Студии по биохемија и физиологија и молекуларна

биологија

Фонд: 4+0+3, 7 кредити

Доцент д-р Миха Буклески

Доцент д-р Миха Буклески
Трет спрат, ходник - лево
Кабинет: 306
Лабораторија: 305
е-mail: mihabukleski@yahoo.com
web: hemija.pmf.ukim.edu.mk/teachers/view/146
Литература
За предавања:
 Модерна аналитичка хемија, Давид Харви, (превод на
македонски)
 Аналитичка хемија, Вовед, Ског, Вест, Холер, Кроуч
(превод на македонски)
За задачи (нумерички вежби):
 Збирка решени задачи од аналитичка хемија,
Б. Андоновски, С. Петровска-Јовановиќ
 Збирка решени задачи по општа хемија,
Најдоски-Буклески
За лабораториски вежби:
 Квантитативна аналитичка хемија, практикум
С. Петровска-Јовановиќ, В. Трајковска, В. Павлова
Наставен план и програма
 Аналитичка хемија и нејзиното значење
 Аналитички постапка и аналитички приод
 Пресметки во аналитичката хемија
 Анализа на траги, концентрирање (земање на проба,
подготовка на проба, мерење). Грешки
 Статистичка обработка на аналитичките податоци
 Квантитативна компонентна аналитика
 Раствори и реагенси: состав, пресметки, подготовка.
 Оптички методи: Апсорпциона анализа,
Флуориметрија, Електроанализа, Потенциометрија,
Јон-селективни електроди
 Нови техники во медицината.
Колоквиуми, испити, бодирање...
 Услов за добивање потпис: изработени
лабораториски вежби и редовност (не повеќе од 3
отсуства)
 Два колоквиуми кои ќе содржат теориски прашања
и задачи или испит (теорија и задачи)
 Два колоквиуми × 40 поени = 80 поени
(или еден испит × 80 поени)
+ успешно изработени лабораториски вежби × 20 поени
Вкупно: 100 поени
 Оцена
0 – 52 = (5)
53 – 61 = (6)
62 – 71 = (7)
72 – 81 = (8)
82 – 91 = (9)
92 – 100 = (10)
Вовед во аналитичка хемија
АНАЛИТИКА
(во хемија, физика, математика, информатика, комерција, бизнис,
политика)
Анализа на ситуации или настани. Обезбедува
информации за:
• природата и бројот на составни делови на системот
• количества
• просторен распоред и промени со тек на време
• разработка на методологија и постапки за
постигнување на овие цели
• проценка и понуда на алтернативни решенија
СТРУКТУИРАНА ТЕХНИКА
ШТО ДОВЕДУВА ДО КОМПЛЕКСНИ РЕШЕНИЈА
Аналитичка хемија
Дел од хемијата кој се занимава со изучување на:
 квалитативниот состав на материјалите (од кои
компоненти се изградени материјалите)
 квантитативен состав на компонентите (колкава е
нивната застапеност во испитуваниот примерок)
 како се однесуваат компонентите во различни
услови, како се одделуваат и комбинираат (какви
промени настануваат)
Карактеристични реакции на компонентите Определување на
структурата/составот на
Хемиски и физички карактеристики материјалот
Дефиниција?
Фридрих Вилхелм Освалд (1853-1932), руско-германски
физико-хемичар и нобеловец:

„Аналитичка хемија, или вештина на препознавање

различни супстанци и определување на нивните
конституенти, зазема важно место меѓу применетите
науки. Таа дава одговори на прашањата, кои се дел од
хемиските процеси и се резултат на научни или
технолошки процеси“

Американско хемиско друштво (American Chemical Society -

ACS):
„Аналитичката хемија е наука на добивањето, обработ-
ката и интерпретацијата на податоците за составот и
структурата на материјата“. Со други зборови, таа е
наука за определување на квалитативниот и квантита-
тивниот состав на материјалите.
АНАЛИТИЧКО РАЗМИСЛУВАЊЕ СИНТЕТИЧКО РАЗМИСЛУВАЊЕ
• овозможува разбирање на деловите • толкува како составните делови
• утврдува разлики функционираат заедно
• наоѓа сличности

СИСТЕМАТСКО РАЗМИСЛУВАЊЕ

• МЕТОДСКИ
• КАКО РАБОТИТЕ ВЗАЕМОДЕЈСТВУВААТ ВО ЦЕЛИНА
• ШИРОК ФОКУС
Аналитичка хемија / инструментална хемија

Аналитичка хемија: квалитативна и квантитативна анализа

- класични методи за анализа
- погодни за анализа на поголеми количини аналит

Инструментална хемија
(дел од аналитичката хемија која за определување користи
инструменти): квалитативна, квантитативна, структурна,
динамичка анализа.
- брзо, паралелно определување на повеќе компоненти без
разделување, сензитивни методи, мала количина од
примерокот, елиминиран субјективен фактор.
Добивање на аналитичката информација

Аналитичка информација – сигнал карактеристичен

за испитуваните компоненти:
- За квалитативни цели: зависи од природата на
испитуваната компонента
- За квантитативни цели: величини карактеристич-
ни за количеството на компонентата (интензитет
на боја, степен за зрачење...)
- Временска зависност (тридимензионална
информација). Промена на квантитативниот
состав во зависност од времето.
 Компонентна аналитика
 Еднодимензионална анализа:
- калитативна анализа: има / нема
- квантитативна анализа: колку има
 Дводимензионална анализа:
- квантитативен и квалитативен состав: што има и
колку има
 Тридимензионална анализа
- промена на квалитативниот и/или квантитатив-
ниот состав на пробата
КЛАСИФИКАЦИЈА НА КВАНТИТАТИВНИ МЕТОДИ ЗА
АНАЛИЗА
 Класични методи
1. Гравиметриска метода: се мери МАСАТА.
2. Волуметриски методи: се мери ВОЛУМЕНОТ што се потрошил или
добил за определување на количеството од аналитот.

 Не класични методи
3. Инструментални методи: користење на ИНСТРУМЕНТИ за
детектирање на сигналот
‐ Електрични и магнетни (електрон-трансфер, магнетна
сусцептибилност)
‐ Спектроскопски, базирани на взаемодејство на електромагнетно
зрачење со испитувана супстанца
‐ Сепарациони техники: GC, HPLC
‐ Дополнителни аналитички техники: радиохемиски методи, масена
спектрометрија, кинетика, термички својства, рефрактометрија....
Користен сигнал за определување на бараната
супстанца (аналит)
Физички карактеристики
маса
волумен
боја
индекс на рефракција
топлинска спроводливост
Интеракции со електромагнетно зрачење (спектроскопија)
апсорпција
емисија
расејување
Електричен полнеж
електрохемија
масена спектрометрија

Во секоја од категориите развиени се серија различни техники

 Најчесто користени термини во аналитичката
хемија
1. Анализа: дава информации (хемиски или физички) во врска со примерокот
2. Аналити: компоненти од примерокот кои се од интерес
3. Матрица: остатокот од примерокот

Во анализата се определува идентитетот, концентрацијата или својствата на аналитите.

За да се направи ова определување, се мери едно или повеќе хемиски или физички
својства од аналитот.

4. Техника: било кој хемиски или физички принцип кој може да се употреби за
изучување на аналит.
5. Метода: примена на техниката за определувањето на даден аналит во определена
матрица.
6. Постапка е збир инструкции во кои има детали за тоа како да се примени методот на
даден примерок, вклучувајќи информации за соодветно земање примерок,
ракувањето со интерферентите и валидација на резултатите. Еден метод не мора да
води до една процедура.
7. Протокол е збир од строго дефинирани запишани инструкции кои даваат детали за
процедурата која мора да се следи, за агенцијата која го специфицирала протоколот
да ги прифати резултатите од анализата
8. Определување - Испитување на примерок со цел да
се најде идентитетот, концентрацијата или својствата
на аналитот.
9. Мерење- Експериментално карактеризирање на
хемиските или физичките својства на аналитот.
10. Сигнал - Експериментална мерка која е
пропорционална со некои карактеристики (пр.
количество) од аналит .
11. Техники на вкупна анализа - Техника кај која
сигналот е пропорционален со апсолутното
количество од аналит; исто така се нарекува
„класична“ техника.
12. Концентрациски техники - Техника кај која
сигналот е пропорционален со концентрацијата од
аналит; исто така се нарекуваат „инструментални“
техники.
 МЕТОДОЛОГИЈА НА РЕШАВАЊЕ НА АНАЛИТИЧКИ ПРОБЛЕМ
(т.н АНАЛИТИЧКИ ПРОЦЕС) или
аналитички пристап кон решавање на проблемите

Анализата вклучува неколку постапки и операции, кои ќе зависат од:

1. Дадениот проблем 2. Нашата експертиза 3. Апаратурата и
инструментацијата со која располагаме. Накратко:
- Идентификување и дефинирање на проблемот
- Разработка на експериментална постапка (метод, примерок, подготовка)
- Изведба на експеримент и собирање на податоци (сепарација, мерења)
- Анализа на експерименталните податоци
- Предложено решение за проблемот

ИЗБОР НА
ИЗБОР ПОДГОТОВКА
РЕПРЕЗЕНТА- СЕПАРА- ИНТЕРПРЕ-
ДЕФИНИРАЈ НА НА ПРИМЕРОК МЕРЕЊА
ПРОБЛЕМ ТИВЕН ЦИЈА ТАЦИЈА
МЕТОД ЗА АНАЛИЗА
ПРИМЕРОК

РЕЗУЛ
ТАТ
 - Што треба да се определува - Квалитативна или
квалитативна или структурна анализа или...?
- За што ќе се користи информацијата? Кој ќе ја користи?
ДЕФИНИРАЈ - Колку брзо е потребен резултатот?
ПРОБЛЕМ
- Колку точен и прецизен треба да биде?
- Колкав е буџетот?
Аналитичарот ја разработува стратегијата со клиентот,
вклучувајќи го и начинот на добивање примероци

Фактори:
- Тип на примерок
- Величина на примерокот
- Подготовка на проба (да или не)
ИЗБОР - Концентрација и интервал (осетливост)
НА - Селективност (интерференции?)
МЕТОД
- Точност (прецизност)
- Инструментација/автоматизација (да или не)
- Експертиза/искуство
- Цена
- Брзина
- Достапност на методи (стандардни) во
литературата/поставување нов приод?
 Фактори:
ИЗБОР НА
РЕПРЕЗЕНТА- - тип на примерок/хомогеност/димензии
ТИВЕН - земање примерок/грешки
ПРИМЕРОК

Фактори:
- цврсто, течно, гас
- се раствора ли?
ПОДГОТОВ- - да се согори или да се загрева?
КА НА
ПРИМЕРОК
- хемиско сепарирање или маскирање на
ЗА АНАЛИЗА интерферентите
- потреба за концентрирање/разредување?
- потреба за трансформација на аналитот за детекција?
- потреба за подесување на условите (рН, реагенси)
 - Дестилација
- Таложење
СЕПАРА-
ЦИЈА
- Екстракција со растворувачи
-дестилација
- Цврсто-фазна екстракција
- Хроматографија (и како дел од мерењето)
- Електрофореза (и како дел од мерењето)

Фактори:
МЕРЕЊА - Калибрација
- Валидација/контроли/слепи проби
- паралелни проби/повторување

- Статистичка анализа
ИНТЕРПРЕ-
ТАЦИЈА - Извештај на резултатот со ограничувањата/
интервал на доверба
1. Дефинирање на проблемот
5. Решение
Определување на видот на потребната
Надворешно проценување
информација (квалитативна, кванти-
тативна, структурна, фундаментална)
Идентификација на содржината на
проблемот

2. Разработка на експеримен-
4. Анализа на
тална постапка
податоците
Воспоставување на критериуми
Трансформација
(точност, прецизност, осетливост,
Статистика
селективност, цена, брзина)
Потврда
Идентификација на интерферентите
Интерпретација
Избор на метода
Воспоставување критериуми за
валидација
Стратегија за земање примерок

3. Спроведување на експериментот
Калибрација на инструменти и прибор
Дијаграм на текот на Стандардизација на реагенсите
аналитичкиот пристап Собирање на податоците
Следење на чекорите за спроведување на анализата

Анализата вклучува неколку постапки и операции, кои ќе зависат од:

1. Дадениот проблем 2. Нашата експертиза 3. Апаратурата и
инструментацијата со која располагаме. Накратко:
- Идентификување и дефинирање на проблемот
- Разработка на експериментална постапка (метод, примерок, подготовка)
- Изведба на експеримент и собирање на податоци (сепарација, мерења)
- Анализа на експерименталните податоци
- Предложено решение за проблемот

ИЗБОР НА
ИЗБОР ПОДГОТОВКА
РЕПРЕЗЕНТА- СЕПАРА- ИНТЕРПРЕ-
ДЕФИНИРАЈ НА НА ПРИМЕРОК МЕРЕЊА
ПРОБЛЕМ ТИВЕН ЦИЈА ТАЦИЈА
МЕТОД ЗА АНАЛИЗА
ПРИМЕРОК

РЕЗУЛ
ТАТ
 ИЗБОР
НА
Избирање на аналитички метод МЕТОД

Методот е примена на определена техника врз даден аналит во

дадена матрица.
Пр. Определување на концентрацијата на олово во води за пиење:
‐ гравиметриски метод (нерастворливи соли од олово како PbSO4 и
PbCrO4)
‐ титриметриски метод со градење на комплекси
‐ спектрофотометриски методи со комплекси што апсорбираат
‐ атомска апсорпциона спектроскопија со олово како слободен атом
во гасна состојба.
‐ кулометриските, потенциметриските и волтаметриските методи на
Pb, Pb2+, Pb4+)

Потребите на анализата го определуваат најдобриот метод. Во

избирањето на метод се дава важност на некои или на сите следни
критериуми: точност, прецизност, осетливост, селективност,
робустност, издржливост, ниво на работење, време на анализа,
достапност на опрема и цена.
 ИЗБОР
НА
МЕТОД
Точност - Мерка за сложувањето помеѓу експерименталниот резултат и неговата
очекувана вредност
Прецизност - Показател на репродуцибилноста на мерење или резултат.
Осетливост - Мерка за способноста на методот да направи разлика помеѓу два
примероци; се запишува како промена на сигнал на единица промена на количина од
аналит (k).
Граница на детекција - Статистички израз во врска со најмалата количина од аналит
која може да се определи со сигурност.
Селективност - Мерка за слободата на методот од интерференти, како што е
дефинирана од коефициентот на селективност на методот.
Коефициент на селективност - Мерка за осетливоста на метод кон интерферент во
однос на онаа кон аналитот (KA,I)
Робусен- Метод кој може да се примени на аналит во широко мноштво од матрици
Издржлив - Метод кој не е осетлив на (релативно мали) промени во
експерименталните услови.
Ниво на работење - Три ограничувања од практична важност се количината од
примерок достапен за анализа, концентрацијата од аналит во примерокот и
апсолутната количина од аналит неопходна за добивање на сигнал кој може да се
измери.
Опрема, време и цена
 ИЗБЕРИ
Споредба на различни аналитички методи МЕТОД

Класификација на аналитичките методи според количеството примерок

 Напредокот во науките што се базираат на мерења
се темели на фундаментални и насочени истражувања

мерење

Насочени (целни) фундаментални

истражувања истражувања

Специфични проблеми, Нови принципи,

нови апликации на иновативни концепти
постоечките принципи и
техники

Карактеризација и
анализа
 ИЗБОР НА
Пет прашања би требало да се земат предвид кога се дизајнира РЕПРЕЗЕН-
план за земање примерок: ТАТИВЕН
ПРИМЕРОК
1.Од каде, во рамки на целната популација, треба да се земат примероци?
2.Каков вид на примероци треба да се земат?
3.Колку е минималното количество примерок потребно за секоја анализа?
4.Колку примероци треба да бидат анализирани?
5.Како може вкупната варијанца да се минимизира?

1 . Од каде да се земе примерок од целната популација

Грешки при земање примерок настануваат кога составот на примерокот не е идентичен со оној на
популацијата од каде е извлечен.
- Хомоген материјал, се земаат посебни примероци без да се води сметка за можните грешки.
- хетероген материјал (во време или во простор).
Пр. лекарствата достапни како суспензии за орална употреба имаат повисока концентрација на
нивните активни состојки на дното од садот. Пред земање на доза (примерок), суспензијата се
протресува
-Нивото на глукоза во крвта од пациентот, на пример, се менува во зависност од активностите
(јадење, лекарства или вежбање).
- Некои системи покажуваат и просторна и временска хетерогеност. Концентрацијата на растворен
O2 во езеро покажува временска хетерогеност поради промените на годишните времиња, додека
расфрлени извори на загадување може да произведат просторна хетерогеност.
Заради хетерогеноста на целната популација, примероците мора да бидат земени на начин што
обезбедува минимизирање на определени грешки при земањето примерок.
 ИЗБОР НА
РЕПРЕЗЕН-
ТАТИВЕН
ПРИМЕРОК
случаен примерок
Примерок земен по случаен избор од целната популација.
проценето земање примерок
Примероци земени од целната популација, употребувајќи достапна информација за
распространетоста на аналитот во популацијата.
систематско земање примерок
Примероци земени од целната популација во точни временски или просторни интервали.

слоевито земање примерок

План за земање примерок кој ја дели популацијата на одделни слоеви од кои се земаат случајни
примероци.

погодно земање примерок

План за земање примерок, во кој примероци се земаат бидејќи е лесно да се обезбедат.

одвоен примерок
Еден примерок земен од целната популација.
композитен примерок
Неколку одвоени примероци комбинирани за да формираат единствен примерок.
in situ земање примерок
Земање примерок во популацијата без физичко отстранување на примерок.
 ИЗБОР НА
Примена на планот за земање примерок РЕПРЕЗЕН-
ТАТИВЕН
Три чекори: ПРИМЕРОК

- физичко отстранување на примерокот од неговата целна популација,

- конзервирање на примерокот и
- подготовка на примерокот за анализа.
Со исклучок на in situ земање примерок, анализата на примерок се прави откако е
отстранет од целната популација.
Садовите за земање примероци- од стакло или пластика.
Kimax или Pyrex борсиликатни садови се стерилизираат, едноставни се за чистење и се
инертни на сите раствори, освен на многу алкални. Недостатоци на стаклените садови
е цената, тежината и кршливоста.
Пластичните садови - различни полимери, вклучувајќи ги полиетилен, полипропилен,
поликарбонат, поливинил хлорид и Тефлон (политетрафлуороетилен).
Пластичните садови се лесни, издржливи и, освен оние направени од Тефлон, не се
скапи.
Најчесто се употребуваат стаклени или пластични шишиња, при што полиетиленски
шишиња се најшироко применувани, поради нивната ниска цена.
Стаклени садови секогаш се употребуваат, кога се земаат примероци за анализа на
пестициди, масла и масти и органски супстанци, бидејќи овие соединенија често
заемодејствуваат со пластичната површина.
Бидејќи стаклената површина лесно апсорбира јони од метали, пластичните шишиња
се подобри за примероци за анализа на метали во траги.
 ИЗБОР НА
РЕПРЕЗЕН-
ТАТИВЕН
ПРИМЕРОК
Откако примерок е отстранет од целната популација, се јавува опасност
дека тој може да претрпи хемиска или физичка промена. Ова е сериозен
проблем бидејќи својствата на примерокот нема повеќе да бидат
репрезентативни за целната популација. Од оваа причина, примероците
често се конзервираат пред нивното транспортирање до лабораторијата за
анализа. Дури и кога примероците се анализираат на терен, сè уште
конзервирањето може да биде потребно.

За биолошки обрасци –смрзнување, органски растворувачи

Методи на конзервирање и максимално време на

задржување, за одбрани параметри во вода и отпадна вода
Параметар Конзервирање Максимално време на
задржување

амонијак разлади до 4 oC, H2SO4 до 28 дена

pH<2

хлорид ништо не е потребно 28 дена

метали – разлади до 4 oC 24 h
Cr(VI)

метали – Hg HNO3 до pH<2 28 дена

метали – сите HNO3 до pH<2 6 месеци
останати

нитрати ништо не е потребно 48 h

Биолошки материјал
Подготовка на примерок За разлика од гасовите и течностите, кои обично бараат ПОДГОТОВКА
мала подготовка на примерок, цврстите примероци имаат потреба од подготовка НА ПРИМЕРОК
пред анализата. За екстремно хетерогени популации, кои се состојат од големи ЗА АНАЛИЗА
честички, грубиот примерокот може да биде многу голем за анализа. На пример, за
вагон кој содржи товар од никелна руда со просечна големина на честичките од 5 mm, за да се добие
разумна варијанца на земање примерок, потребен е примерок тежок еден тон. Намалувањето на
просечната големина на честичките на примерокот овозможува земање на ист број на честички, но
со помала и комбинирана маса со која полесно се работи.
Второ, за поголемиот дел од аналитичките техники, особено оние кои се употребуваат за
квантитативни анализи, потребно е аналитот да биде преведен во раствор. Цврстите примероци,
или барем аналитите од цврстиот примерок, мора да се преведат во раствор.
Преведување на цврсти примероци во раствор Понекогаш, примерокот лесно се раствора во
соодветен растворувач, со благо мешање и загревање. Дестилираната вода е вообичаениот
растворувач за неоргански соли, но органски растворувачи, како метанол, хлороформ или толуен
се употребуваат за органски материјали. Често, еден или повеќе од компонентите од примерокот
се отпорни кон едноставно растворање. Тогаш се применуваат додатни методи за растворање.

Добивање репрезентативна проба

Шематски дијаграм на сад за растворање со

микробранови.
 ПОДГОТОВКА
НА ПРИМЕРОК
ЗА АНАЛИЗА

Табела 7.2 Киселини и бази кои се употребуваат за растворање на примерок

Раствор
(≈ % w/w) Примени и својства
HCl (37 %) - раствора метали кои полесно се редуцираат од H2 (Eo < 1)
- раствора нерастворливи карбонати, сулфиди, фосфати, сулфати и многу оксиди

HNO3 (70 %) - силен оксидационен реагенс

- ги раствора најчестите метали освен Al и Cr
- разложува органски и биолошки примероци (мокро спалување)
H2SO4 (98 %) - раствора многу метали и легури
- разложува органски супстанци преку оксидација и дехидратација

HF (50 %) - раствора силикати образувајќи испарлив SiF4

HClO4 (70 %) - топли, концентрирани раствори се силни оксидациони реагенси
- раствора многу метали и легури
- разложува органски супстанци (реакциите со органски супстанци често се
експлозивни, употреби ги во специјално опремени дигестори со заштитно стакло и
после претходно разложување со HNO3)

HCl:HNO3 (3:1 V/V) - познат уште како царска вода (aqua regia)
- раствора Au и Pt
NaOH - раствора Al и атмосферски оксиди од Sn, Pb, Zn и Cr.
Раздвојување на аналитот од интерференти
сепарација
Целта на аналитичкото раздвојување е да се отстрани или аналитот или интерферентот
од матрицата на примерокот. За да се постигне раздвојување, мора да постои барем една
значителна разлика помеѓу хемиските или физичките својства на аналитот и интерферентот.
Притоа, фундаменталниот проблем останува – и раздвојувањето се темели на селективност.
Раздвојување, во кое целосно се отстранува интерферентот може да доведе до делумно
губење на аналитот. Ако, пак, се адаптира раздвојувањето за да се минимизира загубата на
аналит, може да заостане интерферентот.
На ефикасноста на раздвојување влијае и неможноста за зачувување на целиот аналит и
неможноста за отстранување на целиот интерферент. Се дефинира принос (recovery) на
аналитот, RA, каде c(A) е концентрацијата на аналит која останува после раздвојувањето, а
c(A)o е почетната концентрација на аналитот. Принос од 1,00 значи дека нема губиток на
аналит за време на разделувањето.
Класификација на техниките за раздвојување
𝑐(A) Основа на Техника на раздвојување
𝑅A = раздвојување
𝑐(A)o големина филтрирање
дијализа
Класификација на техниките за раздвојување димензионо-исклучувачка
хроматографија
Аналит и интерферент може да се раздвојат ако маса и густина центрифугирање
има значајна разлика во барем едно од нивните образување маскирање
комплекси
хемиски или физички својства.
промена во дестилација
физичка состојба сублимација
рекристализација
промена во таложење
хемиска состојба јонска размена
електродна депозиција
испарување
одвојување помеѓу екстракција
фази хроматографија
Раздвојувања базирани на големина
Големина - физичко својство за раздвојување. Раздвојувањето се сепарација
постигнува употребувајќи порозен медиум низ кој може да помине само
аналитот или интерферентот.
Филтрирање, користи гравитација. Намален или зголемен притисок за
да се пренесе примерокот низ порозен филтер е најчесто применуваната
техника на раздвојување, базирана на големина.
Интерферентите, во форма на честички, може да се раздвојат од
растворениот аналит со филтрирање, Употребувајќи филтер со големина
на пори што го задржува интерферентот. Филтрацијата, се употребува за
издвојување на аналити, присутни како цврсти честички, од растворените
јони во матрицата од примерокот - нужен чекор во гравиметрија, каде
аналитот се издвојува како талог.
Дијализа, во која семипермеабилна мембрана се употребува за
раздвојување на аналитот и интерферентот. Мембрани за дијализа
вообичаеносе изработуваат од целулоза, со големина на пори од 1-5 nm.
Примерокот се става во внатрешноста на навлака или цевка изработена
од мембраната. Мембраната за дијализа и примерокот се сместуваат во
сад исполнет со раствор чиј состав се разликува од оној на примерокот.
Ако концентрацијата на определено соединение не е еднаква на двете
страни од мембраната, добиениот концентрационен градиент обезбедува
движечка сила за негова дифузија низ мембраната. Иако мали честички
може слободно да поминуваат низ мембраната, поголеми честички не се
во состојба да поминуваат. Дијализата често се употребува за
прочистување на протеини, хормони и ензими. За време на дијализа на Почеток
бубрезите,метаболитичките отпадни продукти, како уреа, уринска крај
киселина и креатинин, се отстрануваат од крвта преку поминување над на дијализата
мембраната за дијализа.
 техника на раздвојување базирана на големина
сепарација
Димензионо-исклучувачка хроматографија, (хроматографија со раздвојување
базирано на големина на молекулите или т.н. гел-пропустлива)
колоната се полни со мали, приближно 10 μm, порозни честички од вкрстено-сврзан
декстрин или полиакриламид. Големината на порите од честичките се контролира
преку степенот на вкрстено сврзување, така што поголемо вкрстено сврзување
одговара на помала големина на пори. Примерокот што треба да се раздвои се
внесува во ток од растворувач, кој се пумпа низ колоната со фиксирана брзина на
течење. Честичките кои се преголеми за да влезат во порите, не се задржуваат и
поминуваат низ колоната со иста брзина како и растворувачот. Но, подолго време
им треба на оние честички што можат да навлезат во структурата на порите, за да
поминат низ колоната. На најмали честички, кои влегуваат подлабоко во
структурата на порите, им треба најмногу време за да поминат низ колоната.
Димензионо-исклучувачка хроматографија широко се употребува во анализата на
полимери и во биохемија, каде се употребува за раздвојување на протеини.
 сепарација
Раздвојувања базирани на маса или густина
При разлика помеѓу масата или густината на аналитот и интерферентот, раздвојување, со
употреба на центрифуга. Примерокот, на пр. суспензија, се внесува во епрувете за
центрифугирање и се врти со голема аголна брзина (голем број на вртежи во минута, rpm).
Честичките со поголема центрифугална сила имаат поголема брзина на седиментација и попрво се
повлечени кон дното на епруветата за центрифугирање.
За честички со еднаква густина, раздвојувањето е базирано на маса, каде потешките честички
имаат поголеми брзини на седиментација.
Кога честичките имаат еднаква маса, оние со поголема густина имаат поголема брзина на
седиментација

Во биохемијата, центрифугирањето е значајна техника

за раздвојување. Пр. лизозомите може да се раздвојат
од другите клеточни компоненти со многукратно
диференцијално центрифугирање, при кое примерокот Услови за раздвојувањето на одбрани клеточни
е поделен на цврст остаток и раствор кој се нарекува компоненти со центрифугирање
матичен раствор. По уништување на мембраните на Центрифугална Време
клетките, растворот се центрифугира 20 min, на Компоненти сила (min)
(∙g)
15000∙g (сила на полето на центрифугирање која е
еукариотски клетки 1000 5
15000 пати поголема од гравитационото поле на мембрани од клетки, 4000 10
Земјата) при што се таложат остатокот од клеточни јадра
мембрани и митохондрии. Матичниот раствор се митохондрии, клетки 15 000 20
одвојува со декантација од остатокот и се од бактерии

центрифугира на 30000∙g за 30 min, при што се лизозоми, мембрани 30 000 30

од бактерии
таложат лизозомите рибозоми 100 000 180
центрифугирање со рамнотежна градиентна густина.
сепарација
Примерокот е или сместен во раствор со подготвена градиентна густина или во
раствор кој, откако е центрифугиран, формира градиентна густина.
градиенти на густината може да се постигнат со раствори од сахароза или CsCl.
При центрифугирање, компонентите од примерокот се подложни на седиментација со брзина,
определена од нивната центрифугална сила. Бидејќи густината на растворот се зголемува одејќи
кон дното на цевката за центрифугирање, брзината на седиментација за секоја компонента се
намалува одејќи кон дното на цевката за центрифугирање. Кога компонента го достигнува нивото
каде нејзината густина е еднаква со онаа на растворот, центрифугалната сила опаѓа на нула и
седиментацијата запира. Секоја компонента, според тоа, е издвоена како посебен прстен
сместен онаму каде густината на компонентите е еднаква со густината на растворот. На пример,
смеша од протеини, RNA и DNA може да се раздвои на овој начин, бидејќи нивните густини се
различни. Градиентна густина од 1,65 g/cm3 до 1,80 g/cm3 се воспоставуваупотребувајќи CsCl.
Протеините, со густина помала од 1,3 g/cm3 не таложат, додека RNA, со густина поголема од 1,8
g/cm3 се собира како остаток на дното од цевката за центрифугирање. DNA, која има приближна
густина од 1,7 g/cm3 се раздвојува како прстен во близина на средината од киветата.

Раздвојување на клеточни органели

Раздвојувања базирани на реакции на образување на комплекси (маскирање) сепарација

Техники за спречување на интерференциите е сврзување на интерферентот во

форма на растворлив комплекс, спречувајќи го да интерферира во определувањето
на аналитот - МАСКИРАЊЕ.

Маскирањето не е техника на раздвојување. бидејќи аналитот и интерферентот не се

физички раздвоени еден од друг туку е на псеудо-раздвојување, при што
соединението не учествува во хемиската реакција затоа што се сврзува со
маскирното средство во нереактивен комплекс

Маскирно Јони за маскирање

средство
 сепарација
Раздвојувања базирани на распределба помеѓу фази

Најважната класа на техники за раздвојување е базирана на селективна распределба на аналитот

или интерферентот помеѓу две немешливи фази. Кога фаза, која содржи растворена супстанца, S,
се доведе во контакт со втора фаза, растворената супстанца се распределува помеѓу двете фази.

𝑐(𝑆фаза 2 )
𝑆фаза 1 ↔ 𝑆фаза 2 𝐾D =
𝑐(𝑆фаза 1 )

се нарекува константа на распределба или коефициент на распределба. Ако KD е доволно голем,

тогаш растворената супстанца ќе помине од фаза 1 во фаза 2. Растворената супстанца ќе остане во
фаза 1 ако коефициентот на одвојување е мал. Ако фаза која содржи две растворени супстанци се
доведе во контакт со втора фаза, и KD е погоден само за една од растворените супстанци, возможно
е раздвојување на растворените супстанци.

Екстракција помеѓу две фази Кога примерокот е првично присутен во една од фазите,
раздвојувањето е познато како екстракција. При едноставна екстракција, примерокот се
екстрахира еден или повеќе пати со делови од втората фаза. Едноставните екстракции се особено
корисни за раздвојување кога само една од компонента има погоден однос на распределба.
Неколку важни техники за раздвојување се базирани на екстракција, вклучувајќи течно-течни,
течно-цврсти, цврсто-течни и гасно-цврсти екстракции.
 сепарација
Течно-течни екстракции

Течно-течни екстракции најчесто се изведуваат во одделителна инка. Двете течности се

внесуваат во одделителната инка која се клумка за да се зголеми допирната површина
помеѓу фазите. Кога екстракцијата е завршена, течностите се оставаат да се раздвојат,
така што погустата фаза се одвојува на дното од одделителната инка. Течно-течна
екстракција може да се изведе и во садот со примерок, со додавање на раствор за
екстракција. Пестициди во вода, на пример, може да се конзервираат за подолг период,
со екстракција во мал волумен од хексан кој се додава на примерокот, на терен.
Цврсто фазни екстракции
Во цврсто фазни екстракции, примерокот поминува низ полнител кој содржи цврсти честички кои
служат како материјал за атсорпција. За течни примероци, цврстиот атсорбент е изолиран или во
носач во форма на диск или во колона. Изборот на атсорбент зависи од својствата на
соединенијата кои ќе се задржуваат и од матрицата во која се наоѓаат. На пример седативи, како
секобарбитал и фенобарбитал, може да се изолираат од серум со цврсто фазна екстракција
употребувајќи C-18 цврст атсорбент. Вообичаено, 500 μL примерок од серум се пропуштаат низ
полнителот, така што седативите се задржуваат со течно-течна екстракција. Полнителот се измива
со дестилирана вода за да се отстранат заостанатите траги од серумската матрица. Задржаните
седативи се елуираат од полнителот со цврсто-течна екстракција, употребувајќи 500 μL ацетон. За
многу анализи, цврсто фазните екстракции ги заменуваат течно-течните екстракции заради нивната
лесна употреба, побрзи времиња
Атсорбент Структура на Својства и употреби на екстракција, намалување на
површина волумен од растворувач и
силициум диоксид - задржува слабо до средно поларни
соединенија од органски матрици нивната голема способност за
- витамини растворливи во масти, концентрирање на аналитите.
стероиди
алуминиум оксид - задржува хидрофилни соединенија
од органски матрици

цијанопропил - задржува најразлични соединенија

од водни и органски матрици
- пестициди, хидрофобни пептиди
диол - задржува голем број соединенија од
водни и органски матрици
- протеини, пептиди, фунгициди
окстадецил (C-18) - задржува хидрофобни соединенија
од водни матрици
- кофеин, седативи, полиароматични
јаглеводороди, јаглехидрати,
пестициди
октил (C-8) - слично со C-18
стирен - задржува голем број соединенија од сепарација
дивинил бензен водни матрици
- полиароматични јаглеводороди
Континуирани екстракции за компоненти од интерес што немаат погоден коефициент на
одвојување, под услов дека сите останати компоненти имаат значително помал коефициент на
одвојување.

Екстракцијата се изведува со континуирано поминување на фазата за екстракција низ

примерокот се додека да се постигне квантитативна екстракција.
Многу од континуираните екстракции за цврсти примероци се изведуваат со Сокслетов
екстрактор. Растворувачот за екстракција се внесува во долниот резервоар и се загрева до
неговата температура на вриење. Растворувачот во парната фаза се движи нагоре низ цевката
од левата страна на апаратурата до кондензаторот каде кондензира назад во течна состојба.
Потоа растворувачот поминува низ примерокот, кој е сместен во целулозен порозен сад за
екстракција, и се собира во горниот резервоар. Кога волуменот од растворувач во горниот
резервоар достигне до закривувањето на повратната цевка, растворувачот и било која
екстрахирана компонента се испуштаат назад во долниот резервоар. Со тек на време
концентрацијата на екстрахираната компонента во долниот резервоар се зголемува.
Денес, Soxhlet-ови екстракции се заменуваат со микробранови. Примерокот се внесува во
затопен сад за растворање заедно со течната фаза за екстракција. Микробранова печка се
употребува за загревање на смешата за екстракција.
Употребата на затопениот сад за растворање овозмо-
жува екстракцијата да се одвива при повисока темпе-
ратура и притисок, со тоа намалувајќи го времето
потребно за квантитативна екстракција. ВоSoxhlet-ова
екстракција температурата е ограничена од страна на
точката на вриење на растворувачот, при
атмосферски притисок.
Хроматографски раздвојувања При екстракција, примерокот првично е присутен во
една фаза а компонентата од интерес се екстрахира во втората фаза. Раздвојувања
може да се постигнат и со континуирано поминување на една фаза без примерок, која
се нарекува мобилна фаза, над втора фаза без примерок која останува фиксна или
неподвижна. Потоа, примерокот се инјектира или се внесува во мобилната фаза. При
движење на компонентите од примерокот со мобилната фаза, се распределуваат
помеѓу мобилната и стационарната фаза. Оние компоненти со најголеми коефициенти
на одвојување, најверојатно ќе се движат во стационарната фаза, и ќе им треба
подолго време за да поминат низ системот. Ова е основата на сите хроматографски
техники за раздвојување. Модерната хроматографија овозможува раздвојување на
аналити и интерференти, но и квалитативна и/или квантитативна анализа на аналитот.