Đề tài nghiên cứu khoa học - Nghiên cứu chiết tách và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không ở tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (download tai tailieutuoi.com)

PHIẾU ĐỀ XUẤT
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

VIỆN
NCKH ĐỀKỸ THUẬT
TÀI CẤP -TRƯỜNG
KINH TẾ BIỂN
NĂM 20..
1. Tên đề tài:
…………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
2. Mục tiêu, nội dung chính: TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
…………………………………………………………………………………
HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA TINH DẦU LÁ
……………………………………………………………………………………
TRẦU KHÔNG Ở BÀ RỊA – VŨNG TÀU
……………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
3. Kết quả, sản phẩm dự kiến:
…………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
Chủ nhiệm: Phạm Minh Tú
Hướng dẫn khoa học: ThS.Vũ Thị Hồng Phượng
……………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
BÀ RỊA-VŨNG TÀU _ NĂM HỌC 2018- 2019
4. Nhu cầu kinh phí dự kiến:

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .........................................................................................i
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... iii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................... iii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................................... iii
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT ................................................................3
1.1. Khái quát về họ Hồ tiêu [1] .............................................................................3
1.1.1. Phân loại khoa học [1].................................................................................3
1.1.2. Phân bố [1] ..................................................................................................3
1.1.3. Đặc tính thực vật [1] ...................................................................................4
1.1.4. Thành phần hóa học của lá trầu [1] .............................................................4
1.1.5. Lợi ích của cây trầu [14] .............................................................................4
1.2. Tổng quan về tinh dầu [5] ...............................................................................5
1.2.1. Khái niệm [5] ..............................................................................................5
1.2.2. Phân loại tinh dầu [5] ..................................................................................5
1.2.3. Tính chất vật lí và thành phần hóa học của tinh dầu [5] .............................6
1.2.3.1. Tính chất vật lý của tinh dầu [5] ...........................................................6
1.2.3.2. Các thành phần hóa học trong tinh dầu [5] ..........................................6
1.2.4. Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật [5] .........................................9
1.3. Tính chất vật lý và thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không .............9
1.3.1. Tính chất vật lý của tinh dầu Trầu không [15] ............................................9
1.3.2. Thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không [1], [2], [3] .......................10
1.3.3. Ứng dụng của tinh dầu Trầu không [14] ...................................................12
1.4. Các phương pháp chiết tách tinh dầu [5] ....................................................12
1.4.1. Phương pháp chưng cất hơi nước [18] ......................................................13
1.4.1.1. Chưng cất bằng nước [18] ..................................................................15
1.4.1.2. Chưng cất bằng nước và hơi nước [18] ..............................................15
1.4.1.3. Chưng cất bằng hơi nước [18] ............................................................16
1.5. Phương pháp định tính thành phần trong dịch chiết lá Trầu không bằng
các phản ứng và thuốc thử ......................................................................................17
1.6. Các phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) dùng để
xác định thành phần trong tinh dầu [5] .................................................................17
1.6.1. Phương pháp sắc ký khí (GC) [5] .............................................................17
1.6.2. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) [5]............................19
1.7. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn [17] ...........................21
1.7.1. Phương pháp khuếch tán đĩa .....................................................................21
1.8. Giới thiệu một số chủng vi khuẩn [2], [6], [16]............................................22
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM..................................................................................30
2.1. Đối tượng, dụng cụ thiết bị và hóa chất, phương pháp nghiên cứu ..........30
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................30
2.1.2. Dụng cụ thiết bị và hóa chất ......................................................................30
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................31
2.2. Xử lý nguyên liệu ...........................................................................................31
2.3. Dự kiến quy trình chiết xuất tinh dầu trầu không......................................32
2.4. Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tinh dầu ............33
2.4.1. Khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu ................................................................33
2.4.2. Khảo sát thời gian ngâm hỗn hợp .............................................................35
2.4.3. Khảo sát thời gian chưng cất hỗn hợp .......................................................36
2.5. Phương pháp xác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không .37
2.5.1. Đánh giá cảm quan ....................................................................................37
2.5.2. Xác định tỷ trọng .......................................................................................37
2.6. Phương pháp định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không .38
2.7. Phương pháp xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu [5] ..................................39
2.8. Phương pháp xác định, định danh các cấu tử, thành phần hóa học có
trong tinh dầu lá Trầu không..................................................................................40
2.9. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương
pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [7] ..........................................................40
2.10. Phương pháp xử lí số liệu ..............................................................................42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..............................................................43
3.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu ...43
3.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ nước/nguyên liệu thích hợp ..................................43
3.1.2. Kết quả xác định thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ thu tinh dầu .........44
3.1.3. Kết quả xác định thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ thu tinh dầu...45
3.2. Đề xuất quy trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không.................................47
3.3. Kết quả xác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không ...........48
3.3.1. Đánh giá cảm quan ....................................................................................48
3.3.2. Tỷ trọng .....................................................................................................48
3.4. Kết quả định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không ..........49
3.5. Kết quả xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu .................................................51
3.6. Kết quả xác định thành phần hóa học của mẫu tinh dầu là Trầu không đã
được tối ưu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS............................52
3.6.1. Sắc ký đồ tinh dầu lá Trầu không..............................................................52
3.6.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu không ...................................53
3.6.3. So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu huyện Châu Đức,
thành phố Bà Rịa với một số vùng khác đã công bố ở Việt Nam ..........................54
3.7. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp
đo đường kính vòng kháng khuẩn ..........................................................................55
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................59
4.1. Kết luận ...........................................................................................................59
4.2. Kiến nghị .........................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................61
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
GC – MC: Gas Chromatography – Mass Spectometry
VPC: Vapour Phase Chromatography
TSB: Tryptic Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB
MHA: Mueller Hinton Agar – Môi trường dinh dưỡng MHA
PDA: Potato dextrose agar (PDA) – Môi trường dinh dưỡng PDA
MHB: Mueller Hinton Broth (MHB – Môi trường dinh dưỡng MHB
XLD: Xylose Lysine Deoxycholate – Môi trường dinh dưỡng XLD
MYP: Mannitol Egg Yolk Polymixin – Môi trường dinh dưỡng MYP
EMB: Eosin Methylene Blue – Môi trường dinh dưỡng EMB
DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức
(CH3)2SO
DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt
động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật và
nhiều loài virus
STEC: Shiga toxin-producing E. coli – Một số E. coli sản sinh ra độc tố có tên là
độc tố Shiga gây tiêu chảy
CFU/ml: Colony Forming Unit/ đơn vị hình thành khuẩn lạc
v/w: Volume/weight (Thể tích/ Khối lượng)
w/w: Weight/weight (Khối lượng/ Khối lượng)
i
DANH MỤC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1:Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu .....................................................................3

Hình 1. 2: Hệ thống sắc ký khí GC (Gas Chromatography) .........................................18
Hình 1. 3: Sắc ký đồ ......................................................................................................19
Hình 1. 4: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) ...................................................20
Hình 1. 5: Vi khuẩn Bacilus cereus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MP ....22
Hình 1. 6: Vi khuẩn Staphylococus aureus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch
MSA...............................................................................................................................24
Hình 1. 7: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi và trên môi trường thạch EMB
.......................................................................................................................................26
Hình 1. 8: Vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi và trên môi trường XLD ................27
Hình 1. 9: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi và trên môi trường MP
.......................................................................................................................................28
Hình 2. 1: Lá Trầu không ..............................................................................................30

Hình 2. 2: Hệ thống chưng cất tinh dầu lá Trầu không tại phòng thí nghiệm ...............33
Hình 2. 3: Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009) .............................42
Hình 3. 1: Mẫu tinh dầu chiết được tại phòng thí nghiệm ............................................48
Hình 3. 2: Sắc ký đồ của tinh dầu lá Trầu không ..........................................................52
Hình 3. 3: Khả năng kháng B. cereus của tinh dầu lá Trầu không ...............................56
Hình 3. 4: Khả năng kháng E. Coli của tinh dầu Trầu không .......................................56
Hình 3. 5: Khả năng kháng S. typhi của tinh dầu lá Trầu không ...................................57
Hình 3. 6: Khả năng kháng S. aureus của tinh dầu lá Trầu không ................................57
Hình 3. 7: Khả năng kháng P. aeruginosa của tinh dầu lá Trầu không ........................58
ii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1: Bảng dụng cụ thiết bị ...................................................................................30
Bảng 3. 1: Các thông số sử dụng để khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu ...........................43

Bảng 3. 2: Kết quả khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu ...........................43
Bảng 3. 3: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian ngâm .......................................44
Bảng 3. 4: Kết quả khảo sát thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu...................44
Bảng 3. 5: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất ................................45
Bảng 3. 6: Kết quả khảo sát thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu ............45
Bảng 3. 7: Kết quả trung bình cộng của ba lần cân ống tiêm để đo tỷ trọng tinh dầu ..48
Bảng 3. 8: Kết quả định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không ...............49
Bảng 3. 9: Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu không .............53
Bảng 3. 10: So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức với
các vùng khác ở Việt Nam ............................................................................................54
Bảng 3. 11: Đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không (mm) ............55
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2. 1: Quy trình công nghệ chiết tách tinh dầu lá Trầu không ..............................32
Sơ đồ 2. 2: Quy trình chiết tách xác định tỷ lệ nước/nguyên liệu .................................34
Sơ đồ 2. 3: Quy trình chiết tách xác định thời gian ngâm .............................................35
Sơ đồ 2. 4: Quy trình chiết tách xác định thời gian chưng cất ......................................36
Sơ đồ 3. 1: Quy trình hoàn thiện chiết tách tinh dầu lá Trầu không .............................47
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3. 1: Thể hiện tinh dầu thu được phụ thuộc vào tỷ lệ nước/nguyên liệu .........43
Biểu đồ 3. 2: Thể hiện lượng tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian ngâm ...........45
Biểu đồ 3. 3: Thể hiện lượng tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian chưng cất ....46
iii
Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay khi mà xã hội không ngừng phát triển, đời sống vật chất tinh thần của
con người ngày một nâng cao, vấn đề chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của con người ngày
càng được chú trọng. Với việc ứng dụng những tiến bộ khoa học vào lĩnh vực y học con
người đã nghiên cứu tổng hợp và điều chế được nhiều loại dược phẩm có nguồn gốc
thiên nhiên. Các dược liệu có hợp chất tự nhiên ngoài tác dụng chữa bệnh còn bổ sung
cho cơ thể các dưỡng chất, không độc hại, cơ thể hấp thụ tốt và không gây ra các tác
dụng phụ. Do đó, việc phát hiện và đi sâu nghiên cứu các hợp chất có trong thảo dược
luôn được chú trọng. Việt Nam ta là một trong những nước nhiệt đới, nóng, ẩm và mưa
nhiều, có nguồn dược liệu rất phong phú lên đến 12000 loài, đa dạng và một nền y học
dân tộc phát triển lâu đời. Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nhiều loại thảo dược
trong việc dưỡng thương, trị bệnh và bồi bổ cơ thể. Những năm gần đây, thuốc tân dược
của nền y học hiện đại được sử dụng một cách rộng rãi nhưng những vị thuốc dân gian
đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hằng ngày của con người, đã có rất nhiều
bệnh tật được chữa khỏi nhờ các loại thảo.
Lá Trầu không rất quen thuộc với chúng ta, trong dân gian được sử dụng xông hơi
cho phụ nữ sau sinh, tắm cho trẻ sơ sinh. Trong y học cổ truyền, lá trầu không có vị
nồng, hơi cay, tính ấm, công dụng ôn trung (làm ấm bụng), tán hàn (trừ lạnh). So với
nhiều loại cây dược liệu khác các thông tin khoa học về lá trầu không vẫn chưa rộng
rãi. Trên tinh thần mong muốn đóng góp phần tìm hiểu mối quan hệ giữa thành phần
hóa học của cây với công dụng dược tính đã được sử dụng em chọn đề tài: “Nghiên cứu
chiết tách và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không ở tỉnh Bà
Rịa – Vũng Tàu”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu
không
- Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, từ đó xây dựng quy trình chiết tinh
dầu
- Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của lá trầu không
3. Đối tượng nghiên cứu
GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 1 SVTH: Phạm Minh Tú

Lá Trầu không được sử dụng trong nghiên cứu được thu hái tại xã Nghĩa Thành,
huyện Châu Đức, thành phố Bà Rịa, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xây dựng quy trình chiết xuất tinh dầu, xác định thành phần hóa học trong tinh
dầu lá Trầu không
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tinh dầu
- Xác định tỷ trọng tinh dầu
- Định tính flavonoids, ankaloid, steroid, anthraquinones, saponin, tanin dịch
chiết lá Trầu không
- Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của lá trầu không
5. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Nghiên cứu Khoa học, Viện Kỹ
thuật – Kinh tế biển, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.
6. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu thập, tổng hợp tài liệu
- Phương pháp phân tích, đánh giá tài liệu
- Phương pháp xử lý số liệu
7. Các kết quả đạt được của đề tài
- Trích ly được tinh dầu với phương pháp và điều kiện tối ưu nhất
- Xác định được tỷ trọng, màu sắc, mùi vị của tinh dầu lá Trầu không
- Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không hiệu quả trên 5 chủng vi
khuẩn
8. Cấu trúc của đồ án
Cấu trúc bài báo cáo gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan lý thuyết
Chương 2: Thực nghiệm
Chương 3: Kết quả thực nghiệm
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.1. Khái quát về họ Hồ tiêu [1]
Họ Hồ tiêu (Piperaceae) là một họ thực vật chứa trên 2.000 loài, được nhóm trong
9 chi. Chúng là các loại cây bụi hay dây leo ở khu vực nhiệt đới. Các loài của họ này nói
chung có hoa được chia thành chuỗi, thông thường có mùi thơm rất mạnh, cay nồng.
Quan trọng nhất về mặt kinh tế trong họ này bao gồm các loại cây ăn hạt, lá như tiêu,
trầu, lá lốt, xem hình 1.1.
Hình 1. 1:Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu

1.1.1. Phân loại khoa học [1]
Tên khoa học của cây trầu là Piper betle. Cây trầu còn được gọi là trầu không, betel
Baum (Đức), árbol de betel (Tây Ban Nha), arbre de betel (Pháp), pokok sirih (Malaisia),
Betel Boom (Hà Lan) ...
1.1.2. Phân bố [1]
Loài này có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á và được trồng ở Ấn Độ, Indonesia,
Sri Lanka, Việt Nam, Malaysia. Lá trầu loại tốt nhất thuộc về giống "Magahi" (từ vùng
Magadha) sinh trưởng ở gần Patna tại Bihar, Ấn Độ. Ở nước ta, cây trầu được trồng khắp
các vùng miền với quy mô lớn nhỏ khác nhau. Có thể trồng từng cây riêng lẻ ở từng hộ

gia đình hoặc trồng thành vườn.

1.1.3. Đặc tính thực vật [1]
Cây trầu hay trầu không là một cây gia vị, cây thuốc. Đây là loại cây thường có
màu xanh, dây leo, sống lâu năm, lá hình trái tim có mặt bóng và các hoa đuôi sóc màu
trắng.
1.1.4. Thành phần hóa học của lá trầu [1]
Các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy trong lá trầu chứa các thành phần
sau:
- Lá trầu chứa tinh dầu gồm 23 thành phần, trong đó chủ yếu: 3-Allyl- 6-methoxyphenyl
acetate (14,95%); 4-Allyl-1,2- diacetoxybenzene (8,98%); Chavicol (4,57%); Eugenol
(9,03%); Beta-caryophyllene (7,06%); Linalool (1,55%). Tinh dầu của nó có màu vàng
nhạt, hương thơm nồng, khi nếm có vị nóng và cay.
- Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho biết lá trầu còn chứa cả chất tanin, đường khử,
pectin 10%, flavonoid, alkaloid, phytosterol, steroid, axit hữu cơ.
1.1.5. Lợi ích của cây trầu [14]
- Lá dùng để xông hơi giúp phụ nữ sau sinh kháng khuẩn vùng kín
- Lá dùng để hơ trẻ sơ sinh giúp khử trùng tự nhiên và kháng các chủng vi khuẩn gây
bệnh cho trẻ, chữa phát ban, chữa ho, mát xa bằng lá trầu giảm chướng bụng, khó tiêu.
- Tại Thái Lan và Trung Quốc chúng được dùng để làm dịu bệnh đau răng. Lá trầu nhai
với vôi giúp sát trùng răng miệng, chữa viêm mũ chân răng, giúp răng chắc khỏe.
- Ăn trầu giúp không bị bệnh đường tiêu hóa, kí sinh trùng ở ruột.
- Nước sắc lá trầu để rửa hoặc đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm.
- Lá trầu ngâm trong nước sôi dùng nhỏ mắt chữa viêm kết mạc.
- Các lá trầu không cũng được sử dụng như là chất kích thích, chất khử trùng và chất
làm sạch hơi thở. Trong y học Ayurveda, chúng còn được sử dụng như là thuốc kích
dục.
- Tại Malaysia chúng được sử dụng để điều trị chứng đau đầu, viêm khớp và các thương
tổn khớp.
- Tại Indonesia chúng được uống như một loại trà và sử dụng như là thuốc kháng sinh.
Chúng cũng được sử dụng trong trà để điều trị chứng khó tiêu, cũng như trong thuốc mỡ
hay thuốc hít để điều trị đau đầu, cũng như trong điều trị chứng táo bón, cũng như có

tác dụng thông mũi và hỗ trợ tiết sữa.

- Người Việt Nam từ hàng ngàn năm nay đã sử dụng Trầu Không + Cau để sáng tạo lên
một món ăn truyền thống mang ý nghĩa nhân văn và văn hóa của người Việt Nam "
miếng trầu là đầu câu chuyện".
1.2. Tổng quan về tinh dầu [5]
Tinh dầu từ lâu đã được loài người biết đến, ngay từ thời thượng cổ người ta biết
đến và sử dụng các loại cây có tinh dầu ở dạng phơi khô, thời kỳ trung cổ khoảng thế kỷ
thứ 15 tinh dầu ngày càng phổ biến, từ thế kỷ thứ 15 đến thế kỷ thứ 17 tinh dầu đã được
sử dụng để làm thơm cho tóc và da mặt, dùng để chữa bệnh và dùng trong đời sống hàng
ngày của con người. Từ thế kỷ thứ 17 đến thế kỷ thứ 19, tinh dầu được dùng nhiều để
trang điểm, làm thuốc và dùng trong công nghiệp với phạm vi rộng hơn.
Từ thế kỷ 20 đến những năm đầu của thế kỷ 21, cùng với sự tiến bộ của nhân loại
và sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nghành công nghiệp sản xuất tinh dầu đã dần phát
triển, tinh dầu đã trở thành một sản phẩm không thể thiếu trong đời sống của con người
và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: hương liệu, thực phẩm,
mỹ phẩm, dược phẩm.
1.2.1. Khái niệm [5]
Tinh dầu là hỗn hợp nhiều cấu tử dễ bay hơi, có mùi thơm hay mùi hắc khó chịu
được tách ra từ các bộ phận của thực vật, là sản phẩm của quá trình chưng cất và chiết
nguyên liệu.
Tinh dầu là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất và không được sử dụng
lại trong hoạt động sống của cây. Mỗi loại tinh dầu được lấy từ các nguồn nguyên liệu
khác nhau sẽ có mùi vị khác nhau, phụ thuộc vào thành phần của các hợp chất có trong
đó. Hệ thực vật có tinh dầu khoảng 3000 loài, trong đó có 150 – 200 loài có ý nghĩa
công nghiệp như làm xà phòng, hương liệu trong bánh kẹo, nước giải khát; trong ngành
y học cũng có nhiều đóng góp như giảm stress, tá dược trong thuốc…
1.2.2. Phân loại tinh dầu [5]
Có hai loại tinh dầu: tinh dầu nguyên chất và tinh dầu không nguyên chất:
+ Tinh dầu nguyên chất: Hoàn toàn không có độc tố, không có chất bảo quản hóa học
nên rất an toàn cho người sử dụng và mang kết quả nhanh khi điều trị.
+ Tinh dầu không nguyên chất: Là tinh dầu được pha từ tinh dầu nguyên chất với các

chất hóa học khác mà vẫn giữ được hương của tinh dầu.
1.2.3. Tính chất vật lí và thành phần hóa học của tinh dầu [5]
1.2.3.1. Tính chất vật lý của tinh dầu [5]
- Tinh dầu thường tồn tại dạng thể lỏng ở nhiệt độ thường, mùi thơm nhẹ, ít khi có
màu trừ tinh dầu chứa aluzen có màu xanh, tinh dầu có tỉ trọng nhỏ hơn tỉ trọng của
nước nên nhẹ hơn nước, chỉ số khúc xạ cao. Tinh dầu bay hơi được, tinh dầu ít tan trong
nước nhưng làm cho nước có mùi thơm, tinh dầu là hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi
nhất định, tinh dầu tan tốt trong cồn, ete, dung môi hữu cơ và các chất béo.
- Để xác định tính chất vật lý của tinh dầu, thông thường người ta tiến hành xác
định các chỉ số như tỷ trọng, chiết suất, tỷ lệ hòa tan trong cồn 900C ở 2500C, nhiệt độ sôi,
năng suất quay cực, màu sắc.
- Hầu hết tỷ trọng các loại tinh dầu thường nhỏ hơn 1, do vậy chúng thường nhẹ
nước. Tùy nhiên, cũng có một vài tinh dầu có khối lượng riêng lớn hơn nước (như tinh
dầu quế, tinh dầu đinh hương, ...).
- Tinh dầu không tan hoặc ít tan trong nước nhưng chúng hòa tan tốt trong đa số
các dung môi hữu cơ như este, cồn, ... Mặc dù thành phần hóa học của mỗi loại tinh dầu
là khác nhau, nhưng nhìn chung chúng có nhiệt độ sôi khoảng 800C – 1500C, dễ bay hơi
và có mùi thơm.
- Về màu sắc, tinh dầu thường không màu hoặc có màu vàng nhạt. Một số ít tinh
dầu có màu (ví dụ: tinh dầu ngải cứu có màu xanh lơ, tinh dầu quế có màu sẵm) là do
sự có mặt của các hợp chất có màu được lôi kéo theo tinh dầu trong quá trình chiết xuất
(ví dụ: màu xanh do có chlorophyll, màu vàng do có carotenoid, ...). Còn mùi và vị của
tinh dầu chủ yếu gây ra do các cấu tử bị oxy hóa.
1.2.3.2. Các thành phần hóa học trong tinh dầu [5]
- Tinh dầu là một loại chất lỏng được tinh chế (thông thường nhất là bằng cách
chưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc những thành
phần khác của thực vật. Tinh dầu đưọc ví như là nhựa sống của cây, vì vậy đã mang sức
sống, năng lượng và mạnh hơn 100 lần các loại thảo dược sấy khô.
- Hidrocacbon: Các hidrocacbon thường gặp trong tinh dầu là những terpen
(C10H16)n mạch hở hoặc mạch vòng.
Bất kỳ một loại tinh dầu nào cũng đều có những thành phần sau:

 Monoterpenes: Được tìm thấy trong hầu hết các loại tinh dầu, Monoterpenes có
công thức phân tử là C10H16 mạch hở. Tiêu biểu như là miaxene, oximene có trong tinh
dầu hoa nguyệt quế
Miaxene Oximene
- Monoterpenes là chất khử trùng và thuốc bổ trong tự nhiên, chúng được lọc
không khí tốt và có mặt trong hầu hết các loại tinh dầu.
 Sesquiterpene: Mặc dù không phải là dễ bay hơi như Monoterpenes, các
Sesquiterpene mạch thẳng và vòng tiêu biểu là Farnesene, Zingiberene
Farnesene
- Sesquiterpene có khoảng 15 nguyên tử cacbon trong đó. Và có một số tác dụng làm
dịu, là chống viêm và chống nhiễm trùng.
 Phenol: Một số chất phenol trích từ các loại tinh dầu như: Thymol, Estragol,
Eugenol,...
Thymol Estragol Eugenol

- Các chất khử trùng hầu hết hóa chất có trong thực vật, kích thích cơ thể, phenol
có tác dụng khi sử dụng với liều lượng nhỏ. Tuy nhiên, liều lớn có thể là một chất độc cho
hệ thần kinh và có thể gây kích ứng da.

• Ancol: Một số ancol quan trọng trích từ tinh dầu thường gặp như: Menthol, α –
Terpincol, Geraniol,...
Menthol α – Terpincol Geraniol

- Rất nhiều ancol cũng có mặt trong các loại tinh dầu. Làm chất sát trùng, kháng
khuẩn, chống nấm rượu và thuốc kháng sinh, thuốc bổ rất tốt cho hệ thần kinh và kích
thích phản ứng miễn dịch trong cơ thể.
 Este: Các este bốc hơi nhanh và tạo độ ngát cho hương. Một số este có trong tinh
dầu: etyl anthranilate, benzyl axetat,...
Etyl anthranilate Benzyl axetat

- Este có tính chất chống co thắt, kháng khuẩn và chống viêm, dùng ete nhẹ nhàng
trên da và giúp đỡ trong việc tái cân bằng của hệ thần kinh có hiệu quả.
 Aldehyt: Trong tinh dầu có rất nhiềualdehyt, song hiện nay các andehit đều thu
được qua tổng hợp hóa học. Chỉ có các aldehyt như Aldehyt Cuminic, Citral và
Citronellal được trích ly từ nguyên liệu tự nhiên.
Aldehyt Cuminic (Z) – Citral (neral)

(E) – Citral (geranial) Citronellal

- Aldehyt chống viêm, có tính chất tương tự như Xeton và Ancol. Tuy nhiên, lượng
Aldehyt có thể gây ra kích thích lớn cho da và các màng nhầy.
 Các hợp chất khác: Ngoài các hợp chất nói trên, trong các loại tinh dầu còn có
các hợp chất thuốc nhóm oxit như: (eucalyptus) và các aminoaxit (axit antranilic), các
lacton (coumarin, ambretolit), các hợp chất có lưu huỳnh như: (anlylisosulfocyannat),
hợp chất có nitơ (metyl antranilat).
1.2.4. Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật [5]
Vấn đề về vai trò của tinh dầu trong đời sống của cây đã được đề cập tới rất nhiều
trong công trình nghiên cứu. Theo quan niệm được trình bày trong các công trình khác
nhau, vai trò của tinh dầu được quy tụ trong các nội dung sau đây:
 Bảo vệ cây khỏi các tác động của sâu bệnh
 Che phủ các vết thương ở cây gỗ
 Ngăn chặn các bệnh do nấm
 Biến đổi sức căng bề mặt của nước trong cây, thúc đẩy sự vận chuyển nước, tăng
hiệu quả của các phản ứng enzym
1.3. Tính chất vật lý và thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không
1.3.1. Tính chất vật lý của tinh dầu Trầu không [15]
Tinh dầu Trầu không là dạng chất lỏng trong suốt, thơm mùi đặc trưng, màu vàng
đến nâu sẫm. Các thông số vật lí như sau:
Bảng 1.1: Thông số vật lý của tinh dầu lá Trầu không ở 300C
Thông số Giá trị
Tỷ trọng (g/cm3) 1,044 – 1,054
Chỉ số khúc xạ (n) 1,5 – 1,524
Góc quay cực (0) -1,5 – -4

1.3.2. Thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không [1], [2], [3]
 Chavicol: hoặc p -allylphenol, là một phenylpropene tự nhiên, một loại hợp chất
hữu cơ. Cấu trúc hóa học của nó bao gồm một vòng benzen được thay thế bằng nhóm
hydroxy và nhóm propenyl. Nó là một chất lỏng không màu được tìm thấy cùng
với terpen trong tinh dầu trầu.
 Công thức: C9H10O

 Khối lượng phân tử: 134,18 g/mol
 Tỉ trọng: 1,02 g/cm³
 Điểm nóng chảy: 160C
 Điểm sôi: 2380C
 Eugenol: là một guaiacol thay thế chuỗi allyl, một thành viên của lớp hợp chất
hóa học allylbenzene. Nó là một chất lỏng nhờn không màu đến màu vàng nhạt, thơm
được chiết xuất từ một số loại tinh dầu đặc biệt là từ dầu đinh hương, nhục đậu
khấu, quế, húng quế và lá nguyệt quế. Nó hiện diện ở nồng độ 80% ngọn, 90% trong
dầu nụ đinh hương và ở 82% trong dầu lá đinh hương. Eugenol có mùi hương dễ chịu,
cay, giống như đinh hương.
 Công thức: C10H12O2

 Điểm nóng chảy: -7,50C
 Beta-caryophyllene: là một sesquiterpene (là một lớp terpen bao gồm ba đơn
vị isopren và thường có công thức phân tử C15H24. Giống như monoterpen, sesquiterpen
có thể có dạng vòng hoặc chứa các vòng. Sesquiterpenes được tìm thấy tự nhiên trong

thực vật và côn trùng, dưới dạng hóa học, ví dụ như các tác nhân phòng thủ hoặc
pheromone.) tự nhiên là thành phần của nhiều loại tinh dầu, đặc biệt là dầu đinh hương,
tinh dầu từ hoa Syzygium aromaticum (đinh hương), tinh dầu của Cannabis
sativa (hương thảo). Nó thường được tìm thấy dưới dạng hỗn hợp với isocaryophyllene
(đồng phân liên kết đôi cis) và α-humulene (tên lỗi thời: α-caryophyllene), một đồng
phân mở vòng. Caryophyllene đáng chú ý vì có một vòng cyclobutane, cũng như một
liên kết ngang trong một vòng 9 nhóm, cả hai hiếm có trong tự nhiên. Caryophyllene là
một trong những hợp chất hóa học góp phần tạo nên mùi thơm của hạt tiêu đen.
 Công thức: C15H24

 Linalool: là một chất lỏng không màu, có mùi nhẹ. Nó xuất hiện trong nhiều loại
tinh dầu, chẳng hạn như quýt, cây bạc hà, hoa hồng, cây bách, chanh, quế... Linalool
còn được tìm thấy ở một số loại nấm. Nó được sử dụng nhiều trong thương mại, phần
lớn trong số đó dựa trên hương thơm dễ chịu của nó.
 Công thức: C10H18O

 Khối lượng phân tử: 254,25g/mol
 Tỉ trọng: 0,858 – 0,868 g/cm³
 Điểm nóng chảy: -200C
 Điểm sôi: 1980- 2000C
 4-Allyl-1,2- diacetoxybenzene: hay còn gọi là Methyleugenol là một hợp chất
hóa học tự nhiên được phân loại là phenylpropene, một loại phenylpropanoid. Nó là

methyl ether của eugenol và rất quan trọng đối với hành vi và sự thụ phấn của côn trùng.
Nó được tìm thấy trong cấc loại tinh dầu khác nhau.
 Công thức: C11H14O2

 Khối lượng phân tử: 178,23g/mol
 Tỉ trọng: 0,98g/cm³
 Điểm nóng chảy: -40C
 Điểm sôi: 2540 – 2550C
1.3.3. Ứng dụng của tinh dầu Trầu không [14]
- Tinh dầu lá Trầu không có hoạt tính kháng sinh mạnh, ức chế nhiều chủng vi
khuẩn như: Tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, trực khuẩn coli, trực khuẩn lị, phẩy khuẩn
tả...và có tác dụng kháng nấm mạnh đối với nhiều chủng loại nấm.
- Tinh dầu trầu: xoa bóp khi đau nhức xương khớp, xông đèn tinh dầu giải stress,
giảm đau đầu.
- Trong lĩnh vực chăm sóc sắc đẹp tinh dầu dùng làm tinh chất trị mụn trong kem.
- Trong dược phẩm tinh dầu được dùng làm nước súc miệng.
- Trong ngành y học tinh dầu Trầu không còn được ứng dụng sản xuất các sản
phẩm dung dịch vệ sinh phụ nữ đang rất được quan tâm và phát triển.
1.4. Các phương pháp chiết tách tinh dầu [5]
- Dựa trên cách thực hành, người ta chia các phương pháp sản xuất tinh dầu ra làm
bốn loại: cơ tiến hành theo bất cứ phương pháp nào, quy trình sản xuất đều có những
điểm chung sau đây:
 Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu.
 Quy trình khai thác phải phù hợp nguyên liệu.
 Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu với chi phí thấp nhất
- Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc
tính của tinh dầu như:
 Dễ bay hơi.
 Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 1000C.

 Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ.

 Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí.
1.4.1. Phương pháp chưng cất hơi nước [18]
Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi
nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi
nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng
do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định.
Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo chi phương dây dài thì khi
chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm
áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn.
 Lý thuyết chưng cất:
Định nghĩa là: “Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều chất lỏng dựa trên
sự khác biệt về áp suất hơi của chúng”. Trong trường hợp đơn giản, khi chưng cất một
hỗn hợp gồm 2 chất lỏng không hòa tan vào nhau, áp suất hơi tổng cộng là tổng của hai
áp suất hơi riêng phần. Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp sẽ tương ứng với áp suất hơi
tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần bách phân của hỗn hợp, miễn là
lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại. Nếu vẽ đường cong áp suất hơi của từng chất theo
nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứng với một áp suất, ta dễ dàng
suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy là nhiệt độ sôi của hỗn hợp luôn
luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng hợp chất. Thí dụ, ở áp suất 760 mmHg nước sôi ở
1000C và benzen sôi ở 800C và chúng là hai chất lỏng không tan vào nhau. Nếu đun hỗn
hợp này dưới áp suất 760 mmHg nó sẽ sôi ở 690C cho đến khi nào còn hỗn hợp hai pha
lỏng với bất kì tỉ lệ nào. Giản đồ nhiệt độ sôi theo áp suất cho thấy, tại 690C, áp suất hơi
của nước là 225 mmHg và benzen là 535 mmHg.
Chính vì đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưng cất hơi
nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật.
 Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước:
 Sự khuếch tán:
Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ
và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi. Phần lớn tinh dầu còn lại
trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm

thấu. Còn nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa
tan vào lượng nước này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô
thoát ra ngoài hết.
Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưng cất
sử dụng hơi nước quá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu bị khô. Nhưng nếu lượng
nước sử dụng thừa quá thì cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu có chứa
những cấu phần tan dễ trong nước.
Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cho lớp
nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này đồng
đều và dễ dàng.
Vì các cấu phần trong tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói trên
cho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn trước.
 Sự thủy giải:
Những cấu phần ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra acid và alcol
khi đun nóng trong một thời gian dài với nước. Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự
chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt.
 Nhiệt độ:
Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu. Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quá
nhiệt (trên 1000C) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng cất,
sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết. Thực ra, hầu hết các tinh dầu đều
kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ cao
của tinh dầu càng ngắn càng tốt.
Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng có
liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ. Khi tăng nhiệt độ, sự khuếch tán
thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủy cũng tăng
theo.
 Ưu và nhược điểm của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước:
 Ưu điểm:
- Phương pháp này đơn giản, dễ làm.
- Thiết bị rẻ tiền, gọn và dễ chế tạo.
- Phù hợp với những cơ sở sản xuất nhỏ, vốn đầu tư ít.

- Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản.

- Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp phụ.
- Thời gian chưng cất tương đối nhanh.
 Nhược điểm:
- Hiệu suất thấp.
- Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật như tốc độ, nhiệt độ chưng cất.
- Không hiệu quả với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp.
- Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu tinh dầu có những cấu tử dễ bị phân
hủy.
- Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn. Những tinh
dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém.
 Các phương pháp chưng cất hơi nước:
 Chưng cất bằng nước
 Chưng cất bằng nước và hơi nước
 Chưng cất bằng hơi nước
1.4.1.1. Chưng cất bằng nước [18]
Trong trường hợp này, nước phủ kín nguyên liệu nhưng phải chừa một khoảng
không gian tương đối lớn phía trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất
nạp qua hệ thống hoàn lưu. Nhiệt cung cấp có thể đun bằng củi lửa, bếp gia nhiệt. Trong
trường hợp chất nạp quá mịn lắng xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu
ở mặt tiếp xúc với đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị các cánh khuấy để trộn đều nguyên
liệu trong lúc chưng cất. Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu
dễ bị thủy giải. Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này.
Những cấu phần có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng
lớn nước phủ đầy khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này.
1.4.1.2. Chưng cất bằng nước và hơi nước [18]
Trong trường hợp này, nguyên liệu được xếp trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổ
sao cho nước không chạm đến vỉ. Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt trực tiếp, hoặc
dùng hơi nước từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi. Có thể coi phương
pháp này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với
hơi nước ở áp suất thường. Như vậy chưng cất ngưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy
hơn là trường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước

quá nhiệt. Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so với
phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp bằng cách xuyên qua nó nên phải
sắp xếp thế nào để chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt. Muốn
vậy, chất nạp phải có kích thước đồng đều, không sai lệch nhau quá. Nếu chất nạp được
nghiền quá mịn nó sẽ dễ bị vón cục và chỉ cho hơi nước đi qua một vài khe nhỏ do hơi
nước tự phá xuyên lên. Như vậy, phần lớn chất nạp sẽ không được tiếp xúc với hơi nước.
Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược
lại vào lớp nước nằm bên dưới gây hư hỏng thất thoát. Tốc độ chưng cất trong trường
hợp này không quan trọng như chưng cất bằng nước. tuy nhiên, tốc độ nhanh sẽ có lợi
vì ngăn được tình trạng quá ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất. Về sản lượng
tinh dầu mỗi giờ, người ta thấy nó khá hơn phương pháp chưng cất bằng nước nhưng
vẫn kém hơn phương pháp chưng cất bằng hơi nước sẽ đề cập sau. So với phương pháp
chưng cất bằng nước, ưu điểm của nó là ít tạo ra sản phẩm phân hủy. Do đó, dù với thiết
bị nào đi nữa, ta phải đảm bảo chỉ có phần đáy nồi được đốt nóng và giữ cho phần vỉ
không tiếp xúc với nước sôi. Khuyết điểm chính của phương pháp là do thực hiện ở áp
suất thường, nên cấu phần có nhiệt độ sôi cao sẽ đòi hỏi một lượng rất lớn hơi nước để
hóa hơi hoàn toàn; như vậy sẽ tốn rất nhiều thời gian. Về kỹ thuật, khi xong một lần
chưng cất, nước ở bên dưới vỉ phải được thay thế để tránh cho mẻ sản phẩm sau có mùi.
1.4.1.3. Chưng cất bằng hơi nước [18]
Hơi nước tạo ra từ lò hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa thẳng
vào bình chưng cất. Điểm ưu việc của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh
được áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm, nhưng phải giữ ở nhiệt độ
nhất định để tinh dầu không bị phân hủy. Việc sử dụng phương pháp này cũng lệ thuộc
vào những điều kiện hạn chế như đã trình bày ở hai phương pháp chưng cất nói trên
cộng thêm hai yếu tố nữa là yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm. Nếu quá nóng
nó có thể phân hủy những cấu phần có nhiệt độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô lại khiến
quá trình thẩm thấu không xảy ra. Do đó trong thực hành, nếu dòng chảy của tinh dầu
ngưng lại quá sớm, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong thời gian
cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới dùng hơi nước quá nhiệt.
Còn trong trường hợp hơi nước quá ẩm, sẽ đưa đến hiện tượng ngưng tụ, phần chất nạp
phía dưới sẽ bị ướt, người ta sẽ phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi.

Trong công nghiệp, hơi nước trước khi đưa vào bình chưng cất phải đi qua bộ phận
tách nước. với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng, nên tốt
nhất là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc.
Không có một quy tắc chung nào cho mọi loại nguyên liệu vì chất nạp đòi hỏi một kinh
nghiệm và yêu cầu khác nhau. Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ thuộc vào đặc tính
của tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất.
1.5. Phương pháp định tính thành phần trong dịch chiết lá Trầu không bằng
các phản ứng và thuốc thử
Tiến hành định tính một số thành phần hoá học trong dịch chiết lá Trầu không:
- Định tính nhóm Anthranoid bằng phản ứng Borntraeger.
- Định tính nhóm Steroid – triterpenoid bằng: Thuốc thử Salkowski, Liebermann –
Burchard, Rosenthaler,...
- Định tính alkaloid bằng: Thuốc thử Mayer, Wagner.
- Định tính nhóm flavonoid bằng: Dung dịch FeCl3 bão hoà, H2SO4 đặc.
- Định tính nhóm saponin bằng khả năng tạo bọt, định tính chỉ số tạo bọt.
- Định tính nhóm tanin bằng: dung dịch FeCl3
1.6. Các phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) dùng để
xác định thành phần trong tinh dầu [5]
1.6.1. Phương pháp sắc ký khí (GC) [5]
- Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong tinh dầu sẽ bị hấp thụ trên pha
tĩnh của cột phân tách nên có thời gian lưu khác nhau.
- Trong sắc ký khí, pha động (hay là pha chuyển động) là một khí mang, thường là
một khí trơ như Heli hoặc một khí không hoạt động như Nitơ. Pha tĩnh là một vi lớp
chất lỏng hoặc polyme được phủ trên một lớp rắn đặt trong một ống thủy tinh hoặc kim
loại được gọi là cột (tương tự cột tách phân đoạn được sử dụng trong chưng cất). Thiết
bị được dùng để tiến hành sắc ký khí được gọi là máy sắc ký khí (hoặc là máy tách khí
hoặc máy ghi khí). Các hợp chất ở dạng khí cần phân tích sẽ tương tác với thành cột –
được phủ bởi pha tĩnh, dẫn đến từng hợp chất được tách ra tại những thời điểm khác
nhau – gọi là thời gian lưu của hợp chất. Khi các chất hóa học đi ra ở cuối cột, sẽ được
phát hiện và xác định bằng điện tử. Ngoài ra, một số thông số khác có thể được sử dụng
để thay đổi thứ tự hoặc khoảng thời gian lưu: tốc độ dòng khí mang, chiều dài cột và
nhiệt độ. Phân tích bằng sắc ký khí dựa trên việc so sánh thời gian lưu này.

- Trên sắc ký đồ ta thu được các tính hiệu tương ứng với các cấu tử cần tách gọi là
peak. Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trong cho chất cần tách (định tính). Còn
diện tích của peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu.
 Điểm khác nhau giữa sắc ký khí và các phương pháp dùng sắc ký khác (sắc ký
cột, HPLC, TLC):
- Quá trình tách các hợp chất trong một hỗn hợp được tiến hành giữa một pha
lỏng tĩnh và một pha khí động, trong khí đó ở sắc ký cột pha tĩnh ở dạng rắn và pha động
ở dạng lỏng.
- Cột mà pha khí đi qua được đặt trong lò cột có thể điều chỉnh được nhiệt độ khí,
trong khí đó ở sắc ký cột (điển hình) không có sự điều chỉnh nhiệt độ đó.
- Nồng độ của một hợp chất ở pha khí chỉ phụ thuộc vào áp suất bay hơi của khí.
 So sánh Sắc ký khí với chưng cất phân đoạn:
 Giống nhau: cả hai quá trình này đều tách các hợp chất từ một hỗn hợp
chủ yếu dựa vào sự khác biệt của điểm sôi (hoặc áp suất bay hơi).
 Khác nhau: chưng cất phân đoạn thường được dùng để tách các hợp chất
từ một hỗn hợp ở qui mô lớn còn sắc ký khí được sử dụng ở qui mô nhỏ hơn nhiều (tức
là mức độ vi lượng).
Sắc ký khí đôi khi còn được hiểu là sắc ký pha hơi (VPC) hoặc sắc ký phân đoạn
khí – lỏng (GLPC). Nói một cách chính xác, GLPC là thuật ngữ chính xác nhất và do
vậy được nhiều tác giả sử dụng.
Các thành phần của máy sắc ký khí:
Hình 1. 2: Hệ thống sắc ký khí GC (Gas Chromatography)

 Nguyên lý hoạt động:

- Nhờ có khí mang trong chứa trong bơm khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng
bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buông điều nhiệt. quá trình sắc ký xảy ra tại
đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào
detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. tín hiệu này được khuyến đại rồi
chuyển sang bộ ghi, tính phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi
chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả. Trên sắc ký đồ nhận được, sẽ có tín hiệu ứng với
các cấu tử được tách gọi là peak. Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng cho chất
cần phân tích diện tích peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần
nghiên cứu.
- Sắc ký đồ là tập hợp tất cả các peak, mỗi peak đại diện cho mỗi chất. Dựa vào
thời gian lưu ta có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi peak ta xác định được
thành phần mỗi chất trong hỗn hợp.
Hình 1. 3: Sắc ký đồ
 Ứng dụng: chủ yếu của sắc ký khí bao gồm kiểm tra độ tinh sạch của một chất
cụ thể, hay tách các chất khác nhau ra khỏi một hỗn hợp (khối lượng của các chất này
cũng có thể được xác đinh một cách tương đối). Trong một số trường hợp, kỹ thuật sắc
ký khí có thể dùng để xác định một hợp chất nào đó. Trong sắc ký điều chế, phương
pháp ký khí được sử dụng để tinh chế các hợp chất từ một hỗn hợp.
1.6.2. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) [5]
Hệ thống sắc ký khí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị
sắc ký khí nối với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bỏ khí mang N2, He để giảm
áp suất của dòng áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa
của khối phổ. Phần thiết bị sắc ký dùng mao quản, phần khối phổ sử dùng buồng ion

hóa với bộ tách từ cực và detector khối phổ.

 GC – MS bao gồm:
 Sắc ký khí (GC): sắc ký khí là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích, các chất
dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.
 Khối phổ (MS): khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét
nghiệm được ion hóa và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân không cao (10 –
6mmHg). Sau quá trình ion hóa, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một
điện trường, được tách trong một từ trường theo tương quan giữa khối lượng và
điện tích của chúng và được ghi nhận theo cường độ của các hạt đó. Dùng để xác
định định tính và định lượng.
Hình 1. 4: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)
 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động:

- Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được
tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là
helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí.
- Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò
này dao động từ 40 – 320oC.
- Cột (cloumn):
 Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt
trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân
tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
 Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây
chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ lọc

lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua.
Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này
sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ là một
biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.
- Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và
đưa ra kết quả khối phổ.
 Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ:
- Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất
hiện trong phổ đồ.
- Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân
tử cũng như ion mảng.
- Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định.
1.7. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn [17]
1.7.1. Phương pháp khuếch tán đĩa
Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al
(2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB
đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở
nhiệt độ 370C. Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200μL dịch khuẩn,
nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB
đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6mm sao cho mỗi giếng cách nhau 2-
3 cm. Chuẩn bị tinh dầu thử bằng cách hòa tan tinh dầu trong Dimethyl Sulfoxide
(DMSO 2%), TWEEN 80 0,2% thành các nồng độ theo yêu cầu. Bổ sung 50μL dịch
chiết thử vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng
trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn;
sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng
sinh ( Ampicilin 10𝜇g/ml, Tetracyclin 30 𝜇g/ml, Amoxilin 10𝜇g/ml); đối chứng âm là
DMSO 2% và TWEEN 80 0,2%. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo
bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D =
đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch (giếng). Thí nghiệm được
lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình.

1.8. Giới thiệu một số chủng vi khuẩn [2], [6], [16]

Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng hình
ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực
phẩm vào năm 1955. Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực
phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực
phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.
Theo phân loại khoa học, Bacillus cereus thuộc:
– Giới (Kingdom): Bacteria
– Ngành (Division): Firmicutes
– Lớp (Class): Bacilli
– Bộ (Order): Bacillales
– Họ (Family): Bacillaceae
– Giống (Genus): Bacillus
– Loài (Species): Bacillus cereus
Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5 - 1,5 µm x 2 - 4 µm. Vi
khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động.
Hình 1. 5: Vi khuẩn Bacilus cereus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MP
Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức
ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
 Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi,
sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50 0C, tối ưu 35 – 40 0C, độ pH 4,5 - 9,3, thích hợp 7
- 7,2.
+ Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
+ Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
+ Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh
có vòng sáng.

+ Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung
quanh có vòng sáng.
+ Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn
 Tính chất sinh hóa:
+ Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí,
không lên men mannitol.
+ Khử nitrat thành nitrit.
+ Phản ứng VP (+)
+ Phân giải Tyroxin
+ Catalase (+), Citrate (+)
+ Mọc trên NB + 0,001% lyzozym
 Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố
+ Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên
thịt, rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột
gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.
+ Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm
nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân
hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
b) Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập
từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của
lịch sử ngành vi sinh vật học.
Phân loại khoa học:
– Giới (Kingdom): Eubacteria
– Ngành (Division): Firmicutes
– Lớp (Class): Bacilli
– Bộ (Order): Bacillales
– Họ (Family): Staphylococcaceae
– Giống (Genus): Staphylococcus
– Loài (Species): Staphylococcus aureus

- Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò
trong y học:
+ Staphylococcus aureus (S. aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh.
+ Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da).
+ Staphylococcus saprophyticus.
Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể
sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối
ưu của S. aureus là 18 – 40 0C, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 250C, hiếu khí hay
kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở
môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh có thể có màu vàng đậm, màu
vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh
trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường
có nồng độ muối cao.
Hình 1. 6: Vi khuẩn Staphylococus aureus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MSA
Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ
phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất là khi tăng trưởng
ở 35 – 37 0C.
Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống, thường sống ký sinh vô
hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus (SA) xâm nhập
hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn
như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu,
phổi hoặc các mô khác.
 Tính chất sinh hoá và đề kháng:
+ Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác,
chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu
vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.

+ S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) chuyển hoá hydrogen peroxit thành
nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose,
sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều
mẫn cảm với novobiocine.
 Cấu trúc kháng nguyên:
+ Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở
vách tế bào.
+ Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề
mặt. Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy
nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chẩn đoán vi khuẩn.
 Độc tố - Enzym:
+ Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn
rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc
loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm
+ Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường
có nhiệt độ trên 150C hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S. aureus là
một protein ổn định nhiệt, nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 0C và có thể
tồn tại nhiệt ở 1000C trong vòng 30 – 700 phút.
+ Các enzyme ngoại bào:
• Protease phân giải protein của tế bào chủ.
• Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo
(FAME).
c) Escherichia coli
Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá trình
điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí sinh
trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn
coli). Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình nhan đề “Vi
khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học. Đến năm 1886,
sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề "Darmbakterien des
Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung".


– Ngành (Division): Proteobacteria
– Lớp (Class): Gammaproteobacteria
– Bộ (Order): Enterobacteriales
– Họ (Family): Enterobacteriaceae
– Giống (Genus): Escherichia
– Loài (Species): E.coli
Escherichia coli là một loại vi khuẩn gram âm, kỵ khí không bắt buộc, vi khuẩn
có hình roi thường tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu nóng.
Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm
trùng sinh mủ.
Hình 1. 7: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi và trên môi trường thạch EMB
Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn E coli
có hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μm đến 5 μm. Một số loài có thể di
chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động. Chúng không
thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác.
Sinh trưởng ở 15 – 40 0C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, pH từ 6,4 – 7,4.
Mọc tốt trên môi trường thạch EMB, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn,
ướt, hồng tím khoảng 2 – 3 mm.
 Tính chất sinh hóa và đề kháng:
+ Có thể lên men chuyển hóa đường thành acid lactic
+ Hầu hết các loại vi khuẩn E coli đều có khả năng nitrat thành nitrit, sinh hơi.
+ Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun ở 1000C trong 2 giờ
+ Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%
+ Bị hủy bởi formol 5%
+ Rất độc, chỉ cần 0,05mg có thể giết chuột nhắc trong vòng 24 giờ.

 Độc tố:
+ Một số E. coli sản sinh ra độc tố có tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể
dẫn đến bệnh nặng. Các E. coli sản sinh ra độc tố Shiga này đôi khi được gọi là STEC
(phát âm là "S-TECK").
+ Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm
hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến triển
thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ gia tăng.
+ Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận
khác trong cơ thể.
d) Salmonella
Được phân lập lần đầu vào năm 1880 bới Karl J. Erberth, S. typhi là một mầm bệnh
đa cơ quan sinh sống ở các mô tuyến giao cảm của ruột non, gan, lá lách và máu của
người nhiễm bệnh.
– Bộ (Order): Enterobacteriales
– Họ (Family): Enterobacteriaceae
– Giống (Genus): Salmonella enterica typhi
Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi,
không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường
kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi.
Phát triển tốt ở 6 – 42 0C, thích hợp nhất là 35 – 37 0C, pH từ 6 - 9, thích hợp nhất
là 7,2. Ở nhiệt độ 18 – 40 0C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.
Hình 1. 8: Vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi và trên môi trường XLD

Trên môi trường phân lập XLD khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen,
môi trường chuyển sang màu vàng.
+ Lên men đường manit, sorbitol (+)
+ Không lên men đường lactose, sucrose, salicin, inositol (-)
 Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiêt ra 2 loại độc tố:
+ Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây
độc thần kinh, hôn mê, co giật.
+ Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion
rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10 lần, sau
cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố tác động
vào thần kinh và ruột.
e) Pseudomonas aeruginosa
– Bộ (Order): Pseudomonadales
– Họ (Family): Pseudomonadaceae
– Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ
biến gây bệnh ở động vật và con người. Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật
trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Vi khuẩn không chỉ phát triển
trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít
khí ôxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo.
Hình 1. 9: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi và trên môi trường MP

Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que với khả năng di chuyển một
cực. Ngoài việc một là mầm bệnh cơ hội cho con người, P. aeruginosa còn được biết
đến như là mầm bệnh cơ hội cho thực vật.
 Phản ứng dương tính với catalase, citrate, oxidase, …
 Phản ứng âm tính với các thử nghiệm MR (Methyl Red), VP (Voges Proskauer)
và indole
 Khả năng khử nitrate thành nitrite, hóa lỏng dung dịch có chứa gelatin
 Khả năng thủy phân casein và tạo enzyme lipase nhưng lại không thủy phân được
tinh bột
 Không có khả năng lên men glucose và lactose để tạo acid
 Độc tố:
+ Lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng
chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu
vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu,
và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người. Vi khuẩn cũng được phát hiện trên
các dụng cụ y khoa, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên
nhân gây ra viêm chân lông.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Đối tượng, dụng cụ thiết bị và hóa chất, phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Hình 2. 1: Lá Trầu không
- Nguyên liệu sử dụng chiết tinh dầu trong nghiên cứu này là: lá Trầu không được trồng
tại xã Nghĩa Thành, Suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
- Nguyên liệu tươi, không bị nấm mốc, đạt độ trưởng thành và không bị sâu bệnh.
2.1.2. Dụng cụ thiết bị và hóa chất
a) Dụng cụ thiết bị
Bảng 2. 1: Bảng dụng cụ thiết bị
Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng

Nồi inox dung tích 5 lít 1 Nhiệt kế 1
Ống sinh hàn ruột thẳng 1 Đũa thủy tinh 1
Bộ Clevenger 1 Phễu chiết (250ml) 1
Cân phân tích (0.001g) 1 Ống đong (500ml) 1
Bình định mức(500ml) 1 Erlen (150ml) 2
Tủ lạnh 1 Cốc thủy tinh (500ml, 5
250ml,100ml)
Bếp điện 1 Bóp cao su 1
Đĩa petri 20 Pipet ( 10ml, 5ml) 2
Giấy tròn kháng khuẩn 50 lỗ Ống nghiệm 20
Ống tiêm 1ml/1cc 3 Màng bọc thực phẩm 1 cuộn

b) Hóa chất:
- Nước cất - Tween 80 0,2%
- Na2SO4 khan - I2
- Mueller Hinton Agar (MHA) - KI
- DMSO 2% - HCl 4N
- Tryptic Soy Broth (TSB) - FeCl3 20%
- Potato Dextrose Agar (PDA) - NaOH 10%
- Mueller Hinton Broth (MHB) - H2SO4đđ
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
Để đạt được mục đích đặt ra của đề tài, đề tài nghiên cứu dựa trên các bài báo
nghiên cứu khoa học khác, nội dung nghiên cứu như sau:
- Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước với các
điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian ngâm và thời gian chưng cất.
- Nghiên cứu phương pháp xác định chỉ tiêu hóa – lý của tinh dầu.
- Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong tinh dầu trầu không dựa trên kết quả các
bài nghiên cứu khoa học khác, nghiên cứu phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS.
Như mục tiêu đề tài đã đưa ra thì phương pháp chiết xuất tinh dầu bằng phương
pháp chưng cất hơi nước cổ điển là phương pháp chiết xuất tinh dầu phổ biến nhất được
áp dụng nhiều nhất trong công nghiệp hiện nay.
2.2. Xử lý nguyên liệu
Lá Trầu không khi thu hoạch chọn lá già, tươi, đạt độ trưởng thành, không bị sâu
bệnh, nấm mốc và được hái vào sáng sớm. Sau đó, đem đi rửa sạch, để ráo nước và cắt
nhỏ. Đem đi cân chính xác 500g rồi cho vào nồi chưng cất.

2.3. Dự kiến quy trình chiết xuất tinh dầu trầu không
Sơ đồ 2. 1: Quy trình công nghệ chiết tách tinh dầu lá Trầu không
 Thuyết minh quy trình:

Lá Trầu không được rửa sạch, cắt nhỏ sơ bộ, cho vào nồi chưng cất chứa nước cất,
đậy kín, ngâm trong khoảng thời gian thích hợp.
Tiến hành chưng cất hỗn hợp nguyên liệu đã chuẩn bị. Hỗn hợp hơi nước và tinh
dầu sẽ bay hơi và ngưng tụ nhờ ống sinh hàn, hỗn hợp được chứa trong cột của thiết bị
Clevenger. Để yên tinh dầu và nước sẽ phân lớp, nước ở phía dưới và tinh dầu ở phía
trên, khi cột đầy thì xả bớt phần nước ngưng đi, tinh dầu vẫn giữ lại trong cột ngưng tụ.
Khi thu tinh dầu ta nên bỏ một ít trước và sau khi thu, vì lượng tinh dầu đó còn lẫn
một ít nước ngưng, sẽ làm tinh dầu bị lẫn tạp chất, không tinh khiết dẫn đến ảnh hưởng
đến xác định hợp chất và công thức.
Thêm Na2SO4 khan vào bình chứa tinh dầu thô, vừa thêm vừa khuấy đều cho đến

khi các tinh thể Na2SO4 bắt đầu rời ra. Để yên cho đến khi tinh dầu nổi lên trên, rồi cho
vào bình chiết, chiết lấy phần tinh dầu đã loại được nước.
Tinh dầu thu hồi được cho vào lọ tối màu, tránh ánh sáng chiếu vào. Các tia UV
trong ánh sáng làm phá vỡ các phân tử, thúc đẩy hình thành các gốc tự do gây ảnh hưởng
đến chất lượng tinh dầu. Khi tinh dầu tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím một số chất trong
tinh dầu tăng lên và một số chất giảm đi đáng kể.
Hình 2. 2: Hệ thống chưng cất tinh dầu lá Trầu không tại

phòng thí nghiệm
2.4. Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tinh dầu
2.4.1. Khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu
 Mục đích: Nước có tác dụng thẩm thấu vào các mô nguyên liệu, sau đó
sẽ hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn các hợp chất hữu cơ trong tinh dầu, có tác dụng phá
vỡ hệ keo trong tinh dầu, tạo điều kiện cho tinh dầu thoát ra ngoài dễ dàng. Nếu thể tích
dung môi quá ít sẽ làm tinh dầu khuếch tán không tốt vào trong dung dịch làm cho thời
gian chưng cất kéo dài và thời gian tiếp xúc nhiệt càng lâu thì tinh dầu sẽ ngả vàng chất
lượng tinh dầu giảm xuống. Tỉ lệ nước nhiều hay ít đều ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi

tinh dầu.
 Thực nghiệm: Xác định lượng nước bổ sung vào khi ngâm nhằm đánh
giá khả năng phân ly tinh dầu trong nguyên liệu, đây là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng
đến hiệu quả của quá trình chưng cất. Và xác định được lượng nước bổ sung cũng quyết
định thời gian chưng cất tối ưu của sản phẩm.
Thực nghiệm này được tiến hành với lượng nước/nguyên liệu theo đổi theo các tỉ
lệ: 3/1; 4/1; 5/1; 6/1; 7/1.
Sơ đồ 2. 2: Quy trình chiết tách xác định tỷ lệ nước/nguyên liệu
 Cách tiến hành: Cân 500g lá trầu đã xử lý sau đó cắt nhỏ, thêm vào đó lượng
nước, trong đó tỷ lệ nước/nguyên liệu thay đổi lần lượt là: 3/1; 4/1; 5/1; 6/1; 7/1(v/w).
Ngâm trong khoảng 1 giờ nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa lá với môi trường nước thúc
đẩy quá trình khuếch tán của tinh dầu. Sau đó, chuyển toàn bộ vào nồi chưng cất và lắp
đặt hệ thống chưng cất hỗn hợp trong 4 giờ dưới áp suất khí quyển. Đọc thể tích tinh
dầu thu được trong cột ngưng tụ (có chia vạch thể tích) và so sánh thể tích tinh dầu thu
được ở những lần thay đổi thể tích khác nhau. Từ đó, chọn tỷ lệ nước/nguyên liệu tối ưu
nhất.

2.4.2. Khảo sát thời gian ngâm hỗn hợp

 Mục đích: Thời gian ngâm là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thể
tích tinh dầu thu được bởi sự thẩm thấu của nước hay sự khuếch tán của các cấu tử tinh
dầu ra môi trường không thể thực hiện được tức thời, mà phải cần một khoảng thời gian
nhất định.
Sau khi xác định tỉ lệ nước/nguyên liệu thích hợp, dung dịch sẽ được ngâm chung
với lá trầu.
 Thực nghiệm: Xác định thời gian ngâm nhằm tìm ra thời gian mà lượng
tinh dầu khi chưng cất được nhiều nhất
Thực nghiệm này được tiến hành theo thời gian ngâm thay đổi lần lượt là: 1h;
1,5h; 2h; 2,5h; 3h.
Sơ đồ 2. 3: Quy trình chiết tách xác định thời gian ngâm
 Cách tiến hành: Lấy 500g lá trầu đã xử lý sau đó cắt nhỏ, thêm vào một lượng
nước với tỷ lệ nước/nguyên liệu được chọn ở lô thực nghiệm này là: 4/1 (v/w). Sau đó
ngâm nguyên liệu trong các giờ cần khảo sát (mỗi giờ làm một mẻ riêng) và chuyển vào
nồi chưng, lắp hệ thống chưng cất hỗn hợp trong 4 giờ dưới áp suất khí quyển. Hỗn hợp
sau khi được gia nhiệt sẽ bay hơi và đi qua ống sinh hàn. Tại đây, tinh dầu ngưng tụ khi
hơi gặp lạnh, rồi phân thành hai lớp: lớp trên là tinh dầu, lớp dưới là nước. Đọc thể tích

tinh dầu thu được trong cột ngưng tụ (có chia vạch thể tích) và so sánh thể tích tinh dầu
thu được ở những lần thay đổi thời gian ngâm khác nhau. Từ đó, chọn thời gian ngâm
tối ưu nhất.
2.4.3. Khảo sát thời gian chưng cất hỗn hợp
 Mục đích: thời gian chưng cất có vai trò quyết định lượng tinh dầu thu
được. Nếu chưng cất trong thời gian quá ngắn thì lượng tinh dầu trích ly chưa hết hoàn
toàn hay nó vẫn tồn tại trong tế bào, làm giảm thể tích tinh dầu thu được. Ngược lại, nếu
chưng cất trong thời gian quá dài, thì vừa tốn thời gian, vừa tốn hao năng nượng và tinh
dầu sẽ bị biến đổi màu lẫn mùi, chất lượng giảm đi rất nhiều.
 Thực nghiệm: Xác định thời gian chưng cất nhằm tìm ra thời gian mà
lượng tinh dầu khi chưng cất được nhiều nhất, tránh lãng phí thời gian nghiên cứu, cũng
như tiêu hao điện khi gia nhiệt.
Thực nghiệm này được tiến hành theo thời gian chưng cất thay đổi lần lượt là: 180
phút; 210 phút; 240 phút; 270 phút; 300 phút.
Sơ đồ 2. 4: Quy trình chiết tách xác định thời gian chưng cất
 Cách tiến hành: Lấy 500g lá trầu đã xử lý sau đó cắt nhỏ, thêm vào một lượng
nước với tỷ lệ nước/nguyên liệu được chọn ở lô thực nghiệm này là: 4/1 (v/w). Sau đó
ngâm nguyên liệu trong 1,5 giờ đã chọn ở lô thực nghiệm trước và chuyển vào nồi
chưng, lắp hệ thống chưng cất hỗn hợp trong 180 phút; 210 phút; 240 phút; 270 phút;

300 phút dưới áp suất khí quyển. Hỗn hợp sau khi được gia nhiệt sẽ bay hơi và đi qua
ống sinh hàn. Tại đây, tinh dầu ngưng tụ khi hơi gặp lạnh, rồi phân thành hai lớp: lớp
trên là tinh dầu, lớp dưới là nước. Đọc thể tích tinh dầu thu được trong cột ngưng tụ (có
chia vạch thể tích) và so sánh thể tích tinh dầu thu được ở những lần thay đổi thời gian
chưng cất khác nhau. Từ đó, chọn thời gian chưng cất tối ưu nhất.
2.5. Phương pháp xác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không
2.5.1. Đánh giá cảm quan
Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan dựa trên việc quan sát
những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc và độ trong suốt.
 Màu sắc và độ trong suốt: xác định bằng cách cho tinh dầu vào một ống
thủy tinh trong suốt không màu có dung tích 20 ml, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi
nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt. Nếu tinh dầu còn vẩn đục và
không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.
 Mùi: là một trong nhữ ng biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tời giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay
rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận
xét về bản chất và cường độ mùi.
 Vị: là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh
dầu có vị riêng. Để xác định vị dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất
(ngọt, đắng, …) và cường độ vị (dịu, thoảng, …)
2.5.2. Xác định tỷ trọng
- Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số của khối lượng tinh dầu ở 25oC với khối lượng của
cùng một thể tích nước cất cùng ở nhiệt độ 25oC.
 Cách tiến hành: Cân ống tiêm có vạch chia chuẩn dung tích 1ml chính
xác tới 0,001g được kết quả G. Lấy ống tiêm ra, hút nước cất vào đến vạch 0,1ml
(chú ý trong quá trình tiến hành đừng để có bọt khí trong ống) đem ống tiêm ổn nhiệt
ở 25oC khoảng 30 phút, đem đi cân được kết quả G1. Sau đó, đổ hết nước đi, vẩy cho
khô. Hút tinh dầu vào ống tiêm cũng đến vạch 0,1ml. Đặt ống tiêm ổn nhiệt ở 25oC
rồi đem cân được kết quả G2. Tiến hành 3 lần, ghi giá trị trung bình.
 Tính kết quả:

𝐺− 𝐺2
d=
𝐺−𝐺1
G: Khối lượng của ống tiêm không, (g).
G1: Khối lượng của ống tiêm khi có nước, (g).
G2: Khối lượng của ống tiêm khi có tinh dầu, (g).
Sau khi xác định tỷ trọng của tinh dầu, tiến hành xác định một số chỉ số hóa lý.
Các chỉ số đều được xác định trên tinh dầu vừa tách đượ c.
2.6. Phương pháp định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
 Định tính Alkaloids
Cho vào ống nghiệm 3ml dịch chiết, sau đó cho từ từ thuốc thử theo thành ống
nghiệm để yên, quan sát. Dùng thuốc thử Wagner.
Thuốc thử Wagner:
- I2 1,27g
- KI 2g
- H2 O vừa đủ 100 ml
 Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
 Định tính Flavonoids
Cho 3 ml dịch chiết vào trong 2 ống nghiệm. Phương pháp này gồm thử nghiệm với
dung dịch NaOH 10% và thử nghiệm với dung dịch FeCl3[11].
- Thử nghiệm NaOH 10%: Thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% vào 3 ml hỗn hợp rồi
lắc đều. Nếu thấy xuất hiện dung dịch màu vàng rồi chuyển sang không màu nếu cho
acid hydrochloric vào chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoids trong dịch chiết.
- Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 bão hòa vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc
đều. Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn tại flavonoids
trong dịch chiết.
 Định tính Anthraquinones
Phản ứng Bomtra eger:
- Dịch chiết 10ml
- HCl 4N 4ml
- FeCl3 20% 4ml

Lắc với 5ml ether, lấy lớp dịch ở trên. Hút 1ml dịch vừa chiết được cho vào ống
nghiệm, thêm từ từ từng giọt đến hết 1ml dung dịch NaOH 10% lắc nhẹ. Phản ứng
dương tính khi lớp kiềm có màu đỏ sim.
 Định tính Steroid
Cho 3 ml dịch chiết vào trong 2 ống nghiệm. Phương pháp này thử nghiệm với thuốc
thử Salkowski.
Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nhỏ từ từ vào 3ml dịch chiết
 Nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính.
 Định tính Saponin
- Thử nghiệm 1: Lấy 1ml dịch chiết cho vào 2 ml dung dịch NaCl rồi lắc đều sau
đó hút 2 ml hỗn hợp cho vào ống nghiệm rồi thêm 3 giọt máu động vật bằng ống tiêm
rồi nhẹ nhàng đảo ngược ống (không tạo rung) và để yên trong 15 phút. Sự lắng xuống
của các tế bào hồng cầu chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong dịch chiết [9].
- Thử nghiệm 2: Lấy 3ml dịch chiết hòa tan trong một ít nước cất sau đó lắc
mạnh trong 30 giây và để yên hỗn hợp trong vòng 30 phút. Nếu có sự hình thành của
bọt khí không tan chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong dịch chiết [9].
 Định tính Tanin
Lấy 2ml dịch chiết hòa tan trong 10 ml dung dịch cồn 50%. Hút 4ml hỗn hợp vừa
pha cho vào ống nghiệm:
- Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào phần thứ nhất, màu sắc
của mẫu chuyển sang màu xanh lam hoặc màu xanh đen đậm chứng tỏ mẫu có tồn tại
tannin [10].
2.7. Phương pháp xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu [5]
Tinh dầu sau khi chưng cất, để lắng hỗn hợp trong ống ngưng tụ đến khi tách hẳn
thành 2 pha riêng biệt. Pha nằm phía trên là tinh dầu, pha phía dưới là nước. Đọc thể
tích tinh dầu trên ống ngưng tụ có vạch đo thể tích. Rồi tiến hành xác định tỉ lệ khối
lượng tinh dầu tách chiết được.
Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu được theo công thức:
𝑉𝑇𝐷 .𝑑𝑇𝐷
η =
𝑚𝑁𝐿

Trong đó:
η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%)
𝑉𝑇𝐷 : thể tích tinh dầu thu được (ml)
𝑑 𝑇𝐷 : tỷ trọng của tinh dầu (g/ml)
𝑚𝑁𝐿 : khối lượng nguyên liệu đem đi chưng (g)
2.8. Phương pháp xác định, định danh các cấu tử, thành phần hóa học có trong
tinh dầu lá Trầu không
Phát hiện sự có mặt của các cấu tử có trong tinh dầu lá Trầu không tại Viện Hàn
Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam trên thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ. Việc
định danh các thành phần trong tinh dầu được thực hiện bằng cách dùng phần mềm cài
đặt sẵn trên máy để so sánh các phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử tách ra trên sắc
ký đồ với các phổ chuẩn có trong thư viện phổ.
Mức độ phù hợp giữa các chất có trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị được tính
bằng đại lượng tương thích. Độ tương thích càng cao thì kết quả định danh càng chính
xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hoàn toàn giống với phổ khối của một chất
chuẩn trong thư viện thì độ tương thích là được biểu thị là 1.000. Độ tương thích đạt
trên 800 được xem là cho kết quả có độ tin cậy cao.
2.9. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương
pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [7]
- Môi trường: Môi trường tăng sinh và tồn trữ TSB, môi trường thử hoạt tính kháng
khuẩn MHA.
- Chuẩn bị độ đục McFarland 0,5: độ đục này được chế bằng cách lấy 0,5ml BaCl2
0,48M trộn đều với 99,5ml H2SO4 0,35N; rồi phân chia ra các ống có đường kính tương
tự các ống nghiệm chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn. Các ống này phải được hàn kín, để ở chỗ
tối trong tủ lạnh và có thể sử dụng được trong vòng 6 tháng. Độ đục này tương ứng với
108CFU/ml (Colony Forming Unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc).
- Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:
 Dung dịch 2% tinh dầu: tinh dầu được hòa tan trong DMSO 2% và TWEEN 80
- 0,2% với các nồng độ khác nhau là: 1024 µl/ml, 512 µl/ml, 256 µl/ml, 128 µl/ml.
 Dung dịch đối chứng âm gồm DMSO 2% và Tween 80 – 0,2% (tỷ lệ 1:1)

 Dung dịch đối chứng dương gồm các kháng sinh: Ampicilin 10𝜇g/ml, Tetracyclin
30𝜇g/ml, Amoxilin 10𝜇g/ml.
- Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:
 Các loại vi khuẩn sử dụng xác định hoạt tính kháng khuẩn: gồm ba chủng Gram
âm (Salmonella typhi - ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027,
Escherichia coli – ATCC 25922); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus -
ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005).
 Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch MHA, vi khuẩn được tồn trữ trong
ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 40C. Từ ống tồn trữ, chọn 2 - 3 khuẩn lạc đưa vào
ống nghiệm chứa 5ml môi trường TSB đã khử trùng, nuôi cấy tĩnh ở 370C (riêng
Staphylococcus aureus nuôi trong 24h). Huyền phù vi sinh vật sau đó được ly tâm tách
sinh khối và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0,5 Mc Farland
(nếu đục quá thì cho thêm nước cất, còn chưa đục thì cho thêm vi khuẩn), ta được hỗn
dịch vi khuẩn khoảng 108CFU/ml.
- Tiến hành:
 Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau
đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đĩa giấy 6mm vô
trùng được thấm bão hòa dung dịch 2% tinh dầu và lấy ra đặt lên mặt thạch đã cấy chang
vi khuẩn, đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối
chứng âm, các đĩa xung quanh thấm dung dịch tinh dầu 2% và dung dịch đối chứng
dương là kháng sinh. Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (100C) khoảng 4 – 8 giờ để tinh
dầu khuếch tán ra thạch. Sau đó đem nuôi ở 370C trong 16 – 18 giờ, riêng
Staphylococcus aureus nuôi trong 24giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô
khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) được xác định bằng đường kính vòng kháng
ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy. Mỗi nồng độ được lập lại 3 lần. đường kính vòng
kháng khuẩn được đo bằng đơn vị mm. [10]

Hình 2. 3: Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009)
2.10. Phương pháp xử lí số liệu

- Xử lí số liệu bằng phần mềm MS Excel 2016
- Vẽ đồ thị bằng phần mềm MS Excel 2016
- Tính toán tỷ trọng bằng máy tính cầm tay Casio 570FX

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu
3.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ nước/nguyên liệu thích hợp
Bảng 3. 1: Các thông số sử dụng để khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu
STT Tên thông số Giá trị thông số
1 Tỷ lệ nước/nguyên liệu Khảo sát
2 Thời gian ngâm 60 phút
3 Thời gian chưng cất 240 phút
Tỷ lệ dung môi được chọn theo điều kiện Vdung môi > Vngưng, vậy thể tích ngưng
trung bình trong quá trình chưng cất ở các điều kiện trước là luôn lớn hơn 500ml, nên
chọn tỷ lệ khảo sát bắt đầu là 3/1, cho đến khi lượng tinh dầu thu được giảm dần.
Bảng 3. 2: Kết quả khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu
Tỷ lệ (ml/g) 3/1 4/1 5/1 6/1 7/1

Lượng tinh
1,2ml 1,3ml 1ml 0,8ml 0,7ml
dầu
 Các dữ liệu ở bảng 3.2: Cho thấy rằng quá trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không
thì tỉ lệ dung môi khảo sát được tối ưu là 4/1.
1.4 1.3
1.2
Lượng tinh dầu thu được (ml)
1.2
1
1
0.8
0.8 0.7
0.6
0.4
0.2
0
3/1 4/1 5/1 6/1 7/1
Tỉ lệ nước/nguyên liệu Lượng tinh dầu thu được
 Biểu đồ 3. 1: Thể hiện tinh dầu thu được phụ thuộc vào tỷ lệ nước/nguyên liệu
 Qua biểu đồ 3.1: Ta có nhận xét lượng tinh dầu thu được phụ thuộc

vào lượng nước vừa đủ. Quá trình đạt hiệu suất cao nhất ở tỷ lệ 4/1. Nếu lượng
nước càng nhiều thì khả năng tạo nhủ tương của tinh dầu với nước càng cao,
chất lượng tinh dầu giảm xuống do nhiều thành phần phân cực tan nhiều trong
nước. Ngoài ra, lượng nước quá nhiều làm thời gian chưng sẽ lâu hơn, ở đây
ta chỉ khảo sát trong 4 giờ nên khi cho nhiều nước sẽ làm thời gian bay hơi lâu
hơn, lượng tinh dầu thu được sẽ thấp hơn.
3.1.2. Kết quả xác định thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ thu tinh dầu
Bảng 3. 3: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian ngâm
1 Tỷ lệ nước/nguyên liệu 4/1
2 Thời gian ngâm Khảo sát
3 Thời gian chưng cất 240 phút
Thời gian ngâm sẽ thay đổi từ 60 phút cho đến khi lượng tinh dầu thu được giảm
dần. Để lựa chọn được thời gian ngâm tối ưu cho quá trình chưng cất tinh dầu lá Trầu
không, ngoài biểu đồ thể hiện tỷ lệ tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian ngâm, ta
còn phải dựa vào chất lượng tinh dầu tạo ra trong quá trình chưng cất để quyết định thời
gian ngâm tối ưu cho quá trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không.
Bảng 3. 4: Kết quả khảo sát thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu
Thời gian
60 90 120 150 180
ngâm ( phút)
Lượng tinh
1,3ml 1,4ml 1,3ml 1,1ml 0,8ml
dầu

1.6
1.4
1.4 1.3 1.3
1.2 1.1
1
0.8
0.8
0.6
0.4
0.2
0
60 90 120 150 180
Thời gian ngâm Lượng tinh dầu thu được
Biểu đồ 3. 2: Thể hiện lượng tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian ngâm
 Qua biểu đồ 3.2: Ta thấy ngoài việc tỷ lệ thu tinh dầu được cao còn phải xét
đến khả năng lôi cuốn của hơi nước ở các thời gian ngâm khác nhau và chất lượng tinh
dầu. Các yếu tố này quyết định và ràng buộc lẫn nhau.
3.1.3. Kết quả xác định thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ thu tinh dầu
Bảng 3. 5: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất
1 Tỷ lệ nước/nguyên liệu 4/1
2 Thời gian ngâm 90 phút
3 Thời gian chưng cất Khảo sát
Kết quả thực nghiệm cho thấy hơi tinh dầu xuất hiện ở (60 – 80) 0C. Nhiệt độ
chưng cất pha hơi khoảng 92,50C, tại nhiệt độ này tinh dầu cuốn theo hơi nước bay lên
và ngưng tụ cùng với hơi nước, đồng thời nhiệt độ giữ ổn định trong suốt thời gian chưng
cất.
Bảng 3. 6: Kết quả khảo sát thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu
Thời gian
180 210 240 270 300
chưng (phút)
Lượng tinh
0,7ml 1ml 1,4ml 1,5ml 1,5ml
dầu

 Các dữ liệu ở bảng 3.6: Quá trình chưng cất sẽ khảo sát trong khoảng thời gian
180 – 300 phút, vì hơi nước bắt đầu bay hơi khoảng sau 120 phút tính từ lúc mở bếp đun
và sau 300 phút thì lượng tinh dầu không thay đổi nhiều do hơi nước bay lên không còn
tinh dầu nữa. Và lượng tinh dầu thu được nhiều nhất là khi chưng cất 270 phút. Lí do
không lấy số liệu ở 300 phút là vì nếu chưng thêm 30 phút nữa mà tinh dầu vẫn như cũ
thì chúng ta nên lấy số liệu ở 270 phút, chưng thêm chỉ tốn thời gian, có khi còn ảnh
hưởng đến chất lượng tinh dầu (để tinh dầu ở nhiệt độ cao trong thời gian dài sẽ làm
biến đổi một số thành phần).
1.6 1.5 1.5

1.4
1.4
Lượng tinh dầu thu được (ml)
1.2
1
1
0.8 0.7
0.6
0.4
0.2
0
180 210 240 270 300
Thời gian chưng cất Lượng tinh dầu thu được
Biểu đồ 3. 3: Thể hiện lượng tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian chưng cất
 Qua biểu đồ 3.3: Lượng tinh dầu sẽ tăng dần khi ta tăng thời gian chưng cất.
Tăng nhanh trong khoảng 180 phút đến 240 phút, sau 300 phút thì không thấy tăng thể
tích tinh dầu nữa. Vậy nên thời gian chưng cất được chọn là 270 phút.

3.2. Đề xuất quy trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không
Sơ đồ 3. 1: Quy trình hoàn thiện chiết tách tinh dầu lá Trầu không
 Thuyết minh quy trình:

Chuẩn bị nguyên liệu: Lá Trầu không đã qua chọn lọc (không sâu bệnh, nấm mốc,
đạt độ trưởng thành) đem đi rửa sạch, để ráo nước, sau đó đem cân chính xác 500g lá
và cắt nhỏ. Cho tỷ lệ nước/nguyên liệu là 4/1 (v/w). Sau đó tiến hành:
- Ngâm với nước cất: chuyển toàn bộ lá đã cắt và nước vào nồi inox của thiết bị
chưng cất, ngâm trong 90 phút.
- Chưng cất: tiến hành chưng cất dưới áp suất khí quyển, nhiệt độ hơi nước 92,50C
trong 270 phút để thu hồi tinh dầu. Hỗn hợp nước và tinh dầu bay hơi ngưng tụ ở
ống sinh hàn khi gặp lạnh. Tinh dầu và hơi nước sẽ được chứa ở bộ phận ngưng tụ
của thiết bị. để yên cho hỗn hợp phân thành hai lớp, cho lớp tinh dầu chảy qua bình
chiết được tinh dầu thô.

- Làm khan: cho Na2SO4 vào bình chiết đựng tinh dầu thô, vừa cho vừa khuấy cho
đến khi thấy các tinh thể Na2SO4 bắt đầu rời ra.
- Sản phẩm tinh dầu thu được cho vào lọ tối màu, tránh ánh sáng chiếu vào. Các tia
UV trong ánh sáng làm phá vỡ các phân tử, thúc đẩy hình thành các gốc tự
do gây ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu. Bảo quản tinh dầu ở nhiệt độ 2 –
40C.
3.3. Kết quả xác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không
3.3.1. Đánh giá cảm quan
Hình 3. 1: Mẫu tinh dầu chiết được

tại phòng thí nghiệm
a/ Màu sắc và độ trong suốt: có màu vàng nhạt, trong suốt không bị vẫn đục.
b/ Mùi: nồng, đặc trưng của tinh dầu Trầu không,
c/Vị: cay
3.3.2. Tỷ trọng
Bảng 3. 7: Kết quả trung bình cộng của ba lần cân ống tiêm để đo tỷ trọng tinh dầu
TB cộng
Ống tiêm 2,975

2,986 2,935 3,005
không(G)
Ống tiêm chứa 4,118
4,14 4,081 4,135
nước cất(G1)
Ống tiêm chứa
tinh dầu Trầu 4,013 3,97 4,023 4,002
không(G2)

𝐺−𝐺2 2,975−4,002
𝑑= = = 0,898
𝐺−𝐺1 2,975−4,118
G: Khối lượng của ống tiêm không, (g).
G1: Khối lượng của ống tiêm khi có nước, (g).
G2: Khối lượng của ống tiêm khi có tinh dầu, (g).
3.4. Kết quả định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
Để xác định sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu tinh dầu Trầu không khảo sát,
tôi tiến hành định tính một số hợp chất có trong mẫu như đã trình bày ở phần 2.8 Kết
quả ghi nhận được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3. 8: Kết quả định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
Thí nghiệm Kết quả Kết luận

1.Định tính Ankaloid
Thuốc thử Wagner

-
2.Định tính Flavonoids
Thử nghiệm NaOH 10%

+

Thử nghiệm FeCl3 +
3.Định tính
Anthraquinones
Phản ứng Bomtra eger

+
4.Định tính Steroid
Thử nghiệm H2SO4đđ +
5.Định tính Saponin
Thử nghiệm 1: +
Thử nghiệm 2: +
6.Định tính Tanin

Thử nghiệm FeCl3

+
Nhận xét: Từ 6 thử nghiệm khảo sát định tính như trình bày, có 5 thử nghiệm có
kết quả dương tính: Flavonoids; Anthraquinones; Steroid; Saponin; Tanin. Theo nghiên
cứu của Nguyễn Nho Dũng (2011) thì dịch chiết lá trầu có chứa Ankaloid, nhưng theo
nghiên cứu ở trên không có. Nguyên nhân có thể là do khác giống, khác điều kiện canh
tác, đất đai, thời tiết nên dẫn đến kết quả không có sự giống nhau.
3.5. Kết quả xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu
Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu được theo công thức:
𝑉𝑇𝐷 .𝑑𝑇𝐷 1,5 .1,046
η= = = 0,27%
𝑚𝑁𝐿 500
Trong đó:
η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%)
𝑉𝑇𝐷 : thể tích tinh dầu thu được (ml)
𝑑 𝑇𝐷 : tỷ trọng của tinh dầu (g/ml)
𝑚𝑁𝐿 : khối lượng nguyên liệu đem đi chưng (g)

3.6. Kết quả xác định thành phần hóa học của mẫu tinh dầu là Trầu không đã
được tối ưu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS
3.6.1. Sắc ký đồ tinh dầu lá Trầu không
Hình 3. 2: Sắc ký đồ của tinh dầu lá Trầu không

Nhận xét: Qua kết quả trên sắc ký đồ, tôi nhận thấy có 18 giá trị có thời gian lưu
khác nhau, điều đó có nghĩa trong mẫu tinh dầu lá Trầu không thu được có chứa 18 cấu
tử, ứng với 18 hợp chất. Các cấu tử ở những điểm peak: 14,994; 28,801; 21,47 có thời
gian lưu cách xa nhau và có cường độ tương đối lớn, chứng tỏ đây là những cấu tử có
hàm lượng cao nhất trong tinh dầu. Các cấu tử còn lại có cường độ tương đối thấp nên
có hàm lượng không đáng kể trong tinh dầu lá Trầu không. Cũng có một số cấu tử có
thời gian lưu rất gần nhau, chúng có thể là đồng phân của nhau như các cấu tử ở peak:
21,592; 21,792.

3.6.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu không
Bảng 3. 9: Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu không
Độ tương
Hàm
TT RT Tên chất Mass hợp khối
lượng
phổ
1 5.079 -Pinene 0.629 136 945
2 6.840 Eucalyptol 0.642 154 941
3 7.093 β-Ocimene 0.493 136 952
4 8.212 Linalool 0.323 154 928
5 11.899 p-Allylphenol 0.755 134 911
6 14.289 Chavicol, acetate 2.337 176 957
7 14.994 Eugenol 33.142 164 938
8 15.198 -Copaene 0.334 204 915
9 15.563 β-Elemen 0.655 204 909
10 15.736 Methyleugenol 0.274 178 923
11 16.314 Caryophyllene 3.118 204 948
12 17.140 Humulene 0.794 204 943
13 17.653 -Muurolene 2.159 204 938
14 17.802 Germacrene D 5.017 204 942
15 18.172 (+)-Bicyclogermacrene 3.041 204 910
16 18.351 β-Bisabolene 0.672 204 823
17 18.800 Aceteugenol 28.801 206 918
18 18.920 (E)--Bisabolene 0.256 204 902
19 20.233 (-)-Globulol 0.381 222 915
20 20.425 (+)-Viridiflorol 0.375 222 905
21 20.637 Rosifoliol 0.166 222 858
22 21.207 1,10-Diepicubenol 0.178 222 856
21.470 2-(Acetyloxy)-4- 234
23 14.749 901
allylphenyl acetate
24 21.592 -Cadinol 0.167 222 899
25 21.792 -Cadinol 0.543 222 911
Nhận xét: Theo bảng phân tích thành phần hóa học của mẫu tinh dầu lá Trầu không
cho thấy có tổng cộng 25 cấu tử được định danh, nhưng ở sắc ký đồ chỉ thể hiện 18 điểm
peak có tên trên biểu đồ. Có lẽ nguyên nhân là do điểm peak của các cấu tử còn lại có
cường độ quá thấp nên không thể hiện được tên của các cấu tử lên biểu đồ. Kết quả bảng
phân tích cho thấy thành phần tinh dầu của lá Trầu không tại Châu Đức, TP.Bà Rịa gồm
25 cấu tử và thành phần chính chủ yếu là: Eugenol chiếm 33,142%; Aceteugenol chiếm

28,801%; 2-(Axetyloxy)-4-allylphenyl acetate chiếm 14,749%; Germacrene D chiếm

5,017%; Caryophyllene chiếm 3,118%; (+)-Bicyclogermacrene chiếm 3,041%;
Chavicol,acetate chiếm 2,337%; 𝛾-Muurolene chiếm 2,159%.
Kết quả chạy sắc ký phổ cho thấy diện tích peak của Eugenol có diện tích lớn nhất,
vì vậy trong mẫu tinh dầu thì Eugenol là thành phần chủ yếu.
3.6.3. So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu huyện Châu Đức,
thành phố Bà Rịa với một số vùng khác đã công bố ở Việt Nam
Sau khi có kết quả thành phần hóa học tinh dầu Trầu không ở Châu Đức, Tp. Bà
rịa tôi tiến hành so sánh thành phần hóa học tinh dầu Trầu không với các vùng khác đã
công bố ở Việt Nam. Thành phần tinh dầu ở Châu Đức, Tp. Bà rịa có 25 cấu tử, thành
phần tinh dầu lá Trầu ở Hậu Giang có trên 8 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Quãng
Nam có 49 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh có 51 cấu
tử và thành phần các cấu tử được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3. 10: So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức với các vùng
khác ở Việt Nam
Hàm lượng %
STT Hợp chất
I II III IV
1 Eugenol 33,142 - - -
2 Methyleugenol 0,274 34,55 8,34 6,31
3 Aceteugenol 28,801 20,14 16,55 13,68
4 Germacrene D 5,017 - 5,21 4,12
5 𝛾-Muurolene 2,159 1,33 - -
6 𝛼-Cadiol 0,543 5,51 - -
Trong đó: (I) Trầu ở Châu Đức, Tp.BR, (II) Trầu ở Hậu Giang [3], (III) Trầu ở Quãng
Nam [1], (IV) Trầu ở Hóc Môn, Tp.HCM [1]
Nhận xét: Đối chiếu thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức
với các vùng khác ở Việt Nam tôi nhận thấy có sự khác nhau về các hợp chất trong bốn
tinh dầu ở các vùng khác nhau. Trong khi hợp chất chủ yếu của tinh dầu lá Trầu ở huyện
Châu Đức là Eugenol (33,142%) thì Methyleugenol (35,55%) là thành phần chiếm hàm
lượng cao nhất trong tinh dầu lá Trầu ở Hậu Giang; và ở Quãng Nam với Hồ Chí Minh
thì Aceteugenol lại chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là: 16,55% và 13,68%. Có sự

khác nhau trên có thể là do điều kiện khí hậu, thỗ nhưỡng và phương pháp trích ly tinh
dầu. Ngoài ba hợp chất chính của Eugenol thì còn có ba hợp chất nữa là: Germacrene
D, 𝛾-Muurolene, 𝛼-Cadiol, chứng tỏ tinh dầu tách chiết được ở phòng thí nghiệm
Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu đem phân tích tại Viện Hàn Lâm Khoa Học Và
Công Nghệ Việt Nam chính là tinh dầu Trầu không.
3.7. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp
đo đường kính vòng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của
vi khuẩn được thể hiện qua đường kính kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri được trình
bày ở bảng 3.8.
Bảng 3. 11: Đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không (mm)
P.
STT Nồng độ µl/ml B. cereus E. coli S. typhi S. areus
aeruginosa
1 1024 8,33±1,11 3,00±0,00 3,5±0,5 4,33±1,11 5,33±2,44
2 512 5,33±1,55 2,67±0,44 2,5±0,5 2,33±0,44 3,00±0,0
3 256 5,00±1,00 1,00±0,00 - 2,33±0,44 1,00±0,00
4 128 4,00±0,67 - - 1,3±1,00 -
5 Tetracyclin 2,67±0,89 4,00±0,00 5,00±0,00 8,00±0,00 6,00 ±0,00
6 Ampicilin 7,33±0,44 4,00±0,00 - - 2,00±0,00
7 Amoxycilin - - - - 3,00±0,00
DMSO 2% +
8 TWEEN 80 - - - - -
0,2%
Theo bảng 3.8 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu
không trên từng chủng vi khuẩn tôi rút ra một số nhận xét như sau:
Trên chủng vi khuẩn B. cereus khi khảo sát ở các nồng độ tôi nhận thấy ở nồng độ

1024 µl/ml có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất với kết quả là 8,33±1,11mm, hai nồng độ
512µl/ml và 256µl/ml không chênh lệch đáng kể kết quả lần lượt là 5,33±1,55 mm và
5,00±1,00mm. Nồng độ còn lại là 128µl/ml kết quả thu được là 4,00±0,67mm. Kết quả
cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với chủng B. cereus tương
đối cao, nhận thấy tinh dầu lá Trầu không có khả năng kháng chủng này tốt kể cả ở nồng
độ thấp.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml,

(3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml,
(5): Tetracyclin, (6): Ampicilin,
(7): DMSO 2% + Tween 80 0,2%
Hình 3. 3: Khả năng kháng

B. cereus của tinh dầu lá
Trầu không
Trên chủng vi khuẩn E. coli, sau khi tiến hành khảo sát thì nhận thấy ở hai nồng độ
1024µl/ml và 512µl/ml khả năng kháng khuẩn không chênh lệch nhiều, chỉ ở mức
3,00±0,00mm và 2,67±0,44 mm. Nồng độ 256µl/ml khả năng kháng chỉ đạt
1,00±0,00mm và không kháng ở nồng độ 128µl/ml. Qua kết quả cho thấy, hoạt tính
kháng vi khuẩn E. coli của tinh dầu lá Trầu không rất thấp so với các chủng vi khuẩn
còn lại.
Hình 3. 4: Khả năng kháng E. Coli của tinh dầu Trầu không
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2%
+ Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c)
Tetracyclin

Trên chủng vi khuẩn S. typhi, sau khi tiến hành khảo sát ta nhận thấy tinh dầu lá Trầu
không chỉ kháng được vi khuẩn S. typhi ở hai nồng độ 1024µl/ml và 512µl/ml, kết quả lần
lượt là: 3,5±0,5mm và 2,5±0,5mm. Còn ở nồng độ 256µl/ml và 128µl/ml thì không có khả
năng kháng S. typhi. Như vậy, qua kết quả cho thấy khả năng kháng vi khuẩn S. typhi của
tinh dầu lá Trầu không cũng rất kém.
Hình 3. 5: Khả năng kháng S. typhi của tinh dầu lá Trầu không
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% +
Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Trên chủng vi khuẩn S. aureus, các nồng độ khảo sát giảm dần vòng kháng khuẩn lần
lượt là: 1024 µl/ml ứng với 4,33±1,11mm, 512 µl/ml và 256 µl/ml có cùng vòng kháng là
2,33±0,44mm, 128 µl/ml ứng với 1,3±1,00mm. Qua kết quả cho thấy, khả năng kháng vi
khuẩn S. aureus của tinh dầu lá Trầu không thấp hơn B. cereus, nhưng cao hơn cả E. coli
và S. typhi.
Hình 3. 6: Khả năng kháng S. aureus của tinh dầu lá Trầu không

Trên chủng vi khuẩn P. aeruginosa có sự thay đổi vòng kháng rõ rệt hơn khi thay đổi
nồng độ từ cao đến thấp. Ở nồng độ cao nhất là 1024 µl/ml thì vòng kháng tương ứng là
5,33±2,44mm, nồng độ giảm xuống 512 µl/ml thì vòng kháng còn 3,00±0,0mm, nồng độ
giảm thêm còn 256 µl/ml thì vòng kháng chỉ còn 1,00±0,0mm; nồng độ thấp nhất 128 µl/ml
thì hoàn toàn không kháng được P. aeruginosa.
Hình 3. 7: Khả năng kháng P. aeruginosa của tinh dầu lá Trầu không
Dựa trên kết quả thí nghiệm với DMSO 2% + Tween 80 0,2%, các mẫu chứng âm
không xuất hiện vòng kháng khuẩn, điều này được khẳng định khi đa số các thí nghiệm
về kháng khuẩn đều dùng DMSO làm chứng âm [10]. DMSO và Tween 80 dùng để phân
tách tinh dầu ra nhỏ hơn để dễ dàng khuếch tán vào đĩa giấy. Vì vậy có thể kết luận rằng
DMSO hòa tan đa số các hợp chất và sử dụng làm chứng âm với khuẩn mà không ảnh
hưởng đến kết quả kháng khuẩn [12].
- Tinh dầu Trầu không có khả năng kháng được 5 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức
độ kháng phụ thuộc vào nồng độ tinh dầu thử nghiệm. Hiệu quả kháng của tinh dầu Trầu
không tốt nhất trên chủng B. cereus và thấp nhất trên chủng E. coli và S. typhi. Đối với S.
aureus và P. aeruginosa mức độ kháng không cao so với B. cereus. Ở nồng độ thấp nhất
(128µl/ml) thì hầu như không kháng được cả 3 chủng E. coli, S. typhi và P. aeruginosa; có
kháng ở B. cereus và S. areus lần lượt là 4,00±0,67mm và 1,3,00±0,0mm.
- Ở nồng độ 1024µl/ml, hiệu quả kháng của tinh dầu Trầu không thấp hơn Tetracyclin
mức 30µg, tương đương với Ampicilin mức 10µg và cao hơn Amoxylin mức 10µg.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu tinh dầu lá Trầu không, tôi rút ra được một số kết luận sau:
- Qua quá trình thực nghiệm tôi đã xây dựng quy trình trích ly tinh dầu lá Trầu không kết
hợp với các điều kiện thích hợp nhằm thu được lượng tinh dầu cao nhất như sau:
Tỷ lệ nước/nguyên liệu 4/1 (v/w)
Thời gian ngâm 90 phút
Thời gian chưng cất 270 phút
Tỷ lệ khối lượng tinh dầu lá Trầu không 0,27% (w/w)
- Bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đã tách được tinh dầu lá Trầu không.
Tinh dầu là một chất lỏng, có màu vàng nhạt, nhẹ hơn nước và có tỷ trọng là 0,898g/cm3,
mùi nồng, đặc trưng của tinh dầu Trầu không và vị cay.
- Dịch chiết lá Trầu không có chứa Flavonoid, Steroid, Anthraquinone, Saponin, Tanin.
- Bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS đã xác định được 25 cấu tử chính
có trong tinh dầu. Trong thành phần chính của lá Trầu không là hợp chất Eugenol chiếm
33,142%.
- Kết quả khảo sát về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với các chủng
vi khuẩn được thử nghiệm cho thấy ở nồng độ cao 1024µl/ml đạt đường kính vòng kháng
khuẩn cao nhất ở 5 loại chủng vi khuẩn và ở nồng độ thấp nhất 128µl/ml thì tinh dầu lá Trầu
không chỉ còn hoạt tính đối với B. cereus và S. areus, 3 chủng còn lại ở nồng độ thấp này
không có hoạt tính kháng. Ngoài ra, ở nồng độ 1024µl/ml nhận thấy tinh dầu lá Trầu không
có khả năng kháng tốt hơn kháng sinh Amoxylin và tương đương với Ampicilin, vẫn thấp
hơn so với Tetracyclin.
4.2. Kiến nghị
Đề tài cần nghiên cứu thêm:

- Các giống Trầu không ở nhiều nơi khác, điều kiện đất canh tác, mùa khô và mùa
mưa, phương pháp bảo quản lá Trầu không ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly tinh dầu bằng
phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và thành phần của tinh dầu.
- Có thể nghiên cứu theo hướng mở rộng để xác định thành phần các chất có trong
thân, rễ và hoa của Trầu không, so sánh với thành phần các chất có trong lá Trầu không.
Từ đó chọn ra nguồn nguyên liệu tối ưu nhất nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu các hoạt
tính sinh học để phục vụ cho ngành y học.
- Áp dụng các phương pháp mới vào quá trình trích ly như: chưng cất bằng nước muối
NaCl, chưng cất bằng nước kết hợp với vi sóng, …
- Xác định tính chất vật lý khác của tinh dầu như: độ khúc xạ ánh sáng, góc quay cực.
- Xác định chỉ số hóa học của tinh dầu như: chỉ số acid, chỉ số este, chỉ số xà phòng
hóa.
- Tìm hiểu thêm về quá trình làm sạch và tinh chế tinh dầu.
- Thử nghiệm thêm một số vi khuẩn khác để đo độ kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu
không
- Xác định khả năng chống oxi hóa của tinh dầu lá Trầu không.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1]. Nguyễn Nho Dũng, “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học tinh dầu
và dịch chiết từ lá Trầu không”, Tóm tắt luận văn Thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng – 2011.
[2]. Huỳnh Kỳ Trân, Trần Nguyễn Ngọc Châu, Hà Mỹ Thuận, Nguyễn Khoa Nam, Đỗ Việt
Hà, “Tinh dầu lá trầu Piper Betle.L và hoạt tính sinh học”, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và
Sinh học – Tập 20, số 3/2015
[3]. Nguyễn Thiện Chí, Nguyễn Thị Ngọc Châm, Phạm Khánh Ngọc, Đỗ Duy Phúc, Dương
Tùng Kha, Nguyễn Thị Thu Thủy, “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi
sinh vật của tinh dầu lá trầu không (Piper betle.L), họ hồ tiêu (Piperaceae)”, Tạp chí
Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2016, 45a: 28 - 32
[4]. Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học.
[5]. Đoàn Ngọc Dũng, “Chiết xuất tinh dầu lá Bạch đàn bằng phương pháp chưng cất
lôi cuốn hơi nước”, Đề tài nghiên cứu khoa học 2017, Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
[6]. Bùi Thị Hồng Loan, “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng”,
Đồ án tốt nghiệp 2017, Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu.
[7]. Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Quang Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên,
“Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015,
Tập 13, số 2: 245 – 250.
[8]. Nguyễn Thị Thắm, Phạm Kim Ngọc, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Đống Thị Anh Đào,
“Khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của dịch chiết củ cải trắng”, Tạp chí khoa
học, Tập 46, số 2A (2017), tr.66 – 72.
[9]. Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm. 2012. Vệ sinh và an toàn thực phẩm. Nhà xuất
bản Đại học Quốc gia Tp. HCM.
[10]. Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình. 2013. Kháng sinh - Đề kháng kháng
Sinh - Kỹ thuật kháng sinh đồ. Các vấn đề cơ bản thường gặp. Nhà xuất bản Y
học, pp. 61 – 63.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

[11]. Su, Pai-Wei, Yang, Cheng-Hong, Yang, Jyh-Femg, Su, Pei-Yu, Chuang, Li- Yeh,
2015, ‘Antibacterial Activities and Antibacterial Mechanism of Polygonum cuspidatum
Extracts against Nosocomial Drug-Resistant Pathogens’, Molecules
2015, Vol. 20, pp. 11119 - 11130.
[12]. Yusuf, A. Z., Zarik, A., Shemau, Z., Abdullahi, M., Halima, S. A.
“Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata
linn”, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, Vol. 6, No. 2, pp. 10 - 16.
[13]. Senthilkumar, A., Venkatesalu, V.,2013, ‘Chemical constituents, in vitro antioxidant
and antimicrobial activities of essential oil from the fruit pulp of wood apple’,
Industrial Crops and Products, Vol. 46, pp. 66 - 72.
TÀI LIỆU WEBSIDE
[14]. Lợi ích của cây Trầu. [Internet] Lấy từ URL: https://vietessence.com/san-pham/tinh-
dau-trau-khong/
[15]. Ứng dụng của tinh dầu lá Trầu không. [Internet] Lấy từ URL: http://tld.vn/tinh-dau-
trau-khong.html
[16]. Vi khuẩn Bacillus cereus. [Internet]. Lấy từ URL:
https://www.scribd.com/doc/33904341/Vi-khuan-Bacillus-cereus
[17]. Phương pháp hoạt tính sinh học. Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. [Internet].
Lấy từ URL: http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/gioi-thieu-mot-so-phuong-phap-danh-
gia-hoat-tinh-sinh-hoc-cac-hop-chat-thien-nhien-15658.html
[18]. Phương pháp chưng cất hơi nước. [Internet]. Lấy từ URL:
https://www.academia.edu/28723409/3.4_PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC

Đề tài nghiên cứu khoa học - Nghiên cứu chiết tách và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không ở tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (download tai tailieutuoi.com)

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Đề tài nghiên cứu khoa học - Nghiên cứu chiết tách và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không ở tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (download tai tailieutuoi.com)

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

PHIẾU ĐỀ XUẤT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

2. Mục tiêu, nội dung chính: TÊN ĐỀ TÀI

3. Kết quả, sản phẩm dự kiến:

4. Nhu cầu kinh phí dự kiến:

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1:Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu .....................................................................3

Hình 2. 1: Lá Trầu không ..............................................................................................30

Bảng 2. 1: Bảng dụng cụ thiết bị ...................................................................................30

Bảng 3. 1: Các thông số sử dụng để khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu ...........................43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 1 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 2 SVTH: Phạm Minh Tú

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

Hình 1. 1:Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 3 SVTH: Phạm Minh Tú

gia đình hoặc trồng thành vườn.

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 4 SVTH: Phạm Minh Tú

tác dụng thông mũi và hỗ trợ tiết sữa.

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 5 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 6 SVTH: Phạm Minh Tú

Thymol Estragol Eugenol

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 7 SVTH: Phạm Minh Tú

Menthol α – Terpincol Geraniol

Etyl anthranilate Benzyl axetat

Aldehyt Cuminic (Z) – Citral (neral)

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 8 SVTH: Phạm Minh Tú

(E) – Citral (geranial) Citronellal

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 9 SVTH: Phạm Minh Tú

 Công thức: C9H10O

 Công thức: C10H12O2

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 10 SVTH: Phạm Minh Tú

 Công thức: C15H24

 Công thức: C10H18O

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 11 SVTH: Phạm Minh Tú

 Công thức: C11H14O2

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 12 SVTH: Phạm Minh Tú

 Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ.

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 13 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 14 SVTH: Phạm Minh Tú

- Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản.

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 15 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 16 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 17 SVTH: Phạm Minh Tú

Hình 1. 2: Hệ thống sắc ký khí GC (Gas Chromatography)

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 18 SVTH: Phạm Minh Tú

 Nguyên lý hoạt động:

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 19 SVTH: Phạm Minh Tú

hóa với bộ tách từ cực và detector khối phổ.

Hình 1. 4: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)

 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động:

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 20 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 21 SVTH: Phạm Minh Tú

1.8. Giới thiệu một số chủng vi khuẩn [2], [6], [16]

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 22 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 23 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 24 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 25 SVTH: Phạm Minh Tú

– Giới (Kingdom): Bacteria

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 26 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 27 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 28 SVTH: Phạm Minh Tú

GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 29 SVTH: Phạm Minh Tú