ĐỊNH TÍNH BERBERIN TRONG THÂN RỄ HOÀNG LIÊN BẰNG

SẮC KÝ LỚP MỎNG

Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài học sinh viên có khả năng

- Thực hiện được kỹ thuật định tính berberin bằng sắc ký lớp mỏng

1. Định nghĩa sắc ký lớp mỏng

Chữ chroma trong từ sắc ký (Chromatography), theo tiếng Hylap là màu sắc.
Kỹ thuật sắc ký là kỹ thuật tách các chất có màu sắc khác nhau. Kỹ thuật này ra
đời vào năm 1903 do nhà thực vật học người nước Nga tên là Mikhail Trvet tìm
ra.

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật  được

dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực: xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong
dược khoa. xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.

Hệ dung môi là một hay nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ nhất định
áp dụng làm pha động trong khai triển sắc ký.

VD: Hệ sắc ký để xác định hoạt chất rutin trong Hòe hoa là methanol: acid
acetic 99:1.

Gồm methanol 99 phần và acid acetic 1 phần.

Hệ số lưu giữ (Rf) được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách từ tâm vết chấm đền
tâm vết chất với khoảng cách từ tâm vết chấm tới giới hạn dung môi khai triển.
 a
Rf = b

Để định tính hoặc định lượng bằng sắc ký lớp mỏng thường được phát hiện ở
một trong hai bước sóng =254nm, =365nm.

2. Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng

- Định tính hoạt chất trong dịch chiết dược liệu.

- Bán định lượng hoạt chất trong dịch chiết dược liệu.

- Định lượng hoạt chất trong dịch chiết dược liệu.

- Khảo sát mức độ tách chất để thực hiện các phương pháp sắc ký khác.

3. Kỹ thuật định tính berberin trong hoàng liên bằng sắc ký lớp mỏng

3.1. Chuẩn bị

Bột thân rễ Hoàng liên

Berberin dược dụng

Dung môi chiết xuất là ethanol 90o.

Bình chạy sắc ký

Bản mỏng silicagel Gf254 được cắt thành các tấm 2 x 7cm, đã sấy ở 110oC trong
30 phút để hoạt hóa.
Mao quản chấm sắc ký.

Đèn tử ngoại bước sóng =254nm

Ống đong 5ml.

Pipet chia vạch.

Kẹp bản mỏng.

Giấy lọc

Thước kẻ

Bút chì

3.2. Tiến hành

3.2.1. Chiết xuất dược liệu và hòa tan berberin chuẩn

- Cân 0,5g Hoàng liên cho vào ống nghiệm số 1. Thêm 10ml ethanol 90 o . Lắc
đều trong 5 phút để hòa tan, để yên ông nghiệm trên giá 5 phút.

- Lấy 3 viên berberin 5mg hoàn tan vào 5ml ethanol 90o trong ống nghiệm số 2.

3.2.2. Chấm sắc ký

Dùng bút chì kẻ 1 đường mờ cách mép dưới bản mỏng silicagel 1,5 cm.
Dùng mao quản hút dịch chiết tại ống nghiệm số 1, chấm nhẹ 5 lần trung nhau
vào 1 điểm trên đường kẻ chì cách mép trái bản mỏng 0,7cm, dùng mao quản
khác hút dịch berberin chuẩn tại ống nghiệm số 2, chấm nhẹ 5 lần trung nhau
vào 1 điểm trên đường kẻ chì, cách mép phải 0,7cm.

Pha hệ dung môi định tính (EtOH : acid acetic 100:1). Lau khô bình khai
triển sắc ký. Đong 10 ml ethanol 90 o và thêm 2 giọt acid acetic đặc (theo qui
định 0,1ml tương đương 2 giọt) vào bình khai triển sắc ký, lắc nhẹ bình để dung
môi hòa tan vào nhau. Đặt vào bình khai triển sắc ký 1 tấm giấy lọc. Đậy kín và
để yên bình trong ít nhất 15 phút để bão hòa dung môi.
Mở bình khai triển, Dùng kẹp đưa nhanh bản mỏng vào bình, dựng bản mỏng
theo chiều thẳng đứng. Đậy bình khai triển sắc ký lại. Chờ đến khi mức dung
môi khai triển cách mép trên bản mỏng silicagel 1,5cm lấy bản mỏng ra, dùng
bút chì kẻ đánh dấu mức giới hạn dung môi. Để bản mỏng khô tự nhiên trong 10
phút. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại 365nm. Tại bước sóng
=365nm hoạt chất berberin có huỳnh quang màu lơ sáng. Dùng bút chì khoanh
vết lơ sáng cả 2 bên, bên vết chấm dịch chiết Hoàng liên và bên vết chám dịch
berberin chuẩn.

Chụp lại ảnh bản mỏng sau khi chấm, bản mỏng ở =365nm để so sánh.

Vết chất berberin

Hình ảnh sắc ký đồ berberin trong thân rễ Hoàng liên ở =254nm

Tính Rf của berberin.

Kết luận trong dịch chiết Hoàng liên có hoạt chất berberin.

Rửa dụng cụ, trang thiết bị sắp xếp ngăn nắp phòng thực hành.
3.2.3. Những sai hỏng thường gặp

- Chiết xuất sai dung môi. Cân sai khối lượng dược liệu.

- Cắt bản mỏng không thẳng.

- Chấm các vết không trùng nhau.

- Đặt bản mỏng vào bình sắc ký không ngay ngắn dẫn đến đường đi của vết chất
bị lệch.

- Khi chụp ảnh để ánh sáng mạnh quá dẫn đến không nhìn rõ vết chất.

Tài liệu tham khảo

1. Phạm Luận, Phương pháp phân tích sắc ký và tách chất, Nhà xuất bản Bách
khoa Hà Nội.

2. https://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFc_k%C3%BD