Chương 4

MỘT SỐ THỬ NGHIỆM SINH HÓA THƯỜNG GẶP TRONG PHÂN TÍCH
VI SINH VẬT THỰC PHẨM
4.1 Thử nghiệm khả năng lên men
Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của một số vi sinh vật lên men (phân giải) một
carbohydrate đặc hiệu có trong môi trường cơ bản tạo acid (hoặc acid và hơi).
Việc sinh acid làm giảm pH thể hiện qua sự đổi màu của chất chỉ thị pH có trong môi
trường. Carbohydrate gồm: đường đơn (monosacharide), polysaccharide hay
oligosaccharide (sản phẩm trùng hợp từ hai hay nhiều monosaccharide giống nhau hoặc
khác nhau, rượu (alcohol) là sản phẩm khử của monosaccharide.
Các đường đơn (monosaccharide) dùng trong thử nghiệm sinh hóa thường có từ 4
đến 6 nguyên tử carbon.
Đường 4 carbon (tetrose): erythrose
Đường 5 carbon (pentose): ribose, ribulose, xylose, arabinose
Đường 6 carbon (hexose): glucose, fructose, galactose, mannose.
Các đường đôi (disaccharide) là polysaccharide (hoặc oligosaccharide) cấu tạo từ hai
đường đơn, một trong số đó là glucose
Sucrose  glucose + frutose
Maltose  2 glucose
Lactose  glucose + galactose
Khi sử dụng các nguồn carbon để lên men, tùy theo phương thức lên men các sản
phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2, … Trong tất cả các trường
hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH của môi trường. Do vậy khả năng lên men
được đánh giá sự làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH
trong môi trường. Ngoài ra, CO2 được tạo thành sẽ được giữ lại trong thành bọt khí trong
ống Durham làm nổi ống này (trong trường hợp sử dụng môi trường lỏng) hoặc làm vỡ
thạch khi được cấy trong ống thạch sâu (trong trường hợp sử dụng môi trường rắn). Môi
trường lỏng thường được dùng trong đa số các trường hợp thử nghiệm khả năng lên men.
Môi trường: môi trường phenol red base
Thao tác: Dùng que cấy vòng cấy vi khuẩn vào các ống môi trường chứa các loại
nguồn carbon khác nhau, ủ 37oC trong 24 giờ, lấy đọc kết quả.
Đọc kết quả: Khả năng lên men được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi
- Sinh aicd là (+) khi môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, ngược lại môi trường màu
đỏ là (-).
 - Sinh hơi là (+) khi có bọt khí trong ống Durham và nếu không có bọt khí trong ống
Durham, cần phải thực hiện lại thử nghiệm với ống nghi ngờ.
4.2 Thử nghiệm khả năng oxy hóa-lên men
Nguyên tắc: Xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng nguồn carbonhydrate làm
nguồn năng lượng thông qua phương thức lên men hoặc hô hấp.
Lên men là một quá trình biến dưỡng năng lượng trong điều kiện kỵ khí, năng lượng
được tạo ra bởi phosphoryl hóa cơ chất, không có sự tham gia của chuỗi truyền điện tử và
chất nhận điện tử sau cùng từ bên ngoài tế bào. Sản phẩm cuối cùng của con đường lên
men phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật và điều kiện môi trường. Tuy vậy điểm cốt yếu
của con đường lên men là phân tử glucose bị phosphoryl hóa ở bước đầu tiên để thành
glucose-6-phosphate.
Hô hấp là quá trình biến dưỡng năng lượng trong đó điện tử được truyền tuần tự từ
chất cho điện tử đến chất nhận điện tử trong chuỗi truyền điện tử, trong quá trình này năng
lượng ATP được tạo ra theo cơ chế phosphoryl hóa oxi hóa. Quá trình này được gọi là sự
hô hấp hiếu khí khi chất nhận điện tử cuối cùng là oxi phân tử, chỉ diễn ra trong môi trường
có oxi.
Môi trường: môi trường Hugh-Leifson
Thao tác: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vi khuẩn vào hai ống nghiệm môi trường.
Một trong hai ống được phủ lên bề mặt 1ml dầu khoáng lỏng vô trùng để ngăn cản sự tiếp
xúc với oxi không khí, ủ cả hai ống 37oC trong 24 giờ, lấy đọc kết quả.
Đọc kết quả: Phương thức biến dưỡng carbohydrate là lên men khi cả 2 ống đều bị
acid hóa đều ở trên bề mặt và phần sâu của môi trường. Ngược lại, khi ống kỵ khí bị acid
hóa khắp thạch sâu, trong khi đó ống hiếu khí không bị acid hóa trên mặt mà chỉ bị acid
hóa ở phần đáy ống thì kết luận vi sinh vật biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi
hóa.
4.3 Thử nghiệm Bile Esculin
Nguyên tắc: Thử nghiệm này phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên
kết glucoside trong esculi thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật.
Trong phản ứng này, liên kết β-glucoside trong esculin bị thủy phân, phóng thích glucose
và esculetin. Esculetin phản ứng với muối sắt trong môi trường tạo thành phức hợp màu
đen hay màu nâu đen.
Môi trường: môi trường Aesculin hay Edwards
Thao tác: cấy vi khuẩn vào môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ, đọc kết quả
Đọc kết quả:
- Môi trường chuyển thành đen hay nâu đen (+)
- Môi trường không đổi màu (-)
4.4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
 Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của một vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn
carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường
Một số vi sinh vật có enzyme citrate permease có khả năng sử dụng citrate trong môi
trường có natri citrate làm nguồn carbon duy nhất. Khi sử dụng citrate chúng giải phóng ra
môi trường ion Na+ làm tăng pH của môi trường. Đồng thời những vi sinh vật có khả năng
sử dụng citrate làm nguồn carbon thì cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ làm
nguồn nito tạo ra NH3 cũng làm kiềm hóa môi trường, sự thay đổi pH của môi trường được
nhận biết nhờ chỉ thị màu Bromothymol blue.
Môi trường: môi trường Simmon citrate
Thao tác: Cấy vi khuẩn vào môi trường theo đường zic-zắc, ủ 37oC trong 24 giờ, đọc
kết quả.
Đọc kết quả:
- Môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương (+)
- Môi trường không đổi màu (-).
4.5. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của một vi sinh vật sử dụng malonate như
nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường
Một số vi sinh vật có enzyme succinate dehydrogenase xúc tác sự chuyển hóa
succinate thành fumarate. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có
khả năng sử dụng muối amonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự tăng trưởng trên môi trường
chứa malonate làm nguồn carbon duy nhất sẽ kéo theo việc sử dụng nguồn đạm này tạo ra
NH3 cũng làm kiềm hóa môi trường. Do vậy khả năng biến dưỡng malonate có thể nhận
thấy bằng sự chuyển màu của chỉ thị pH trong môi trường.
Môi trường: môi trường lỏng malonate
Thao tác: Sử dụng que cấy vòng cấy vi khuẩn vào môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ,
đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương (+)
- Môi trường không đổi màu (-).
4.6 Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase
Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ
của phân tử có độc tính cao trong tế bào. Enzyme catalase có ở hầu hết các vi sinh vật hiếu
khí và kỵ khí tùy nghi chứa cytochrome, ngoại trừ Streptococcus spp.
Thông thường một vi sinh vật không có hệ cytochrome thì cũng không có enzyme
catalase và vì vậy không thể phân cắt H2O2 (hydrogen peroxide). Đa số vi sinh vật kỵ khí
(như Clostridium chẳng hạn) có enzyme peroxidase thay vì catalase. Tuy nhiên trắc nghiệm
catalase không phải là đặc hiệu và có thể bị nhiễu bởi các enzyme peroxidase.
Hóa chất: dung dịch hydrogen peroxide 30% được giữ lạnh trong chai nâu, tránh ánh
sáng
Thao tác:
- Thử trên lam kính: dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt
lên một phiến kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính.
Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
- Thử trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần
trên bề mặt thạch nghiêng. Ghi nhận sự sửi bọt quanh sinh khối nếu có.
Đọc kết quả:
- Sủi bọt khí xung quanh sinh khối (+)
- Không sủi bọt (-).
4.7 Thử nghiệm decarboxylase
Nguyên tắc: Đánh giá hoạt tính enzyme của vi sinh vật khử nhóm carboxyl của acid
amin sinh một amin tạo tính kiềm
Họ decarboxylase gồm nhiều thành viên, mỗi loại chỉ tác động lên một cơ chất nhất
định. Trong thực tế kiểm nghiệm có 3 loại decarboxylase là lysine decarboxylase (LDC),
ornithine decarboxylase (ODC), arginine decarboxylase (ADC) có cơ chất tuần tự là lysine,
ornithine và arginine. Phản ứng được xúc tác bởi LDC sẽ loại bỏ CO2 khỏi lysine, phóng
thích CO2 và dẫn đến sự tạo thành cadaverine. Trường hợp ODC và ADH sản phẩm tạo ra
là CO2 và putrescine. Ngoài ra, arginine còn có thể được chuyển hóa thành citruline nhờ
xúc tác của enzyme arginine dihydrolase (ADH) trước khi chuyển hóa tiếp thành CO2 và
putrescine. Trong tất cả các trường hợp, CO2 sinh ra làm tăng pH của môi trường và được
ghi nhận qua sự đổi màu của chất chỉ thị pH
Môi trường: môi trường decarboxylase basal chứa chỉ thị bromocresol tím
Thao tác: Dùng que cấy vòng cấy vi khuẩn vào môi trường, thêm 2-3ml dầu khoáng
hoặc parafin và ủ 37oC trong 24 giờ, đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Môi trường trở nên đục và có màu tím (+)
- Môi trường trong có màu vàng (-).
4.8 Thử nghiệm coagulase
Nguyên tắc: Kiểm tra khả năng của một vi sinh vật làm đông huyết tương thỏ hoặc
người do tác dụng của enzyme coagulase
Một số vi sinh vật, đặc biệt là các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết
ra môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương,
tạo thành các khối đông làm đông huyết tương. Enzyme này khá bền nhiệt, có thể chịu
được nhiệt độ đến 60oC trong 30 phút.
Môi trường: huyết tương thỏ hay người đông khô dạng thương phẩm
Thao tác: Phân phối huyết tương vào mỗi ống nghiệm nhỏ, cấy vi khuẩn cần kiểm tra
vào, ủ 37oC trong 24 giờ. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Huyết tương thỏ đông lại từ giờ thứ 4, thứ 8, thứ 12 hoặc 24 giờ (+)
- Huyết tương vẫn lỏng sau 24 giờ nuôi cấy (-).
4.9 Thử nghiệm urease
Nguyên tắc: Xác định khả năng của vi sinh vật phân giải urea tạo hai phân tử ammonia
do tác dụng của enzyme urease làm kiềm hóa môi trường.
Cơ chất urea là một diamide của acid carbonic H2CO3 thường được gọi là carbamide.
Mọi amide đều dễ dàng bị thủy phân. Sự thủy phân urea được xúc tác bởi một enzyme đặc
hiệu là urease tạo nên 2 phân tử ammonia.
Môi trường:
- Môi trường urea lỏng, chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng
chuyển màu là pH 6,8 – 8,4)
- Môi trường urea rắn, chứa chỉ thị đỏ phenol, rót môi trường vào ống nghiệm làm
ống nghiệm thạch nghiêng, phần đáy ngắn, phần nghiêng dài
Thao tác: Cấy vi khuẩn vào môi trường, nếu là môi trường rắn thì cấy hình ziczac
khắp bề mặt nghiêng, không cấy đâm xuyên phần đáy để dùng làm mẫu đối chứng, ủ 37oC
trong 24 giờ. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Đỏ phenol chuyển từ vàng sang đỏ cánh sen (+)
- Môi trường không đổi màu (-).
4.10. Thử nghiệm gelatinase
Nguyên tắc: Xác định khả năng phân giải gelatin của vi sinh vật
Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin
thành polypeptide và acid amin làm phá hủy đặc tính đông đặc của gelatin ngay khi ở nhiệt
độ < 25oC. Gelatin có đặc tính đông đặc ở nhiệt độ < 25oC và hóa lỏng ở nhiệt độ > 25oC.
Môi trường: môi trường canh NB bổ sung 10% gelatin
Thao tác: Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn vào môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả: sau khi ủ lấy ra cho vào ngăn dưới tủ lạnh 1 giờ
- Nếu môi trường hóa lỏng (+)
 - Môi trường đông đặc (-).
4.11. Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Nguyên tắc: Một số vi sinh vật tổng hợp được enzyme desulfohydrase xúc tác sự
chuyển hóa trong điều kiện kỵ khí các acid amin chứa lưu huỳnh như cysteine, cystin,
methione và phóng thích H2S. Thành viên quan trọng nhất của nhóm enzyme này là
cysteine desulfohydrase. Các acid amin này là sản phẩm của quá trình thủy phân protein
thành aicd amin. Khí H2S sinh ra sẽ tạo tủa màu đen với chỉ thị sulfide chứa trong môi
trường nuôi cấy.
Môi trường: các loại môi trường có thể được sử dụng cho thử nghiệm sinh H2S là
KIA, TSI, BSA
Thao tác: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào phần đáy của ống thạch nghiêng hoặc
ống thạch đứng, ủ 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả:
- Môi trường chuyển màu đen (+)
- Môi trường không chuyển màu (-).
4.12 Thử nghiệm indol
Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh indol từ tryptophan
Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme
tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Sản phẩm trung gian chính của phản
ứng oxi hóa tryptophan là indolpyruvic acid IPA. Tryptophanase xúc tác phản ứng loại
nhóm amin để tạo thành indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của
phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân
pyrrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên một
phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Môi trường và thuốc thử: môi trường Trypton water, thuốc thử Kowac’s
Thao tác: cấy vi khuẩn vào môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ, lấy ra nhỏ 3-5 giọt
Kowac’s. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ cánh sen (+)
- Môi trường có màu vàng chanh (-).
4.13 Thử nghiệm KIA/ TSI
Nguyên tắc: xác định khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose,
lactose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật.
Khả năng sử dụng cả hai nguồn đường là glucose và lactose hay chỉ sử dụng glucose
để thu lấy năng lượng cần cho tăng trưởng là tùy thuộc vào di truyền của chủng vi sinh vật.
Khi cấy chủng lên môi trường này, có ba trường hợp có thể xảy ra đối với sự tăng trưởng
của chủng vi sinh vật thử nghiệm: chỉ sử dụng glucose, sử dụng các glucose và lactose,
không sử dụng cả hai loại đường này. Khả năng của vi sinh vật có thể được xác định thông
qua sự đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường ở trên bề mặt và bên trong môi trường
trong ống thạch nghiêng.
Môi trường: môi trường KIA hoặc TSI
Thao tác: Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn vào phần nghiêng của ống thạch nghiêng
và cấy đâm sâu vào phần đứng của ống thạch nghiêng, ủ 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả:
Đáy ống nghiệm
- Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)
- Màu đỏ/không đổi màu: glucose âm tính (không lên men glucose)
- Màu đen: sinh H S
2

- Vỡ thạch: sinh hơi từ glucose

Mặt nghiêng:
- Màu vàng: lactose và/hoặc sucrose dương tính (lactose và/hoặc sucrose được sử
dụng)
- Màu đỏ/không đổi màu: lactose và sucrose âm tính (lactose và sucrose không được
sử dụng).
4.14 Thử nghiệm nitratase
Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nitrat (khử NO3-) của vi sinh vật
Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nhận hydro cơ chất trong quá
trình hô hấp kỵ khí đồng thới sử dụng nitrat làm nguồn nito do có khả năng tổng hợp
enzyme nitratreductase. Nitrat bị khử thành nitrit và rồi có thể bị khử tiếp thành NH3 hoặc
N2.
Môi trường và thuốc thử: môi trường nitrat và thuốc thử Gress A (acid sulfanilic) và
Gress B (α-naphthylamin).
Thao tác: Dùng que cấy vòng cấy vi khuẩn vào môi trường nitrat lỏng, ủ 37oC trong
24 giờ. Lấy ra nhỏ vài giọt thuốc thử Gress A (acid sulfanilic) và vài giọt Gress B (α-
naphthylamin). Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Môi trường có màu hồng đỏ (+)
Trong trường hợp không có màu đỏ hồng xuất hiện, tiếp tục thêm bột kẽm:
- Môi trường không chuyển màu (+)
- Môi trường có màu hồng đỏ (-).
 4.15 Thử nghiệm oxidase
Nguyên tắc: Xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật
Thành viên quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi
truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện
trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Hoạt tính cytochrome oxidase được
phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine. Trong điều kiện có sự hiện diện của
cytochrome c khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxi hóa thành một hợp chất indolphenol
có màu xanh dương.
Thuốc thử: Giấy tẩm N-dimethyl-para phenylenediamine hoặc dung dịch 1%
tetramethyl-p-phenylenediamine.
Thao tác: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn đã nuôi cấy phết lên giấy tẩm thuốc thử.
Hoặc dùng ống nhỏ giọt, nhỏ 1 giọt tetramethyl-p-phenylenediamine lên khuẩn lạc đã nuôi
cấy. Đọc kết quả trong vòng 30 giây-1 phút.
Đọc kết quả:
- Giấy tẩm hoặc giọt thuốc thử chuyển sang màu xanh dương đậm (+)
- Giấy tẩm không chuyển màu hoặc thuốc thử vẫn màu hồng (-).
4.16 Thử nghiệm ONPG
Nguyên tắc: Xác định sự hiện diện của enzyme β-galactosidase ở vi sinh vật
Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp trong tế bào của hai enzyme là
β-galactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose và permease có vai trò vận chuyển
lactose vào bên trong tế bào. Một số vi khuẩn không có gen mã hóa enzyme β-galactosidase
nên không thể lên men lactose. Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định dựa vào
một cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG). Sự thủy phân của cơ
chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenyl có màu vàng.
Môi trường: môi trường lỏng ONPG
Thao tác: Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống
môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả:
- Môi trường chuyển sang vàng (+)
- Môi trường không chuyển màu (-).
4.17 Thử nghiệm MR (Methyl Red)
Nguyên tắc: Kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối
mang tính acid
Phép thử MR dựa trên việc sử dụng MR làm chất chỉ thị pH để xác định nồng độ ion
hydro hiện diện khi một vi sinh vật lên men glucose. Nồng độ ion hydro tùy thuộc vào tỉ lệ
các loại khí (CO2 và H2), tỉ lệ này lại là chỉ số về các con đường biến dưỡng glucose khác
nhau bởi các vi sinh vật khác nhau. Các phương thức lên men khác nhau tùy thuộc vào sự
biến động của các men vốn có ở vi sinh vật tham gia biến dưỡng acid pyruvic.
Một số nhóm đường ruột như E. coli, Salmonella,… chuyển hóa glucose thành acid
pyruvic. Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol, acid acetic, acid lactic, acid
succinic. Các aicd tạo ra làm pH môi trường giảm mạnh, pH = 4-4,5. Ở pH này methyl red
màu đỏ, ngược lại pH cao hơn thì methyl red chuyển sang màu vàng.
Môi trường và thuốc thử: môi trường lỏng MR-VP, thuốc thử methyl red
Thao tác: Cấy vi khuẩn vào môi trường lỏng MR-VP, ủ 37oC trong 24 giờ, lấy ra nhỏ
vài giọt methyl red, đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Môi trường giữ nguyên màu đỏ (+)
- Môi trường từ đỏ chuyển sang vàng (-)
4.18. Thử nghiệm VP (Voges- Proskauer)
Nguyên tắc: Xác định khả năng của một số vi sinh vật tạo sản phẩm cuối mang tính
trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol-AMC) do lên men glucose.
Vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic rồi tiếp tục chuyển hóa acid
pyruvic thành acetyl methyl carbinol (AMC). AMC trong môi trường kiềm sẽ chuyển hóa
thành diacetyl. Diacetyl kết hợp với α-naphtol để cho hợp chất màu hồng đỏ.
Môi trường và thuốc thử: môi trường MR-VP, thuốc thử có ba công thức khác nhau:
1) Công thức Barritt: dung dịch A là 5% α-naphtol trong cồn và dung dịch B là NaOH 40%
(KOH 40%). 2) Công thức Koblentz: dung dịch A là 5% α-naphtol trong cồn và dung dịch
B là 0,3% creatin trong dung dịch NaOH 40% (KOH 40%). 3) Công thức O’Meara (cải
tiến): dung dịch đơn 0,3% creatin trong NaOH 40% (KOH 40%).
Thao tác: Cấy vi khuẩn vào môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ, lấy ra nhỏ thuốc thử
Nhỏ các dung dịch thử theo đúng trình tự sau:
Đối với công thức 1 và 2 trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung
dịch B. Với phương pháp 3 nhỏ 1ml thuốc thử, lắc nhẹ ống. Đọc kết quả sau 10-20 phút
(với công thức 1, 2) hoặc chậm nhất sau 4 giờ (với công thức 3).
Đọc kết quả:
- Môi trường chuyển sang màu đỏ cam (+)
- Môi trường có màu vàng hoặc nâu đất (-).
4.19. Thử nghiệm CAMP
Nguyên tắc:
 - Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật tạo ra nhân tố CAMP có khả năng phối hợp
với β-hemolysin của Staphylococcus tác động lên hồng cầu bò hoặc cừu sinh ra hiện tượng
tan huyết tại vùng tiếp giáp của hai vi sinh vật.
- Nhằm xác định cũng hiện tượng tan huyết do phối hợp như trên giữa nhân tố CAMP
và α-hemolysin của Clostridium perfringens.
Phản ứng CAMP được Christie và cộng sự quan sát thấy đầu tiên trên cơ sở hiện
tượng Streptococci nhóm B sinh ra một nhân tố (về sau gọi là nhân tố CAMP) có khả năng
tác động phối hợp với β-hemolysin của S. aureus lên hồng cầu cừu hay bò trên môi trường
thạch máu. Đây là một dạng ”phối hợp hành động” của 2 hoặc vài vi sinh vật; nhân tố phối
hợp (nhân tố CAMP) đóng vai trò trợ giúp cho tác động của một vi sinh vật khác.
Môi trường: môi trường thạch máu
Cơ chất β-lysine: Dùng S. aureus hoặc bất kỳ chủng nào tạo nhiều β-lysine
Vi sinh vật chứng: Streptococcus spp. đã định danh
Thao tác: Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng thuần của S. aureus
thành một đường zic-zắc thẳng đứng ở giữa đĩa (chia môi trường trong đĩa thành hai vùng).
Trên hai vùng môi trường của đĩa, thực hiện cấy ria sinh khối chủng thuần Streptococcus
cần thử nghiệm thành các đường 2-3cm theo hướng vuông góc nhưng không chạm với
đường cấy của S. aureus. Thực hiện đồng thời hai đường cấy của chủng Streptococcus
agalactiae làm đối chứng (+) và chủng Streptococcus faecalis làm đối chứng (-). Lật ngược
đĩa và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 35oC trong 6 giờ hoặc đến 18 giờ.
Đọc kết quả:
- Có sự hình thành vùng tan huyết trong rõ hình mũi tên tại vùng tiếp giáp giữa đường
cấy của chủng kiểm nghiệm và S. aureus (+)
Không có vùng tan huyết tại vùng tiếp giáp như trên (-).
4.20 Thử nghiệm tính di động
Nguyên tắc: xác định khả năng di động của vi sinh vật
Một số vi sinh vật có tiêm mao nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng
và làm đục môi trường hay mọc giống như rẻ cây xung quanh đường cấy.
Môi trường: môi trường bán lỏng NA, để đứng.
Thao tác: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng, đâm
thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường, ủ 37oC trong 24 giờ. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi
khuẩn mạnh hay yếu (+)
- Vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy (-).