Хроматографски

методи
2. Теоретски
разгледувања
Коеф. на распределба ↔ разделување
Од што зависи хроматографската сепарација?
Како се оценува квалитетот на разделувањето?
Хроматографски процес ↔ компонентите од
примерокот‐смесата патуваат со мобилната фаза
низ/преку стационарната фаза ↔ тернарен систем
РАСПРЕДЕЛБА:    [AS] ↔ [AM]

Коеф. на распределба: 

↗К ↔ А преферира стационарна фаза и обратно!

Коеф. на распределба ↔ разделување

↗К ↔ А преферира стационарна фаза и обратно!
стационарна фаза
А ↕ распределба
мобилна фаза во безброј едноподруго
рамнотежи
KA < KB < KC
↗K ⇒ ↗ заостанување
доволен број чекори
⇒ разделување!
разделување!
Хроматограм! 
Се мери:
¾волумен
¾време

⇒ висина, 
висина, површина
површина, 
, 
ширина, 
ширина, симетрија
симетрија на
пиковите

Фактори кои влијаат на задржувањето

¾ Составот и својствата на мобилната фаза

¾ Видот и својствата на стационарната фаза
¾ Меѓумолекулските интеракции помеѓу компонентата ‐
компонентите и стационарната и мобилната фаза
¾ Температурата

Гасна хроматографија Течна хроматографија

¾ Мобилна фаза ¾ Мобилна фаза
¾ Стационарна фаза ¾ Стационарна фаза
¾ Температура ¾ Температура
Фактори кои влијаат на задржувањето
¾ Меѓумолекулски интеракции
„слично привлекува слично“ или Кулонов закон – се
привлекуваат молекули со слични електростатски својства, 
својства, се
се
одбиваат оние со различни
Силни електростатски интеракции ↔ помеѓу јони!
Поларни van der Waal‐сови сили помеѓу поларни молекули
– молекули со поларни групи
Неполарни дисперзиони сили помеѓу неутрални молекули и
функционални групи, пр. алкани
, 
Комбинација: n‐бутанол = неполарни + поларни
Водородни врски – компонента‐стационарна фаза ⇒ бавно
воспоставување на р‐жи ⇒ развлекување, опашка

Фактори кои влијаат на задржувањето

¾ Меѓумолекулски интеракции
Поларни van der Waal‐сови сили помеѓу поларни молекули
– дипол‐дипол интеракции
– водородно сврзување
– просечна енергија на асоцијација ЄD

– парови solvent‐solute помеѓу молекули со слични диполи

– дипол‐индуциран дипол – поларна молекула со +полот
заемодејствува со електроните од друга молекула ⇒
индуциран дипол ⇒ електростатска интеракција
Фактори кои влијаат на задржувањето
¾ Меѓумолекулски интеракции
9 Поларни van der Waal‐сови сили помеѓу поларни молекули
– дипол ↔ диполен момент: μ

СЕЛЕКТИВНОСТ!

Фактори кои влијаат на задржувањето

¾ Меѓумолекулски интеракции
Неполарни – дисперзиони сили – најуниверзални помеѓу
неутрални молекули во неполарни растворувачи или
стационарни фази ↔ Лондонови дисперзиони сили
Асоцијација ↔ индуцирани диполи формирани од
електрони и јадра од едни молекули кои заемодејствуваат
со други ⇒ кохерентни диполи ⇒ релативно слаби
дисперзиони сили
Лондоновите сили:
поларизабилност α
јонизациски потенцијал I
растојание r
Дејствуваат на куси растојанија, главно на површината
на молекулите кои заемодејствуваат!
Задржување и рамнотежа (Ског, Вест...)
Времиња на задржување = ретенциони
= ретенциони времиња

• tM – мртво време (dead time) – за вид кој не се задржува,  мерка за

средната брзина на движење на мобилната фаза
• tR – време на задржување=ретенционо време (retention time)
средна линеарна брзина на средна линеарна брзина на
р‐рена супс. во cm/s мобилната фаза во cm/s
L=должина на колона

Задржување и рамнотежа
Врска брзини на миграција – константи на распределба

n = cV
Задржување и рамнотежа
Ретенционен фактор, 
фактор, k
k, за
, за супстанца А е дефиниран:
дефиниран:

• tM и tR – од хроматограм
• k < 1 – брзо елуирање=малку задржување
• k > 20 – бавно елуирање=мн. задржување
• 1 < k < 5 – тамам &
Како тоа се регулира?
• во GC – со промена на T и стац. фаза
• во LC – со промена на мобилна и стац. фаза

Задржување и рамнотежа
сепарација), α, 
Фактор на селективност (на сепарација), 
за две супстанци А и B е дефиниран како:
како:
KB –константа на распределба за посилно задржаната супс. B
KA –константа на распределба за послaбо задржаната супс. А
⇒ α > 1
Оптимизација ⇒ α ≠ 1
А и B се разделени!

• tM и tR – од хроматограм
Разделувачка ефикасност на колоната

Идеално – ако А, B и C патуваат низ колоната со сличен

тесен профил на пикот од почеток до крај!
Но, не е така! ⇒ Гаусовски профил на пикот – распределба на
молекулите во проширена зона (band)
⇒ задоволителна сепарација на A, B и C ⇒ резолуција ↔
функција од бројот на последователни сепарациони чекори
и дисперзијата на молекулите при тоа

Разделувачка ефикасност на колоната

Хроматографски пик ↔ ширина на пикот (bandwidth, w) ↔
распределба на молекулите во зона како што супстанцата патува
низ колоната (зависност од: инјектор, детектор, t, ретенција...).
Класична хроматографска теорија (σ2‐варијанца, N‐бр. на чекори)
N↗⇒σ↘
или
⇒поголема
ефикасност!
Функција и од време : или

Во пракса:

Бидејќи 95,5% од молекулите во една лента се во рамките на

±2 σ од средното ретенционо време, tR ⇒ wb=4σ ⇒ σ =wb/4 ⇒
Разделувачка ефикасност на колоната
tR ⇒ wb=4σ ⇒ σ =wb/4 ⇒ wb= ширина на пик во основата
wh= ширина на пик на ½ висина
(полуширина)
N = теор. број на чекори
на разделување

Ефикасност на колоната, N, 
во пракса!

Разделувачка ефикасност на колоната

Ефикасноста на колоната ↔ должина на колоната L!
N = број на теоретски подови т.е. рамнотежни чекори
⇒ висината на еден теоретски под H = L/N

1952 Martin & Synge – први ја опишале ефикасноста на

колоните преку H ‐ рамнотежeн чекор или HETP (height 
equivalent to a theoretical plate = висина на еден
теоретски под) и проширувањето на пиковите или
варијанцата во процесот на елуирање.
1956 van Deemter и сор. – утврдиле дека проширува‐
њето на лентите се случува главно при елуирањето низ
колоната.
Разделувачка ефикасност на колоната
(А)симетрија на пик
симетричен пик = гаусовски облик
– нормална дисперзија на
молекулите при движењето низ
колоната
Асиметрија:
‐ tailing – опашка – посилно
задржување на молекулите од
стац. фаза (водородно врзување ...)
‐fronting – „брзање“ напред на
молекулите поради послабо
задржување од стац. фаза,  tailing    fronting
преголемо количество примерок...

Процес на проширување на лентите

Проширувањето на хроматографски пик не може да го објасни
хроматографската теорија на теоретски подови!
⇒ Теорија на брзина (The Rate Theory)–van Deemter 1956
B
HETP = A + +C* u
u

3 члена (придонеси)
во проширувањето
на лентите :
А, B и C
Процес на проширување на лентите
⇒ Теорија на брзина (The Rate Theory)–van Deemter 1956
член А: „различни
патишта“ (eddy diffusion)

B
HETP = A + +C* u
u

→ dp= дијаметар на честичките
→ λ ↔ големината на честичките
од стационарната фаза
А не зависи од брзината на моб. 
фаза, но зависи од стац. фаза: 
големина и пакување!

помали честички, униформно пакување! ⇒ A↘

Процес на проширување на лентите

⇒ Теорија на брзина (The Rate Theory)–van Deemter 1956
член B: 
лонгитудинална
дифузија
B
HETP = A + +C* u
u

→ дифузија во насока на оската

на колоната и протокот
→ γ – hindrance фактор зависен
од пакувањето (1–капиларни; 
0,7–полнети) 
→ DM коеф. на дифузија, 104 пати
поголем за гасови ⇒ GC!!!
⇒ Важен при мали брзини на моб фаза! GC!
Процес на проширување на лентите
⇒ Теорија на брзина (The Rate Theory)–van Deemter 1956
член C: отпор
кон пренос
на маса
B
HETP = A + +C* u
u
пропорц. 
со u → df дебелина на филм од стац.фаза
→ dP дијаметар на честички од стац. 
фаза или dC на капиларна колона
→DS, DM коеф. на дифузија
⇒ CM << CS во GC 
⇒ CM ≈ CS во HPLC 

Процес на проширување на лентите

⇒Теорија на брзина (The rate Theory)–van Deemter 1956
⇒оптимална брзина на моб. фаза ↔ max N ↔ min H
B Hmin
HETP = A + +C* u
u

GC HPLC
Резолуција
Колку е добра хроматографската сепарација?
¾РЕЗОЛУЦИЈА помеѓу соседни пикови
⇒ точно да се определи површината под пикот
⇒ треба разделување до базната линија, не препокривање
⇒ два пика A и B треба да се разделени со 6σ (3σА+3σB) ↔ <0,3%
препокривање (overlap)
Во пракса:

Идеално:  1,2 < Rs < 1,5

Rs > 1,8 непотребно
продложување на времето
0,2% 2,3%

Резолуција, селективност, ефикасност

? √
√
? ?

? √
√
√√ √

?
Резолуција и селективност
Резолуцијата меѓу два пика зависи од:
¾ретенционите карактеристики на секоја компонента (k)
¾способноста на стац. фаза селективно да ги задржува
компонентите (α)
¾ефикасноста на колоната (N)

Oд:

RS

Резолуција и селективност
Резолуцијата меѓу два пика зависи од:
¾ретенционите карактеристики на секоја компонента (k)
¾способноста на стац. фаза селективно да ги задржува
компонентите (α)
¾ефикасноста на колоната (N)
RS

За постигнување на сакана резолуција:

1.оптимизација на k и α – менување на мобилната
фаза, елуирање при не многу ниски k (tR>tM, α>1) до
саканата резолуција
2.зголемување на N (должината на колоната)
Квантификација во хроматографија
Податоците од хроматограмот ⇒ релативни концентрации
на компонентите во смесата (ако е ОК резолуцијата)
Површината под пикот ≈ количеството на соодв. компонента!
Но, одговорот на детекторот се разликува за различни
компоненти:
¾UV детектор ↔ одговор зависен од апсорпц. коеф.
¾FID одговор ↔ формирање на јони
¾ECD одговор ↔ афинитет за електрони
¾...
⇒ треба да се знаат факторите на одговор на детекторот за
секоја супстанца (detector response factors) пред анализата
⇒Area% не е вистински одраз на составот на примерокот!

Квантификација во хроматографија
1. Нормализирање на површините под пиковите
• Повеќе (мин 5) мерења на смеса од компоненти со еднакви
(познати) количества на сите компоненти (треба прецизност)
• Една компонента се избира како референтна и релативните
одговори на детекторот се пресметуваат во однос на неа со
делење на површината под пикот на секоја компонента со
површината на пикот од референтната супс.
• DRFx (detector response factor за секоја компонента X):

• Се пресметува за секоја компонента: 

• % на секоја компонента се пресметува со изразот:
Квантификација во хроматографија
2. Внатрешен стандард
• Варијанта на претх. метод – за прецизна квантификација!
• Не е неопходно точно инјектирање
• Внатрешен стандард кој се додава во секој примерок и
неговиот пик е добро одделен во хроматограмот
• Се анализира познат примерок со внатрешен стандард
за секоја компонента x: ,  Cx – конц. на стд(x)
за внатр. стандард:
• Се пресметува response factor за секоја комп. во однос на IS:

• се анализира непознат примерок со IS:

• одлична прецизност, RSD<4%

Квантификација во хроматографија
3. Надворешен стандард
• Класична калибрација! 
• Автоматски инјектори со добра репродуцибилност
• Се определува зависноста: површина/концентрација ⇒
калибрациона права од серија стандардни р‐ри
Areastd = x mg/L
• Се анализира непознат примерок
x ⋅ Areamix
γ mix = mg/L
Areastd
Квантификација во хроматографија
4. Стандардни додатоци
• Се користи за многу аналитички техники, па и тука! 
• Се анализира примерок без и со стандарден додаток
• Се пресметува концентрацијата на аналитот преку
површините на пиковите од аналитот без (А1) и со (А2) 
стандарден додаток (x – конц. на стд. р‐р): 

• Алтернатива: 
повеќе стд. додатоци – серија
пресек со апсцисата = 
непозната конц.