Bảo quản nguồn gen in vitro

Khái niệm về bảo quản nguồn gen

1.1. MỤC ĐÍCH

Mục đích cơ bản của việc
bảo quản nguồn gen thực
vật là duy trì sự phong phú
đa dạng di truyền trong
loài, giữa các loài và trong
hệ sinh thái nói chung để
làm cơ sở cho việc khai
thác và sử dụng chúng một
cách hợp lý cho hiện tại và
trong tương lai.
1.2 Các phương thức bảo quản nguồn gen thực vật

• Nguồn gen thực vật thường được bảo quản theo 2 phương thức chính :
• Bảo quản tại chỗ ( in situ ) : trong phương thức bảo quản này thực vật
sinh trưởng trong trạng thái tự nhiên của chúng. Loại thực vật được bảo
quản tại chỗ là những cây sinh sản vô tính, cây có hạt recalcitrant và các
cây hoang dại.
• Bảo quản nhân tạo (ex situ ) : trong phương thức bảo quản này thực vật
hay các cơ quan sinh sản của chúng được bảo quản trong điều kện nhân
tạo tối ưu. Bảo quản ex situ đóng vai trò quan trọng trong xây dựng các
ngân hàng gen và được sử dụng rộng rãi cho bất kỳ loại cây trồng nào.
Những hình thức bảo quản ex situ khác nhau :
• Bảo quản cây trên vườn ươm tạo thành field bank
• Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed bank
• Bảo quản in vitro tạo thành in vitro bank
• Việc lựa chọn phương thức bảo quản nào sẽ phụ thuộc vào bản chất
của cây, điều kiện kinh tế và phát triển khoa học công nghệ của mỗi
quôc gia.
• Trong thực tế, để bảo tồn được sự đa dạng nguồn gen một cây trồng
nào đều phải phối hợp chặt chẽ và hợp lý các phương thức bảo quản
trên. Phụ thuộc đối tượng cần bảo quản chúng hỗ trợ lẫn nhau và có
tầm quan trọng khác nhau.
930,000 varieties of food crops

Svalbard có chứa hạt giống

từ hơn 60 tổ chức và hầu
hết các nước trên thế giới.
Cơ sở lý luận của việc bảo quản nguồn gen in vitro

• A. Lưu giữ nhưng nguồn gen có

giá trị không bị bệnh hoặc tác
động của côn trùng
- Nguồn gen của các cây lương
thực có giá trị được lưu giữ để sử
dụng khi cần và dùng cho các
mục đích khác…
- Đây là nguồn vật liệu cho các
nghiên cứu phân tử
Cơ sở lý luận của việc bảo quản nguồn gen in vitro

B. Bảo tồn các nguồn gen thực

vật có nguy cơ tuyệt chủng
• Đặc biệt lưu ý các nguồn gen cây
thực phẩm có các gen hữu ích
Cơ sở lý luận của việc bảo quản nguồn gen in vitro
C. Tại sao không lưu giữ các
nguồn gen quý hiếm, có giá trị
bằng hạt?
• Hình thức bảo quản hạt chỉ thích
nghi vơi một số đối tượng (gạo,
lúa mì…)
• Một số đối tượng hạt không thể
bảo quản
• Sức sống của hạt sẽ giảm theo
thời gian
• Không thích hợp cho cây nhân
giống vô tính
 Kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro
• Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn
gen thực vật nhất là với các cây nhân giống vô tính và có hạt mất sức
nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp (recalcitrant).
• Có hai phương thức: Bảo quản sinh trưởng chậm và bảo quản ngừng
sinh trưởng tạm thời
 Bảo quản sinh trưởng chậm

• Đặc điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian giữa 2 lần cấy
chuyển nhờ ức chế sự sinh trưởng của mẫu cấy nhằm giảm đến mức
tối thiểu chi phi trong quá trình bảo quản.
• Trong thời gian bảo quản mô và tế bào thực vật vẫn tiếp tục sinh
trưởng nhưng với tốc độ rất chậm (thường giảm từ 15 - 20 lần so với
bình thường).
• Thời gian bảo quản sinh trưởng chậm có thể kéo dài một vài năm.
Phương pháp này thường áp dụng để bảo quản cây non hoàn chỉnh,
chồi mầm, phôi... để ít gây các biến dị sinh dưỡng và các đặc tính di
truyền không bị mất hay thay đổi trong thời gian bảo quản.
 Bảo quản sinh trưởng chậm
• Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản
các mẫu bảo quản được chuyển sang
môi trường tươi và đặt một thời gian
gắn trong điều kiện tối thích để kích
thích sự tái sinh trưởng trước khi băt
đầu một chu kỳ bảo quản mới.
• Xác định thời gian tối đa an toàn cho
từng loại cây trồng trong quá trình bảo
quản sinh trưởng chậm.
 Các nhân tố ức chế sinh trưởng
(trong bảo quản sinh trưởng chậm)
• Nhiệt độ thấp: giảm nhiệt độ của phòng nuôi cây
• Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy axit abcisic
(ABA), Clo cholin clorit (CCC)
• Các chất gây áp suất thẩm thấu: bổ sung vào môi trường nuôi cấy
manitol, sorbitol, saccarose…
• Thay đổi điều kiện nuôi cấy như: giảm cường độ chiếu sáng, giảm
nồng độ oxy…
 Hạ thấp nhiệt độ phòng nuôi

Ví dụ: Chồi cây hoa cẩm chướng có thể duy trì

sinh trưởng ở điều kiện nuôi cấy 4 độ hoặc 24 độ
C.
Lưu ý một số đối tượng cây nhạy cảm với nhiệt
độ
4C
Trong quá trình bảo quản vẫn cần có ánh sáng. 24 C

14
 An example of simple low T storage

• Recalcitrant seed
• 15 C allowed storage for 15
months.
• 15 C was better than 10 C or 5 C.
• Plastic caps were better than
cotton plugs (less drying).
• However, tight sealing caused
some problems with ethylene.
Plant Cell Reports (1992) 11:200 15
 Bảo quản sinh trưởng chậm
• Ưu điểm • Nhược điểm
Nguồn vật liệu bảo quản có thể - Mẫu cấy tiếp xúc dài hạn với các
quay trở về điều kiện sinh trưởng nhân tố ức chế sinh trưởng đe dọa
bình thường ngay khi cần đến khả năng sống của mẫu
- Mẫu bị nhiễm trong quá trình
nuoi cấy
- Biến đổi về kiểu gen khi có biến
dị soma xảy ra
 Bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời
Cryopreservation
• Đặc điểm của kỹ thuật này là mẫu nuôi cấy được bảo quản
trong nitơ lỏng (- 196 độ C ) và trong thời gian bảo quản tế
bào, mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng.
• Đây là kỹ thuật bảo quản dài hạn và trước khi đưa vào bảo
quản cần phải tiến hành xử lý tránh sự kết tinh nước trong tế
bào làm chết các mẫu bảo quản.
• Kỹ thuật này hiện đã được áp dụng cho hàng tram loài thực
vật khác nhau và mẫu đưa vào bảo quản thường gồm tế bào
huyền phù, mô sẹo, phôi hợp tử, phôi soma, mầm ngủ, đỉnh
ngọn...
Các giai đoạn của kỹ thuật của bảo quản
ngừng sinh trưởng tạm thời
• Nuôi cấy in vitro và tách mẫu ở pha tăng trưởng để đưa vào bảo quản.
• Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu.
• Xử lý lạnh đến nhiệt độ cần thiết (-300C, - 400C).
• Bảo quản mẫu trong nitơ lỏng (-1960C).
• Phá băng cho các mẫu bảo quản ở nhiệt độ 370C - 400C
• Phục hồi sự sinh trưởng của mẫu và tái sinh cây nguyên vẹn.
 Cryoprotectants

Cryobiology 76 (2017)

74e91

Glycerol and DMSO are the most commonly

employed cryoprotective agents.
 Stages in a freeze preservation protocol

1. Pre-growth
2. Cryoprotective
pretreatment
3. Freezing
4. Storage, thawing
and regrowth