот; μe – електрофоретска

 Електрофоретската подвижност (µе) на сферичен јон

каде: q – полнеж на јонот; η – вискозност на медиумот во

 Капиларната електрофореза со високи перформанси наоѓа

 Наједноставната форма на капиларната електрофореза се

 потенцијално многупати  моментално, помалку

Д–р Биљана Ѓорѓеска, редовен професор

 Локалното магнетно поле (Bloc) кај 13С јадрата во состав

каде: γH – гиромагнетен однос на протоните; r –

 При изведба на NMR спектроскопијата, покрај проблемот

 Под поимот кристал се подразбира цврсто тело кое се состои

каде: λ – бранова должина; d – растојание помеѓу два соседни

 Иако SCD претставува моќна техника за проучување на

 TGA се темели на одредување на промената, односно

 Дистрибуцијата на честиците од прашочен материјал

 Густината на прашочниот материјал се дефинира како

Серија бр.: Пакување: _________

Произведено: Рок на траење: ___

Серија бр.: Пакување: _________

Произведено: Рок на траење: ___