PHÉP THỬ NỘI ĐỘC TỐ VI KHUẨN

Phép thử nội độc tổ vi khuẩn dùng để phát hiện hoặc định lượng nội độc tố của vi khuẩn gram âm có
trong mẫu thử cần kiềm tra. Phương pháp sử dụng thuốc thử lysat là dịch phân giải tế bào dạng
amip có trong máu một loài sam biển, Limulus polyphemus hoặc Tachypleus Tridentatus.

Tại sao phải thử nội độc tố vi khuẩn?

- Các vi khuẩn này giải phóng ra môi trường một lượng nhỏ nội độc tố như là sản phẩm của
quá trình trao đổi chất của chúng và lượng lớn nội độc tố được giải phóng khi thành tế bào
bị hư hại hay khi vi khuẩn gram âm bị chết hoặc bị ly giải. Khi bệnh nhân có hệ thống miễn
dịch kém, đã có bệnh nền hoặc bị nhiễm lượng lớn nội độc tố thì sẽ biểu hiện triệu chứng
trên lâm sàng của shock nhiễm khuẩn gồm sốt, giảm huyết áp, giảm tuần hoàn ở các tổ chức,
gây tổn thương các tổ chức mô cơ quan của cơ thể như tim, phổi, gan, thận,..hệ thống miễn
dịch tiết ra enzyme tiêu diệt tế bào, rối loạn chuyển hoá do thiếu oxy tế bào, tổn thương tế
bào nội mạc, tăng tính thấm thành mạch và có thể dẫn tới tử vong.
- Không đảm bảo được chất lượng thuốc.

Hiện nay có 3 phương pháp để thực hiện phép thừ này:

- Phương pháp tạo gel dựa trên sự tạo thành gel khi cho thuốc thử vào dung dịch có chứa nội
độc tổ
- Phương pháp đo độ đục, dựa vào sự thay đổi độ đục của thuốc thừ lysat khi tạo gel
- Phương pháp đo màu dựa trên sự thay đôi màu của phức hợp màu – peptid

( Tùy theo điều kiện và tính chất của mẫu thư, có thể áp đụng một trong các kỹ thuật thích hợp
để thực hiện phép thừ. Tuy nhiên, khi có nghi ngờ hoặc tranh chấp, kết luận cuối cùng sẽ đựa
vào phương pháp tạo gel trừ khi có chỉ dẫn khác.)
Phương pháp tạo gel

dựa trên sự tạo thành gel. Khi bổ sung mẫu cần kiểm tra vào ống có chứa sẵn thuốc thử, sẽ tạo
thành gel khi có mặt nội độc tố.

Quy trình:

Kiểm tra độ nhạy của lysat: Độ nhạy của thuốc thử lysat ghi trên nhãn là nồng độ nội độc tố thấp
nhất cần thiết để tạo gel với thuốc thử trong điều kiện xác định. Phép thử kiểm tra độ nhạy được
thực hiện mỗi khi có lô thuốc thử mới hoặc khi có sự thay đổi điều kiện thí nghiệm có thể ảnh hưởng
tới kết quả của phép thử.

Dung dịch Nồng độ nội Dung môi Hệ số pha Nồng độ nội Số ống
độc tố được loãng độc tố sau nghiệm
thêm vào pha loãng
mỡi dung
dịch
A 0/dd thử - - - 4
B 2 /dd thử Dung dịch thử 1 2 4
2 4
1
4 4
8 0.5 4
0.25
C 2 /dd nước Nước BET 1 2 4
BET 2 4
1
4 4
8 0.5 4
0.25
D 0/dd nước - - - 2
BET

Phép thử có giá trị khi dung dịch A và D cho phản ứng âm tính và kết quả dung dịch C khẳng định
đúng độ nhạy của thuốc thử

Trong đó:

- Dung dịch A (dung dịch thử): Mau thử pha ở độ pha loãng < MVD.
- Dung dịch B (đối chứng dương tính có mẫu thử): Nội độc tố pha trong dung dịch thử để kiêm
tra yếu tổ ảnh hưởng.
- Dung dịch C (khẳng định độ nhạy của lysat): Chuẩn nội độc tổ pha trong nước BETvới nóng
độ khác nhau.
- Dung dịch D (đối chứng âm tính): Nước BET
 Mỗi mẫu pha loãng 4 lần với 4 nồng độ khác nhau để đảm bảo độ nhạy của thuốc thử, phát
hiện và kiểm tra được các yếu tố ảnh hưởng phép thử

Phép thử giới hạn:

Dựa trên sự tạo gel của thuốc thử lysat với nội độc tố, phương pháp này kiêm tra xem lượng nội độc
tô có trong mẫu thử có lớn hơn giới hạn qui định hay không.
 Dung dịch Nồng độ nội độc tố đưọc Số ống nghiệm
thêm vào mỗi dung dịch
A 0/dung dịch thử 2
B 2/dung dịch thử 2
C 2/nước BET 2
D 0/nước BET 2
Trong đó:

- Dung dịch A (dung dịch thử): Mẫu thử pha ở độ pha loãng < MVD.
- Dung dịch B (đối chứng dương tính cỡ mẫu thứ): Nội độc tố pha trong dung dịch thử.
- Dung dịch C (đối chứng dương tính): Chuẩn nội độc tố pha trong nước BET.
- Dung dịch D (đối chứng âm tính): Nước BET
 Đánh giá kết quả:
Phép thử có giá trị nếu cả 2 ống của dung dịch B và C đều cho kết quả dương tính và dưng
dịch D âm tính. Mẫu thử đạt yêu cầu nếu kết quà âm tính ờ cả hai ổng nghiệm của dung dịch
A.
Mẩu thử không đạt yêu cầu nếu kết quà dương tính trên cả hai ống nghiệm của dung dịch A
khi độ pha loãng bằng MVD. Nếu hai ống của dung dịch A cho kết quả khác nhau, một ống
dương tính và một ống âm tính thì làm lại phép thử. Mẩu thừ đạt yêu cầu nếu ờ lần thử thứ
hai cà hai ống đều cho kết quả âm tính

Phép thử bán định lượng

Phép thử này xác định lượng nội độc tố có trong dung dịch mẫu thử bằng cách thực hiện phản ứng
tiến dần đến điểm dừng trong quá trình tạo gel.

Dung dịch Nồng độ nội Dung môi Hệ số pha Nồng độ nội Số ống
độc tố được loãng độc tố sau nghiệm
thêm vào pha loãng
mỡi dung
dịch
A 0/dung dịch - 1 - 2
thử 2 2
4 2
8 2
B 2/dung dịch Dung dịch thử 1 2 2
thử
C 2/nước BET Nước BET 1 2 2
2 1 2
4 0.5 2
8 0.25 2
D 0/nước BET - - - 2
Trong đó:

- Dung dịch A (dung dịch thử): Dung dịch thứ có độ pha loãng < MVD, không có yếu tố ảnh
hưởng. Pha mẫu thử với nước BET theo các hệ so pha loãng 1/2, 1/4, 1/8... Có thể pha loãng
tiếp để có kết quả phù hợp nhưng hệ sổ pha loãng dung dịch thử cuối cùng phải không quá
MVD.
- Dung dịch B (đồi chứng dương tỉnh cỏ mâu thử): Nội độc tố pha trong dung dịch A, để kiểm
tra yểu tố ức chế sự tạo gel.
 - Dung dịch C (đối chứng dương tính): 2 dãy chuân nội độc tổ pha trong nước BET.
- Dung dịch D (đối chứng âm tính): Dùng nước BET
 Thử để xác định được điểm dừng tạo gel tránh được hao hụt và lãng phí

1.6 Kim loại nặng: Không được quá 0,1 phần triệu (Phụ lục 9.4.8).
- Lấy 200 ml chế phẩm cho vào cốc thủy tinh, thêm 0,15 ml dung dịch acid nitric 0, 1M, đem bốc hơi
trên cách thủy tới khi còn 20 ml. Lấy 12 ml dung dịch này để tiến hành thử kim loại nặng theo
phương pháp 1(*). Dùng 10 ml dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb đã được cho thêm 0,075 ml dung
dịch acid nitric 0,1 M để chuẩn bị mẫu so sánh. Thêm vào mẫu trắng 0,075 ml acid nitric 0,1M.

(*) Phương pháp 1:

Dung dịch thử: 12 ml dung dịch chế phẩm dược đã chuẩn bị.
Dung dịch đối chiếu: Hỗn hợp gồm 10 ml dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (hoặc dung dịch chì
mẫu 2 phần triệu Pb) và 2 ml dung dịch thử.
Mẫu trắng: Hổn hợp gồm 10 ml nước và 2 ml dung dịch thử.
Thêm 2 ml dung dịch đệm acetal pH 3,5 vào mỗi dung dịch trên.
Lắc đều và thêm dung dịch thu vào 1.2 ml dung dịch thioacetamid , lắc ngay.
Quan sát các dung dịch sau 2 phút.
Cách đánh giá:
- Độ đục trong ống thử không được đậm hơn độ đục trong ống mẫu

- Dung dịch đổi chiếu phải có nàu nâu nhạt khi so sánh với dung địch mẫu trắng.

Giải thích tại sao phải kiểm nghiệm chỉ tiêu kim loại nặng:
- Gây cản trở quá trình trao đổi chất trong cơ thể, việc hấp thụ chất dinh dưỡng và quá trình bài
tiết cũng trở nên khó khăn hơn. Kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển. Làm rối loạn tiêu hóa,
rối loạn tim mạch, rối loạn chức năng hệ thống thần kinh…
- Một số kim loại nặng còn có thể ra các căn bệnh ung thư như: ung thư da, ung thư vòm họng,
ung thư dạ dày. Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) và Cơ quan Quốc tế nghiên cứu
về Ung thư(IRAC) coi kim loại nặng là tác nhân gây ung thư lớn ở người.

Giải thích quy trình:

- “Lấy 200 ml chế phẩm cho vào cốc thủy tinh, thêm 0,15 ml dung dịch acid nitric 0, 1M, đem
bốc hơi trên cách thủy tới khi còn 20 ml”
- “Thêm vào mẫu trắng 0,075 ml acid nitric 0,1M.”
 Acid nitric là chất oxy hoá mạnh, có phản ứng với kim loại, nên khi cho acid nitric vào sẽ
tạo ra hợp chất nền xác định dấu vết của kim loại trong dung dịch thử và mẫu trắng.
- “Dùng 10 ml dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb đã được cho thêm 0,075 ml dung dịch acid
nitric 0,1 M để chuẩn bị mẫu so sánh.”
 Chì hòa tan trong acid nitric (HNO3) giải phóng khí nito oxit và tạo thành dung dịch
chứa Pb(NO3)2 nên sẽ khiến cho mẫu đối chiếu có màu nâu đậm.
- “Thêm 2 ml dung dịch đệm acetal pH 3,5 vào mỗi dung dịch trên.”
 Dung dịch đệm acetal đóng vai trò giữ ổn định pH để phản ứng xảy ra.
- Khi cho thioacetamid vào cái mỗi dung dịch, lắc và quan sát.
 Ion Pb2+ phản ứng với dung dịch thioacetamid tạo phức màu nâu.