BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

ĐẬU THỊ KIM DUNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI

CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ
ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN

Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2006
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI

CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ
ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN

Luận văn kỹ sƣ

Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện :

TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2006
 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING

PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES
ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON
SEMI SOLID MEDIUM

Graduation thesis
Major : Biotechnology

Professors : Student :
PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG
Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006
BA. ĐO THI TUYEN

HCMC, 09/2006
 LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến :

* Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
* Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
* Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các
Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình
hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này.
* Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu
thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng nhƣ cung cấp cho em nhiều kiến thức
xung quanh đề tài.
* Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng
nhƣ chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập.
* Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
* Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả
về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bƣớc vào đời.

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC

iv
ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG
BÁN RẮN”. Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới TP.HCM.
Hội đồng hƣớng dẫn :
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
TS. NGUYỄN NGOC HẢI
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki đƣợc chiết bằng nƣớc cất, thu đƣợc dịch chiết enzyme thô. Dịch
chiết thô này đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60,
65, 70, 75 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6
Cặn tủa thu đƣợc hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra
nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ƣu
cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu đƣợc từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn
tối ƣu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel và xác định
trọng lƣợng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau :
 Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để

tủa protease.
0
 Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 47 C.

 Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus

kawasaki.

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bìa ..................................................................................................................................... i
Trang tựa..........................................................................................................................ii
v
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3
2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5
2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9
2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11
2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12
2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13
2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13
2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15
2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15
2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease ................................. 18
2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19
2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký ....................................................... 22
2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 29
3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29

vi
3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm.......................................................................................... 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô .................................................................................................................................. 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa
enzyme protease ............................................................................................................ 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease .... 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme bằng phƣơng pháp điện
di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45
4.1 Hàm lƣợng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45
4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ƣu cho việc tủa protease .......................................... 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease ..................................................................... 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53
4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54
4.5.1 pH tối ƣu ............................................................................................................... 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu ...................................................................................................... 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae................................................................................... 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối........................................................................................ 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70

vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ

Asp.oryzae : Aspergillus oryzae

Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki
CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh
ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp).

viii
CBB : Coomasie Brilliant Blue.
ĐVHT : Đơn vị hoạt tính.
HT : Hoạt tính
HTR : Hoạt tính riêng.
TCA : Trichloacetic acid
A.U : Độ hấp thụ.
mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lƣờng độ dẫn điện).
UI : Đơn vị hoạt tính enzyme.

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein .......................................... 22
Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn Albumin ................................................................................... 32

ix
Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn Tyrosine ................................................................................... 34
Bảng 3.3 Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ ...................................... 36
Bảng 3.4 Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ. ............................................................ 36
Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô
của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki ................................................................. 45
Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ................................................ 46
Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ............................................................ 46
Bảng 4.4 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.................................................. 48
Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ....................................................... 48
Bảng 4.6 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .................................................. 50
Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .............................................................. 50
Bảng 4.8 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .................................................... 51
Bảng 4.9 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn.......................................................... 52
Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. ................................................................ 53
Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH ................ 54
Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH ............ 55
Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ ......... 55
Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ .... 56
Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel ....... 59
Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel .... 61
Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng muối ...................................................................................................................... 62

x
Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng cồn ......................................................................................................................... 62
Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang. ............. 65
Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae .......... 66
Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki ..... 66

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

HÌNH TRANG
Hình 2.1 Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ

xi
phản ứng ......................................................................................................................... 8
Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ
cơ chất ......................................................................................................................... 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease ............................................................... 11
Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi............................................... 16
Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi
trƣờng CBS – MEA2%. ................................................................................................. 16
Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký ......................... 23
Hình 2.7 Quá trình lọc gel ............................................................................................. 26
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis ................................................................................. 31
Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ .................................... 38
Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng
muối đối với nấm Aspergillus oryzae ........................................................................... 58
Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng
cồn đối với nấm Aspergillus oryzae .............................................................................. 58
Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng
muối đối với nấm Aspergillus kawasaki........................................................................ 60
Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng
cồn đối với Aspergillus kawasaki .................................................................................. 60

ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch
chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki ..................... 45
Đồ thị 4.2 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối................................................................... 47
Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ............................................................. 49
Đồ thị 4.4 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn ..................................................................... 51
Đồ thị 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn ................................................................. 52

xii
Đồ thị 4.6 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae. ....... 54
Đồ thị 4.7 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki ..... 55
Đồ thị 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae ............. 55
Đồ thị 4.9 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki. ....... 56
Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa
protein bằng muối. ......................................................................................................... 62
Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa
protease bằng cồn. ......................................................................................................... 63
Đồ thị 4.12 Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf. .................. 65

xiii
 1

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU

1.2 Đặt vấn đề

Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa
sinh. Nhƣ vậy điều gì đã giúp các phản ứng này đƣợc tiến hành mau lẹ phi thƣờng mà
vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme.
Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc
tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi
tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục
năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát
triển với tốc độ rất mạnh mẽ.
Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lƣợng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống. Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme
hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ƣu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trƣờng bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã đƣợc dùng nhƣ là nguồn vi sinh vật đƣợc nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì ngƣời ta
 2

chỉ biết đến nhƣ là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta
có thể đánh giá đƣợc hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
1.2 Mục đích nghiên cứu.
 Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki.
 So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae và Aspergillus kawasaki.
1.3 Yêu cầu.
 Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa và tỷ lệ cồn tối
ƣu trong việc tủa enzyme - bƣớc đầu trong quá trình tinh sạch enzyme.
 Xác định pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease.
 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
 Xác định trọng lƣợng phân tử của enzyme protease bằng kỹ thuật điện di SDS
– PAGE.
 3

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát chung về enzyme

2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme
Từ trƣớc thế kỷ 17, khi loài ngƣời hoàn toàn chƣa hiểu biết gì về ezyme,
ngƣời ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế nhƣ
làm bánh mì, làm bia, rƣợu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có
tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế
bào vi sinh vật.
Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa
học ngƣời Hà Lan Van Heltmon đề xƣớng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”
nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu
tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rƣợu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là
điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào
thực nghiệm, quan sát, mô tả.
Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn
giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa đƣợc nhà tự nhiên học ngƣời Pháp
Réaunur tiến hành vào năm 1713 và đƣợc Spallanzani ngƣời Ý khẳng định lại một
cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.
Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov ngƣời Nga
làm thí nghiệm chứng minh nƣớc chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển
hóa tinh bột thành đƣờng ở nhiệt độ 40 – 600C .
Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí
nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý
học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên ngƣời ta
đã chứng minh đƣợc rằng hiện tƣợng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,
nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ
những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.
Năm 1833, hai nhà khoa học ngƣời Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận
đƣợc chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ
hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đƣờng và đƣợc gọi
 4

là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme
vào nửa sau thế kỷ 19.
Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của
enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tƣợng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc
tác và chất gây ra hiện tƣợng này là chất xúc tác.
Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men
rƣợu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dƣới kính hiển
vi là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng lên men rƣợu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay
vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái
niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn đƣợc
(ferment hòa tan).
Năm 1862, nhà khoa học ngƣời Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc
biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật
“phƣơng pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và
“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện
nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.
Năm 1894, nhà khoa học ngƣời Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme
mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta
Rhus succedanea.
Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều
hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà
khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách đƣợc pepsine và trypsine dƣới dạng tinh thể.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc
tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phƣơng pháp quang học và phƣơng
pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta
“phƣơng trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.
(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất
nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành nhƣ hóa
lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản
hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phƣơng
 5

pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái
sinh lý và bệnh lý.
2.1.2 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do
tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau
phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể
sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với
tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hƣớng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt
động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống
nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của
Anghen : “Sự sống, đó là phƣơng thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,
1982).
Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhƣng mỗi loại mô, mỗi
loại tế bào thƣờng có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham
gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất thấp và nhiệt độ bình thƣờng của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn
lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng nhƣ đối với chất mà nó tác dụng.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Các loại enzyme trong cơ thể đƣợc tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để
sao cho các chất ban đầu đƣợc chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt
xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn
cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do
gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức
Lƣợng, 2004).
Ƣu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt
nhƣ sau :
 Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng

sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lƣợng hóa học có trong vật chất.
 6

 Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển

hóa rất cao.

 Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản

ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
 Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lƣợng thƣờng rất ít.

 Enzyme luôn luôn đƣợc tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lƣợng

enzyme đƣợc tổng hợp rất lớn và luôn luôn tƣơng ứng với số lƣợng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
 Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa

học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lƣợng này
là rất nhỏ so với số lƣợng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã
biết, loài ngƣời mới thu nhận và kết tinh đƣợc khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lƣợng,
2002).
2.1.3 Phân loại enzyme
Khi số lƣợng enzyme đƣợc phát hiện còn ít, ngƣời ta đặt tên enzyme theo ý
thích từng ngƣời tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lƣợng enzyme tìm ra ngày càng
nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ƣớc quốc tế. Enzyme đƣợc phân loại
theo tính chất của nó, đƣợc xếp vào từng nhóm nhỏ tƣơng ứng với các enzyme có bản
chất tƣơng tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.
Theo quy ƣớc quốc tế, tên gọi của enzyme thƣờng đƣợc đặt theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme
thƣờng có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản
ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn đƣợc gọi theo tên cũ, không theo
hệ thống nhƣ trypsine, pepsine.
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và đƣợc đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thƣờng có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tƣ chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm nhƣ sau
:
 7

I. Oxydoreductase
a. Dehydrogenase
b. Oxydase
c. Oxygenase
d. Peroxydase
II. Transferase
a. Acyltransferase
b. Glucosyltransferase
c. Aminotransferase
d. Phosphotransferase
III. Hydrolase
a. Peptide hydrolase
b. Lipase
IV. Liase
a. Pyruvate decarboxylase
b. Fumarate hydrolase
V. Isomerase
VI. Ligase
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các
phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,
hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.
Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
nhƣ nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,
pH môi trƣờng, nồng độ ion trong môi trƣờng, nồng độ các chất kìm hãm, các chất
hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
a) Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng
độ enzyme. Đƣờng biểu diễn có dạng nhƣ ở hình 2.1
 8

V
V = k[E]

[E]

Hình 2.1 : Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng

b) Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố định và
nồng độ cơ chất thay đổi, ngƣời ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ
chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đƣờng biểu diễn uốn cong và với
nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biểu diễn tiệm cận
với giá trị vmax.

Vmax

v
2

0 Km [S]

Km : Hằng số Michalis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc bằng 1/2 vận tốc vmax.
Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

c) Ảnh hƣởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng
chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đƣa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
 9

Ngƣợc lại, ở nhiệt độ 00C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhƣng khi
đƣa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ƣu.
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng với hai hiện tƣợng khác nhau :
0
 Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40 C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.

Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lƣợng cho phản ứng.
0
 Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 45 C),

vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80
– 1000C.
Nhiệt độ tối ƣu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, pH, lực ion của môi trƣờng.
d) Ảnh hƣởng của pH
Sự thay đổi pH gây nên :
 Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của

enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.
 Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn

cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trƣờng hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở
dƣới dạng ion.
Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trƣờng. Đó là vì
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm
hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hƣởng đến độ bền của enzyme.
Ngƣời ta có thể xác định một giới hạn pH tối ƣu cho hoạt động của một
enzyme. Ngoài pH tối ƣu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy
tầm quan trọng của môi trƣờng phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng
enzyme in vitro.
Mỗi một enzyme có một pH tối ƣu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),
hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ƣu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá
trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ƣu của một enzyme cũng không cố định mà phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch
đệm, nhiệt độ.
 10

2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống
2.1.5.1 Nguồn thu nhận
Enzyme đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ
dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ
thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền
kinh tế quốc dân. Nhƣ vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu
nhận từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa các
enzyme từ động vật và thực vật :
 Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lƣợng

lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm
cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công
nghiệp khác nhau.
 Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng

hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động
vật không thể đồng hóa đƣợc.
 Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác.

Do vậy chỉ cần một lƣợng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lƣợng lớn cơ chất.
 Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ,

kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.
 Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh

vật cho enzyme thƣờng có khả năng phát triển trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền nhƣ
các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.
 Ƣu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cƣờng

sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo đƣợc những biến chủng có hoạt lực
cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trƣờng, có khả năng thích ứng với
nguồn dinh dƣỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động
lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng nhƣ
hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi
 11

cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo đƣợc những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận
đƣợc enzym có độ thuần khiết cao.
2.1.5.2 Vai trò
Cùng với những thành tựu đạt đƣợc trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các
nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng đƣợc mở rộng và đạt hiệu quả
cao. Các chế phẩm enzym đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ
trong hoá phân tích để định tính, định lƣợng các chất trong nông nghiệp, y học, công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dƣợc liệu, công nghiệp nhẹ nhƣ công nghiệp dệt, công
nghiệp da.
 Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các

sinh tố và các chất kháng sinh.

 Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm

nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trƣớc khi gieo.
 Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym đƣợc sử dụng khá rộng

rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất
bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thƣờng làm tăng nhanh
quá trình chế biến, tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử
dụng enzym còn có thể tái tạo hƣơng vị của các loại rau quả tƣơi sau khi chế biến.
Ngày nay, ngƣời ta cũng đã đạt đƣợc nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme
trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân
liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,
một ít peptid ngắn, pepton.

Hình 2.3 : Công thức cấu tạo enzyme protease

 12

2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease

2.2.2.1 Protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa đƣợc nghiên cứu sớm hơn
cả.
Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm
rất đơn giản và đã phát hiện đƣợc rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu
hóa thịt.
Năm 1836, Schwam đã quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau ngƣời ta mới tách đƣợc enzyme này.
Năm 1857, Corvisart tách đƣợc trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên
thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.
Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng pháp hấp phụ trên colondion đã tách
đƣợc trypsine với amylase tụy tạng. Phƣơng pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên
cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách đƣợc chế phẩm chymotrypsine (renin).
Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những
nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có
enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã
tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận đƣợc có tác
dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
2.2.2.2 Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật đƣợc phát hiện
muộn hơn.
Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận đƣợc protease từ hạt của một
loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động
phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ
các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu
Biure.
Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp
tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz đƣợc xem nhƣ là ngƣời đầu tiên tách chiết thành công
protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có
 13

chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận đƣợc một chế phẩm enzyme không
tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain.
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950,
mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện đƣợc khả năng phân giải protein
của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật
tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực
vật. Những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp
phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.
Trong thời gian gần đây ngƣời ta cũng đã có những phƣơng pháp thích hợp
để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong
nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease
Các enzyme protesae nhƣ đã nói ở trên đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác
nhau.
2.2.3.1 Từ động vật
Protesae động vật thƣờng có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ
dày…
 Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng,

chúng đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.

 Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.

 Renin chỉ có ở ngăn thứ tƣ ở dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi, là enzyme

đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.
2.2.3.2 Từ thực vật
Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây nhƣ
thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả .
Ví dụ:
 Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh

 Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.

 Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.

 14

2.2.3.3 Từ vi sinh vật

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn các
protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và
đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y
dƣợc.
Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có
nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào
cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ƣu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi
sinh vật thành 4 nhóm cơ bản nhƣ sau :
 Protease serine

 Protease kim loại (metallo protease)

 Protease acid

 Protease tiol

2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease

Các protease nói chung cũng nhƣ protease vi sinh vật nói riêng đƣợc sử dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
 Trong sản xuất nƣớc chấm : Nƣớc mắm, tƣơng, chao,…

 Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi
chế biến,…
 Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…

 Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.

 Trong hƣơng mỹ phẩm : Ngƣời ta trộn một lƣợng nhỏ protease vào kem

xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ
dàng lớp tế bào già.
 Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng

dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.

 Trong công nghiệp sữa, các protease nhƣ renine, pepsine đƣợc dùng trong

sản xuất formate, sữa đông tụ.

 Trong y học :
 15

+ Protease đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi vi sinh vật,
sản xuất huyết thanh miễn dịch.
+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch…

+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trƣng.
+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị
tiêu hóa kém…
 Trong nông nghiệp : Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu

đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.

 Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các

nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp
nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các
loại phim và giấy ảnh quý.
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.3.1.1 Phân loại
Giới : Fungi
Ngành : Ascomycota
Ngành phụ : Pezizomycota
Lớp : Ascomycetes
Bộ : Plectascales
Họ : Aspergillaceae
Giống : Aspergillus
Loài : Aspergillus oryzae
2.3.1.2 Đặc điểm
 Hình thái

Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển
rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm
đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
 16

Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi

Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên
môi trƣờng CBS – MEA2%.
 Điều kiện phát triển :
Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành bào tử : 45%.
Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%.
Độ ẩm không khí : 85 -95%.
pH môi trƣờng : 5,5 - 6,5.
Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 300C.
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt.
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng nhƣ các enzyme khác có thể
dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy : phƣơng pháp bề mặt và phƣơng pháp bề sâu. Phƣơng
pháp bề mặt thƣờng dùng để nuôi cấy nấm mốc, phƣơng pháp bề sâu thƣờng dùng đối
với vi khuẩn.
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật đã đƣợc
nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lƣợng
 17

enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với phƣơng
pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thƣờng là những
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật nhƣ cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi
sinh vật để thu nhận protease, ngƣời ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành nhƣ
những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng bán rắn khi nuôi bằng
phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi

cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
+ Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trƣờng còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu đƣợc hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối
không đƣợc đƣa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
 Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này

có những thay đổi cơ bản sau:

+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển
rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi
trƣờng, trong lòng môi trƣờng.
+ Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt.
+ Độ ẩm môi trƣờng giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.
+ Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của
nấm sợi.
+ Các loại enzym đƣợc hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội
hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn.
+ Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai
đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-
30oC là tốt nhất.
 18

 Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có

một số thay đổi cơ bản nhƣ sau:

+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dƣỡng
sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trƣờng giảm, do đó làm giảm lƣợng không khí
môi trƣờng xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt
độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử đƣợc hình thành nhiều do đó lƣợng
enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất
cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này
đƣợc gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa
sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng). Ngƣời ta
thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm
enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease
Quá trình tinh sạch enzyme đƣợc tóm tắt nhƣ sau :

Chế phẩm enzyme

thô

Trích ly

Lọc

Kết tủa enzyme

Thu nhận kết tủa

Tinh chế kết tủa

bằng sắc ký lọc
gel

Kiểm tra độ tinh sạch,

xác định trọng lƣợng
phân tử
 19

Sản phẩm enzyme

tinh khiết

2.5.1 Trích ly enzyme

Toàn bộ khối lƣợng chế phẩm enzyme thô đã sấy đƣợc đem đi nghiền nhỏ.
Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội
bào chƣa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.
Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nƣớc nên sau khi nghiền mịn, ngƣời
ta dùng nƣớc, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone).
Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nƣớc trong mục đích này cho kết quả tốt và
dễ đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc có thể
chiết đƣợc lƣợng enzyme trên 90 – 95% và trong nƣớc chiết không chứa các tạp chất
không tan. Nƣớc thƣờng dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. (Lƣơng Đức Phẩm,
1998)
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly :
 Tỷ lệ nƣớc trích

Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nƣớc để trích ly enzyme hơn chế phẩm
ẩm, tỷ lệ nƣớc trên chế phẩm khác nhau sẽ trích đƣợc lƣợng enzyme khác nhau.
Lƣợng nƣớc dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lƣợng chế phẩm nấm mốc.
 Thời gian trích

Enzyme thủy phân dễ tan trong nƣớc, thời gian trích ly càng lâu càng có
khả năng trích đƣợc nhiều enzyme hơn nhƣng làm tăng lƣợng tạp chất trong dịch chiết
và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.
 Nhiệt độ trích

Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhƣng làm giảm
hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly
tối thích là 20 – 300C.
Để tăng cƣờng khả năng thu enzyme, chế phẩm đƣợc đánh tơi trƣớc khi trích
để đạt đƣợc kích thƣớc hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thƣờng dùng hệ
thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ
 20

trích đƣợc nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và
hàm lƣợng enzyme trong dịch chiết thu đƣợc.
2.5.2 Quá trình tủa
Dịch thu nhận đƣợc vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa
nƣớc, các chất hòa tan khác từ khối môi trƣờng nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô
thƣờng chứa một lƣợng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì
thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm đƣợc điều đó ngƣời ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác
nhân gây kết tủa. Tủa là phƣơng pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bƣớc ban đầu
trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này ngƣời ta loại đƣợc một số protein tạp ở giai
đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
 Nguyên tắc :

Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung
môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ƣa nƣớc và kỵ nƣớc thƣờng nằm trên bề mặt.
Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau.
Trong đó, các nhóm kỵ nƣớc có xu hƣớng nằm trong lòng phân tử protein, một phần
không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi,
các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lƣỡng cực khác có vai trò quyết
định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme đƣợc coi là kết quả của tƣơng tác lƣỡng cực của chất
hòa tan với nƣớc và tƣơng tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành
màng nƣớc bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tƣơng tác
này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung
dịch, thƣờng gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có
thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền nhƣ trƣớc thì đƣợc gọi là kết tủa thuận nghịch,
hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
 Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein

a) Kết tủa bằng muối

 21

Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử
muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein,
do vậy các phân tử protein có khuynh hƣớng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lƣợng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình
này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính.
Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối
thấp.
Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó
cũng đƣợc sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân
tử protein lớn có khuynh hƣớng kết tủa trƣớc, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong
dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên
cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối
khác nhau.
Nhƣ vậy với quá trình này ta có thể thu đƣợc protein mong muốn một cách
tinh sạch hơn.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một
trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi
có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tƣơng tác
giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của
protein trong dung dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone,
ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó độ hòa
tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi
hiện hữu của môi trƣờng. Điều này có đƣợc bằng cách thêm một dung môi hòa tan
trong nƣớc (nhƣ acetone) vào dung dịch chứa protein.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960 có nhiều thuận lợi do tƣơng đối rẻ,
có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do
nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme
bằng phƣơng pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Có thể xảy ra hiện tƣợng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung
môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự
tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nƣớc lại tiếp xúc
 22

với dung môi. Hiện tƣợng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành
kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lƣu ý đến nhiệt độ, ta bắt
buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thƣờng
mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ.
Ngƣời ta thƣờng tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –
100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme đƣợc xác định
bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch
enzyme.
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký
Sắc ký sinh học là phƣơng pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh
học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh
sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.

Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein
Đặc tính Kỹ thuật
Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)
Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)
o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)
o Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction
Chromatography – HIC)
Kích thƣớc Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)
Nhận biết sinh học Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)
(tính đặc hiệu của
ligand)
 23

Hình 2.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký

Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đƣa vào thị trƣờng sản phẩm thƣơng mại
SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh
sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
 Nguyên tắc :

Lọc gel là phƣơng pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật
này dùng để tách những phân tử có kích thƣớc, trọng lƣợng khác nhau bằng cách cho
chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thƣớc đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel
sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển
bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và đƣợc giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm
hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :
a) Phân tách nhóm (Group separations)
Các thành phần của một mẫu đƣợc phân tách thành hai nhóm chính theo
phạm vi kích thƣớc. Sự phân tách nhóm đƣợc sử dụng để loại các phân tử lớn hay các
phân tử tạp chất nhỏ (nhƣ đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao
đổi đệm.
b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution
fractionation of biomolecules)
Các thành phần của cùng một mẫu đƣợc phân tách theo sự khác biệt về kích
thƣớc phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể đƣợc dùng để cô lập
một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác
định trọng lƣợng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lƣợng phân tử.
 24

 Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel

a) Ƣu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh
học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác
động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các
cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ
ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí
nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và
dễ dàng khử muối.
b) Nhƣợc điểm
- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)
- Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu.
- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó
đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử
dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
 Một số thông số vật lý của phƣơng pháp

Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lƣợng phân tử (MW) nhỏ nhất
không chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lƣợt ra khỏi
cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000
Da đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách
từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ đƣợc
phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50.
Độ ngậm nƣớc (Water Regain-WR) : Là trọng lƣợng nƣớc mà 1g bột gel khô
hút nƣớc. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao
quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột.
Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trƣơng nở
trong nƣớc. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định bằng mesh
hoặc đƣờng kính hạt theo m. Hạt có kích thƣớc lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho
 25

tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400
mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng
ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100-200 mesh, 50-150 m.
Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác
định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da.
Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.
 Phân tách bằng sắc ký lọc gel

Để phân tách, môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi
trƣờng này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này đƣợc chọn vì tính ổn
định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản
ứng).
Nền nhồi đƣợc cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ
của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi đƣợc
xem nhƣ phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các
hạt, đƣợc xem nhƣ phase động. Cần lƣu ý rằng, mẫu đƣợc giải hấp một cách đồng nhất
(isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân
tách. Tuy nhiên, bƣớc rửa giải dùng loại đệm đang chạy thƣờng bao gồm ở thời điểm
kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lƣu
trong cột đƣợc dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
 Quá trình lọc gel

1. Các hạt hình cầu của môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột.
2. Mẫu đƣợc nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử
khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng đƣợc miêu tả nhƣ quá trình phân
đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu
trong chất nền hơn và do đó lƣu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích
thƣớc lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử
nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống
dƣới đáy cột.
 26

5. Các phân tử lớn rời cột trƣớc nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình
tự kích thƣớc của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lƣợng dung
môi bằng tổng thể tích cột (tƣơng đƣơng với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi
trƣờng lọc gel.

Hình 2.7 : Quá trình lọc gel

 27

2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di
SDS – PAGE
Sau khi qua các bƣớc ly trích và tinh sạch, ngƣời ta thƣờng kiểm tra lại độ tinh
sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng
lƣợng phân tử và độ tinh sạch của chúng.
Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách
cho đi qua chất nền là gel trong một điện trƣờng.
Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của
SDS.
Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các phân tử
acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác
bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine
(TEMED).
Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trƣờng và kích thƣớc
của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng nhƣ giới hạn trọng lƣợng phân tử của các phân tử
sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide :
nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích
thƣớc lớn và ngƣợc lại.
SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ
thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 đƣợc biến đổi
thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó,
sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những
phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi
đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử
tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng và các phân tử tích điện dƣơng sẽ di chuyển
về cực âm của điện trƣờng.
Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một
thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác
nhau đã biết.
 28

Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên
tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp:
 Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu đƣợc dồn lại

và tạo một lớp băng mỏng.

 Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới) : tạo ra các băng protein có

trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này đƣợc phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide
và vị trí.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng
lƣợng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn
hơn 200.000 daltons thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.
 29

PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 10/2/2006 đến tháng 1/6/2006 tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới TPHCM.
3.2 Vật Liệu
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô
Chế phẩm enzyme protease dạng bột thô của hai chủng Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki do phòng Vi Sinh Ứng Dụng - Viện SHNĐ cung cấp.
3.2.2 Hóa chất
Hóa chất để pha dung dịch đệm phosphate : Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4
Hóa chất để tủa enzyme : Cồn 960, (NH4)2SO4
Hóa chất để xác định hàm lƣợng protein : Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml,
thuốc thử Bradford (Coomasie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid Phosphoric)
Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme : dung dịch Tyrosine 1mg/ml; HCl
0,1M; Na2CO3 0,4M; dung dịch Trichloacetic acid 0,4M (TCA); thuốc thử Folin; dung
dịch đệm phosphate 0,1M; casein dạng bột.
Hóa chất dùng trong phƣơng pháp sắc ký.
Hóa chất dùng trong phƣơng pháp điện di.
3.2.3 Thiết bị
 Máy đo quang phổ UV – Vis

 Máy khuấy từ

 Thiết bị lọc hút chân không

 Máy ly tâm

 Máy đo pH

 Cân phân tích

 Bể ổn nhiệt

 Tủ sấy

 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Biorad gồm phễu đổ gel, flow

adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch.
 Ống nghiệm
 30

 Bình định mức

 Ống đong
 Giấy lọc
 Phễu lọc
 Đũa khuấy
 Pipette thủy tinh, pipetman 50 – 300 l, 100 – 1000 l
 Các dụng cụ để chạy điện di : Bộ điện di dứng, bộ nguồn chạy điện di, đầu
típ, eppendorf, phao để eppendorf.
3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm
3.3.1. Bố trí thí nghiệm
3.3.1.1. Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease
của dịch chiết enzyme thô.
Cân 100g chế phẩm enzyme thô của mỗi chủng, hòa tan trong 750 ml nƣớc
cất.
Khuấy đều hỗn hợp trong thời gian 1 tiếng bằng máy khuấy từ.
Lọc hỗn hợp qua vải thô. Dịch lọc thu đƣợc tiếp tục lọc bằng thiết bị lọc hút
chân không.
Dịch sau lọc đƣợc đem đi ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút.
Loại bỏ cặn và thu lấy dịch . Định mức đến 650 ml.
Bảo quản ở 100C.
Dịch chiết enzyme thô đƣợc xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp
Bradford và hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano.
a) Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford
Bradford là một trong những phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng protein.
Phƣơng pháp này có một số ƣu điểm sau :
 Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử).
 Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20 g)
 Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định.
 Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
protein.
 31

 Nguyên tắc

Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay
đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid.
Trong dung dịch mang tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm
có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 465 nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp
thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm liên hệ trực tiếp với
nồng độ protein.
Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ.
Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với cả nhóm kỵ nƣớc và các
nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang
điện tích dƣơng, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện
sau hai phút và ổn định trong gần một giờ.
 Hóa chất và thiết bị

 Hóa chất
Dung dịch Albumin chuẩn.
Thuốc thử Bradford.
 Thiết bị
Máy đo quang phổ UV - Vis

Hình 3.1 : Máy quang phổ UV-Vis

 32

 Các bƣớc tiến hành

 Xây dựng đƣờng chuẩn Albumin
Pha dung dịch Albumin chuẩn 1mg/ml : Cân 100 mg Albumin dạng bột trên
cân phân tích, định mức đến 100 ml bằng nƣớc cất.
Pha thuốc thử Bradford :
Coomasie Brilliant Blue (CBB) : 0,005 g
Ethanol tuyệt đối : 23,5 g
Acid phosphoric 85% : 42,5 g
Phẩm màu CBB đƣợc làm tan trong ethanol, bổ sung acid phosphoric 85%
và chỉnh tới 500 ml bằng nƣớc cất. Bảo quản trong chai tối.
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa dung dịch Albumin chuẩn ở các nồng độ xác
định nhƣ bảng 3.1
Bảng 3.1 : Đƣờng chuẩn albumin
Đối
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9
chứng
Nồng độ
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
( g/ml)
Dung dịch
albumin chuẩn 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
( l)

Nƣớc cất ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910
Thuốc thử
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Bradford (ml)

Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm ở bƣớc sóng 595 nm.
Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối
chứng sẽ xây dựng đƣợc đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ( OD) theo
nồng độ protein.
 Xác định nồng độ protein của mẫu
 33

Dịch chiết enzyme thô của hai chủng nấm mốc cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự
nhƣ trên. Mẫu đƣợc pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo đƣợc trong khoảng của
đƣờng chuẩn. Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối
chứng, rồi chiếu vào đƣờng chuẩn để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí
nghiệm ( g/ml).
b) Xác định hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp Amano
 Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme
protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu
với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng tyrosine tƣơng ứng với lƣợng
sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme đƣợc biểu diễn
bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme.
 Hóa chất và thiết bị

 Hóa chất
HCl 0,1M
Na2CO3 0,4M
Dung dịch TCA 0,4M
Tyrosine tinh khiết
Thuốc thử Folin
Đệm phosphate pH7 0,1M
Dung dịch casein 1% : Cân 1g casein từ sữa (Hãng Merck), thêm vào 100 ml
dung dịch đệm phosphate 0,1M; pH = 7.
 Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc.
Bể ổn nhiệt
Máy đo quang phổ UV – Vis
Máy đo pH
 Các bƣớc tiến hành

 Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine

 34

Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn tyrosine.

Ống số Đối
1 2 3 4 5 6 7 8 9
chứng
Nồng độ ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Dung dịch tyrosine
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
chuẩn ( l)
Dung dịch HCl ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910
Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
Thuốc thử Folin
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
(ml)

Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, 90 gtyrosine/mlHCl nhƣ bảng 3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào dung dịch
tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch
hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp
thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40,
As50, As60, As70, As80, As90.
Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ
hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso.
Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối
chứng sẽ đƣợc giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo
nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đƣờng chuẩn tyrosine.
 Xác định hoạt tính enzyme protease
Hoạt tính enzyme đƣợc khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7.
Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 0,50C
trong 10 – 15 phút.
Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn
hợp này ở 37 0,50C trong một giờ.
Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme.
 35

Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc
để loại tủa.
Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc.
Thêm 1 ml thuốc thử Folin.
Trộn đều, để yên ở 37 0,50C trong 20 phút.
Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 660 nm
(ghi nhận kết quả này là Am).
Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nƣớc cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến
hành các bƣớc tƣơng tự nhƣ mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ
hấp thụ là A0.
Hàm lƣợng tyrosine đƣợc giải phóng do protease thủy phân đƣợc tính bằng
cách lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đƣờng chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ
protease theo tính toán sau :
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng
enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g tyrosine trong 1 ml dịch
lọc dƣới điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – A0).F.1/100.n.V
m
F = [10/ As10 + 20/ As20 + 30/ As30 + 40/ As40 + 50/ As50 + 60/ As60
+ 70/ As70 + 80/ As80 + 90/ As90]/9
Am : độ hấp thu của mẫu
A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng
F : Hệ số tƣơng quan giữa hàm lƣợng tyrosine và độ hấp thu ở bƣớc sóng
660 nm trên đƣờng chuẩn.
n : Hệ số pha loãng của enzyme
1/100 : Hệ số chuyển đổi
V : Thể tích của dung dịch enzyme
m : khối lƣợng chế phẩm enzyme thô.
 Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease
Từ kết quả hàm lƣợng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml)
tính hoạt tính riêng của enzyme.

Số đơn vị hoạt tính

 36

HTR (UI/mg) =
mg protein enzyme

3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu
để tủa enzyme protease.
Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết thu
đƣợc đem đi tủa với các tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 và cồn 960 .
a) Tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hòa khác nhau
Bảng 3.3 : Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ.
Nồng độ
(NH4)2SO4 (% độ 50 55 60 65 70 75
bão hòa)

Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50

(NH4)2SO4 (g) 15,7 17,55 19,5 21,5 23,6 25,3

Tiến hành tủa trong điều kiện nhiệt độ thấp để đảm bảo hoạt tính enzyme
không bị ảnh hƣởng và quá trình tủa xảy ra tốt.
Thể tích dịch enzyme và khối lƣợng muối (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng
độ đƣợc sử dụng nhƣ bảng 3.3
Dịch chiết enzyme thô đƣợc cho vào becher đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn
xung quanh. Tất cả đƣợc đặt trên máy khuấy từ.
Cho từ từ muối (NH4)2SO4 vào để muối có thời gian hòa tan trong dịch
enzyme.
Tiếp tục khuấy từ thêm 15 phút.
Lấy dịch đi ly tâm 5000 vòng /phút trong 20 phút.
Thu tủa, hòa lại trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7.
Cho dịch pha tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C .
b) Tủa enzyme bằng ethanol 960 ở các tỷ lệ khác nhau
Bảng 3.4 : Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ

Tỷ lệ dịch : ethanol 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

 37

Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50

Ethanol (ml) 50 100 150 200 250 300

Để tránh làm biến tính protein, ethanol 960 phải đƣợc giữ lạnh trƣớc khi tiến
hành tủa.
Thể tích dịch enzyme và thể tích cồn tƣơng ứng với mỗi nồng độ đƣợc sử dụng
nhƣ bảng 3.4
Lắc đều hỗn hợp, bảo quản lạnh trong một giờ.
Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút.
Bỏ dịch, thu tủa, hòa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7.
Cho dịch hòa tan tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C.
c) Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme
protease.
Dịch hòa tan tủa thu đƣợc từ việc tủa dịch chiết enzyme thô bằng (NH4)2SO4
và C2H5OH 960 ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau đƣợc xác định hàm lƣợng protein và
hoạt tính protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) nhƣ ở thí nghiệm 1. Nồng độ muối và tỷ
lệ cồn tối ƣu cho việc tủa enzyme protease là giá trị mà ở đó hoạt tính protease thu
đƣợc cao nhất.
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của
protease.
Dịch hòa tan tủa thu đƣợc khi tủa protease ở nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu ở
thí nghiệm 2 đƣợc xác định hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano ở các giá trị
pH và nhiệt độ khác nhau.
a) Xác định pH tối ƣu cho hoạt động của protease
Khảo sát hoạt tính protease ở các giá trị pH : 4, 5, 6, 7, 8, 9 trong cùng điều
kiện nhiệt độ (370C). Ở giá trị pH nào cho hoạt động của protease mạnh nhất (hoạt tính
cao nhất) thì đó là pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme.
b) Xác định nhiệt độ tối ƣu
Khảo sát hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ (0C) : 37, 47, 57, 67, 77 trong cùng
một điều kiện về pH (pH tối ƣu xác định đƣợc ở thí nghiệm trên). Ở nhiệt độ nào hoạt
tính enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme.
 38

3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel
a) Hóa chất và dụng cụ
 Dụng cụ và thiết bị
Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ.
Phễu đổ gel
Bình hút chân không.
Flow Adapor 1,5 cm.
Cột sắc ký Bio-Rad, kích thƣớc 30 x 1,5 cm; thể tích : 53 ml [thể tích =
chiều cao cột x (đƣờng kính/2)2 x 3,14].
Bình đựng dung dịch đệm.
Ống nghiệm: 50 cái.
Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch

Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp,

hãng Bio-Rad, Mỹ

 Hóa chất

 Gel Bio-Gel P-100, hãng Bio-Rad : là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, đƣợc

điều chế bằng quá trình đồng polymer hóa acrylamide và N, N’-methylene-bis-
acrylamide. Các gel này rất ƣa nƣớc và không mang điện tích, giúp việc lọc các hợp
chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Đặc tính của Bio-Gel P-100 : dạng hạt mịn, kích
thƣớc hạt 45 – 90 m, khả năng ngậm nƣớc : 12ml/1g gel khô, phạm vi phân tách :
5000-100000 daltons.
 Đệm phosphate 0,1M; pH7 : khử bọt khí trƣớc khi dùng.

b) Các bƣớc tiến hành

 39

 Chuẩn bị gel

Cân 5 g gel Bio-gel P-100 khô. Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm
phosphate 0,1M, pH = 7 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate pH = 7 nhiều
gấp hai lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 =
106 ml dung dịch đệm.
Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển
dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không Khử khí của
dung dịch trong khoảng từ 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa
khuấy vì nó có thể làm hƣ gel.
Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và
lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi
trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn.
Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm
đầy 20% thể tích cột.
Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn
gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí.
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho
đến khi cột đƣợc nạp đầy gel.
Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel, mở khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor.
Mở khóa đầu ra của cột, cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền
chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy.
Đóng đầu ra của cột, điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp
mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua
flow adaptor.
 Chuẩn bị mẫu

Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu ở
thí nghiệm 2 đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel.
Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn),
hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm.
Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền và
thời gian sử dụng của cột .
Thu và xác định mẫu tách đƣợc.
 40

Dịch ra khỏi cột đƣợc đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector
trong hệ sắc ký và đƣợc thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP
Data View trên máy tính. Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi
phân đoạn 2 ml..
Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease
Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các
peak sẽ đuợc phân tích hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính
protease theo phƣơng pháp Amano sau tinh sạch nhƣ thí nghiệm 2
c) Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme
sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.

HT enzyme 2
 Hiệu suất về hoạt tính enzyme =
HT enzym 1

Trong đó :
HT enzyme 1 : Hoạt tính enzyme protease trƣớc tinh sạch (UI/ml dung dịch
enzyme trƣớc tinh sạch.
HT enzyme 2 : Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (UI/ml dung dịch
enzyme sau tinh sạch.)
HT enzyme 2
 HTR của enzyme protease sau tinh sạch =
Hàm lƣợng protein sau
tinh sạch

HTR enzyme 2
 Độ tinh sạch của enzyme =
HTR enzyme 1

Trong đó :
HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng enzyme trƣớc mỗi lần tinh sạch.
HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng enzyme tƣơng ứng sau mỗi lần tinh sạch.

HTR enzyme 2
 Độ tinh sạch của protease sau sắc ký =
HTR enzyme1

Trong đó :
HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng của enzyme protease trƣớc tinh sạch
HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch.
 41

3.3.1.7 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng
phƣơng pháp điện di SDS - PAGE
a) Thiết bị và dụng cụ
Bộ điện di đứng
Bộ nguồn chạy điện di Biorad.
Pipetteman
Đầu típ
Eppendorf
Dụng cụ làm gel (tấm kính, lƣợc, kẹp...)
Hóa chất
N,N,N’,N’-tetramethylennediamide(C6H16N2 – TEMED)
Dung dịch Acrylamide/Bisacrylamide 40% (29:1)93,3%C)
-Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH)
Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-rad), gồm các protein chuẩn có kích
thƣớc xác định sau :
Myosin : 200000 daltons.
-galactosidase : 116250 daltons
Phosphorylase b : 97400 daltons
Bonvine serum albumin : 66200 daltons
Ovalbumin : 45000 daltons
Carbonic anhydrase : 31000 daltons
Soybean trypsin inhibitor : 21500 daltons
Lysozyme : 14400 daltons
Aprotinin : 6500 dalons
Sodium dodecyl sunfate (SDS)
Ammoniumpersulfate [(NH4)2S2O8]
Coomasie Brilliant Blue G-250 (Bio-rad)
Cồn tuyệt đối (99,50)
Methanol (CH3OH)
 42

Tris (hydroxymethyl) aminomethane

Acid acetic
Bromophenol blue
Glycerol (C3H8O3)
Glycine (C2H5O2N)
Acid Clohydric (HCl)
Sodium dodecyl sunfate (SDS) 10% : cân 10g SDS, cho 100 ml nƣớc cất vào
khuấy cho tới khi tan hết.
Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1,5M; pH8,8-
0,4% SDS : cân 36,3g Tris pha trong 100 ml nƣớc cất, thêm dần HCl 6N và khuấy
dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8,8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm
nƣớc cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40C
Ammoniumpersulfate 10% (chỉ pha trƣớc khi dùng) : cân 0,1g cho vào một
eppendorf 1000 l, thêm 1 ml nƣớc cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8,3 : pha dung dịch mẹ 10X chứa 30
g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000 ml nƣớc cất.
Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần nhƣ sau : 2,5 ml
dung dịch đệm Tris-Cl 0,5M; pH 6,8; 4 ml 10%SDS; 2 ml Glycerol; 2 mg
Bromophenol Blue; 0,2 ml mercaptoethanol; thêm nƣớc đủ 10 ml.
Dung dịch nhuộm gel : chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625g
Coomasie Blue G 250;112,5 ml ethanol tuyệt đối; 112,5 ml nƣớc cất và 25 ml acid
acetic; lắc đều; giữ trong chai màu tối.
Dung dịch giải nhuộm : 30 ml methanol, 10 ml acid acetic, 60 ml nƣớc cất.
b) Phƣơng pháp
 Đổ gel
 Gel phân tách (separating gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự, vào becher 50 ml sạch :
40% Acrylamide/Bis (29:1) : 2,5 ml
Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 2,5 ml
Nƣớc cất : 4,445 ml
TEMED : 5 l
 43

Ammoniumpersulfate 10% : 50 l
Tổng thể tích : 10 ml
Sau khi cho Ammoniumpersulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần
(tránh tạo bọt khí), dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho
mức dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng
đặt một lớp nƣớc cất lên trên lớp gel để mặt gel đƣợc phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20
– 30 phút).
 Gel gom (Stacking gel):
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch khác :
40% Acrylamide/Bis (29:1) : 0,5 ml
Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 1 ml
Nƣớc cất : 2,476 ml
TEMED : 4 l
Ammoniumpersulfate 10% : 20 l
Tổng thể tích : 4 ml
Sau khi gel phân tách đã trùng ngƣng hoàn toàn, đổ hết nƣớc bên trên. Tiến
hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn.
Đồng thời đƣa lƣợc vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn
gel). Sau khi gel trùng ngƣng, tháo lƣợc, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di cho dung
dịch điện di vào buồng điện di.
 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di
 Xử lý mẫu
Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki đồng thời với peak đƣợc dự đoán là protease mà ta quan tâm của
cả hai chủng khi tủa protein bằng cồn.
Hút 30 l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30 l dung dịch mẫu
protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5 –
10 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1-5 giây.
Chú ý nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lƣợng protein trong
một giếng không vƣợt quá 20 – 40 g và hàm lƣợng protein/band không vƣợt quá 0,1
g.
 44

Đối với thang chuẩn protein (Biorad) hút 2 l vào eppendorf 1 ml chứa 8 l
nƣớc cất và 10 l dung dịch nạp mẫu.
 Tiến hành chạy điện di
Dùng pipetteman 10 l nạp mẫu vào các giếng (20 l/giếng)
Tiến hành chạy điện di ổn định dòng : 100V.
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trƣớc (2-4 giờ)
trong một giờ. Sau đó tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải
nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong,
protein đƣợc phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
Xác định trọng lƣợng phân tử của protein
Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các
band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng.
Tính giá trị Rf :

Khoảng cách di chuyển của protein

Rf =
Khoảng cách di chuyển của vạch màu
bromophenol blue
Vẽ biểu đồ lg của các giá trị trọng lƣợng phân tử của các protein chuẩn và
các giá trị Rf của chúng.
Trọng lƣợng phân tử của các vạch protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có
thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng.
Trọng lƣợng phân tử của các protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể
xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phƣơng pháp ngoại suy từ đồ thị.
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel.
 45

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô
Chiết enzyme từ 100g chế phẩm enzyme thô bằng nƣớc cất. Dịch chiết thu
đƣợc đem xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease theo thí nghiệm 1 ở mục
3.3.1.1. Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính
protease trong 100g chế phẩm thành hàm lƣợng và hoạt tính trên một gam chế phẩm.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1 : Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết
enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp.kawasaki
Hoạt tính protease Hàm lƣợng protein
HTR(UI/mg)
(UI/g CP) (mg/g CP)
Asp.oryzae 29,01 31,20 0,93
Asp. kawasaki 12,85 20,40 0,63

35
30
25
20 Hàm lƣợng (mg/g CP)
15 Hoạt tính (UI/g CP)
10
5
0
Asp.oryzae Asp.kawasaki

Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong
dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki
 Nhận xét : Từ đồ thị 4.1 cho thấy hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của
Asp.oryzae cao hơn Asp.kawasaki.
4.2 Nồng độ muối tối ƣu cho việc tủa protease
 46

Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết
đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ 50, 55, 60, 65, 70, 75% độ bão hòa. Sử
dụng 50 ml dịch chiết enzyme thô cho mỗi nồng độ. Ly tâm để thu tủa. Sau đó cặn tủa
thu đƣợc hòa tan vào 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định tổng hàm
lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) trong 15 ml
dịch hòa tan tủa này. Ở nồng độ nào cho hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nồng độ
tối ƣu cho việc tủa enzyme protease.
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae
Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml
dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.
Nồng độ muối
Tổng hoạt tính Tổng hàm lƣợng
(NH4)2SO4 (% độ HTR (UI/mg)
(UI) (mg)
bão hòa)
50 271,67 106,12 2,56
55 385,98 129,96 2,97
60 495,85 159,95 3,1
65 805,91 204,56 3,94
70 702,29 208,4 3,37
75 625,2 216,09 2,89

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng
protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính
trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối
Nồng độ (NH4)2SO4 Hoạt tính Hàm lƣợng
HTR (UI/mg)
(% độ bão hòa) (UI/g CP) (mg/g CP)
50 35,33 13,8 2,56
55 50,19 16,9 2,97
60 64,48 20,8 3,1
65 104,80 26,6 3,94
 47

70 91,33 27,1 3,37

75 81,3 28,0 2,89
Hàm lượng protein (mg/g CP)

Hoạt tính protease (UI/g CP)

30 120

25 100

20 80

15 60
Hàm lƣợng protein
Hoạt tính protease
10 40

5 20

0 0

50 55 60 65 70 75
Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa
(% độ bão hòa)

Đồ thị 4.2 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.
 Nhận xét :
Kết quả từ bảng 4.3 cho thấy :
 Về hàm lƣợng : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 75% độ bão hòa

thu đƣợc hàm lƣợng protein tủa là nhiều nhất. Nồng độ muối (NH4)2SO4 càng tăng thì
hàm lƣợng protein tủa đƣợc càng nhiều. Điều này có đƣợc là do khi nồng độ muối
càng cao, các phân tử muối phân ly thành các ion càng nhiều. Chính các ion này bắt
lấy các phân tử nƣớc khỏi protein càng nhiều, do đó các protein có điều kiện tiếp xúc
nhau và sa lắng.
 Về hoạt tính : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 65% độ bão hòa cho

hoạt tính enzyme protease cao nhất.

 Hoạt tính riêng của enzyme ở nồng độ muối 65% độ bão hòa cao nhất.

Nhƣ vậy, nồng độ muối tủa đƣợc nhiều protein nhất không phải là nồng độ tối
ƣu để thu nhận enzyme protease. Bởi vì, ở các nồng độ muối khác nhau sẽ tủa đƣợc
các protein khác nhau. Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc
nhiều nhất nhƣng chứa nhiều protein tạp, không phải là enzyme protease. Ngƣợc lại, ở
nồng độ muối 65% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc không cao nhất nhƣng
hoạt tính protease mạnh nhất . Điều này chứng tỏ ở nồng độ muối 65% độ bão hòa tủa
 48

đƣợc nhiều protease nhất. Từ đây có thể kết luận, nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ
bão hòa là tối ƣu để tủa enzyme protease vì vừa cho hoạt tính protease cao, vừa tiết
kiệm lƣợng muối sử dụng.

4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki

Bảng 4.4 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15
ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối
Nồng độ (NH4)2SO4 Tổng hoạt tính Tổng hàm lƣợng
HTR(UI/mg)
(% độ bão hòa) (UI) (mg)
50 96,89 53,83 1,80
55 148,18 72,29 2,05
60 197,04 89,97 2,19
65 276,84 103,05 2,68
70 232,47 106,1 2,19
75 202,01 109,2 1,85

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein
có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g
chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5

Bảng 4.5 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối
Nồng độ muối (NH4)2SO4 Hoạt tính Hàm lƣợng
HTR (UI/mg)
(% độ bão hòa) (UI/g CP) (mg/g CP)
50 12,6 7 1,8
55 19,27 9,4 2,05
60 25,62 11,7 2,19
65 36 13,4 2,68
70 30,2 13,8 2,19
75 26,27 14,2 1,85
 49

15 40

Hoạt tính protease

Hàm lượng protein

30
10

(UI/g CP)
(mg/g CP)

20
5
10

0 0
50 55 60 65 70 75
Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa (% độ bão hòa)

Hàm lƣợng protein

Hoạt tính protease

Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.
 Nhận xét :
Tƣơng tự với chủng Asp.oryzae, đối với chủng Asp.kawasaki :
 Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc là nhiều nhất.

 Nồng độ muối 65% độ bão hòa chính là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme

protease.
4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease
Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết
đƣợc tủa với cồn lạnh ở các tỷ lệ dịch enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Sử
dụng 50 ml dịch trích enzyme thô cho mỗi tỷ lệ. Ly tâm để thu tủa sau đó hòa tan tủa
trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định hàm lƣợng và hoạt tính của
dịch hòa tan tủa. Ở tỷ lệ nào hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là tỷ lệ cồn tối ƣu cho
việc tủa enzyme.
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae
 50

Bảng 4.6 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15
ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn.
Tổng hoạt tính Tổng hàm lƣợng HTR
Tỷ lệ dịch enzyme : cồn
(UI) (mg) (UI/mg)
1:1 247,46 130,11 1,9
1:2 337,98 155,03 2,18
1:3 454,48 185,48 2,45
1:4 701,63 216,55 3,24
1:5 563,68 197,79 2,85
1:6 524,30 193,48 2,71

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng
protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính
trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn
Hoạt tính Hàm lƣợng Hoạt tính riêng
Tỷ lệ dịch trích : cồn
(UI/g CP) (mg/g CP) (UI/mg)
1:1 32,18 16,92 1,9
1:2 43,95 20,16 2,18
1:3 59,1 24,12 2,45
1:4 91,24 28,16 3,24
1:5 73,3 25,72 2,85
1:6 68,18 25,16 2,71
 51

30 100

25 80

Hoạt tính protease

Hàm lượng protein

20

(UI/g CP)
60
(mg/g CP)

15
40
10
20
5
0 0

1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Tỷ lệ dung dịch enzyme và cồn lạnh
Hàm lƣợng protein
Hoạt tính protease

Đồ thị 4.4 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn.
 Nhận xét : Ở tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1:4, hàm lƣợng protein và hoạt tính
protease đều cao nhất. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng, tỷ lệ dịch trích enzyme thô : cồn
= 1:4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease.
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki

Bảng 4.8 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15
ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn.
Tổng hoạt tính Tổng hàm lƣợng
Tỷ lệ dịch trích : cồn HTR(UI/mg)
(UI) (mg)
1:1 78,8 47,75 1,65
1:2 119,09 66,90 1,78
1:3 147,58 80,21 1,84
1:4 268,15 125,89 2,13
1:5 202,59 109,51 1,85
1:6 195,17 108,43 1,80
 52

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein
có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g
chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn
HTR
Tỷ lệ dịch trích : cồn Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP)
(UI/mg)
1:1 10,25 6,21 1,65
1:2 15,49 8,70 1,78
1:3 19,19 10,43 1,84
1:4 34,86 16,37 2,13
1:5 26,34 14,24 1,85
1:6 25,38 14,10 1,80

20 40
35

Hoạt tính protease

Hàm lượng protein

15 30

(UI/g CP)
25
(mg/g CP)

10 20
15
5 10
5
0 0
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
Tỷ lệ dung dịch enzyme và cồn lạnh

Hàm lƣợng protein

Hoạt tính protease

Đồ thị 4.5 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn.
 Nhận xét : Từ kết quả ở bảng 4.9 cho thấy, khi tủa enzyme bằng cồn ở tỷ lệ 1:4,
hàm lƣợng protein thu đƣợc nhiều nhất đồng thời hoạt tính protease cũng cao nhất.
Nhƣ vậy tỷ lệ dịch trích enzyme thô : cồn ở tỷ lệ 1:4 là tối ƣu để kết tủa enzyme
protease.
 53

4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4.
Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng
Asp.oryzae và Asp.kawasaki.

Tác nhân HT cao nhất HL cao nhất HTR ở nồng độ muối và

Chủng
tủa (UI/g CP) (mg/g CP) tỷ lệ cồn tối ƣu (UI/mg)

Cồn 960 91,24 28,16 3,24

Asp.oryzae

Muối
104,80 28 3,94
(NH4)2SO4
Asp.kawasaki

Cồn 960 34,86 16,37 2,13

Muối
36 14,2 2,35
(NH4)2SO4

Từ kết quả của cả hai chủng cho thấy, hàm lƣợng protein thu đƣợc từ tác nhân
tủa là cồn cao hơn tác nhân tủa là muối. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme protease khi tủa
bằng cồn lại thấp hơn khi tủa bằng muối. Điều này là do khi kết tủa bằng cồn, tạp chất
trong chế phẩm lớn hơn khi kết tủa bằng muối. (Lê Ngọc Tú, 1982). Hơn nữa, có thể
xảy ra hiện tƣợng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Khi
hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt
động. Trong khi đó muối (NH4)2SO4 là muối trung tính thƣờng đƣợc sử dụng vì tính
hòa tan tốt và ít gây biến tính protein ở nhiệt độ thƣờng
 Đối với tủa bằng cồn: Thu đƣợc hàm lƣợng protein cao, dễ dàng thực hiện
trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp tủa bằng
cồn là hoạt tính protease không cao so với tủa bằng muối, hoạt tính riêng thấp hơn so
với muối, cần dụng cụ tủa có thể tích lớn nên không tiện áp dụng ở quy mô công
nghiệp.
 54

 Đối với tủa bằng muối : Hoạt tính protease cao, hoạt tính riêng cao. Tuy
nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp tủa bằng muối là hàm lƣợng protein không cao so
với tủa bằng cồn. Việc sử dụng muối trong sản xuất quy mô lớn bị hạn chế do việc rất
khó tách nó hoàn toàn ra khỏi tủa protein. Vì trong quá trình lắng tủa, tuy phần lớn
muối tồn tại trong dung dịch trên cặn, nhƣng vẫn có một phần nhỏ có mặt trong tủa
protein.
4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease.
Nhƣ đã trình bày trong phần 4.3.2 việc tủa enzyme trong cồn lạnh dễ áp dụng ở
quy mô phòng thí nghiệm. Do đó để xác định pH và nhiệt độ tối ƣu của enzyme
protease, chúng tôi sử dụng dịch pha tủa ở tỷ lệ cồn tối ƣu (tỷ lệ dịch enzyme : cồn =
1:4).
4.5.1 pH tối ƣu
Khảo sát hoạt tính enzyme ở các giá trị pH : 4, 5, 6, 7, 8, 9 trong cùng điều
kiện về nhiệt độ (370C) để xác định pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease.
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae
Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH
pH 4 5 6 7 8 9
Hoạt tính (UI/g CP) 84,98 87,57 89,56 91,73 88,12 85,21

94
92
Hoạt tính (UI/gCP)

90
88
86
84
82
4 5 6 7 8 9
pH

Đồ thị 4.6 : Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae.
 Nhận xét : Enzyme rất nhạy với pH của môi trƣờng. pH môi trƣờng thƣờng ảnh
hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền enzyme. Chính
vì thế pH có ảnh hƣởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với
một vùng pH nhất định. Từ đồ thị 4.6 cho thấy pH tối ƣu cho hoạt động của protease
 55

từ Asp.oryzae là pH = 7. Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ƣu , hoạt tính enzyme đều
giảm.
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki

Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH
pH 4 5 6 7 8 9
Hoạt tính (UI/g CP) 29,82 31,50 34,12 36,23 33,46 30,71

37
Hoạt tính (UI/g CP)

35

33

31

29
4 5 6 7 8 9

pH

Đồ thị 4.7 : Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ
Asp.kawasaki
 Nhận xét : Qua đồ thị 4.7 cho thấy pH = 7 là pH tối ƣu cho hoạt động của

enzyme protease từ Asp.kawasaki.

4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu
Khảo sát hoạt tính enzyme theo dãy nhiệt độ (0C) : 30, 37, 47, 57, 67, 77 trong
cùng điều kiện về pH (pH = 7).
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae
Bảng 4.13 : Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ.
Nhiệt độ (0C) 30 37 47 57 67 77
Hoạt tính (UI/g CP) 77,89 90,7 94,89 91,41 85,7 60,2

105
Hoạt tính (UI/gCP)

95

85

75

65

55
30 37 47 57 67 77
 56

Đồ thị 4.8 : Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae
 Nhận xét :
Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme,
chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất. Thông thƣờng khi
nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một
giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm.
Từ đồ thị 4.8 cho thấy protease của chủng Asp.oryzae hoạt động mạnh nhất ở
nhiệt độ 470C. Vƣợt quá nhiệt độ này, hoạt tính enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở
770C do sự biến tính của enzyme.
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki
Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ
Nhiệt độ (0C) 30 37 47 57 67 77
Hoạt tính (UI/g CP) 24,84 36,73 39,16 30,12 15,2 10,14

45
Hoạt tính (UI/gCP)

35

25

15

5
30 37 47 57 67 77
Nhiệt độ (0C)

Đồ thị 4.9 : Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki.
 Nhận xét : Tƣơng tự chủng Asp.oryzae, đối với Asp.kawasaki nhiệt độ tối ƣu
cho hoạt động của protease cũng ở 470C. Sau nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính protease giảm.
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel.
Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với muối 65% và cồn ở tỷ lệ dịch chiết
enzyme thô : cồn là 1:4 đƣợc chạy qua hệ sắc ký lọc gel với các thông số sau :
 57

 Gel : Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5000 – 100.000 daltons).
 Cột : 30 x 1,5 cm
 Flow adaptor : 1,5 cm.
 Tốc độ dòng : 0,14 ml/phút.
 Vmẫu : 1ml.
 Phân đoạn : 2 ml/phân đoạn.
 A280 : Độ hấp thụ protein ở bƣớc sóng 280 nm.
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae
a) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 sau khi tủa protease bằng
muối.

Hình 4.1 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease
bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae.
Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 thu đƣợc 3
peak với thứ tự nhƣ sau :
 Peak1 : từ ống số 8 đến ống 11 : 8 ml
 Peak2 : từ ống số 17 đến ống 19 : 6 ml.
 Peak3 : từ ống số 25 đến 31 : 14 ml.
Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi
nhận thấy cả ba peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan
tâm.
 58

b) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 sau khi tủa protease bằng
cồn.

Hình 4.2 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 khi tủa bằng cồn
đối với nấm Aspergillus oryzae.
Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng cồn thu đƣợc 3 peak với thứ
tự nhƣ sau:
 Peak 1 : từ ống số 7 đến ống 12 : 12 ml
 Peak 2 : ống 13 và 14 : 4 ml
 Peak 3 : ống 19 đến ống 27 : 18 ml.
Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi
nhận thấy cả ba peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan
tâm.
 59

c) Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae khi tủa protease bằng
cồn và muối qua sắc ký lọc gel.

Bảng 4.15 : Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel.
HT protease HL protein HTR Độ tinh Hiệu suất
(UI/g CP) (mg/g CP) (UI/mg) sạch về HT (%)
Chế phẩm enzyme
29,01 31,2 0,93 1 100
thô
Dịch thu đƣợc sau
khi chạy sắc ký qua
19,293 3 6,43 6,91 66,49
Biogel P-100 khi
tủa muối
Dịch thu đƣợc sau
khi chạy sắc ký qua
10,059 1,7 5,9 6,34 34,67
Biogel P-100 khi
tủa cồn

 Nhận xét kết quả lọc gel :

Sau quá trình tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel, hoạt tính riêng của
protease tăng lên đáng kể. Hoạt tính riêng của protease khi tủa bằng muối sau khi qua
sắc ký cao hơn khi tủa bằng cồn. Độ tinh sạch của enzyme sau khi qua sắc ký nhƣ sau :
+ Khi tủa protease bằng muối : Độ tinh sạch gấp 6,91 lần so với chế phẩm
enzyme thô ban đầu.
+ Khi tủa protease bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 6,34 lần so với chế phẩm
enzyme thô ban đầu.
 60

4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki

a) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng muối.

Hình 4.3 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa bằng
muối đối với nấm Aspergillus kawasaki.
Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng muối thu đƣợc 2 peak với thứ
tự nhƣ sau :
 Peak1 : từ ống số 7 đến ống 12 : 12 ml
 Peak2 : từ ống số 22 đến ống 29 : 16 ml.
Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi
nhận thấy cả hai peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của peak 2 cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa protease quan
tâm.
b) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 khi tủa protease bằng cồn.
 61

Hình 4.4 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa bằng cồn
đối với Aspergillus kawasaki.
Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng cồn thu đƣợc hai peak với thứ
tự nhƣ sau :
 Peak 1 : Từ ống số 7 đến ống 13 : 14 ml.

 Peak 2 : từ ống số 14 đến ống 31 : 36 ml

Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi
nhận thấy cả hai peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của peak 2 cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa protease quan
tâm.
c) Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki khi tủa protease bằng
cồn và muối qua sắc ký lọc gel.

Bảng 4.16 : Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc
gel.
HT protease HL protein HTR Độ tinh Hiệu suất
(UI/g CP) (mg/g CP) (UI/mg) sạch về HT (%)
Chế phẩm enzyme
12,852 20,40 0,63 1 100
thô
Chạy sắc ký qua
Biogel P-100 khi 8,045 1,38 5,83 9,25 62,7
tủa muối
Chạy sắc ký qua
Biogel P-100 khi 5,534 1,05 5,27 8,37 43,1
tủa cồn.

 Nhận xét kết quả lọc gel :

Sau quá trình tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel, hoạt tính riêng của
protease tăng. Độ tinh sạch của enzyme sau khi qua sắc ký nhƣ sau :
 62

+ Khi tủa protease bằng muối : Độ tinh sạch gấp 9,25 lần so với chế phẩm
enzyme thô ban đầu.
+ Khi tủa protease bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 8,37 lần so với chế phẩm
enzyme thô ban đầu.
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki.
4.7.1 Tủa protease bằng muối
Bảng 4.17 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa
protease bằng muối.

Asp.oryzae Asp.kawasaki

Dịch thô 0,93 0,63

Hoạt tính riêng
Dịch tủa muối 3,94 2,68
(UI/mg)
Dịch sau sắc ký 6,43 5,83

7
6
5
Dịch enzyme thô
4
Dịch tủa muối
3
Dịch sau sắc ký
2
1
0
Asp.oryzae Asp.kawasaki

Đồ thị 4.10 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua

các bƣớc tinh sạch khi tủa protein bằng muối

4.7.2 Tủa protease bằng cồn

Bảng 4.18 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa
protease bằng cồn.

Asp.oryzae Asp.kawasaki

Hoạt tính riêng Dịch thô 0,93 0,63

 63

(UI/mg) Dịch tủa cồn 3,24 2,13

Dịch sau sắc ký 5,9 5,27

6
Dịch enzyme thô
4 Dịch tủa cồn
Dịch sau sắc ký
2

0
Asp.oryzae Asp.kawasaki

Đồ thị 4.11 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease

qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protease bằng cồn.

 Nhận xét :
 Qua hai đồ thị 4.10 và 4.11 cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn hay

muối hoạt tính riêng của protease từ hai chủng nấm mốc qua các bƣớc tinh sạch đều
tăng dần. Sau quá trình tủa, hoạt tính protease tăng lên do đã loại bớt đƣợc một số
protein tạp. Tuy nhiên, enzyme vẫn hoàn toàn chƣa sạch do trong đó vẫn còn chứa một
số protein lạ khác. Các protein lạ này sẽ bị loại bỏ qua quá trình sắc ký. Do đó, hoạt
tính riêng của protease sau khi qua sắc ký cao nhất.
 Từ hai đồ thị trên, chúng ta cũng thấy đƣợc hoạt tính protease của Aspergillus

kawasaki không cao bằng hoạt tính protease từ Aspergillus oryzae. Nhƣ vậy, nếu đƣa
vào sản xuất, chủng Asp.kawasaki vẫn không thể là nguồn vi sinh vật thay thế
Asp.oryzae để thu nhận enzyme protease.

4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel
SDS – PAGE.
Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki. Đồng thời, dịch enzyme thu đƣợc từ các peak sau khi chạy sắc
 64

ký của mẫu tủa bằng cồn của cả hai chủng cũng đƣợc chạy điện di đồng thời với dịch
chiết enzyme thô.
Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu nhƣ ở mục 2.2.3

Kết quả điện di nhƣ hình 4.5.

Kdal 1 2 3 4 5 6 7 8
200
116,25

97,4
66,2

45

31

21,5
14,4

Hình 4.5 : Kết quả chạy điện di của các dịch enzyme protease
Thứ tự cho mẫu vào các giếng :
Giếng 1 : Thang protein chuẩn
Giếng 2 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae
Giếng 3 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 1 của Aspergillus oryzae.
Giếng 4 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 2 của Aspergillus oryzae.
Giếng 5 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 3 của Aspergillus oryzae.
Giếng 6 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus kawasaki.
Giếng 7 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 1 của Aspergillus kawasaki.
 65

Giếng 8 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 2 của Aspergillus kawasaki.

Từ kết quả điện di, tính giá trị Rf của từng protein trong thang chuẩn. Từ đó xây
dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lg trọng lƣợng phân tử của các
protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.

Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang.
Rf Trọng lƣợng phân tử (daltons) Lg(trọng lƣợng phân tử)
0,0317 200.000 5,301
0,1111 116.250 5,065
0,2539 974.000 4,988
0,3174 662.000 4,820
0,5555 45.000 4,653
0,7460 31.000 4,491
0,9206 21.500 4,332
0,9682 14.400 4,158

5.6
Lg(trọng lượng phân tử)

5.4
5.2
y = -1.0576x + 5.2426
5
4.8
4.6
4.4
4.2
4
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Rf

Đồ thị 4.12 : Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf.
Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc từ đồ thị 4.12 nhƣ sau :
Y = - 1,0576X + 5,2426
Trong đó : Y = lg(trọng lƣợng phân tử protein)
X = Rf : Tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng
cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tách.
 66

Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lƣợng
phân tử của protein :
Trọng lƣợng phân tử protein = 10Y

Từ hình 4.5 cho thấy :

 Đối với Aspergillus oryzae:
 Giếng 2 xuất hiện bốn vạch, là bốn loại protein có trong dịch chiết

enzyme thô.
 Giếng 3 và 4 không xuất hiện vạch protein, kết quả này là do hàm lƣợng

protein trong peak 1 và 2 thấp nên không hiện vạch trên điện di đồ.
 Giếng 5 xuất hiện 2 vạch. Vì hoạt tính của peak 3 cao nhất nên có thể dự

đoán hai vạch này chính là hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra. Giá trị Rf và trọng
lƣợng phân tử của hai loại protease đƣợc tính toán dựa vào kết quả điện di và phƣơng
trình hồi quy tuyến tính. Kết quả nhƣ bảng 4.20.
Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae
Trọng lƣợng phân tử của protease
Thứ tự vạch X = Rf Y
(Daltons)
Vạch 1 0,6031 4,6046 40.242
Vạch 2 0,7619 4,4368 27.340

 Đối với Aspergillus kawasaki:

Trong hai peak thu đƣợc của Asp.kawasaki sau khi chạy sắc ký, peak 2 có hoạt
tính protease và hàm lƣợng protein cao nhất và cho hai vạch trên điện di đồ, peak 1
cho hoạt tính protease thấp và không xuất hiện vạch trên điện di đồ. Từ đó có thể dự
đoán hai vạch của peak 2 chính là hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra. Giá trị Rf
và trọng lƣợng phân tử của hai loại protease đƣợc tính toán dựa vào kết quả điện di và
phƣơng trình hồi quy tuyến tính. Kết quả nhƣ bảng 4.21.
Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki.
Trọng lƣợng phân tử của
Thứ tự vạch X = Rf Y
protein (daltons)
 67

Vạch 1 0,5873 4,3192 41.828

Vạch 2 0,873 4,3192 20.859

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết Luận

Từ những kết quả thu đƣợc qua các thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết
luận sau :
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
 Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme

protease.
 Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease.

 Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở

nhiệt độ 470C và pH = 7.
0
 Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 96 , hoạt tính riêng của

protease tăng lên :

+ Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg
tăng lên 6,43 UI/mg.
+ Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg tăng
lên 5,9 UI/mg.
 Sau khi qua sắc ký :

+ Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế
phẩm thô ban đầu là 66,49% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,91
lần so với chế phẩm enzyme thô.
+ Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm
thô ban đầu là 34,67% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,34 lần so
với chế phẩm enzyme thô.
 68

 Trọng lƣợng phân tử của hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra lần lƣợt là

40.242 và 27.340 daltons.

5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki
 Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme

protease.
 Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease.

 Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở

nhiệt độ 470C và pH7.

0
 Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 96 , hoạt tính riêng của

protease tăng lên :

+ Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg
tăng lên 5,83 UI/mg.
+ Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg tăng
lên 5,27 UI/mg.
 Sau khi qua sắc ký :

+ Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế
phẩm thô ban đầu là 62,7% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 9,25 lần
so với chế phẩm enzyme thô.
+ Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm
thô ban đầu là 43,1% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 8,37 lần so
với chế phẩm enzyme thô.
 Trọng lƣợng phân tử của hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra lần lƣợt là

41.828 và 20.859 daltons.

5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki
0
 Protease của cả hai chủng đều hoạt động tốt nhất ở pH7 và nhiệt độ 47 C.

 Protease thu đƣợc từ Aspergillus oryzae có hoạt tính cao hơn protease từ

Aspergillus kawasaki.
5.2 Đề nghị
 Khảo sát thêm các phƣơng pháp tủa protein khác nhƣ lắng tủa đẳng điện, lắng

tủa bằng các chất đa điện phân.

 Tiến hành chạy sắc ký với các loại gel khác Biogel P-100 nhằm tìm ra loại gel

tốt nhất để phân tách protease cho kết quả tinh sạch hơn.
 69

 Tinh sạch tiếp tục protease bằng sắc ký trao đổi ion sau khi qua sắc ký lọc gel.

 Thực hiện western blot để kiểm tra vạch protease sau khi chạy điện di. Từ đó

hoàn thiện quy trình tinh sạch protease.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Hữu Chấn, 1984. Enzyme và xúc tác sinh học. Nhà xuất bản Khoa
học và Kỹ Thuật.
2. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Qốc Gia
TP.HCM.
3. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại
học Quốc Gia TP.HCM.
4. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc
gia TP.HCM.
5. Nguyễn Văn Mùi, 2001. Thực hành hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học
Quốc Gia Hà Nội.
6. Lƣơng Đức Phẩm, 1998 . Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp
7. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982.
Enzyme vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học Kĩ thuật.
8. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, 1994 . Công nghệ sinh học và một số ứng dụng tại
Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
9. Nguyễn Tiến Thắng, 2004. Giáo trình Công nghệ enzyme.Tủ sách trƣờng Đại
học Nông Lâm TP.HCM.
10. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Tủ
sách Viện Sinh Học Nhiệt Đới.

TIẾNG NƢỚC NGOÀI

11. Amersham Biociences, 2004. Gel Filtration – Principle and Methods.
Edition A1.
 70

PHỤ LỤC

1) Đƣờng chuẩn Albumin

 71

2) Đƣờng chuẩn Tyrosine

72