Tổng hợp các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật qPCR định lượng vi khuẩn Fn

Trình tự 5’-3’ TLTK

NusG sequence CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA Relationship between Fusobacterim
s-F nucleatum, inflamatory mediators
NusG sequence GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAAT and microRNAs in colorectal
s-R C carcinogenesis (Marcela
Probe FAM-
TCAGCAACTTGTCCTTCTTGATCTTTAAATGAA
CC-TAMRA
Fn-F CAA CCA TTA CTT TAA CTC TAC CAT GTT CA - Castellarin M, Warren
Fn-R GTTGACTTTACAGAAGGA GAT TAT GTA AAA RL, Freeman JD,
ATC Dreolini L, Krzywinski
Probe FAM- M, Strauss J, et
TCAGCAACTTGTCCTTCTTGATCTTTAAATGAA
al.. Fusobacterium
CC-TAMRA
nucleatum infection is
prevalent in human
colorectal
carcinoma. Genome
Research.
2012;22(2):299–306.
- Marie S. Rye, Kerryn L.
Garrett, Robert A. Holt ,
Cameron F. Platell,
Melanie J. McCoy .
Fusobacterium
nucleatum and Bacteroi
des fragilis detection in
colorectal tumours:
Optimal target site and
correlation with total
bacterial load, 2022
-

Align trình tự Mồi xuôi và mồi ngược và mẫu dò của các nghiên cứu trên với đoạn gene nusg của chủng
chuẩn Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 23726 chromosome được trình bày trong hình
sau.
Kết quả cho thấy trình tự mồi xuôi và probe 100% giống trình tự chủng chuẩn Fusobacterium
nucleatum trong khi trình tự mồi ngược cho thấy có một số nucleotit sai khác. Chính vì vậy, chúng tôi
thiết kế lại trình tự mồi ngược với một số nucletotit thay đổi. Trình tự cặp mồi và probe sử dụng trong
nghiên cứu này được trình bày ở trong bảng sau

Trình tự
Fn-F CAA CCA TTA CTT TAA CTC TAC CAT GTT CA
Fn-R ATTGACTTTACTGAGGGAGATTATGTAAAAATC
Probe Fam-
TCAGCAACTTGTCCTTCTTGATCTTTAAATGAACC-
tamra

Trình tự nucleotit thay đổi so với các nghiên cứu được đánh dấu màu đỏ
Phụ lục: Trình tự nucleotit đoạn gene nusg của chủng Fusobacterium nucleatum subsp.
nucleatum ATCC 25586
> AE009951.2:c549749-549168 Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC
25586, nusg gene
ATGAGTATAGAAAATGTCAGAAAATGGTTTATGATTCATACTTATTCTGGATATGAAAAAAAAGTAAAAA
CAGACCTTGAACAAAAAATGGAAACATTGGGTTTTAAAGAAGTTGTAACTAATATATTGGTTCCAGAAGA
AGAATTAACAGAAATTGTTAGAGGAAAGCCCAAGAAGGTCTATAGAAAGCTTTTTCCAGCATATGTTATG
CTTGAAATGGAAGCTACAAGAGAAGAAAATGAAAATGGTATAAGTTATAAAGTAGATCCTCGTGTATGGT
ATGAAGTTAGAAATACTAATGGGGTTACTGGATTTGTAGGAGTTGGTTCTGACCCTATTCCTATGGAAGA
AGAAGAAGTAAAAAATATATTCAACATAATAGGTGTAAAGACACCTAAAGAAAATGTGAAAATTGACTTT
ACTGAGGGAGATTATGTAAAAATCTTAAAAGGTTCATTTAAAGATCAAGAAGGACAAGTTGCTGAAATTG
ATCATGAACATGGTAGAGTTAAAGTAATGGTTGATATTTTTGGAAGAATGACACCAGTTGAAATTGAAGT
AGATGGTGTTTTGAAAGTGTAG
 THIẾT KẾ MỒI CHO CHỨNG DƯƠNG CHO PHẢN ỨNG realtime PCR

Đoạn chứng dương được thiết kế bao phủ sản phẩm realtime PCR trên đoạn gen
nusg của chủng Fusobacterium nucleatum subsp. Theo thiết kế thì sản phẩm
realtime PCR của chúng tôi có trình tự nucleotit từ vị trí 60-171 trên đoạn gen nusg.
Sử dụng phần mềm Primer-BLAST để thiết kế trình tự mồi cho phản ứng PCR tạo
chứng dương bao phủ từ vị trí 60-171. Primer-BLAST là một công cụ được phát
triển bởi NCBI giúp người dùng thiết kế mồi đặc hiệu cho một phản ứng PCR cụ
thể. Primer-BLAST sử dụng mã nguồn mở Primer3 để thiết kế mồi, sau đó dùng
công cụ  BLAST và thuật toán định tuyến tổng quát (global alignment) để kiểm tra
trong cơ sở dữ liệu của NCBI nhằm tránh các sai sót kết cặp, tương đồng chéo là
nguyên nhân dẫn đến phản ứng PCR không hiệu quả. Kết quả các cặp mồi sau khi
sử dụng phần mềm Primer-Blast được trình bày trong hình sau:
Thiết kế mồi cho phản ứng PCR cần tránh tạo ra hiện tượng kết cặp hay gọi là tạo dimer.
Đây là hiện tượng mồi thay vì gắn vào khuôn sẽ gắn vào mồi ngược với nó hoặc với chính
nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ và làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn.
Kết quả các trình tự mồi được thiết kế trên phần mềm primer-blast cho thấy cặp 1 có hiện
tượng kết cặp (dimer) là thấp nhất. Từ kết quả chúng tôi chọn cặp primer 1 có trình
tự nucleotit từ 32 đến 422, sản phẩm của phản ứng PCR này đảm bảo bao phủ trình
tự nucleotit trong phản ứng realtime PCR.
 Self 3'
Templat Self
Sequence (5'- Template strand Length Start Stop Tm GC% complementarity
e strand complementarity
>3')
Forward 57.1
TCAACTGGTGTCATTCTTCCA Plus 21 32 52 42.86 3.00 0.00
primer 4
59.6
Reverse primer GAGGAAAGCCCAAGAAGGTCT Minus 21 422 402 52.38 3.00 3.00
5
AGACCTTCTTGGGCTTTCCTC
391 bp
Product length