Translated from English to Vietnamese - www.onlinedoctranslator.

com
Xem siêu dữ liệu, trích dẫn và các bài báo tương tự tạilõi.ac.uk mang đến cho bạn CỐT LÕI

cung cấp bởiHelsingin yliopiston digitaalinen arkisto

Chuẩn bị, phân tích cấu trúc và prebiotic

tiềm năng của arabinoxylo-oligosacarit

Helena Pastell

LUẬN VĂN HỌC THUẬT

Được trình bày, với sự cho phép của Khoa Nông Lâm nghiệp của
Đại học Helsinki, cho những lời chỉ trích công khai trong giảng đường B3, Viikki,
vào ngày 29 tháng 1quần què2010, lúc 12 giờ trưa.

Đại học Helsinki

Khoa Hóa học Ứng dụng và Vi sinh
Hóa học và Hóa sinh / Hóa học Thực phẩm

Helsinki 2010
Tùy chỉnh: Giáo sư Vieno Piironen
Khoa Hóa học Ứng dụng và Vi sinh Đại học
Helsinki
Helsinki, Phần Lan

Người giám sát: Giáo sư Maija Tenkanen

Khoa Hóa học Ứng dụng và Vi sinh Đại học
Helsinki
Helsinki, Phần Lan

Docent Päivi Tuomainen

Khoa Hóa học Ứng dụng và Vi sinh Đại học
Helsinki
Helsinki, Phần Lan

Người đánh giá: Giáo sư Alphons GJ Voragen Phòng

thí nghiệm Hóa học Thực phẩm Đại
học Wageningen
Wageningen, Hà Lan

Docent Tarja Tamminen

Trung tâm nghiên cứu kỹ thuật VTT
Helsinki, Phần Lan

Phản đối: Phó giáo sư Luc Saulnier

Đơn vị nghiên cứu về Polyme sinh học - Tương tác và lắp ráp
INRA, Trung tâm nghiên cứu Nantes
Nantes, Pháp

ISBN 978-952-10-6054-0 (bìa mềm)

ISBN 978-952-10-6055-7 (pdf)
ISSN 0355-1180

Ảnh bìa: Tuuli Koivumäki

Đại học Helsinki Bản in

Helsinki 2010
”Bột mì nguyên cám được khuyên dùng
vì tác dụng bổ ích của nó đối với ruột.”

Hippocrates, 4quần quèThế kỷ BC

Pastell, H. 2010. Điều chế, phân tích cấu trúc và tiềm năng tiền sinh học của
arabinoxylooligosacarit (luận án). EKT-Series 1463. Đại học Helsinki. Khoa Hóa học Ứng
dụng và Vi sinh vật. 112 + 48 tr.

TRỪU TƯỢNG

Arabinoxylo-oligosacarit (AXOS) có thể được điều chế bằng enzym từ arabinoxylans (AX) và AXOS được
biết là có tiềm năng tiền sinh học. Ở đây các đặc điểm cấu trúc của 10 loại ngũ cốc AX đã được kiểm tra.
AX bị thủy phân bởi Shearzyme®để chuẩn bị AXOS và cấu trúc của chúng đã được phân tích đầy đủ. Tiềm
năng tiền sinh học của AXOS tinh khiết đã được nghiên cứu trong các thí nghiệm lên men với vi khuẩn
bifidobacteria và hệ vi sinh vật trong phân.

Trong AX được chiết xuất từ bột và cám, một lượng lớn --L-Arafcác đơn vị được gắn vào --
D-XylPchuỗi chính, trong khi mức độ thay thế vừa phải hoặc thấp được tìm thấy từ trấu, lõi
ngô và rơm. Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy bột mì và cám AX chứa
lượng --L-Ara caofcác đơn vị liên kết với O-3 của --D-Xylp dư lượng và được thay thế gấp đôi
các đơn vị --D-Xylp bằng --L-Arafnhóm thế ở O-2 và O-3. Vỏ lúa mạch và lõi ngô AX chứa một
lượng lớn --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên, cũng có thể được tìm thấy trong AX từ bột
yến mạch và vỏ trấu, và với số lượng ít hơn trong AX lúa mì.

Lúa mạch đen và bột mì AX và yến mạch đánh vần là AX đã được thủy phân bởi Shearzyme®
(vớiAspergillus aculeatusGH10kết thúc-1,4---D-xylanase làm enzym chính) để sản xuất AXOS
trên thang miligam. AXOS đã được tinh chế và cấu trúc của chúng được phân tích đầy đủ, sử
dụng phép đo khối phổ (MS) và quang phổ 1D và 2D NMR. Xylobiose và xylotriose được thế
đơn với --L-Arafđược gắn vào O-3 hoặc O-2 của đầu không khử --D-XylPđơn vị và AXOS bị loại
bỏ với hai --L-Arafđơn vị ở đầu không khử --D-XylPđơn vị xylobiose hoặc xylotriose được sản
xuất. Xylobiose với --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên cũng đã được tinh chế. Các AXOS này
được sử dụng làm tiêu chuẩn để xác định và định lượng thêm AXOS tương ứng từ các sản
phẩm thủy phân trong sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao với phân tích phát hiện ampe kế
xung (HPAEC-PAD).

Tiềm năng tiền sinh học của AXOS đã được thử nghiệm trongtrong ống nghiệmthí nghiệm lên
men. Bifidobacterium vị thành niênATCC 15703 vàB. longumATCC 15707 đã sử dụng AXOS từ các
sản phẩm thủy phân AX. Cả hai loài đều giải phóng L-arabinose từ AXOS, nhưngB. vị thành niên
tiêu thụ XOS hình thành, trong khiB. longumlên men L-arabinose được giải phóng. Loài thứ ba
được thử nghiệm,B. breveATCC 15700, phát triển kém trên các chất nền này. Khi được nuôi cấy
trên AXOS tinh khiết, hỗn hợp bifidobacteria sử dụng gần như hoàn toàn AXOS thay thế đơn
thuần, nhưng không phát hiện thấy sự phát triển nào với AXOS tinh khiết thay thế kép làm cơ
chất. Tuy nhiên, AXOS thay thế kép được sử dụng từ hỗn hợp xyloza, XOS và AXOS. Hệ vi sinh vật
trong phân sử dụng cả AXOS đơn thuần và thay thế kép. Do đó, một hỗn hợp AXOS thay thế đơn
lẻ và kép có thể hoạt động như một chất tiền sinh học lên men chậm, phù hợp.

Luận án này góp phần cung cấp thông tin về cấu trúc của AX ngũ cốc và điều chế AXOS đơn
và thay thế kép từ AX. Hiểu các chiến lược sử dụng là cơ bản trong việc đánh giá tiềm năng
tiền sinh học của AXOS. Vẫn cần nghiên cứu thêm trước khi AXOS có thể được sử dụng trong
các ứng dụng cho con người.
Sự nhìn nhận

Nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Hóa học Ứng dụng và Vi sinh, Bộ môn
Hóa học và Hóa sinh, trường Đại học Helsinki trong những năm 2003-2009. Một
phần của nghiên cứu được thực hiện trong chuyến nghiên cứu tại trường Đại học
Kỹ thuật Đan Mạch (DTU ). Công trình được hỗ trợ tài chính bởi Quỹ Nghiên cứu
Raisio, Quỹ Danisco, Học viện Phần Lan và Quỹ Văn hóa Phần Lan, những tổ chức
này rất biết ơn. Hành động COST 928 và Mạng NordForsk; Food and Bioresource
Enzyme Technology được ghi nhận đã tài trợ cho chuyến tham quan nghiên cứu
tại DTU.

Tôi vô cùng biết ơn những người hướng dẫn của tôi, Giáo sư Maija Tenkanen và Docent Päivi Tuomainen đã
giúp tôi hoàn thành luận văn này. Bạn đã khiến tôi quan tâm đến công việc nghiên cứu, và bạn đã cho tôi rất
nhiều lời khuyên bổ ích, những lời phê bình mang tính xây dựng và sự kiên nhẫn. Cảm ơn bạn đã hỗ trợ tôi
trong suốt công việc với sự hướng dẫn đầy cảm hứng của bạn. Tôi xin cảm ơn Giáo sư Vieno Piironen vì những
nhận xét quý báu liên quan đến luận án này và những lời động viên khích lệ trong quá trình làm việc. Tôi xin
chân thành cảm ơn Tiến sĩ Liisa Virkki vì sự giúp đỡ của bạn trong việc chuẩn bị các bản thảo và luận án này
cũng như sự quan tâm liên tục của bạn đối với công việc của tôi.

Tôi xin chân thành cảm ơn Giáo sư Anne Mayer và Phó Giáo sư Peter Westermann đã cung cấp cơ
sở vật chất làm việc tuyệt vời tại DTU và đã giới thiệu tôi vào thế giới nghiên cứu của vi sinh học và
sinh học phân tử. Tôi đặc biệt cảm ơn Louise Vigsnæs, Gitte Hinz-Berg và nhiều người khác đã
hướng dẫn tôi trong phòng thí nghiệm tại DTU và khiến kỳ nghỉ của tôi ở Đan Mạch trở nên khó
quên.

Tôi muốn cảm ơn các đồng tác giả của tôi, Phó Giáo sư Henk Schols và Tiến sĩ Mirjam Kabel vì sự giúp đỡ
của bạn đối với các thí nghiệm MALDI-TOF-MS và những nhận xét mang tính xây dựng trong quá trình
chuẩn bị bản thảo.

Tôi cảm ơn tất cả các đồng nghiệp hiện tại và trước đây của tôi trong tòa nhà Viikki D đã tạo ra bầu
không khí làm việc hỗ trợ và vì những khoảnh khắc đẹp mà chúng tôi đã chia sẻ. Xin gửi lời cảm ơn đặc
biệt đến nhóm nghiên cứu hemicellulose: Leena Pitkänen, Ndegwa Maina, Sanna Koutaniemi, Sun-Li
Chong, Susanna Heikkinen, Kirsi Mikkonen, Mari Heikkilä, Kirsti Parikka, Henna Pynnönen, Liisa
Johansson, Paula Koivisto, Riku Talja, Saara Hamarila và Annemai Soovre. Cảm ơn tất cả các bạn đã nhận
xét công việc của tôi, trình bày ý tưởng của bạn và chia sẻ những khoảnh khắc tuyệt vời cũng như lắng
nghe và giúp đỡ trong những thời điểm khó khăn. Tôi rất biết ơn Essi Harju và Jaakko Arpiainen vì sự
giúp đỡ trong phòng thí nghiệm.

Giáo sư Alphons GJ Voragen và Docent Tarja Tamminen được cảm ơn vì đã xem xét cẩn thận
trước luận án này, những nhận xét và đề xuất của họ để cải thiện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến bố mẹ tôi là Hanna và Tapio Rantanen và em gái Riitta
của tôi. Bạn đã luôn tin tưởng ở tôi, giúp đỡ và hỗ trợ tôi bằng mọi cách có thể. Tôi cũng muốn
cảm ơn những người thân và bạn bè của tôi vì sự quan tâm mà bạn đã thể hiện đối với công việc
của tôi, vì những khoảnh khắc hạnh phúc và sự thoải mái khi cần thiết. Cảm ơn bạn vì tình bạn lâu
dài trong suốt ngần ấy năm và đã giúp tôi đôi khi hoàn toàn quên đi khoa học...

Cuối cùng, lời cảm ơn yêu thương của tôi xin gửi đến Matti, chồng tôi và con trai Aleksanteri của chúng
tôi. Cảm ơn Matti vì đã yêu con người thật của con, tin tưởng và ủng hộ con. Bạn đã làm cho cuộc sống
của tôi hoàn thành. Aleksanteri, bạn luôn có thể khiến mẹ cười với những trò đùa “keksijä-Kyösti” của
bạn và hạnh phúc với một nụ hôn ướt át. Tôi đánh giá cao niềm vui sống tinh tế của bạn – thế giới là một
nơi đầy nắng với bạn!

Helsinki, tháng 1 năm 2010

Helena Pastell
nội dung

TRỪU TƯỢNG 5
SỰ NHÌN NHẬN 6
DANH MỤC CÁC XUẤT BẢN GỐC 10
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 12

1. GIỚI THIỆU 15

2 ĐÁNH GIÁ TÀI LIỆU 18

2.1 Arabinoxylan ngũ cốc 18

2.1.1 Ngũ cốc 18
2.1.2 Sự xuất hiện của AX 18
2.1.3 Cấu trúc của AX 20
2.1.4 Phân bố nhóm thế trong ngũ cốc AX 23

2.2 Enzyme thủy phân arabinoxylan 25

2.2.1 Enzyme thủy phân chuỗi chính xylan 25
2.2.2 Enzim tác động lên --L-Arafnhóm thế 26
2.2.3 Enzim tác dụng lên nhóm thế khác 27

2.3 Điều chế enzym của arabinoxylo-oligosacarit 29

2.3.1 AXOS từ AX bị cô lập 29
2.3.2 AXOS từ vật liệu lignocellulose 33

2.4 Các phương pháp phân tách và phát hiện trong phân tích AXOS 33
2.4.1 Lưu giữ monosacarit 34
2.4.2 Lưu giữ oligosacarit 35
2.4.3 Phát hiện ampe kế xung 35

2.5 Prebiotic và men vi sinh 37

2.5.1 Định nghĩa về pro- và prebiotic 37
2.5.2 Các prebiotic (oligo)sacarit tiềm năng 38
2.5.3 Sản xuất SCFA trong quá trình lên men prebiotic 39
2.5.4 Hệ vi sinh vật đường ruột 40
2.5.5 Enzyme bifidobacteria trong sử dụng AXOS 40

3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 44

4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 45

4.1 Vật liệu 45

4.1.1 Cacbohydrat 45
4.1.2 Enzym 46
4.1.3 Vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm lên men 47
 4.2 Thực nghiệm 47
4.2.1 Chiết xuất AX (III) 47
4.2.2 Phân tích thành phần monosacarit của AX (I, III) 47
4.2.3 Sản xuất enzym và tinh chế sắc ký AXOS (I-III) 48
4.2.4 Phương pháp sắc ký điều chế (I-III) 49
4.2.5 Định lượng AXOS (I-III) 50
4.2.6 Phương pháp sắc ký phân tích (I-IV) 51
4.2.6.1 TLC 51
4.2.6.2 HPAEC-PAD 51
4.2.6.3 Tổng công ty 53
4.2.7 Làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS (I-III) 55
4.2.7.1 Khối phổ 56
4.2.7.2 Quang phổ NMR 57
4.2.8 Phương pháp vi sinh vật và sinh học phân tử (IV) 58
4.2.8.1 Thí nghiệm lên men 58
4.2.8.2 Tách chiết ADN, tinh sạch, PCR và t-RFLP 58

5. KẾT QUẢ 61

5.1 Thành phần cacbohydrat của nguyên liệu ban đầu (I-IV) 61
5.2. Cấu trúc của AXOS được điều chế bằng enzym (I-III) 61
5.3 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX (I-III) 66
5.4 Hoạt động của Shearzyme (I-III) 68
5.5 Hành vi của AXOS trong sắc ký (I-III) 68
5.5.1 Tách AXOS trên TLC 68
5.5.2 Thứ tự rửa giải của AXOS và phản ứng của chúng trong HPAEC-PAD 69
5.6 Thí nghiệm lên men (IV) 71
5.6.1 Thành phần cacbohydrat của sản phẩm thủy phân XOS và AX 71
5.6.2. Sự phát triển của các nền văn hóa bifidobacteria tinh khiết 72
5.6.3 Lên men với hệ vi sinh vật trong phân 74

6. THẢO LUẬN 77
6.1 Thành phần cacbohydrat của nguyên liệu ban đầu 77
6.2 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX 78
6.3 Sản xuất AXOS ở quy mô chuẩn bị 82
6.4 Những thách thức trong việc xác định và định lượng AXOS 84
6.5 Hoạt động của AXOS trong hệ thống HPAEC-PAD 85
6.5.1 Thứ tự rửa giải của AXOS 85
6.5.2 Phản hồi của AXOS trong PAD 86
6.6 Thí nghiệm lên men 87
6.6.1 Sử dụng chất nền 87
6.6.2 Chiến lược sử dụng cơ chất của bifidobacteria thuần khiết 90
6.6.3 Các tính năng cụ thể trong việc sử dụng AXOS tinh khiết 92

7. KẾT LUẬN 95

8. TÀI LIỆU THAM KHẢO 97

XUẤT BẢN GỐC

DANH MỤC CÁC XUẤT BẢN GỐC

Luận án này dựa trên các ấn phẩm gốc sau đây, được gọi trong văn bản bằng chữ
số La Mã:

TÔI Rantanen, H., Virkki, L., Tuomainen, P., Kabel, M., Schols, H., Tenkanen, M. 2007.
Điều chế arabinoxylobiose từ xylan lúa mạch đen sử dụng họ 10Aspergillus
aculeatusendo-1,4---D-xylanase.Polyme cacbohydrat, 68, 350-359.

II Pastell, H., Tuomainen, P., Virkki, L., Tenkanen, M. 2008. Chuẩn bị enzyme
theo từng bước và mô tả đặc điểm cấu trúc của arabinoxylo-oligosacarit thay
thế đơn và kép với các nhánh cuối không khử. Nghiên cứu carbohydrate, 343,
3049-3057.

III Pastell, H., Virkki, L., Harju, E., Tuomainen, P., Tenkanen, M. 2009. Sự hiện diện của 2-
Ô---D-xylopyranosyl---L-arabinofuranosyl chuỗi bên trong arabinoxylan ngũ cốc.
Nghiên cứu carbohydrate, 344, 2480-2488.

IV. Pastell, H., Westermann, P., Meyer, AS, Tuomainen, P., Tenkanen, M. 2009.Trong ống
nghiệmquá trình lên men carbohydrate có nguồn gốc arabinoxylan bởi bifidobacteria và hệ
vi sinh vật phân hỗn hợp.Tạp chí hóa học nông nghiệp và thực phẩm, 57, 8598- 8606.

Các giấy tờ được sao chép với sự cho phép của người giữ bản quyền: Elsevier (TÔI, II,
III) và Hiệp hội Hóa học Hoa Kỳ (IV.).

Đóng góp của tác giả cho các bài báo từ I đến IV:

TÔI Helena Pastell (nhũ danh Rantanen) đã lên kế hoạch nghiên cứu cùng với Giáo sư
M. Tenkanen và Docent P. Tuomainen. Docent L. Virkki đã lên kế hoạch cho các
phân tích NMR, giải thích kết quả và viết phần NMR trong bản thảo. Phó giáo sư
H. Schols và Ph.DM Kabel đã giúp lập kế hoạch và thực hiện phân tích MALDI-
TOF-MS. Các công việc thí nghiệm khác, ngoại trừ phép đo hoạt tính enzyme và
phân tích metanol bằng axit, được thực hiện bởi Helena Pastell. Cô ấy đã viết bản
thảo được cùng biên tập với các tác giả khác. Helena Pastell đóng vai trò là tác giả
tương ứng của bài báo.

II Helena Pastell đã lên kế hoạch cho nghiên cứu cùng với Giáo sư M. Tenkanen và Tiến
sĩ P. Tuomainen, người cũng đã thực hiện các phép đo MALDI-TOF-MS. Docent L. Virkki
đã lên kế hoạch cho các phân tích NMR, giải thích kết quả và viết phần NMR trong bản
thảo. Helena Pastell chịu trách nhiệm về công việc thử nghiệm khác. Cô ấy đã viết bản
thảo được cùng biên tập với các tác giả khác, và cô ấy đóng vai trò là tác giả tương
ứng của bài báo.
III Helena Pastell đã lên kế hoạch cho nghiên cứu cùng với Giáo sư M. Tenkanen và Tiến
sĩ P. Tuomainen. Docent L. Virkki đã lên kế hoạch cho các phân tích NMR, giải thích kết
quả và viết phần NMR trong bản thảo. B.Sc E. Harju đã phân lập được arabinoxylan và
oligosacarit. Công việc thử nghiệm khác, ngoại trừ các phân tích trước đó và ESI-MS,
được thực hiện bởi Helena Pastell. Cô ấy đã viết bản thảo đã được các tác giả khác
nhận xét, và cô ấy đóng vai trò là tác giả tương ứng của bài báo.

IV. Helena Pastell đã lên kế hoạch cho nghiên cứu cùng với Giáo sư M. Tenkanen, PGS.
Giáo sư P. Westermann và Giáo sư AS Meyer. Helena Pastell chịu trách nhiệm về công
việc thử nghiệm, ngoại trừ phân tích t-RFLP. Cô ấy đã viết bản thảo được cùng biên
tập với các tác giả khác. Helena Pastell đóng vai trò là tác giả tương ứng của bài báo.
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

- - L-Araf alpha-L-arabinofuranosyl
CÂY RÌU arabinoxylan(s)
MỘTzX MỘT; --L-Araf+ --D-XylP,z; vị trí liên kết giữa --L-Araf và --D-
XylP,X; (-)-D-Xyl(P)
AXH-d3 - - L-arabinofuranosidase (chỉ có thể giải phóng liên kết (1-3) -- L-
Arafcác đơn vị từ bị loại bỏ --D-XylPdư lượng)
AXH-m - - L-arabinofuranosidase (tác động trên (1-2)- và (1-3)-liên kết
- - L-Arafđơn vị trên monosubstituting --D-XylPdư lượng)
AXOS arabinoxylo-oligosacarit (s)
- - D-XylP beta-D-xylopyranosyl
BHAX vỏ lúa mạch arabinoxylan
CCAX lõi ngô arabinoxylan
ĐP Mức độ trùng hợp Mức
ĐS độ thay thế
DQF-COSY quang phổ tương quan được lọc lượng tử kép
Đ.2,3X
- - D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl phổ
ESI-MS khối ion hóa phun điện hóa
FOS thực phẩm fructo-oligosacarit
FOSHU dùng cho sức khỏe được chỉ
GC định sắc ký khí
GH glycosid thủy phân
GOS sắc ký thẩm thấu gel galacto-
GPC oligosacarit sắc ký tương quan đa
HMQC lượng tử dị nhân kết nối đa liên kết dị
HMBC nhân
HPAEC-PAD sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao với phát hiện ampe kế
xung
HSQC sắc ký lỏng tương quan đơn lượng tử hạt
LC/MSD nhân/phát hiện chọn lọc khối lượng
LDL lipoprotein mật độ thấp
MALDI-TOF-MS quang phổ khối thời gian bay/giải hấp thụ laser có hỗ trợ
ma trận
mw khối lượng mol trung bình trọng lượng cộng
NMR 1D hưởng từ hạt nhân một chiều cộng hưởng từ
2DNMR hạt nhân hai chiều cám yến mạch
OBAX arabinoxylan
OSAX yến mạch đánh vần arabinoxylan

RAX arabinoxylan lúa mạch đen

RAX cám lúa mạch đen arabinoxylan

RiHAX arabinoxylan trấu

rf yếu tố duy trì
SCFA sắc ký lớp mỏng axit
TLC béo chuỗi ngắn
tr thời gian lưu
t-RFLP giới hạn đầu cuối đoạn đa hình chiều dài lúa
SÁP mì arabinoxylan
WBAX cám lúa mì arabinoxylan biến đổi
SỢI Fourier đã loại bỏ nước rơm lúa mì
WStAX arabinoxylan
XOS xylo-oligosacarit
 15

1. Giới thiệu

Trong hầu hết các chế độ ăn uống của con người, carbohydrate là nguồn năng lượng chính.

Carbohydrate có thể được chia thành hai loại: 1) carbohydrate được tiêu hóa và hấp thụ

trong ruột người và 2) chất xơ là carbohydrate không tiêu hóa được đi đến ruột già. Do đó,

chất xơ có thể được định nghĩa là “các bộ phận thực vật ăn được hoặc carbohydrate tương

tự có khả năng chống tiêu hóa và hấp thụ trong ruột non của con người với quá trình lên

men hoàn toàn hoặc một phần trong ruột già” (Hiệp hội các nhà hóa học ngũ cốc Hoa Kỳ

(AACC), 2001). Theo định nghĩa mới nhất của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA),

chất xơ đơn giản là “carbohydrat không tiêu hóa được cộng với lignin”. Thành phần chính

của chất xơ là các polysacarit không tinh bột (ví dụ: cellulose,

hemicelluloses, pectins và --glucans), oligosacarit kháng (ví dụ: fructooligosacarit (FOS)

và galacto-oligosacarit (GOS)), tinh bột kháng và lignin. Việc sử dụng thực phẩm giàu
chất xơ có liên quan, chẳng hạn như giảm nguy cơ mắc bệnh tiểu đường loại 2, giảm
nồng độ cholesterol toàn phần và mật độ thấp (LDL) và có thể giảm nguy cơ ung thư
ruột kết. Để đạt được những ảnh hưởng sức khỏe này, lượng chất xơ hấp thụ đầy đủ
cho người lớn được coi là 25 g/ngày (EFSA, 2009).

Nhiều loại oligosacarit không thể tiêu hóa khác nhau, được phân loại là chất xơ ăn kiêng,

hoặc oligosacarit thu được từ polysacarit được phân loại là chất xơ ăn kiêng, được đưa vào

trong các thành phần thực phẩm mới và có thể được sử dụng trong thực phẩm chức năng.

Oligosacarit có nhiều đặc tính sinh lý có lợi, chẳng hạn như thúc đẩy sự phát triển của vi

khuẩn đường ruột có lợi (BifidobacteriumVàLactobacillus) (= hiệu ứng tiền sinh học) (Gibson

và Roberfroid, 1995; Crittenden và Playne, 1996; Voragen, 1998) và bảo vệ chống ung thư

ruột kết bằng cách sản xuất axit béo chuỗi ngắn (SCFA) trong ruột già trong quá trình lên

men (Voragen, 1998; Scharlau và cộng sự, 2009). Mối quan tâm đến oligosacarit như thành

phần phụ trong thực phẩm tăng cường sức khỏe đã tăng lên ở Châu Âu, nhưng hiện chỉ có

inulin, FOS và GOS được phép sử dụng cho người trong thực phẩm chức năng (van Loo et

al., 1999; Pascal, 2008). Tại Nhật Bản, thực phẩm dành cho mục đích sử dụng lành mạnh

được chỉ định (FOSHU) đã được luật hóa vào năm 1991. Các sản phẩm của FOSHU bao gồm

fructo-, galacto-, đậu tương, palatinose, xylo- và isomaltooligosacarit, lactulose và

lactosucrose. Yêu cầu sức khỏe chính đối với các sản phẩm này là chúng là “thực phẩm được

thiết kế để giúp duy trì môi trường tiêu hóa tốt,

 16

FOS, GOS, xylo-oligosaccharides (XOS) và lactulose đặc biệt kích thích sự phát triển của

Bifidobacterium(Imaizumi và cộng sự, 1991; Crittenden và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, oligosacarit

tuyến tính có thể bị lên men quá nhanh bởi vi khuẩn bifidobacteria và mục tiêu hiện tại là tìm ra

oligosacarit lên men chậm trong ruột già. Quá trình lên men chậm tạo ra nhiều SCFA, trong đó

đặc biệt là axit butyric và propionic dường như đóng vai trò chính trong việc ngăn ngừa ung thư

ruột kết (Scharlau et al., 2009). Các oligosacarit có khả năng lên men chậm bao gồm arabinoxylo-

oligosacarit (AXOS), được tạo ra bằng cách phân hủy arabinoxylan cao phân tử (AX). AXOS phân

nhánh là các oligosacarit không tiêu hóa được, nhưng được lên men trong ruột già bởi hệ vi sinh

vật đường ruột (Gibson và Roberfroid, 1995; van Laere và cộng sự, 2000). AXOS được lên men bởi

một số vi khuẩn bifidobacteria có lợi cho sức khỏe và bởi vi khuẩn đường ruột chiếm ưu thế,vi

khuẩnspp., nhưng có hại Clostridiumspp. cho thấy việc sử dụng AXOS phân nhánh thấp (van Laere

và cộng sự, 2000; Kabel và cộng sự, 2002b).

Để có được những tác dụng đối với sức khỏe thông qua vi khuẩn có lợi cho sức khỏe, một chiến lược là

bổ sung bifidobacteria vào thực phẩm. Tuy nhiên, bifidobacteria dùng đường uống có thể không tồn tại

trong ruột và ngay sau khi ngừng ăn, hệ vi khuẩn đường ruột sẽ trở lại trạng thái trước đó (Suwa et al.,

1999). Một chiến lược khác là củng cố thực phẩm bằng SCFA, nhưng không chắc rằng SCFA được thêm

trực tiếp vào thực phẩm sẽ đến được ruột già. Do đó, chất xơ hoặc oligosacarit có thể lên men được sử

dụng bằng đường uống sẽ đến được ruột non có thể thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn bifidobacteria

và mang lại tác dụng tích cực của SCFA (Campbell và cộng sự, 1997b; Suwa và cộng sự, 1999).

Để chuẩn bị các oligosacarit không thể tiêu hóa, có sẵn một số nguồn thực vật giàu
carbohydrate. Trong thành tế bào, lignin, cellulose và hemiaellulose liên kết chặt chẽ
với nhau và có thể được gọi là vật liệu lignocellulose (Aspinall, 1980; Puls, 1993). Chất
thải hoặc sản phẩm phụ của lâm nghiệp, nông nghiệp và công nghiệp có chứa một
lượng đáng kể vật liệu lignocellulose. Xử lý sinh khối còn lại làm nguyên liệu thô mang
lại lợi ích kinh tế và sinh thái do khả năng tái tạo sinh học và sự phong phú của nó
(Alonso et al., 2003). Xylan là thành phần chính của hemiaellulose và do đó, sau
cellulose, là nguồn thực vật tái tạo phong phú thứ hai với tiềm năng sử dụng cao như
các sản phẩm hữu ích (Kulkarni et al., 1999). Xylan chiếm khoảng
 17

20-30% trọng lượng khô của phụ phẩm nông nghiệp, chẳng hạn như rơm ngũ cốc và vỏ hạt

(Aspinall, 1970).

Luận án này xem xét các tài liệu về sự xuất hiện và cấu trúc của arabinoxylan trong ngũ cốc, quá

trình sản xuất AXOS bằng enzym, cũng như tiềm năng tiền sinh học của chúng. Phần thực nghiệm

của luận án là tổng hợp các số liệu đã công bố trong các bài báo đính kèmI-IV, trong đó mô hình

thay thế của một số AX cao phân tử được nghiên cứu, quá trình sản xuất, tinh chế và phân tích

cấu trúc của AXOS được đặc trưng và tiềm năng tiền sinh học của AXOS được đánh giá trongtrong

ống nghiệmhọc. Các kết quả thu được được đánh giá trong phần Thảo luận.
 18

2 Đánh giá tài liệu

2.1 Arabinoxylan ngũ cốc

2.1.1 Ngũ cốc

Hạt ngũ cốc thường bao gồm cám, mầm và nội nhũ tinh bột. Ngoài ra, một số loại
ngũ cốc thông thường còn mang vỏ trấu (hulls); lúa mì (Triticum aestivumL.) và lúa
mạch đen (serealeL.) được tách vỏ trong khi thu hoạch, trong khi lúa mạch (
Hodeum thô tụcL.) và yến mạch (Avena sativaL.) thì không, nhưng vỏ trấu được
loại bỏ theo cách truyền thống trước khi sử dụng trong chế độ ăn uống của con
người. Cám được sản xuất từ các loại ngũ cốc, sử dụng các phương pháp phù
hợp với các loại ngũ cốc có cấu trúc khác nhau, dẫn đến cám chứa các lớp hạt đa
dạng. Cám lúa mì khá sạch các lớp khác, cám lúa mạch chứa một số tàn tích vỏ
trấu và cám yến mạch thường chứa một lượng đáng kể nội nhũ tinh bột (Fulcher
và Duke, 2002). Thành tế bào thực vật ngũ cốc bao gồm chủ yếu là polysaccharid,
lignin và protein (Puls, 1993; Aspinall, 1980). Các polyme chính trong thành tế bào
là cellulose (25-35%), hemiaellulose (40-50%) và lignin (7-10%) (Ishii, 1997). Cả
cellulose và hemiaellulose đều có chức năng như vật liệu hỗ trợ cấu trúc trong
thành tế bào; cellulose có độ bền kéo cao và tạo độ cứng cho tường,

2.1.2 Sự xuất hiện của AX

Xylan xuất hiện dưới dạng hemiaellulose phổ biến nhất và sau cellulose, chúng là
polysacarit phổ biến thứ hai trong giới thực vật. Xylan có thể được chia thành ba nhóm:
1) (glucuron-)arabinoxylan, hiện diện trong gỗ mềm, mô gỗ của cỏ và cây hàng năm, 2)
arabinoxylan trung tính trong hạt ngũ cốc và 3) glucuronoxylan có trong gỗ cứng
(Aspinall, 1959, 1970) ; Sjöström, 1981; Ebringerová và Heinze, 2000). Ngũ cốc nguyên
hạt chứa AX từ 1,2% trọng lượng (trong gạo (Oryza sativa
L.)) đến 8,5% trọng lượng (trong lúa mạch đen), trong khi xylan trong các mô ngũ cốc
(lá, rơm, trấu) chiếm 25-35% sinh khối khô (Aspinall, 1970; Henry, 1985; Härkönen et al.,
1997; Moure và cộng sự, 2006). Mặc dù tỷ trọng AX khá nhỏ trong tổng thể
 19

ngũ cốc, tỷ lệ tương đối là đáng kể trong thành tế bào nội nhũ ngũ cốc, trong đó AX chiếm

từ 20% (w/w; trong lúa mạch) đến 72% (w/w; trong lúa mì) (Fincher, 1975; Bacic và Stone,

1980). Do đó, AX là thành phần chính của thành tế bào của một số loại ngũ cốc (Hoffmann et

al., 1992). Tuy nhiên, thành tế bào nội nhũ chỉ đóng góp 0,5-5% trọng lượng khô của ngũ cốc

nguyên hạt và chúng cũng tạo thành các polyme không tinh bột khác với AX, ví dụ như

cellulose, (1-3)(1-4)---D-glucans và glucomannans (Bacic và Stone, 1981; Fulcher và Duke,

2002). Trung bình 2,1% trọng lượng AX trong bột mì (chủ yếu là nội nhũ) đã được báo cáo

(Andersson và Åman, 2001). Về mặt định lượng, hầu hết AX nằm trong các lớp cám, đóng

góp khoảng 25% trọng lượng khô của hạt (Fulcher và Duke, 2002).

Arabinoxylans có thể được chia thành AX chiết xuất được trong nước và không thể chiết xuất được

bằng nước. Khả năng không chiết xuất được của nước là do sự kết hợp của các tương tác không

cộng hóa trị và liên kết cộng hóa trị với các thành phần khác của thành tế bào, chẳng hạn như

protein, cellulose và lignin (McNeil et al., 1975; Markwalder và Neukom, 1976; Andrewartha et al.

1979; Jeffries, 1990). Nhiều liên kết trong số này không bền với kiềm và do đó một số AX có thể

được giải phóng và chiết xuất bằng cách xử lý kiềm (Ishii, 1997; Courtin và Delcour, 2001).

Gruppen et al. (1991) đã chỉ ra rằng với bari hydroxit (Ba(OH)2) phần chính của AX được chiết xuất

có chọn lọc từ các mẫu ngũ cốc khác nhau. Các kiềm khác, chẳng hạn như natri hydroxit (NaOH)

và kali hydroxit (KOH), cũng đã được sử dụng để chiết xuất AX. KOH được ưa chuộng hơn NaOH vì

mannan ít nhiều không hòa tan trong KOH (Puls và Schuseil, 1993). TRONG

bổ sung (1-3, 1-4)---glucan được chiết xuất cùng với KOH và NaOH, và do đó chúng không chọn lọc

như Ba(OH)2(Gruppen và cộng sự, 1991). Nhóm xylan bao gồm cả các polysacarit chiết xuất được

trong nước và kiềm (Aspinall, 1970) nhưng bất kể phương pháp chiết xuất nào, AX đều có độ hòa

tan khác nhau trong nước, vì khả năng hòa tan trong nước phụ thuộc vào cấu trúc của polyme.

Các xylan không được thay thế gần như không tan trong nước, nhưng khi tăng lượng nhóm bên

arabinose, các polyme trở nên dễ tan trong nước hơn (Sternemalm et al., 2008; Pitkänen et al.,

2009). Số lượng và sự sắp xếp cấu trúc của các chuỗi bên của AX khác nhau giữa các loài ngũ cốc

và thậm chí giữa các bộ phận khác nhau của cùng một loại cây.
 20

2.1.3 Cấu trúc của AX

Chuỗi chính tuyến tính của arabinoxylan bao gồm (1-4) --D-xylopyranosyl được liên kết với nhau

(--D-XylP) dư lượng. Xylan ngũ cốc chủ yếu được thay thế bằng (1-2)- và/hoặc (1-3)-

được liên kết --L-arabinofuranosyl (--L-Araf) dư lượng, do đó dẫn đến mono- và

bị loại --D-XylPdư lượng. --L-Arafcác nhóm bên thường được liên kết (1-3) với
- - D-XylPdư lượng trong tất cả các loại ngũ cốc (Ebringerová et al., 1990; Gruppen et al., 1992; Viëtor et al.

al., 1992; Izydorczyk và Biliaderis, 1993). Monosubstituting --D-XylPđơn vị có (1-2)- liên kết -L-

Arafnhóm thường được tìm thấy trong bột lúa mạch chiết xuất kiềm AX (22%) nhưng chúng

đã được tìm thấy với một lượng nhỏ trong tất cả các loại ngũ cốc AX. Cám lúa mì có thể chiết

xuất bằng nước AX sở hữu lượng cao nhất của (1-2)- và (1-3)-được thay thế --D-XylPđơn vị

(40% số đơn vị được thay thế) (Viëtor và cộng sự, 1992; Shiiba và cộng sự, 1993; Izydorczyk

và Biliaderis, 1995). Ngoài --L-Arafdư lượng, chuỗi chính --D-XylPđơn vị cũng có thể

mang --D-glucopyranosyluronic acid (--D-GlcA) hoặc 4- của nóÔ-metyl ete (4-Ô-Me---D-

GlcA) và nhóm thế acetyl (Aspinall, 1959, 1980; Vázquez et al., 2000). Ferulic vàP- axit
coumaric có thể được liên kết este với cấu trúc AX ở vị trí O-5 của một số

- - L-Arafđơn vị (Saulnier et al., 1995b; Ishii, 1997). Nhóm axetyl, ferulic vàP-axit coumaric dễ

dàng được giải phóng trong quá trình chiết xuất bằng kiềm (Puls và Schuseil, 1993). Các đơn

vị cấu trúc chính của AX được trình bày trong Hình 1 và cấu trúc giả định của AX trong Hình

2.

h COOH
h CH CH COOH COOH
h Ô Ô h Ô CH CH
h Ồ OH H Ồ h Ồ
Ồ h Ồ h
HỒ HOH2C h3khí CO
HỒ HỒ

h Ồ h Ồ h Ồ OCH3

D-xylo- L-arabino- 4-Ô-MeGlcA axit ferulic P-axit coumaric

pyranose furan hoá

Hình 1.Đơn vị cấu trúc chính của arabinoxylans.

Một số xylan ngũ cốc cũng có thể mang chuỗi bên chứa nhiều hơn một đơn vị đường

(Aspinall, 1970). Trong các chuỗi bên mở rộng hơn này, --L-Arafphần còn lại gắn vào chuỗi chính

xylan mang các nhóm thế bổ sung, chẳng hạn như các đơn vị galactose hoặc xylose (Aspinall,

1980). Các chuỗi bên đa dạng này đã được phân lập từ các mô được xếp hạng cao hơn của cây

ngũ cốc (Wilkie, 1979).

 21

Đisaccarit 2-Ô---D-XylP-L-Arafchuỗi bên, được gắn vào O-3 của chuỗi xylan chính, lần đầu tiên

được báo cáo trong lõi ngô AX và vỏ lúa mạch AX (Whistler và McGilvray, 1955; Aspinall và Ferrier,

1958; Kusakabe và cộng sự, 1983; Ebringerová và cộng sự, 1992). Sau đó, cấu trúc chuỗi bên này

cũng được xác định ở ngô (Zea maysL.) vỏ trấu và cám ngô AX (Hromádková và Ebringerová, 1995;

Saulnier et al., 1995a). Sự tồn tại của chuỗi bên disaccharidic này trong vỏ lúa mạch chiết xuất

bằng kiềm AX gần đây đã được Höije et al. (2006). Wende và Fry (1997) đã báo cáo rằng disacarit,

thường được este hóa bởi axit ferulic ở vị trí O-5 của Ara.fđơn vị, là một thành phần phổ biến của

các bức tường tế bào cỏ. Các mẫu nhóm thế chính khác nhau trong các bộ phận thực vật dựa trên

ngũ cốc khác nhau được thể hiện trong Bảng 1.

 22

Bảng 1.Các nhóm thế chính của các AX khác nhau từ cây ngũ cốc.
thay thế
nguồn AX - - L-Araf - - L-Araf - - L-Araf (4-Ô-Tôi-)--D-GlcA 2-Ô---D-XylP---L-Araf Thẩm quyền giải quyết

(1-3)đơn sắc (1-2)đơn sắc (1-2, 1-3)đi (1-2) (1-3)

Bột lúa mạch x x x Vietor và cộng sự, 1992; Trogh và
cộng sự, 2004 Aspinall và Ferrier,
vỏ lúa mạch x x x 1957; Höije và cộng sự, 2006

Lõi bắp x x x Ebringerová và cộng sự, 1992

vỏ ngô x x x Ebringerová và Hromádková, 1997

nội nhũ yến mạch x x Westerlund và cộng sự, 1993

Cám yến mạch x x Westerlund và cộng sự, 1993

nội nhũ lúa x Shibuya và Misaki, 1978

Cám gạo x x Ebringerová và Heinze, 2000

bột lúa mạch đen x x x Cyran và cộng sự, 2003

Verwimp và cộng sự, 2007

cám lúa mạch đen x x Roubroeks và cộng sự, 2000

Bột mì x x Cleemput và cộng sự, 1997

cám lúa mì x x x Brillouet và cộng sự, 1982; Schooneveld-

Bergmans và cộng sự, 1999 Sun và cộng sự,

rơm lúa mì x x 1996

 23

2.1.4 Phân bố nhóm thế trong ngũ cốc AX

Các nhóm thế không phải lúc nào cũng được phân phối thường xuyên trên đường
trục AX. Riêng đối với AX có lượng nhóm thế cao, người ta đã đề xuất sự luân
phiên giữa các vùng phân nhánh cao và ít phân nhánh (Ewald và Perlin, 1959;
Gruppen et al., 1993). Nói chung, thành tế bào nội nhũ ngũ cốc chứa arabinoxylan
phân nhánh cao, trong khi các mô phân nhánh cao hơn, chẳng hạn như cỏ, rơm,
vỏ trấu và lõi ngô, thường chứa AX ít phân nhánh hơn và bổ sung (4-Ô-methyl)
nhóm bên axit glucuronic (Aspinall, 1980). Cám lúa mạch đen, lúa mì, gạo và yến
mạch chứa AX phân nhánh cao tương tự như AX nội nhũ từ lúa mì, gạo và lúa
mạch đen. AX với mức độ phân nhánh thấp đã được báo cáo trước đó từ vỏ trấu,
rơm lúa mì và yến mạch (Hromádková et al., 1987; Schooneveld-Bergmans et al.,
1999; Puls et al., 2006). Tỷ lệ arabinose-to-xylose (Ara/Xyl) dao động từ 0,5 đến 0,8
trong nội nhũ ngũ cốc và từ 0,4 đến 1,2 trong cám thường xảy ra, nhưng người ta
cũng tìm thấy các biến thể tự nhiên rộng rãi. Tỷ lệ Ara/Xyl trong nội nhũ, lớp
aleurone, màng ngoài quả, vỏ quả và màng ngoài quả rất đa dạng, và màng ngoài
quả có thể có tỷ lệ Ara/Xyl cao nhất trong một số loại ngũ cốc (Izydorczyk và
Biliaderis, 1995; Glitsø và Bach Knudsen, 1999 ; Ordaz-Ortiz và cộng sự, 2005).

Thành tế bào của nội nhũ lúa mì và lúa mạch đen rất giàu AX. Tỷ lệ Ara/Xyl là khoảng 0,5

trong bột lúa mì và lúa mạch đen hòa tan trong nước AX từ Megazyme International Ireland

Ltd. (Bray, Ireland), nhưng cấu trúc liên quan đến loại -L-Arafthay thế khác nhau đáng kể.

Trong bột mì AX có khoảng 1/3 -L-Arafđược liên kết (1-3) với monosubstituting --D-XylPdư

lượng và hai phần ba là (1-2)- và (1-3)-được liên kết với thay thế kép --D-XylP(Sorensen và

cộng sự, 2006; Pitkänen và cộng sự, 2009). Bột lúa mạch đen AX đã thay thế đơn lẻ nhiều

hơn đáng kể --D-XylPdư lượng, kể từ hai phần ba của -L-Arafđược liên kết (1-3) thành mono-

và một phần ba thành thay thế kép --D-XylP, tương ứng (Höije và cộng sự, 2008; Pitkänen và

cộng sự, 2009). Cấu trúc AX của nội nhũ lúa mì được chiết xuất bằng kiềm tương ứng với cấu

trúc của nội nhũ lúa mì được chiết xuất bằng nước, mặc dù các biến thể nhỏ trong tỷ lệ Ara/

Xyl và trọng lượng phân tử đã được báo cáo (Gruppen et al., 1993). Tỷ lệ Ara/Xyl của các AX

khác nhau được chiết xuất từ các nguyên liệu ngũ cốc khác nhau được thể hiện trong Bảng

2.
 24

Ban 2.Tỷ lệ arabinose so với xyloza của các loại AX dựa trên ngũ cốc khác nhau được chiết xuất bằng các phương pháp
khác nhau. Dung môi được sử dụng để chiết xuất được sử dụng sau nhiều lần tiền xử lý khác nhau.

Dung môi cho AX Ara/Xyl

Nguồn gốc của AXE Thẩm quyền giải quyết
khai thác tỉ lệ
Bột lúa mạch kiềm (Ba(OH)2) 0,62 Viëtor và cộng sự, 1992 Trogh
Bột lúa mạch kiềm (Ba(OH)2) 0,71 và cộng sự, 2005 Aspinall và
vỏ lúa mạch kiềm (Ba(OH)2) 0,17 Ferrier, 1957 Höije và cộng sự,
vỏ lúa mạch kiềm (NaOH) 0,22 2005
vỏ lúa mạch kiềm (Ba(OH)2) 0,20 Pitkänen và cộng sự, 2008

mạch nha lúa mạch Nước 0,64 Dervilly và cộng sự, 2002 Kabel

Nhà máy bia ś ngũ cốc đã qua sử dụng kiềm (KOH) 0,48 và cộng sự, 2002a Kabel và

Nhà máy bia ś ngũ cốc đã qua sử dụng Nước 0,88 cộng sự, 2002a Ebringerová và

Lõi ngô kiềm (NaOH) 0,07 cộng sự, 1992 Kabel và cộng sự,

Lõi bắp kiềm (KOH) 0,11 2002a

Lõi bắp kiềm (NaOH) 0,06 Ramírez và cộng sự, 2008 Kabel và cộng
Lõi bắp Nước 0,72 sự, 2002a Ebringerová và Hromádková,
vỏ ngô kiềm (NaOH) 0,63 1997 MacArthur và D. Áppolonia, 1980
Cám yến mạch kiềm (NaOH) 1,07 Gruppen và cộng sự, 1991
đánh vần yến mạch kiềm (Ba(OH)2) 0,12
nội nhũ lúa kiềm (KOH) 0,84 Shibuya và cộng sự, 1985 Shibuya và cộng
Cám gạo kiềm (KOH) 0,97 sự, 1983 Ebringerová và cộng sự, 1994
cám lúa mạch đen kiềm (NaOH) 0,14 Hromádková và cộng sự, 1987 Hromádková
cám lúa mạch đen kiềm (NaOH) 0,18 và Ebringerová, 1987 Cyran và cộng sự, 2004
cám lúa mạch đen kiềm (NaOH) 0,87
bột lúa mạch đen kiềm (Ba(OH)2) 0,75
bột lúa mạch đen Nước 0,67 Cyran và cộng sự, 2003

lúa mạch đen Nước 0,59 Delcour và cộng sự, 1999

lúa mạch đen Nước 0,51 Nilsson và cộng sự, 2000

cám lúa mì kiềm (NaOH) 1.17 Brillouet và cộng sự, 1982 Gruppen và
cám lúa mì kiềm (Ba(OH)2) 0,73 cộng sự, 1991 Bataillon và cộng sự, 1998
cám lúa mì kiềm (NaOH) 0,39 Schoonveld-Bergmans và cộng sự, 1999
cám lúa mì kiềm (Ba(OH)2) 0,71 Nandini và Salimath, 2001 Maes và
cám lúa mì kiềm (Ba(OH)2) 0,81 Delcour, 2002
cám lúa mì kiềm (NaOH) 0,82
cám lúa mì kiềm (KOH) 0,40 Kabel và cộng sự, 2002a Maes
cám lúa mì Nước 0,56 và Delcour, 2002 Kabel và
cám lúa mì Nước 0,63 cộng sự, 2002a
cám lúa mì Nước 1,25 Hollmann và Lindhauer, 2005
Bột mì kiềm (Ba(OH)2) 0,52 Gruppen và cộng sự, 1991
Bột mì Nước 0,80 MacArthur và D. Áppolonia, 1980.
Bột mì Nước 0,52 Cleemput và cộng sự, 1997
Bột mì Nước 0,55 Dervilly-Pinel và cộng sự, 2001

rơm lúa mì kiềm (NaOH) 0,17 Sun và cộng sự, 1996

Đối với một số phân đoạn AX được chiết xuất được báo cáo trong ấn phẩm gốc, tỷ lệ Ara/Xyl trung bình được
tính toán tại đây.
 25

2.2 Enzyme thủy phân arabinoxylan

2.2.1 Enzyme thủy phân chuỗi chính xylan

Xương sống arabinoxylan bị phân hủy bởi glycoside hydrolase (GH) có khả năng thủy phân

liên kết glycosid giữa (1-4) --D-Xyl được liên kếtPcác đơn vị. Các enzym như vậy được sản

xuất ví dụ như bởi các loại vi khuẩn và nấm khác nhau. Xương sống AX của thực vật được

thủy phân ngẫu nhiên, sử dụngkết thúc-1,4---D-xylanase (EC 3.2.1.8), tạo ra hỗn hợp các

oligosacarit khác nhau. Các xylanase hiện được phân loại dựa trên sự tương đồng về cấu

trúc và trình tự trong các họ GH 5, 7, 8, 10, 11 và 43, nhưng nghiên cứu chủ yếu tập trung

vào họ GH10 và GH11 (CAZy - Carbohydrate Active enZymes; Collins et al., 2005).

Các xylanase GH10 và GH11 có các đặc tính xúc tác riêng biệt. Pell et al. (2004) và
Fujimoto et al. (2004) đã quan sát thấy rằng họ GH10 chứa các enzym có vị trí xúc tác
hơi đa dạng so với enzym GH11, dẫn đến sự khác biệt nhỏ trong các sản phẩm cuối
thủy phân của chúng. Các xylo-oligosacarit tạo ra từ hoạt động của GH10 xylanase
ngắn hơn so với các xylo-oligosacarit được tạo ra bởi GH11 xylanase. GH11 xylanase bị
cản trở bởi sự hiện diện của các nhóm phụ, trong khi GH10 xylanase có thể hoạt động
gần nhóm thế, tạo thành oligosacarit mang nhóm thế ở đầu cuối không khử

của --D-XylPdư lượng (Biely và cộng sự, 1997; Vardakou và cộng sự, 2003; Beaugrand và cộng sự, 2004;

Maslen và cộng sự, 2007) (Hình 2). AXOS ngắn nhất được sản xuất là --L-Araf-(1-3)---D-

XylP-(1-4)-D-XylP(MỘT3X) và --D-XylP-(1-4)[--L-Araf-(1-3)]---D-XylP-(1-4)-D-XylP(XA3X).
Các nhóm thế feruloyl không cản trở hoạt động của xylanase, vì feruloyl
arabinoxylobiose là oligosacarit lên men ngắn nhất được giải phóng bởi GH10
xylanase (Vardakou et al., 2003). Hệ thống đặt tên cho oligosacarit được áp dụng
từ Fauré et al. (2009).

Ngoài rakết thúc-1,4---D-xylanase, có những enzym có khả năng thủy phân

chuỗi xyloza từ đầu.exo-1,4---D-xylosidase (EC 3.2.1.37) giải phóng các đơn vị xyloza từ
đầu không khử của XOS, nhưng hiệu quả giảm khi chiều dài chuỗi XOS tăng (Biely,
1985). một sốexo-1,4---D-xylosidase cũng có thể thủy phân chậm xylan cao phân tử
(Margolles-Clark và cộng sự, 1996), nhưng các nhóm thế cuối cùng, chẳng hạn
 26

như (1-2)-liên kết 4-Ô---D-MeGlcA, ở đầu không khử của chuỗi xyloza ngăn cản
hoạt động của enzym (Poutanen et al., 1990). Hơn nữa, áp chót (1-3)-liên kết
- - L-Arafdư lượng ngăn chặnexo-1,4---D-xylosidase từTrichoderma reeseitừ
thủy phân liên kết --1,4-glycosid trước đơn vị xyloza được thay thế (Tenkanen et al., 1996).

Ngoài ra, các exo-oligoxylanase giải phóng xyloza ở đầu khử (EC 3.2.1.156) có thể thủy phân

(A)XOS hơn nữa thành các oligosacarit thậm chí còn ngắn hơn (Tenkanen và cộng sự, 2003).

Enzyme được đề cập cuối cùng không thể thủy phân xylobiose, trong

tương phản vớiexo-1,4---D-xylosidaza. Vị trí hoạt động của các enzyme thủy phân chuỗi
chính xylan được trình bày trong Hình 2.

2.2.2 Enzim tác dụng lên--L-Arafnhóm thế

--L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) là các enzym phân cắt đầu cuối Arafdư lượng -từL-
các polysacarit và oligosacarit khác nhau. Các arabinofuranosidase tác động lên - L-
polyme AX (arabinoxylan arabinofuranohydrolases, AXH) được phân chia thêm tùy theo
đặc tính cơ chất của chúng, vì một số tác động lên (1-2)- và (1-3)-L-Ara được liên kếtf
đơn vị trên monosubstituting --D-XylPdư lượng (AXH-

m), trong khi những người khác chỉ phát hành (1-3)-liên kết -L-Arafcác đơn vị từ bị loại bỏ --

D-XylPdư lượng (AXH-d3) (van Laere et al., 1997) (Hình 2). Hầu hết -Larabinofuranosidase

được phân lập, chẳng hạn như từnấm mốc Aspergillus(Kormelink và cộng sự, 1993c),

Pseudomonas huỳnh quang(Kellett, 1990) và lúa mì (Beldman et al., 1996), chỉ hoạt động
trên --L-Arafdư lượng trên thay thế đơn lẻ --D-XylPdư lượng (AXH-m).

AXH-d3-type -arabinofuranosidase được phân lập từBifidobacterium vị thành niên (van

Laere và cộng sự, 1997, 1999) vàmiếng lót Humicola(Sørensen và cộng sự, 2006).

-arabinofuranosidase được báo cáo đầu tiên, có thể giải phóng --L-Araftừ cả đơn lẻ và đôi

thay thế --D-XylP, được phân lập từ mạch nha lúa mạch (Ferré et al., 2000). Cái này --

arabinofuranosidase có thể hoạt động trên các liên kết ở đầu cuối không khử --D-XylPvới

một hoặc hai --L-Arafnhóm thế, nhưng không cho thấy hoạt động đối với thay thế kép

nội bộ --D-XylP. AXH-m và AXH-d3 có tính đặc hiệu cao, hoạt động trên các polyme và oligome, là

những công cụ tuyệt vời để sử dụng trong việc sửa đổi tỷ lệ phân nhánh của AX và AXOS.
 27

2.2.3 Enzim tác dụng lên nhóm thế khác

Xylan --1,2-glucuronidase (EC 3.2.1.131) thủy phân liên kết giữa (4-Ô-
methyl)---nhóm thế D-glucopyranosyl và --D-XylPđơn vị. --1,2-Glucuronidase hoạt động được

tìm thấy trong vi khuẩn và nấm (Pul et al., 1987). Một số glucuronidase có thể hoạt động

trên xylan cao phân tử và một số trên oligosacarit (Khandke et al., 1989; Tenkanen và Siika-

aho, 2000). Các nhóm axetyl được loại bỏ bởi các este axetyl xylan (EC 3.1.1.72), tách các

nhóm axetyl khỏi các vị trí O-2 và O-3 của --D-XylPđơn vị (Biely, 1985; Kormelink và Voragen,

1993). Enzyme quan trọng hơn trong việc biến đổi AX có thể chiết xuất bằng nước, vì trong

quá trình chiết xuất AX bằng kiềm, hầu hết các nhóm acetyl đều bị loại bỏ. Hơn nữa, các este

feruloyl (EC 3.1.1.73) có thể cắt các liên kết este

giữa ferulic hoặcP-axit coumaric và --L-Arafđơn vị (Smith và Hartley, 1983).

 Một một, b Một f OCH3
đ Ô
HỒ HỒ Ồ
đ e Ồ
HOOC
Ồ Ồ Ồ Ô
CH2Ồ CHOH
2
Ồ CHOH CHOH
2
HỒ HỒ HỒ 2 HỒ
Ô
Ô Ô Ô Ô Ô Ô Ô
Ồ Ồ Ô Ồ Ồ
Ồ Ồ Ô
Ô HỒ Ô HỒ Ô HỒ Ô HỒ Ô HỒ Ô HỒ Ô HỒ
HỒ Ô Ô Ô Ô Ô Ô Ô Ô Ô Ô Ô
HỒ Ô HỒ
Ô Ồ
Ô HỒ Ô
Ồ Ồ Ô Ô Ô Ô Ô Ồ
Ồ Ồ
Ô Ô Ô Ô

Ồ Ồ
HOH2C HOH2C

Ồ Ồ

a, b, ca Một đ Một
28

Ồ Ồ
HỒ Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ô Ô
Một.kết thúc-1,4---D-xylanase GH10 (EC 3.2.1.8) HỒ
Ồ
Ô Ô HỒ
Ô Ồ
b.kết thúc-1,4---D-xylanase GH11 (EC 3.2.1.8) Ô đ
Ồ
HOH2C
c.exo-1,4---D-xylosidase (EC 3.2.1.37)
Ồ
d. --L-arabinofuranosidase AXH-m (EC 3.2.1.55)
đ. --L-arabinofuranosidase AXH-d3 (EC 3.2.1.55) c g
f. --glucuronidaza (EC 3.2.1.131)
g. khử exo-oligoxylanase giải phóng xyloza cuối (EC 3.2.1.156)

Nhân vật2.Cấu trúc arabinoxylan dựa trên ngũ cốc giả thuyết và các glycanaza thủy phân xương sống xylan (ac) và các glycanaza giải
phóng các nhóm thế được trình bày (df). Chức năng khử exo-oligoxylanase (g) giải phóng xyloza cuối được hiển thị trên AXOS.
 29

2.3 Điều chế enzym của arabinoxylo-oligosacarit

Arabinoxylo-oligosacarit (AXOS) có thể được sản xuất từ arabinoxylan polyme, sử

dụng quá trình thủy phân axit hạn chế, xử lý thủy nhiệt (tự động thủy phân), xay xát
khô hoặc thủy phân bằng enzym (Garrote và Parajó, 2002; Tenkanen, 2004; Van
Craeyveld và cộng sự, 2009) . Chỉ quá trình thủy phân bằng enzym mới cho phép điều
chỉnh cụ thể các sản phẩm cuối cùng và có thể thu được AXOS có mức độ polyme hóa
(DP) và kiểu thay thế mong muốn. Các phương pháp khác được đề cập ở trên tạo ra
nhiều hỗn hợp oligosacarit bừa bãi hơn với mức độ trùng hợp và thay thế khác nhau.
Việc chuẩn bị enzym của AXOS được mô tả chi tiết trong các phần sau.

Enzyme tinh khiết cho phép điều chỉnh thành công các sản phẩm cuối cùng của
quá trình thủy phân, trong khi hỗn hợp enzyme thương mại thường chứa sự kết
hợp của các enzyme khác nhau có thể ảnh hưởng đến kiểu thủy phân. DP và mức
độ thay thế (DS) có thể được giảm hiệu quả bằng các enzym khác nhau. Sản phẩm
thủy phân chủ yếu là xylose, XOS và AXOS mạch thẳng không thế. Tuy nhiên, nếu
xương sống xyloza được thay thế nhiều, thì không có vị trí nào trên xương sống
mà các enzym có thể tiếp cận được. Để phân tích cấu trúc, AXOS phải được phân
lập khỏi các sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác. Sắc ký thẩm thấu
gel (GPC) và sắc ký trao đổi anion (AEC) là các phương pháp được sử dụng rộng rãi
trong việc phân tách chuẩn bị monosacarit và các oligosacarit khác nhau, dựa trên
sự khác biệt về kích thước và điện tích của chúng (Kormelink et al., 1993b; Kabel et
al., 2002c) . AXOS,

2.3.1 AXOS từ AX bị cô lập

AXOS, với DP từ 3-11, đã được điều chế và xác định trong các nghiên cứu được trình bày

trong Bảng 3. Các nghiên cứu toàn diện nhất về phân lập và mô tả cấu trúc của AXOS được

thực hiện sau quá trình thủy phân nội nhũ lúa mì AX vớinấm mốc Aspergillus xylanase I và

III, không may là không được gán vào họ GH nhưng hầu hết có lẽ là thành viên của GH10 và

GH11 tương ứng (Gruppen et al., 1992; Kormelink et al., 1993a; Viëtor et al., 1994).

Kormelink và cộng sự. (1993b) báo cáo rằngA. awamori endo-

 30

1,4---D-xylanase Tôi đã chuyển đổi 72% AX của bột mì thành mono-, di- và oligosacarit
với DP 3-10, trong khi xylanase III thủy phân 50% AX thành oligosacarit với DP 5-10.nội
soi-1,4---D-xylanase Tôi có thể tạo ra AXOS thay thế đơn lẻ và kép bằng các nhánh đầu
cuối không khử. AXOS với ít nhất một đơn vị xyloza không được thay thế trong thiết bị
đầu cuối không khử trước khi dư lượng xyloza phân nhánh được tạo ra bởikết thúc
-1,4---D-xylanaza III. Tương tự, các AXOS ngắn hơn cũng được hình thành

bởi GH10 kháckết thúc-1,4---D-xylanase so với GH11 được trình bày trong Bảng 3.

Số lượng AXOS được tạo ra hiếm khi được xác định. Vietor et al. (1994) đã báo cáo năng suất

24% trọng lượng đối với tất cả các mono- và oligosacarit được định lượng từ lúa mạch AX

sau khi xử lý bằng xylanase. Trong nghiên cứu của Ordaz-Ortiz et al. (2004), 8% trọng lượng

AXOS với DP 4-9 đã được xác định và định lượng sau khi xử lý AX xylanase bột mì. AXOS

chính (XA3XX) với hiệu suất cao nhất bao gồm 3% (77 mg) của tất cả các AXOS được định

lượng.

Một chuỗi bên disaccharidic khá hiếm gặp trong ngũ cốc, cụ thể là 2-Ô---D-XylP---L-Araf
, đã được báo cáo trong AXOS thu được bởi gia đình GH 11kết thúc-1,4---D-xylanase
thủy phân vỏ lúa mạch AX. Hexasacarit này (--D-XylP-(1-4)-[--D-XylP-(1-2)---L-Araf-

(1-3)]---D-XylP-(1-4)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl) (XD2,3XX), đã được phân lập và cấu trúc

được xác định bởi Höije et al. (2006).

Chuẩn bị thương mại Ultraflo (Novo-Nordisk A/S, Bagsvaerd, Đan Mạch) cũng đã được sử

dụng để điều chế AXOS. Ultraflo là một chế phẩm --glucanase được sản xuất bởimiếng lót

Humicolavà nó chứa các hoạt động phụ như cellulase, xylanase, arabinase và feruloyl
esterase (Faulds et al., 2002). Broberg và cộng sự. (2000) đã xử lý mạch nha lúa mạch chiết

xuất AX bằng Ultraflo và xác định sáu loại AXOS khác nhau (A2XX, MỘT2+3XX, XA2+3XX, MỘT2

XXX, MỘT2+3XXX). Lượng AXOS trong các phân số thu được là 3-18 g (4-26nmol).
 31

Bàn số 3.Arabinoxylo-oligosacarit thu được trong quá trình thủy phân các AX khác nhau được chiết xuất từ các
nguyên liệu làm từ ngũ cốc. Các AXOS chính được sản xuất được gạch dưới.
Enzim họ GH Chất nền (AX)
AXOS Thẩm quyền giải quyết
(Sinh vật sản xuất) nguồn gốc

nội soi-1,4---Họ GH D-xylanase Lúa mì MỘT3X Dekker và

HC-II không được xác định ( nội nhũ MỘT3XX Richards, 1975
Ceratocystis nghịch lý) MỘT3XXX

nội soi-1,4---D-xylanaza Bột mì XA3XX Hoffmann và cộng sự,

GH11* XA2+3XX 1991
(Aspergillus) XA3XXX
XXA3XX
XA2+3XXX
XXA2+3XX

nội soi-1,4---D-xylanaza I Bột mì MỘT3X Kormelink và cộng sự,

GH10* XA3X 1993b;
(nấm mốc Aspergillus) MỘT3MỘT3X Gruppen và cộng sự,

MỘT2+3XX 1993
MỘT2+3MỘT3X

XA3MỘT3X
XA2+3XX
MỘT3MỘT2+3XX

MỘT2+3MỘT2+3XX
XA3MỘT2+3XX
XA2+3MỘT2+3XX
XA2+3XA2+3XX

nội soi-1,4---D-xylanaza III Bột mì XA3XX Kormelink và cộng sự,

GH11* XA2+3XX 1993b;
(nấm mốc Aspergillus) XXA3XX Gruppen và cộng sự,

XA3MỘT3XX 1993
XXA2+3XX
XA3MỘT2+3XX
XA2+3MỘT2+3XX
XA2+3MỘT3XX
XXA3MỘT3XX
XXA3MỘT2+3XX
XA3MỘT2+3XXX
XA3XA3XX
XA2+3XA2+3XX
XA3XXA3XX
XXA3XA3XX

nội soi-1,4---D-xylanaza I vách tế bào lúa mạch MỘT3X Vietor và cộng sự,

GH10* XA3X 1994

(nấm mốc Aspergillus) MỘT2XX
MỘT2+3XX
XA2+3XX
MỘT3MỘT3X

XA3MỘT3X
MỘT2MỘT3X

MỘT2+3MỘT3X
 32

Bàn số 3.tiếp tục

Enzim họ GH Chất nền (AX)
AXOS
(Sinh vật sản xuất)
Thẩm quyền giải quyết
nguồn gốc

nội soi-1,4---D-xylanaza Bột mì XA2XX van Laere và cộng sự,

GH11 MỘT2+3XX 2000
(Aspergillus tubingensis) XA2+3XX
XA3MỘT2+3XX
X2+3MỘT2+3XX
XA2+3XA2+3XX

nội soi-1,4---D-xylanaza I Nhà máy bia ś dành MỘT3X Kabel và cộng sự,

GH10* ngũ cốc XA3X 2002a,

(nấm mốc Aspergillus) MỘT2+3XX Kabel và cộng sự,

XA2+3XX 2002b

nội soi-1,4---D-xylanaza I Lõi bắp MỘT3X Kabel và cộng sự,

GH10* MỘT2XX 2002a

(nấm mốc Aspergillus) XA3X

nội soi-1,4---D-xylanaza I cám lúa mì Kabel và cộng sự,

MỘT3X
GH10* 2002a
XA3X
(nấm mốc Aspergillus)

nội soi-1,4---D-xylanaza Bột mì XA3X Ordaz-Ortiz và cộng sự,

GH11 XA3XX 2004
(Trichoderma viride) XA2+3XX
XA3MỘT3XX
XA3MỘT2+3XX
XA2+3MỘT3XX
XA2+3MỘT2+3XX
XA3XA3XX

nội soi-1,4---D-xylanaza M3 vỏ lúa mạch XD2,3XX Höije và cộng sự,

GH11 2006
(Trichoderma longibrachiatum)

nội soi-1,4---D-xylanaza† Bột mì XA3X Puchart và

GH11 XA2+3X Bialy, 2008
(Thermomyces lanuginosus) XA3XX
XA2+3XX
XA3MỘT3XX
XA2+3MỘT3XX
XA3MỘT2+3XX
XA3XA3XX
XXA2+3XX
XA3MỘT2+3MỘT3XX
XA2+3XA2+3XX
XA2+3XA3XX
XA2+3XXA2+3XX
XA3XA3XA3XXXA
2+3XXA3XX
XA2+3MỘT2+3XX
XA3XXA3XX
* Rất có thể thuộc về các họ GH được chỉ định
†AXOS thu được từ quá trình lên men AX bởi nấmT. lanuginosus, enzyme không tinh khiết
 33

2.3.2 AXOS từ vật liệu lignocellulose

Ngoài việc điều chế AXOS từ AX chiết xuất, AXOS cũng có thể được sản xuất trực tiếp từ
vật liệu lignocellulose. Trong nghiên cứu của Swennen et al. (2006), AXOS được sản
xuất trên quy mô lớn từ cám lúa mì (500 kg). Cám lúa mì lần đầu tiên được khử bằng
enzyme và khử protein và sau đó được xử lý bằngBacillus subtilisGH11kết thúc-1,4---D-
xylanaza. AXOS thu được được phân đoạn bằng kết tủa etanol được phân loại, trong đó
nồng độ etanol được tăng dần cho đến khi đạt được nồng độ cuối cùng là 90% (v/v).
AXOS được tạo ra có DP trung bình là 15 và tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27. Sản lượng của AXOS là
6% trọng lượng với độ tinh khiết là 72%. --D-XylPcác đơn vị nói chung là

thế đơn với --L-ArafDư lượng O-3, nhưng AXOS thu được với 40-70%
kết tủa ethanol chứa gần như nhiều --L-Arafthay thế kép --D-XylP các đơn vị. Trong
nghiên cứu của Maes et al. (2004), cám lúa mì đã tách tinh bột và khử protein (1000 g)

được ủ vớikết thúc-1,4---D-xylanaza từB. subtilis(GH11; Grindamyl H640, Danisco A/S,

Copenhagen, Đan Mạch) vàAspergillus aculeatus(GH10; Shearzyme 500L, Novozymes A/S,

Bagsvaerd, Đan Mạch).nội soi-1,4---D-xylanaza từB. subtilisđã có thể thủy phân 41% khối

lượng AX không chiết xuất được trong nước thành AXOS với DP trung bình là 15, trong khi

A. aculeatus endo-1,4---D-xylanase chỉ thủy phân 18% khối lượng (DP trung bình là 8). Giống nhau

nghiên cứu cho thấy rằng,A. aculeatus endo-1,4---D-xylanase chủ yếu phân hủy AX có thể chiết

xuất trong nước.

2.4 Các phương pháp phân tách và phát hiện trong phân tích AXOS

Carbohydrate hầu như không hấp thụ tia cực tím (UV), do không có liên kết - và do đó,
phương pháp phát hiện chỉ số khúc xạ (RI) hoặc điện hóa (EC) được sử dụng trong
phân tích của chúng. Phát hiện EC đã trở thành phương pháp phân tích ưa thích, đặc
biệt là trong phân tích dấu vết, do giới hạn phát hiện thấp (mức picomolar) (Johnson và
LaCourse, 1990; Lee, 1990; Johnson và cộng sự, 1993). Sắc ký trao đổi anion hiệu năng
cao kết hợp với phát hiện ampe kế xung (HPAEC-PAD) hiện được sử dụng thường
xuyên để phân tách và phân tích oligosacarit. HPAEC-PAD có khả năng phân giải đặc
biệt các đồng phân oligosacarit trung tính và tích điện (Lee, 1990, 1996; Kabel et al.,
2002c). Hơn nữa, khả năng tái sản xuất của HPAEC-PAD là thuận lợi (Thayer et al.,
 34

1998). Một trong những ưu điểm lớn nhất của HPAEC-PAD là khả năng phân tách các
oligosacarit kém hoạt động (Lee, 1990).

Cacbohiđrat là axit yếu có pKMột> 12, và trong cột trao đổi anion, quá trình phân tách
đạt được ở độ pH cao, sử dụng dung dịch kiềm mạnh (NaOH 0,1 M) (Lee, 1990; Johnson
et al., 1993). Sự phân ly của các proton từ các nhóm hydroxyl ở độ pH cao tạo ra các
oxyanion được cột HPAEC giữ lại (Thayer et al., 1998). Thời gian lưu (tr) tương quan
nghịch với pKMộtgiá trị và tăng lên khi tăng khối lượng phân tử của carbohydrate. Thời
gian lưu có thể giảm đáng kể bằng cách bổ sung các ion axetat (OAc-) (Johnson và cộng
sự, 1993).

2.4.1 Lưu giữ monosacarit

Dự đoán thứ tự rửa giải của monosacarit là phức tạp, do trạng thái cân bằng phức tạp của

chúng giữa pyranoses và furanoses, và -- và --anomers. Một số quy tắc rửa giải chính có thể

được nêu dựa trên hóa học lập thể carbohydrate và các nhóm chức năng. Nhóm hydroxyl dị

thường của carbohydrate có tính axit cao hơn các nhóm khác và ảnh hưởng nhiều nhất. Thứ

tự rửa giải phần lớn tương ứng với pKMộtgiá trị của carbohydrate và trong số các pentose

monosacarit có pK cao hơnMộtrửa giải đầu tiên, ví dụ như arabinose (pKMột

12.43) rửa giải trước xyloza (pKMột12.29). Hơn nữa, các đồng phân 1-OH theo trục là

dự kiến sẽ là axit mạnh hơn so với --anome xích đạo 1-OH, và lượng -- anome dự kiến sẽ

cao hơn nhiều trong mannose so với glucose, điều này có thể giải thích cho việc rửa giải

glucose sớm hơn. Về hexose và pentose đồng hình, pentose dường như rửa giải sớm hơn

(L-arabinose < D-galactose). Tuy nhiên, xyloza thiếu 5-CH2OH (Hình 3) nhưng mặt khác

tương tự như glucose, rửa giải muộn hơn glucose có tính axit hơn (pKMột12.35) (Lee, 1990).

Ồ Ồ Ồ h
h
Ô HỒ Ô h Ô h Ô h Ô
OH H Ồ h Ồ h Ồ h Ồ h Ồ
Ồ h Ồ Ồ Ồ h Ồ h
HOH2C h HỒ hÔ HỒ
h Ồ h Ồ h h h Ồ h Ồ

L-arabino- D-galacto- D-manno- D-glucozơ- D-xylo-

furan hoá pyranose pyranose pyranose pyranose

Hình 3.Cấu trúc của L-arabinofuranose, D-galactopyranose, D-mannopyranose,

Dglucopyranose và D-xylopyranose.
 35

2.4.2 Lưu giữ oligosacarit

Với các oligosacarit, vị trí của các liên kết glycosid và cấu trúc hình dạng tổng thể trở
thành các yếu tố quan trọng và các yếu tố khác ngoài tính axit của các nhóm 1-OH có
ảnh hưởng nhiều hơn đến thứ tự rửa giải. Trong nghiên cứu của Roberts et al. (1971),
pK khác nhauMộtcác giá trị đã được tìm thấy cho mỗi nhóm hydroxyl. Họ đã báo cáo
tính axit của các nhóm hydroxyl trong metyl -- hoặc --D-glucopyranoside là 2-OH > 6-
OH > 3-OH > 4-OH. Do đó, việc che phủ hoặc biến đổi một số nhóm hydroxyl ảnh
hưởng đến thứ tự rửa giải của oligosacarit. Nói chung, khối lượng lưu giữ tăng khi DP
tăng. Vị trí liên kết ảnh hưởng đến quá trình rửa giải theo thứ tự sau đối với glucose
oligosacarit: --1,3 > --1,3 > --1,4 > --1,4 > --1,6 > --1,2 > --1,6 (Koizumi et al., 1991) và do
đó thứ tự rửa giải là khác nhau đối với các disacarit D-glucose khác nhau. Vì thời gian
lưu của oligosacarit từ chuỗi Xyl-(1,4) là

ngắn hơn so với sê-ri Glc-(1,4) và sự khác biệt duy nhất giữa sê-ri là không có -CH2
OH từ xyloza, người ta đã kết luận rằng 6-OH có thể tiếp cận được bằng bề mặt
nhựa. Mặt khác, ngay cả với các nhóm 6-OH tự do, chuỗi Man-(1,4) (Hình 3) rửa
giải ngay cả trước chuỗi xyloza tương ứng, và do đó có ý kiến cho rằng sự hiện
diện của 2-OH dọc trục bằng cách nào đó cản trở sự tương tác giữa oligosacarit và
nhựa (Lee, 1990).

Thông tin về việc lưu giữ oligosacarit phân nhánh còn hạn chế. Tuy nhiên, hai yếu tố có
tác dụng trong việc xác định thứ tự rửa giải: 1) độ axit tương đối của các nhóm
hydroxyl và 2) khả năng tiếp cận của các oxyanion oligosacarit đối với các nhóm chức
của pha tĩnh. Hardy và Townsend (1988) đã nghiên cứu việc tách các oligosacarit trung
tính khỏi glycoprotein, nhưng kết quả không thể áp dụng trực tiếp cho AXOS.

2.4.3 Phát hiện ampe kế xung

Trong phát hiện ampe kế xung, cacbohydrat bị oxy hóa ở điện cực vàng (Au)
(Johnson và LaCourse, 1990). PAD, với điện cực làm việc Au, được phát triển để cho
phép đổi mới thường xuyên bề mặt điện cực làm việc. Độ nhạy cao để phát hiện
anot của cacbohydrat ở điện cực Au yêu cầu pH 12 (Johnson et al.,
 36

1993). Chức năng của điện cực có thể được chia thành ba bước. Trong bước đầu tiên,
cacbohydrat bị oxy hóa ở điện cực Au, dẫn đến dòng oxy hóa cụ thể và trong bước này,
tín hiệu được thu thập. Tiếp theo là một điện thế dương lớn để đạt được sự hình thành
anốt của các oxit bề mặt để làm sạch điện cực. Giai đoạn cuối cùng là bước kích hoạt
lại, vì bề mặt điện cực bị oxy hóa bị khử trở lại bề mặt Au phản ứng. Quá trình oxy hóa
glucose ở dạng mạch hở trên PAD trong bước đầu tiên được mô tả như sau: xảy ra quá
trình oxy hóa hai electron đầu tiên rất nhanh của aldehyd thành axit cacboxylic tương
ứng, tiếp theo là các bước tương đối nhanh dẫn đến sự phân cắt liên kết C1-C2 sản
xuất CHO2H, sau đó C2 và C6 được chuyển thành cacboxylat tương ứng. Sự phân cắt
anot tuần tự tiếp theo của các cacbon cuối cùng còn lại xảy ra chậm và các electron
được giải phóng trong quá trình oxy hóa được phát hiện (Johnson và LaCourse, 1990).

PAD không cung cấp phản ứng đồng nhất đối với carbohydrate bao gồm các đơn vị monosacarit giống nhau nhưng với sự sắp xếp cấu trúc khác nhau của

dư lượng. Do đó, kỹ thuật này yêu cầu một tiêu chuẩn định lượng cho từng oligosacarit được xác định (Lee, 1990). Đây là một nhược điểm nghiêm trọng, vì

các hợp chất tham chiếu cho các oligosacarit phức tạp không có sẵn và do đó phải tự điều chế. Thông tin trước đây về các phản ứng đối với oligosacarit, bao

gồm cả AXOS, bị hạn chế. Khi phân tích định lượng được thực hiện, sự lựa chọn giữa đo diện tích hoặc chiều cao là sự thỏa hiệp giữa một số yếu tố. Khi tích

phân các pic, chiều cao pic hoặc diện tích pic có thể được sử dụng khi đạt được độ phân giải và hình dạng pic tốt. Đôi khi chiều cao cực đại chính xác hơn

diện tích khi đo đại lượng, mặc dù diện tích được sử dụng rộng rãi hơn trong sắc ký (Dyson, 1998). Snyder (1972) chỉ ra rằng chiều cao ít bị ảnh hưởng bởi sự

chồng lấp hơn so với diện tích có các đỉnh đối xứng, trong khi Meyer (1995) chứng minh rằng chiều cao là lựa chọn an toàn hơn trong việc đo các đỉnh chồng

lấn nhỏ. Hơn nữa, sai số tích phân đối với các phép đo chiều cao trong hầu hết mọi tình huống đều nhỏ hơn so với các phép đo diện tích tương ứng. Một

thiếu sót của việc sử dụng chiều cao pic là chiều cao là một hàm của độ rộng pic, làm cho điều này phụ thuộc vào hiệu suất của cột chứ không phải số lượng

của phân tử được đo. Tuy nhiên, để tích hợp, chiều cao cực đại có thể được khuyến nghị trong một số trường hợp (Bicking, 2006). trong khi Meyer (1995)

chứng minh rằng độ cao là lựa chọn an toàn hơn trong việc đo các đỉnh nhỏ chồng lên nhau. Hơn nữa, sai số tích phân đối với các phép đo chiều cao trong

hầu hết mọi tình huống đều nhỏ hơn so với các phép đo diện tích tương ứng. Một thiếu sót của việc sử dụng chiều cao pic là chiều cao là một hàm của độ

rộng pic, làm cho điều này phụ thuộc vào hiệu suất của cột chứ không phải số lượng của phân tử được đo. Tuy nhiên, để tích hợp, chiều cao cực đại có thể

được khuyến nghị trong một số trường hợp (Bicking, 2006). trong khi Meyer (1995) chứng minh rằng độ cao là lựa chọn an toàn hơn trong việc đo các đỉnh

nhỏ chồng lên nhau. Hơn nữa, sai số tích phân đối với các phép đo chiều cao trong hầu hết mọi tình huống đều nhỏ hơn so với các phép đo diện tích tương

ứng. Một thiếu sót của việc sử dụng chiều cao pic là chiều cao là một hàm của độ rộng pic, làm cho điều này phụ thuộc vào hiệu suất của cột chứ không phải

số lượng của phân tử được đo. Tuy nhiên, để tích hợp, chiều cao cực đại có thể được khuyến nghị trong một số trường hợp (Bicking, 2006).
 37

2.5 Prebiotic và men vi sinh

2.5.1 Định nghĩa về pro- và prebiotic

Nghiên cứu về các hợp chất tiền sinh học và vi khuẩn sinh học đã hoạt động trong hơn một thập

kỷ. Probiotic là “một thành phần thực phẩm vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe” (Salminen et al.,

1998). Các ảnh hưởng sức khỏe liên quan đến việc sử dụng men vi sinh bao gồm: làm giảm các

triệu chứng kém hấp thu đường sữa, cải thiện sức đề kháng tự nhiên đối với các bệnh truyền

nhiễm ở đường tiêu hóa, ức chế ung thư, giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, cải thiện

tiêu hóa và kích thích miễn dịch đường tiêu hóa (Collins và Gibson, 1999 ).

Các hợp chất prebiotic được nhắm mục tiêu để kích thích sự phát triển của
bifidobacteria và lactobacilli được công nhận là men vi sinh tăng cường sức khỏe
(Gibson và Roberfroid, 1995). Gibson và cộng sự. (2004) đã đưa ra định nghĩa mới
nhất về hợp chất prebiotic: "Prebiotic là một thành phần lên men có chọn lọc cho
phép những thay đổi cụ thể, cả về thành phần và/hoặc hoạt động trong hệ vi sinh
vật đường tiêu hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và sức khỏe của vật chủ." Do đó,
để đánh giá các đặc tính tiền sinh học của các hợp chất khác nhau, ba tiêu chí đã
được thiết lập bởi Gibson et al. (2004): 1) Một hợp chất prebiotic nên chống lại axit
dạ dày,

Đường tiêu hóa của con người (GIT) là một hệ vi mô trong đó vi khuẩn có lợi, có khả năng gây

bệnh và có hại cùng tồn tại. Các chức năng sinh lý bình thường được kích hoạt, trừ khi vi khuẩn có

hại và có khả năng gây bệnh chiếm ưu thế. Do đó, việc duy trì trạng thái cân bằng hợp lý của hệ vi

sinh vật là rất quan trọng và có thể được hỗ trợ bằng cách sử dụng men vi sinh, prebiotic hoặc sự

kết hợp của chúng, synbiotic, trong chế độ ăn uống (Bielecta và cộng sự, 2002).
 38

2.5.2 Các prebiotic (oligo)sacarit tiềm năng

Fructo-oligosacarit, galacto-oligosacarit và lactulose được lên men có chọn lọc bởi men vi

sinh và do đó có thể được gọi là prebiotic (Gibson et al., 2004). Ngoài ra, tiềm năng tiền sinh

học của một số oligosacarit khác đã được thử nghiệm. Ví dụ, xylo-oligosacarit tuyến tính đã

cho thấy kết quả đầy hứa hẹn trongtrong ống nghiệmVàtrong cơ thể sốngnghiên cứu

(Okazaki và cộng sự, 1990; Crittenden và Playne, 1996; Vázquez và cộng sự, 2000). XOS được

báo cáo là ổn định trong một loạt các giá trị pH (2,5-8,0) và khó tiêu hóa trong đường tiêu

hóa (Vázquez et al., 2000). Tuy nhiên, oligosacarit tuyến tính có thể được lên men nhanh

chóng trong ruột kết và do đó oligosacarit có cấu trúc carbohydrate phức tạp hơn hiện đang

được nghiên cứu để tìm ra prebiotic lên men chậm hơn (Voragen, 1998; Kabel et al., 2002b).

Hơn nữa, chưa có bằng chứng nào cho thấy XOS kích thích chọn lọc sự phát triển của vi

khuẩn bifidobacteria, vì ngoài bifidobacteria,vi khuẩn, ClostridiumVàLactobacilluscũng có

thể chuyển hóa XOS (Moura et al., 2007).

Một nhóm tiềm năng là arabinoxylo-oligosacarit có nguồn gốc từ arabinoxylan, có thể

có các cấu trúc hóa học khác nhau, tùy thuộc vào nguồn xylan và phương pháp phân
hủy được sử dụng (Grootaert et al., 2007). Cả AXOS và AX đều cho thấy các đặc tính tiền
sinh học đầy hứa hẹn trong môi trường nuôi cấy thuần túytrong ống nghiệmnghiên
cứu (van Laere và cộng sự, 1997, 1999, 2000; Palframan và cộng sự, 2003; Yuan và cộng
sự, 2005; Grootaert và cộng sự, 2007). Một số nghiên cứu cũng điều tra mối quan hệ
giữa cấu trúc của AX và sự phát triển của môi trường nuôi cấy vi khuẩn đường ruột hỗn
hợp (Karppinen et al., 2001; Hopkins et al., 2003; Hughes et al., 2007). Vì AXOS khác
nhau về mức độ trùng hợp và mức độ thay thế, nên tính đa dạng của các hợp chất này
cao hơn so với các carbohydrate prebiotic thương mại khác. Trong quá trình phát triển
các hợp chất prebiotic, mục tiêu là tăng cường sự tồn tại của prebiotic trong ruột kết, vì
quá trình lên men chậm có liên quan đến việc giảm nguy cơ ung thư ruột kết
(Grootaert et al., 2007). Cho đến gần đây, vẫn có rất ít thông tin về việc AXOS nào sẽ có
lợi nhất.

Grootaert và cộng sự. (2009) đã đánh giá tác dụng prebiotic của chế phẩm AXOS với DP trung bình là 15

và tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27. Một mô hình về hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột của con người đã được sử dụng

và sự thay đổi một phần của quá trình lên men đường đối với phần xa của đại tràng đã được quan sát

thấy khi bổ sung AXOS. AXOS cũng có tác dụng kích thích propionate mạnh
 39

tác dụng. Ngoài ra, AX được xử lý trước bằng xylanase (không đặc trưng) đã kích thích vi khuẩn bifidobacteria ở

ruột kết trong mô hình đường ruột của con người (Vardakou et al., 2007).

Chỉ có một vàitrong cơ thể sốngnghiên cứu lên men trên AXOS có thể được tìm thấy trong

tài liệu. Van Crayeveld và cộng sự. (2008) đã đánh giá tiềm năng tiền sinh học của AXOS có

nguồn gốc từ cám lúa mì liên quan đến cấu trúc của chúng ở chuột. AXOS và XOS với DP 3

dẫn đến tăng nồng độ axetat và butyric trong đại tràng và tăng lượng vi khuẩn

bifidobacteria. Mặt khác, AXOS với DP trung bình là 61 đã ức chế hiệu quả nồng độ axit béo

chuỗi ngắn phân nhánh, do đó làm thay đổi sự cân bằng khỏi quá trình lên men protein,

nhưng AXOS chuỗi dài không làm tăng nồng độ butyrate hoặc kích thích sự phát triển của vi

khuẩn bifidobacteria trong phân. AXOS với DP là 12, tỷ lệ Ara/Xyl là 0,69 và AXOS với DP là

15, tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27 cũng bị ảnh hưởng tương tự, cho thấy ảnh hưởng của DP rõ rệt hơn.

Hiệu quả sức khỏe đường ruột tốt nhất thu được với AXOS của DP 5 và tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27.

Cloetens et al. (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm AXOS được sản xuất từ lúa

mì đối với quá trình chuyển hóa ruột kết ở người tình nguyện. Kết quả từ nghiên cứu cho

thấy rằng liều tối thiểu 2,2 g AXOS (DP 15, tỷ lệ Ara/Xyl 0,26) điều chỉnh thuận lợi quá trình

chuyển hóa ruột kết ở người khỏe mạnh. Tuy nhiên, các nghiên cứu dài hạn vẫn được yêu

cầu để xác nhận kết quả.

2.5.3 Sản xuất SCFA trong quá trình lên men prebiotic

Quá trình lên men của các oligosacarit ngắn (prebiotic) trong ruột già bởi vi khuẩn đại tràng,

ngoài sự phát triển của vi sinh vật, còn dẫn đến việc sản xuất CO22, H2, SCFA và lactate. SCFA

và lactate có thể được chuyển hóa hơn nữa để cung cấp năng lượng cho vật chủ. Ngoài ra,

nhiều tác dụng đối với sức khỏe đã được báo cáo đối với SCFA, chẳng hạn như cải thiện chức

năng ruột, hấp thụ canxi, chuyển hóa lipid và giảm nguy cơ ung thư ruột kết (Scheppach et

al., 2001; Scharlau et al., 2009). Việc sản xuất SCFA không phân nhánh (acetate, propionate

và butyrate) là mong muốn, vì chúng có thể làm giảm độ pH trong ruột và ức chế sự phát

triển của vi khuẩn có hại (Campbell et al., 1997a; Wong et al., 2006) . Butyrate đặc biệt có khả

năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô ruột kết trongtrong ống nghiệmVà

trong cơ thể sốngthí nghiệm. Sự hình thành axit butyric trong quá trình lên men ở ruột kết
dường như cũng tương quan với đặc tính ức chế ung thư của chất xơ (Scheppach et al.,

1995; Wollowski et al., 2001). Một số tác giả cho rằng butyrate
 40

cũng có thể được sản xuất từ lactate bởi một số vi khuẩn đường ruột (Duncan et al., 2004).

Ngược lại, nồng độ của SCFA phân nhánh (isobutyrate, isovalerate) nên được giảm xuống, vì

chúng được hình thành trong quá trình dị hóa protein thành các chất dị hóa có khả năng gây độc

liên quan đến ung thư ruột (Visek, 1978; Van Craeyveld và cộng sự, 2008). Probiotic trong một số

trường hợp có thể ngăn chặn quá trình lên men protein trong ruột kết (De Preter et al., 2004).

2.5.4 Hệ vi sinh vật đường ruột

Hệ vi sinh vật đường ruột đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe và phòng

ngừa bệnh tật, điều này đã được công nhận rõ ràng (Holzapfel và Schillinger, 2002). Trong

đường tiêu hóa có hơn 400 loài vi khuẩn, trong đó vi khuẩn axit lactic chiếm khoảng 10%. kỵ

khí gram dươngvi khuẩn,Vi khuẩn, Và Bifidobacteriumloài chiếm ưu thế trong ruột già,

nhưng cũng có những nhóm quan trọng khác như clostridia và lactobacilli (Kontula et al.,

2000; Holzapfel và Schillinger, 2002). Sự hiện diện của bifidobacteria trong đường tiêu hóa

có liên quan đến những ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe (Modler, 1994). Sự phát triển của

những vi khuẩn này có liên quan đến khả năng sản xuất protein của chúng, chẳng hạn như

các enzym thủy phân ngoại bào và nội bào, cũng như các chất vận chuyển mono và

oligosacarit tham gia vào quá trình chuyển hóa carbohydrate không tiêu hóa được (van den

Broek et al., 2008).

2.5.5 Enzyme bifidobacteria trong sử dụng AXOS

Trình tự bộ gen củaB. longumNCC 2705 vàB. vị thành niênATCC 15703 đã tiết lộ hàm
lượng protein cao liên quan đến việc sử dụng các polysacarit và oligosacarit không tiêu
hóa, bao gồm cả --D-xylosidase và -L-arabinofuranosidase giả định để phân hủy AXOS
(Schell et al., 2002; van den Broek et al., 2008 ). Cho đến nay, bifidobacteria không được
biết đến ở mức độ protein để sản xuấtkết thúc-1,4---D-xylanase, nhưng một gen mã
hóa xylanase giả định (họ GH 8) đã được phân lập (van den Broek et al., 2005). Do đó,
các vi sinh vật khác trong đường tiêu hóa là cần thiết cho quá trình thủy phân AX
polyme không tiêu hóa thành oligosacarit. Các enzyme chính để sử dụng AXOS là
- - L-arabinofuranosidase.Bifidobacterium vị thành niênATCC 15703 chứa các gen cho
hai hoạt động xylan cao phân tử ngoại bào -L-arabinofuranosidase: AXH-m (họ GH
 41

51) và AXH-d3 (GH family 43), có khả năng phát hành -L-Araftừ mono- và thay thế kép --
D-XylPtương ứng (van Laere và cộng sự, 1999; van den Broek và cộng sự, 2005, 2008).
Đáng ngạc nhiên, cácB. longumCác gen NCC 2705 được chú thích trong các họ GH43 và
GH51 đã không tiết lộ sự tương đồng đáng kể với -L-arabinofuranosidase ngoại bào
hiện được biết đến (van den Broek et al., 2008), mặc dù một sốB. longumcác chủng có
thể phát triển trên arabinoxylan lúa mạch đen, có lẽ bằng cách giải phóng và chuyển
hóa -L-Arafnhóm thế (Crittenden et al., 2002). Thật vậy, nhiều người khácB. longumcác
chủng rõ ràng có họ GH 51 -L-arabinofuranosidase (Gueimonde et al., 2007). Trình tự
bộ gen củaClostridiumVàLactobacilluscác chủng cho đến nay không tiết lộ enzyme nào
trong họ GH 43 và 51 có chứa -L-arabinofuranosidase và
- - xylosidase (van den Broek et al., 2008), điều này tiếp tục chỉ ra tiềm năng sử dụng AXOS

làm oligosacarit tiền sinh học với tính chọn lọc của vi khuẩn bifido.

Mặc dù có một số nghiên cứu cho thấy rằng AXOS và đặc biệt là các sản phẩm thủy phân AX khác

nhau là các prebiotic tiềm năng (Grootaert và cộng sự, 2007; Vardakou và cộng sự, 2008), vẫn còn

thiếu thông tin về ảnh hưởng của cấu trúc phân tử của AXOS tiền sinh học giả định. về sự phát

triển của lợi khuẩn bifidobacteria. Bảng 4 tóm tắt sự phát triển của một số chủng vi khuẩn

bifidobacteria trên các chất nền L-arabinose, D-xylose, XOS, AXOS và (arabino)xylan. Thông

thường, sự tăng trưởng được xác định bằng cách đo mật độ quang học (OD) và phát hiện quá

trình sản xuất SCFA trong các mẫu lên men. HPAEC-PAD cũng được sử dụng trong một số nghiên

cứu để xác định việc sử dụng carbohydrate (Crittenden và cộng sự, 2002; van Laere và cộng sự,

2000; Moura và cộng sự, 2007; Gullón và cộng sự, 2008).

 42

Bảng 4.Sự phát triển của các chủng vi khuẩn bifido khác nhau trên L-arabinose, D-xylose, xylo-oligosaccharides (XOS), arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) và
(arabino)xylan. + = tăng trưởng, - = không tăng trưởng, nôm na = không phân tích.
Cơ chất
sinh vật Thẩm quyền giải quyết
L-arabinose D-xylose XOS AXOS (tiếng Ả Rập)xylan
B. vị thành niênMã ATCC 15703 - - na na na Roy và Ward, 1990 van Laere

B. vị thành niênMã ATCC 15703 na na na + na và cộng sự, 1997 van Laere

B. vị thành niênMã ATCC 15703 - + + + - và cộng sự, 1999 van Laere

B. vị thành niênMã ATCC 15703 na na + + - và cộng sự, 2000 Crittenden

B. vị thành niênMã ATCC 15703 na na + na - và cộng sự, 2002 Palframan

B. vị thành niênMã ATCC 15703 na + + na - và cộng sự, 2003 Moura và

B. vị thành niênMã ATCC 15703 + + + na na cộng sự, 2007 Gullón và cộng

B. vị thành niênMã ATCC 15703 na na + na na sự, 2008 Crittenden và cộng

B. vị thành niênVTT E-991436Một + + + na + sự, 2002 Roy và Ward, 1990

B. cá gaiATCC 27535 + + na na na Crittenden và cộng sự, 2002

B. cá gaiATCC 27535 na na + na - Palframan và cộng sự, 2003

B. cá gaiATCC 27535 na - - na - Roy và Ward, 1990 Crittenden

B. bifidumATCC 29521 - - na na na và cộng sự, 2002 Palframan

B. bifidumATCC 29521 na na + na - và cộng sự, 2003 Yuan và

B. bifidumATCC 29521 na - + na + cộng sự, 2005

B. bifidumF-35b - - na + na
B. breveATCC 15700 - - na na na Roy và Ward, 1990 van Laere

B. breveATCC 15700 na na na - - và cộng sự, 2000 Crittenden

B. breveATCC 15700 na na + na - và cộng sự, 2002 Palframan

B. breveATCC 15700 na - - na + và cộng sự, 2003 Gullón và

B. breveATCC 15700 na na + na na cộng sự, 2008 Crittenden và

B. breveCIP 64,68c na na (+) na - cộng sự, 2002 Roy và Ward,

B. catenulatumATCC 27539 - - na na na 1990 Palframan và cộng sự,

B. catenulatumATCC 27539 na + + na + 2003

 43

Cơ chất
sinh vật Thẩm quyền giải quyết
L-arabinose D-xylose XOS AXOS (tiếng Ả Rập)xylan
B. galicumATCC 49850 na + + na + Palframan và cộng sự, 2003

B. galicumATCC 49850 na na + na - Crittenden và cộng sự, 2002

B. trẻ sơ sinhATCC 15697 - - na na na Roy và Ward, 1990 van Laere

B. trẻ sơ sinhATCC 15697 na na - - - và cộng sự, 2000 Crittenden

B. trẻ sơ sinhATCC 15697 na na + na - và cộng sự, 2002 Palframan

B. trẻ sơ sinhATCC 15697 na - - na - và cộng sự, 2003 Gullón và

B. trẻ sơ sinhATCC 15697 na na + na na cộng sự, 2008 Crittenden và

B. latisBb-12đ - - + na - cộng sự, 2002 Roy và cộng sự

B. longumATCC 15707 + + na na na Ward, 1990 van Laere và

B. longumATCC 15707 na na + + + cộng sự, 2000 Crittenden và

B. longumATCC 15707 + na + na + cộng sự, 2002 Palframan và

B. longumATCC 15707 na + + na - cộng sự, 2003 Gullón và cộng

B. longumATCC 15707 na na + na na sự, 2008 Jaskari và cộng sự,

B. longum2e na na + na na 1998 Crittenden và cộng sự,

B. longumVTT E-96702Một + - + na + 2002 Crittenden và cộng sự,

B. longumCSCC 5532f + + + na + 2002 Moura và cộng sự. ,

B. longumDSM 20097 + + + na na 2007 Roy và Ward, 1990

B. pseudocatenulatumATCC 27919 + + na na na Crittenden và cộng sự, 2002

B. pseudocatenulatumATCC 27919 na na + na - Crittenden và cộng sự, 2002

B. giả hànhATCC 25526 + - + na - Palframan và cộng sự, 2003

B. giả hànhATCC 25526 na + + na -

MộtCông nghệ sinh học VTT, Phần Lan,bPhòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm của SYTU, WUXI, Trung Quốc,cBộ sưu tập các chủng vi khuẩn của Viện Pasteur, Pháp,
đChr Hansen, Đan Mạch,ePhòng thí nghiệm Visby Toender aps., Toender, Đan Mạch,fCSIRO Starter Culture Collection, Úc
ATCC = Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ, Hoa Kỳ; DSM = Bộ sưu tập vi sinh vật của Đức
B. vị thành niênATCC 15703 = DSM 20083,B. cá gaiATCC 27535 = DSM 20098,B. bifidumATCC 29521 = DSM 20456,B. breve ATCC
15700 = DSM 20213,B. catenulatumATCC 27539 = DSM 20103,B. galicumATCC 49850 = DSM 20093,B. trẻ sơ sinhATCC 15697 =
DSM 20088,B. longumATCC 15707 = DSM 20219,B. giả hànhATCC 25526 = DSM 20099
 44

3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Mục đích tổng thể của luận án này là điều chế và tinh chế các arabinoxylooligosacarit chuỗi ngắn

khác nhau (AXOS) từ arabinoxylans ngũ cốc (AX) và làm sáng tỏ các cấu trúc cũng như nghiên cứu

tiềm năng tiền sinh học của AXOS được sản xuất. Hoạt động của enzyme trên AX đã được nghiên

cứu thông qua AXOS được tạo ra trong quá trình thủy phân và các nghiên cứu cũng được thực

hiện để thu thập thông tin về hoạt động của các AXOS khác nhau về cấu trúc trong sắc ký.

Các mục tiêu chính là:

- Để điều chế AXOS chuỗi ngắn bằng enzym và tách chúng ra khỏi các sản phẩm thủy phân

khác, sử dụng phương pháp sắc ký (TÔI-III)

- Để phân tích đầy đủ các cấu trúc của AXOS tinh khiết (TÔI-III)

- Đánh giá chức năng của Shearzyme sử dụng trong quá trình thủy phân bằng enzym (TÔI-III)

- Để chỉ định thứ tự rửa giải của AXOS và xác định phản hồi của các AXOS khác nhau trên hệ

thống HPAEC-PAD được sử dụng (II,III)

- Xác định cấu trúc của một số AX ngũ cốc khác nhau (I-III) và sự xuất hiện của --
D-XylP-(1-2)---L-Araf-(1-3) chuỗi bên trong chúng (III)
- Nghiên cứu tiềm năng tiền sinh học của AXOS trongtrong ống nghiệmnghiên cứu, và đặc biệt là

để kiểm tra ảnh hưởng của --L-Ara cụ thểfthay thế trên sự phát triển của bifidobacteria (IV.)
 45

4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phần này tổng hợp các tài liệu và phương pháp được trình bày chi tiết hơn trong các
bài gốcI-IV.

4.1 Vật liệu

4.1.1 Cacbohydrat

Các arabinoxylan được sử dụng trong nghiên cứuI-IVđược liệt kê trong Bảng 5. Một số AX được

sử dụng đã được mua và một số ít được làm quà tặng. AX còn lại được chiết xuất từ các mẫu

ngũ cốc khác nhau. AX được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để điều chế AXOS (I-IV) và trong

trong ống nghiệmNghiên cứu quá trình lên men (IV.) để sản xuất chất nền.

Bảng 5. Arabinoxylans được sử dụng trong nghiên cứuI-IV.

Nguồn gốc Viết tắt nhà chế tạo Học
Bột lúa mạch đen (độ nhớt cao) RAX Megazyme TÔI,IV.
(Bray, Ireland)
Bột mì (độ nhớt cao) Bột mì WAX-hv Megazyme TÔI
(độ nhớt trung bình) Bột mì WAX-mv Megazyme II,IV.
(độ nhớt thấp) WAX-lv Megazyme TÔI
đánh vần yến mạch OSAX Sigma-Aldrich Chemie TÔI,III
(Steinheim, Đức)
Lõi bắp CCAX Tiến sĩ Ramírez/Tiến sĩ. Sake III
(Đại học Guadalajara, Mexico/
vTI, Hamburg, Đức)
rơm lúa mì WStAX VTT, Phần Lan/ Dr. Jürgen Puls (vTI) III
nguồn gốc arabinoxylan Viết tắt Nhà sản xuất sản phẩm ngũ cốc Học
vỏ lúa mạch BHAX* Trấu từ Altia Corp. III
(Koskenkorva, Phần Lan)
cám yến mạch OBAX* Cám từ Raisio Oyj III
(Raisio, Phần Lan)
trấu RiHAX* Trấu từ Giáo sư Parajó (Đại III
học Vigo, Tây Ban Nha) Cám
cám lúa mạch đen RBAX* từ Korpela Mill (Jalasjärvi, III
Phần Lan)
cám lúa mì WBAX* Cám từ Raisio III
* Arabinoxylans được chiết xuất trong phòng thí nghiệm của chúng tôi

Monosacarit, L(+)-arabinose, D(+)-xylose và D(+)-glucose từ Merck (Darmstadt,

Đức) và XOS tuyến tính (1,4---D-xylobiose, 1,4--- D-xylotriose và 1,4--- D-
xylotetraose) từ Megazyme được dùng làm chất chuẩn trong sắc ký lớp mỏng
 46

(TLC) và phân tích HPAEC-PAD (I-IV). Các monosacarit trước đây cũng được sử dụng làm chất

chuẩn trong phân tích sắc ký khí (GC) (I-III). XOS từ Wako Pure Chemical Industries (Osaka,

Nhật Bản), FOS từ BioCare (Birmingham, Vương quốc Anh) và monosacarit (arabinose và

xyloza) đã được sử dụng trong các nghiên cứu lên men (V).

4.1.2 Enzym

Chế phẩm xylanase thương mại Shearzyme®, có chứaAspergillus aculeatusHọ GH 10

endo-1,4---D-xylanase là enzyme chính (49 100 nkat/ml), được sử dụng để điều chế AXOS

chuỗi ngắn từ AX (I-IV). Shearzyme 500 L được lấy từ Novozymes A/S. Các enzym tinh chế

được sử dụng để tạo ra các AXOS khác nhau từ AX và để đánh giá cấu trúc của các AXOS

được tạo thành bằng các phương pháp có sự hỗ trợ của enzym (I-IV). Các enzyme tinh khiết

được sử dụng được liệt kê trong Bảng 6.

Bảng 6.Enzyme tinh khiết được sử dụng trong các nghiên cứuI-III.
tinh khiết EC GH Hoạt động
sinh vật Nguồn Học
enzym Con số Gia đình (nkat/ml)
AXH-m
Aspergillus niger 3.2.1.55 54* 6970 Megazyme TÔI
(E-AFASE)
AXH-d3 Bifidobacterium
3.2.1.55 43 3340 Megazyme II
(E-AFAM2) vị thành niên
XH-m không xác định 3.2.1.55 14590 Novozyme II,III
- - xylosidaza Trichoderma reesei 3.2.1.37 3 2340 VTT TÔI
endoxylanaza Aspergillus oryzae 3.2.1.8 10* 1850 VTT TÔI
endoxylanaza Aspergillus aculeatus 3.2.1.8 10 121530 Novozyme TÔI
exoxylanaza Trichoderma reesei 3.2.1.156 5 9,7† VTT II
* Thuộc về một số gia đình GH, dựa trên hành động của họ;†= mg đạm/ml

AXH-m và AHX-d3 là --L-arabinofuranosidase (Bảng 6); AXH-m hoạt động trên cả hai

Ara liên kết (1-2)- và (1-3)fđơn vị trên monosubstituting --D-XylPdư lượng, trong khi AXH-

d3 chỉ có thể phát hành liên kết (1-3) -- L-Arafcác đơn vị từ bị loại bỏ --D-XylP
dư lượng. --Xylosidaza (exo-1,4---D-xylosidase) thủy phân chuỗi xyloza từ
đầu không khử, và xylanase (kết thúc-1,4---D-xylanase) hoạt động ở giữa chuỗi
xyloza. Họ GH 5 xylanase là một exoenzyme giải phóng các đơn vị xyloza từ đầu
khử của chuỗi xyloza.
 47

4.1.3 Vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm lên men

Các chủng vi khuẩn thuần sử dụng trong nghiên cứuIV.đã từngB. vị thành niênATCC 15703

(DSM 20083),B. breveATCC 15700 (DSM 20213) vàB. longumATCC 15707 (DSM 20219) được

mua từ DSMZ (Braunsweig, Đức). Đối với các nghiên cứu về quá trình lên men của hệ vi sinh

vật trong phân, các mẫu phân người được lấy từ một người hiến tặng khỏe mạnh trong bốn

lần. Các mẫu phân được trộn trong dung dịch đệm PBS 0,1 M kỵ khí đã khử trùng (nước

muối đệm phốt phát). Tất cả các vi khuẩn (các chủng bifidobacteria thuần túy và vi khuẩn từ

hệ vi sinh vật trong phân) được nuôi cấy kỵ khí trong môi trường BA nghèo dinh dưỡng

được mô tả bởi Angelidaki et al. (1990) với sự sửa đổi rằng chiết xuất nấm men (1 g/l; Merck)

đã được thêm vào môi trường. Dung dịch vitamin được chuẩn bị theo Wolin et al. (1963) và

được bổ sung trước khi cấy.

4.2 Thực nghiệm

4.2.1 Chiết xuất AX (III)

Các arabinoxylan được mua hoặc thu được ở dạng tinh khiết hoặc được chiết xuất từ các nguyên

liệu ngũ cốc khác nhau trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (Bảng 5). Rìu (III) được chiết xuất từ

lúa mạch đen, lúa mì và cám yến mạch và trấu với Ba(OH) bão hòa2sau khi tiền xử lý bằng enzyme

bằng phương pháp được Virkki et al. (2005). Vỏ lúa mạch AX trước đây đã được chiết xuất bởi

Pitkänen et al. (2008), sử dụng phương pháp tương tự.

4.2.2 Phân tích thành phần monosacarit của AX (I, III)

Để đánh giá thành phần monosacarit và tính tỷ lệ Ara/Xyl của AX cao phân tử được phân lập,

hai phương pháp khác nhau đã được sử dụng để phân giải AX thành monosacarit: 1) axit

sunfuric (H2VÌ THẾ4) thủy phân (TÔI) và 2) metanol hóa bằng axit (III). Điều kiện thủy phân

để phân hủy AX bằng H2VÌ THẾ4đã được chọn trong các bài kiểm tra sơ bộ (kết quả không

được hiển thị).

 48

1)h2VÌ THẾ4thủy phân:

Bột lúa mạch đen AX được thủy phân bằng 1 MH2VÌ THẾ4trong 30 phút ở 120oC (TÔI). các H2VÌ THẾ4

phương pháp đã được sửa đổi từ phương pháp được sử dụng bởi Lebet et al. (1997). Quá

trình thủy phân được thực hiện song song với bốn mẫu. Sau khi thủy phân, pH được điều

chỉnh đến 7-9 bằng NaOH 10 M. Các chất chuẩn (25 mg/ml) D-xylose, L-arabinose và D-

glucose, được xử lý giống như các mẫu AX. Độ pha loãng cho các mẫu đường chuẩn được

tạo ra từ các dung dịch monosacarit này. Phương pháp HPAEC-PAD để phân tích

monosacarit (phần 4.2.6.2) đã được sử dụng để phân tích các mẫu.

2) Metanol bằng axit:

Cám lúa mì, lúa mạch đen và yến mạch AX, trấu gạo và lúa mạch AX, yến mạch đánh vần AX và

rơm lúa mì AX được phân hủy thành monosacarit bằng phương pháp metanol hóa axit (III) như

được mô tả bởi Sundberg et al. (1996). AXOS cũng bị phân hủy thành monosacarit, sử dụng

phương pháp metanol hóa axit (III). Các monosacarit silyl hóa được phân tích với GC (phần

4.2.6.3). Các tiêu chuẩn monosacarit cũng được xử lý bằng phương pháp metanol hóa axit.

4.2.3 Sản xuất enzym và tinh chế sắc ký AXOS (I-III)

AXOS được sản xuất theo phương pháp enzym từ AX được chiết xuất ở quy mô chuẩn bị.

Enzyme thương mại Shearzyme được sử dụng để thủy phân chuỗi chính AX tuyến tính (I-III).

AX (5 g/l; 1,5 g bột lúa mạch đen AX (TÔI) hoặc 1,5 g bột mì AX (II) hoặc 5 g yến mạch đánh

vần AX (III)) trong dung dịch đệm natri axetat (NaOAc) 20 mM, pH 5,0, được ủ với

Shearzyme (10 000 nkat/g AX (tôi, tôi) và 50 000 nkat/g AX (III)) ở tuổi 40oC trong 48 giờ. Các

enzyme được sử dụng từng bước để sản xuất AXOS (II). Mẫu thay thế của AX lần đầu tiên

được sửa đổi bằng cách sử dụng --arabinofuranosidase AXH-m (5000 nkat/g AX ở 40oC trong

24 giờ, pH 5), sau đó xử lý bằng Shearzyme. Một số L-Arafnhóm thế tiếp tục được loại bỏ

bằng xử lý AXH-d3 (1000 nkat/g AX ở 40oC trong 24 giờ, pH 6,5). Tất cả quá trình thủy phân

được chấm dứt bằng cách giữ các mẫu trong bể nước sôi trong 10 phút. Sau khi xử lý bằng

enzyme, các sản phẩm thủy phân được tách ra (TÔI-III) theo Hình 4.
 49

CÂY RÌU

Thủy phân bằng enzym:

xylanase
arabinofuranosidase

monosacarit
XOS
AXOS
MeGlcA- và GlcA-XOS

tách bằng
sắc ký trao đổi anion - MeGlcA- và GlcA-XOS
Cột Dowex 1 x 2

tách bằng
sắc ký thẩm thấu gel
Cột biogel P-2

monosacarit XOS (X2, X3) AXOS

Hinh 4.Quy trình sản xuất AXOS tinh khiết.

4.2.4 Phương pháp sắc ký điều chế (I-III)

sắc ký trao đổi anion

Để chuẩn bị phân tách AXOS và các phân tử tích điện (MeGlcA- hoặc GlcA-XOS), yến
mạch đánh vần là AX (III) (5 g/l) được xử lý bằng Shearzyme. Các phân tử tích điện
được tách ra khỏi AXOS trung tính bằng sắc ký trao đổi anion (AEC) với cột Dowex 1x2
(2,8 x 12 cm; Fluka Chemicals, Buchs, Thụy Sĩ) sử dụng milli-Q-water (2,5 ml/phút)
(Millipore Corp. , Billerica, MA, USA) làm chất rửa giải cho các phân tử trung tính và
NaOAc 0,5 và 2 M (pH 7,8) làm chất rửa giải cho các anion. Mẫu (835 ml, chia thành hai
mẻ) được đưa vào cột AEC và rửa giải bằng nước cho đến khi kết thúc quá trình rửa giải
của đường trung tính, được kiểm tra trên các bản TLC mỏng. Sau khi rửa giải các loại
đường trung tính, các phân tử tích điện được rửa giải khỏi cột, sử dụng NaOAc.
 50

Sắc ký thẩm thấu gel

Để chuẩn bị phân lập AXOS, bột lúa mạch đen AX (TÔI), bột mì AX (II) và oat đánh vần
là AX (III) (5 g/l) được xử lý bằng Shearzyme. AEC đã được sử dụng cho mẫu thủy phân
AX đánh vần bằng yến mạch (III) để tách MeGlA- và GlCA-XOS khỏi cacbohydrat trung
tính trước khi thực hiện sắc ký thẩm thấu gel (GPC). Đối với GPC, mỗi mẫu thủy phân
được cô đến thể tích 40-50 ml bằng hơi quay. AXOS được phân tách bằng cột Biogel P2
(8,9 x 135 cm, BioRad, Hercules, CA, USA) rửa giải bằng milli-Q-water với tốc độ 10 ml/
phút và các phần 27 ml được thu thập (TÔI,II). Một vài phần 5 ml được thu thập sau khi
tách AXOS bằng cột Biogel P2 nhỏ hơn (5 x 95 cm; Bio-Rad), sử dụng milli-Q-water (2
ml/phút) làm chất rửa giải (III). Mono- và oligosacarit được phát hiện từ các phân số với
TLC và HPAEC-PAD (I-III).

4.2.5 Định lượng AXOS (I-III)

Các AXOS đã phân lập được thủy phân thành monosacarit với --L-arabinofuranosidase

(AXH-m; 5000 nkat/g chất nền) và --xylosidase (1000 nkat/g chất nền) trong 24 giờ ở 40

oC trong dung dịch đệm NaOAc 20 mM, pH 5,0 (TÔI). Hỗn hợp enzym (II) đã được sử dụng

để thủy phân hoàn toàn AXOS thành monosacarit, như được mô tả bởi Virkki et al. (2008).

Hỗn hợp enzym được sử dụng được định lượng theo hoạt tính -L-arabinofuranosidase (1000

nkat/g AX), được coi là hoạt tính enzym giới hạn trong hỗn hợp. Phương pháp metanol hóa

bằng axit đã được sử dụng (III) để giảm cấp AXOS, như được mô tả ở trên đối với giảm cấp

AX. Sau khi xử lý phân hủy AXOS tinh khiết, trước tiên, các mẫu được phân tích bằng phương

pháp HPAEC-PAD đối với oligosacarit để kiểm tra tính hoàn chỉnh của quá trình thủy phân.

Sau đó, các monosacarit được phân tích bằng phương pháp HPAEC-PAD đối với monosacarit

(TÔI) hoặc với GC (II,III) như được mô tả sau.

Tỷ lệ Ara/Xyl được xác định từ kết quả phân tích HPAEC-PAD hoặc GC. Nồng độ của
AXOS đã được tính toán, dựa trên sản lượng monosacarit và cấu trúc AXOS đã biết.
Sau khi định lượng mẫu AXOS, pha loãng cho các mẫu đường cong chuẩn được
thực hiện từ mẫu đã định lượng. Các đường cong chuẩn AXOS đã được sử dụng
muộn để định lượng AXOS tương ứng từ các mẫu khác.
 51

4.2.6 Phương pháp sắc ký phân tích (I-IV)

TLC, HPAEC-PAD và GC được sử dụng để phân tách các mono-, di- và oligosacarit khác
nhau. Hơn nữa, sau khi phân tích cấu trúc hoàn chỉnh trên phép đo phổ khối phổ (MS)
và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), các phương pháp sắc ký đã được sử dụng để xác
định các hợp chất khác nhau dựa trên thời gian lưu của chúng trong HPAEC-PAD hoặc
hệ số lưu (Rf) trên TLC.

4.2.6.1 TLC

TLC được thực hiện (I-III), sử dụng silica gel 60 tấm (Merck). Hỗn hợp 1-butanol/etanol/
nước (3:2:2 v/v) được sử dụng làm chất rửa giải. Các carbohydrate được phát hiện bằng
cách phun 2% (w/v) orsinol hòa tan trong dung dịch ethanol/H2VÌ THẾ4/H2O (80:10:10
vol%), sau đó các tấm được làm nóng ở 105 ° C trong 10 phút.

4.2.6.2 HPAEC-PAD

HPAEC-PAD được sử dụng để phân tích mono- và oligosacarit sau quá trình thủy phân AX

bằng enzym hoặc axit (I-IV), để xác định và định lượng AXOS tinh khiết (I-III), và để so sánh

carbohydrate trước và sau thí nghiệm lên men (IV.). Đối với monosacarit HPAEC-PAD chỉ

được sử dụng trongTÔI,vì trong các nghiên cứu sau này, các monosacarit được phân tích

bằng GC. Đối với oligosacarit, phương pháp HPAEC-PAD là vô giá và đã được sử dụng trong

tất cả các nghiên cứu (I-IV).

Hệ thống HPAEC-PAD được trang bị bộ cân bằng xung SSI (Scientific Systems, Inc.,
model LP 21; State College, PA, USA), hai máy bơm HPLC Waters 515, mô-đun điều
khiển máy bơm PC Waters và bộ lấy mẫu tự động Waters 717 làm mát bằng cách sử
dụng thiên niên kỷ32phần mềm (Waters Corporation, Milford, MA, USA) để điều khiển
thiết bị và xử lý dữ liệu. Máy phân tích CarboPac PA-1 (TÔI) và CarboPac PA-100 (I-IV)
cột (250 x 4 mm, id) và cột bảo vệ PA-1 (TÔI) và PA-100 (I-IV), tương ứng, (25 x 3 mm,
id) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) được duy trì ở 30oC. Tất cả các mẫu được lọc, sử dụng
bộ lọc ống tiêm Acrodisc® 0,45 m với màng nylon (Pall Corporation, Ann

Arbor, MI, USA) và thể tích tiêm thường là 10 l trong các phép đo.
 52

Các pha động được lọc bằng màng lọc Polypro 0,45 m GH (Pall Corporation) và khử khí
bằng helium. Dung dịch rửa giải để phân tích gradient của oligosacarit (I-IV) là A: 1 M
NaOAc trong 100 mM NaOH và B: 100 mM NaOH và tổng thời gian phân tích là 50
phút. Đối với các monosacarit, dung dịch rửa giải được sử dụng để phân tích gradient (
TÔI) là A: H2O và B: 50 mM NaOH và tổng thời gian phân tích là 45 phút. Phương pháp
monosacarit đã được sửa đổi từ phương pháp của Johansson et al. (2006). Độ dốc và
tốc độ dòng chảy của các phương pháp được mô tả trong Bảng 7. Trong cả hai phương
pháp oligo và monosacarit, máy dò Decade với điện cực vàng (Antec Leyden,
Zoeterwoude, Hà Lan) được sử dụng ở chế độ xung ở 30oC. Điện thế xung và thời
lượng là: E1= 0,15 V, t1= 400 ms, E2= 0,75 V, t2= 120 ms, E3= -0,8 V, t3= 130 mili giây, tS=
20 ms.

Bảng 7.Các dải chuyển màu được sử dụng trong các phương pháp HPAEC-PAD để phân tích oligo- và
monosacarit.
Phương pháp HPAEC-PAD cho oligosacarit
Lưu lượng dòng chảy %MỘT %B
Thời gian
(ml/phút) 1 M NaOAc trong 100 mM NaOH 100 mM NaOH
0 1.0 0 100
15 1.0 0 100
35 1.0 12 88
40 1.0 12 88
45 1.0 0 100
50 1.0 0 100
Phương pháp HPAEC-PAD cho monosacarit
Lưu lượng dòng chảy %MỘT %B
h2Ô
Thời gian
(ml/phút) 50 mM NaOH
0 0,7 97 3
21 0,7 97 3
22 1.1 97 3
24 1.1 0 100
30 1.1 0 100
32 1.1 97 3
33 0,7 97 3
45 0,7 97 3

Phương pháp ngoại chuẩn được sử dụng trong phân tích oligosacarit (I-IV). Hỗn hợp xyloza,

xylobiose, xylotriose và xylotetraose được sử dụng làm chất ngoại chuẩn. Tất cả các hợp

chất trong hỗn hợp chuẩn có nồng độ 25 g/ml. Raffinose (50 g/ml) cũng được bổ sung vào

hỗn hợp chuẩn bên ngoài (TÔI)và được sử dụng làm chất chuẩn nội để cho phép định lượng

chính xác bằng cách thêm vào các mẫu trước khi phân tích HPAEC-PAD (TÔI). Đối với

monosacarit, hỗn hợp chuẩn bên ngoài có chứa arabinose, galactose,

 53

glucose, xyloza (50 g/ml), và fructose và mannose (100 g/ml) đã được sử dụng; một tiêu chuẩn nội

bộ đã không được sử dụng trong phân tích monosacarit (TÔI). Các tiêu chuẩn bên ngoài được

đưa vào sau mỗi ba mẫu trong cả hai phương pháp để theo dõi thời gian lưu và phản ứng phát

hiện.

Để xác định và định lượng các sacarit tương ứng trong các sản phẩm thủy phân (I-
IV) và các mẫu sau khi lên men (IV.), các monosacarit thương mại X2, X3và X4
đã được sử dụng. Xác định và định lượng AXOS (I-IV) đã được thực hiện, sử dụng A thuần

túy3X (I-IV), MỘT2X, MỘT2XX, MỘT2+3X, MỘT2+3XX (II-IV), Đ2,3X (III) (cấu trúc hóa học của

AXOS được trình bày trong phần 5.2, Hình 6). Các đường chuẩn được tạo để định lượng từ

mỗi hợp chất chuẩn với các mẫu trùng lặp hoặc ba lần ở các mức nồng độ 4-6, như được mô

tả trong phần 4.2.4. Chiều cao cực đại (mV) được sử dụng để định lượng carbohydrate. XA3X

và U4m2XX đã được sử dụng làm tiêu chuẩn để nhận dạng (III), và XA3XX để xác định thứ tự

rửa giải của AXOS trong HPAEC-PAD. XA tinh khiết3X và XA3XX thu được từ bột lúa mạch đen

AX được thủy phân bằng GH11T. reesei endo- 1,4---D-xylanaza và U4m2XX từ xylan bạch

dương được thủy phân bằng Shearzyme.

4.2.6.3 Tổng công ty

Phân tích GC của monosacarit

Các phương pháp GC đã được sử dụng để phân tích thành phần monosacarit của AX sau quá trình

metanol hóa axit, theo phương pháp của Sundberg et al. (1996) (TÔI,III), và sau khi thủy phân

hoàn toàn AX bằng enzym, sử dụng phương pháp của Virkki et al. (2008) (IV.) (Bảng 8). Các

phương pháp GC cũng được sử dụng để phân tích các monosacarit sau khi phân hủy AXOS (II, III).

Các monosacarit thu được bằng quá trình metanol hóa bằng axit được silyl hóa và sorbitol được

sử dụng làm chất nội chuẩn. Các monosacarit thu được từ quá trình thủy phân bằng enzym đã bị

khử và acetyl hóa, và myoinositol được sử dụng làm chất nội chuẩn. Các dẫn xuất monosacarit

sau đó được phân tích với GC, sử dụng một trong ba phương pháp được trình bày trong Bảng 8.

Định lượng được thực hiện, sử dụng sáu mức nồng độ của từng loại đường (arabinose, xyloza và

glucose) và tất cả các mẫu và chất chuẩn được phân tích hai lần hoặc ba lần .
 54

Bảng 8.Tóm tắt các phương pháp GC được sử dụng trong phân tích thành phần
monosacarit của AX và AXOS (I-III).
TÔI II III
phân hủy mẫu metanol hóa axit thủy phân enzyme metanol hóa axit
phương pháp (Sundberg và cộng sự, (Virkki và cộng sự, 2008) (Sundberg và cộng sự,

1996) 1996)
Đường đơn silyl hóa Acetyl hóa silyl hóa
tiền xử lý
dụng cụ GC hewlett Packard hewlett Packard nhanh nhẹn 6890N

HP5859 sê-ri II HP5859 sê-ri II hệ thống

hệ thống hệ thống

máy dò FID FID FID

Đầu phun/bộ lấy mẫu tự động Dòng HP7673 Đầu phun sê-ri HP7673 Dòng Agilent 7683
kim phun và và bộ lấy mẫu tự động kim phun và
bộ lấy mẫu tự động (Hewlett Packard) bộ lấy mẫu tự động

(Hewlett Packard)
Cột HP-5 (30 m, id HP-5 (30 m, id 0,32 DB-1 (30 m, id
0,32 mm, độ dày mm, độ dày màng 0,25 mm, độ dày
màng 0,25 m; 0,25 m; Agilent màng 0,25 m;
nhanh nhẹn công nghệ) nhanh nhẹn

công nghệ) công nghệ)

Nhiệt độ Hệ thống dốc: Chương trình đẳng nhiệt: Hệ thống dốc:
chương trình 150oC trong 5 phút, 2o 200oC trong 20 phút 150oC trong 3 phút
C/phút đến 260oC 1) 2oC/phút từ 150oC
đến 186oC
2) 1oC/phút từ 186o
C đến 200oC
3) 20oC/phút từ 200
o C đến 325oC
thời gian chạy 60 phút 20 phút 41,25 phút
nhiệt độ đầu phun 225oC 225oC 225oC
nhiệt độ máy dò 280oC 280oC 280oC
Dung tích thuốc tiêm 1l 1l 1l
Tỷ lệ phân chia 1:30 1:30 1:20
Lưu lượng dòng chảy 1 ml/phút 1 ml/phút 0,8 ml/phút
khí mang Anh ta Anh ta Anh ta

Phân tích GC của VFA

Axit béo dễ bay hơi (VFA) được phân tích với GC (IV.). Trước khi định lượng VFA, các
mẫu được axit hóa đến pH < 2 bằng axit photphoric 17% (H3PO4) và sau đó được phân
tích bằng GC (Hewlett Packard 5890 sê-ri II; Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA) với
đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) và cột mao quản (Hewlett Packard FFAP 30 m,
 55

đường kính trong 0,53 mm, phim 1 m). Nhiệt độ của kim phun và máy dò là 175oC
và 200oC, tương ứng. Độ dốc nhiệt độ như sau: nhiệt độ ban đầu là 110oC, tăng
dần ở 5oC/phút đến 140oC, duy trì ở 140oC trong 6 phút, tăng tốc ở 45oC/phút đến
200oC và duy trì ở 200oC trong 3 phút. Thể tích tiêm của mẫu là 10 l. VFA đã định
lượng được phân tích dưới dạng axit: axit axetic, propionic, isobutyric, butyric,
isovaleric và valeric. Các tiêu chuẩn được sử dụng trong phân tích VFA là các axit
giống như đã đề cập ở trên với nồng độ 1-40 m . Sau đó, các hợp chất này được
gọi là VFA mặc dù chúng xuất hiện dưới dạng các anion axit (acetate, propionate,
isobutyrate, butyrate, isovalerate và valerate) ở pH sinh lý.

4.2.7 Làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS (I-III)

Các phương pháp sắc ký cung cấp thông tin sơ bộ về kích thước AXOS và thành phần

monosacarit, và do đó là một phần của việc làm sáng tỏ cấu trúc. Các phương pháp hỗ trợ

enzyme cũng được sử dụng để làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS. Sử dụng quá trình thủy phân

một phần bằng enzym, đã thu được thêm thông tin về cấu trúc của AXOS tinh khiết. Các --

Arafcác nhóm phụ đã bị loại bỏ, sử dụng --arabinofuranosidase, cho biết độ dài của
chuỗi chính xyloza trong phân tích TLC hoặc HPAEC-PAD sau đây (III). AXOS được thủy
phân hoàn toàn thành monosacarit, sử dụng kết hợp --xylosidase và --
arabinofuranosidase, và tỷ lệ Ara/Xyl được xác định bằng phân tích GC hoặc HPAEC-
PAD (TÔI,II). Quang phổ MS và NMR đã được sử dụng để phân tích cấu trúc hoàn chỉnh
của AXOS. Các bước phân tích được thực hiện để mô tả đầy đủ cấu trúc của AXOS được
trình bày trong Hình 5.
 56

Buổi chiếu đầu tiên của AXOS

với TLC

Lựa chọn thú vị

mẫu

Buổi chiếu thứ hai của AXOS

với HPAEC-PAD

Lựa chọn tốt nhất

mẫu cho kết cấu
Phân tích
Sự xuống cấp của AXOS
thành monosacarit,
sử dụng enzym thủy phân
hoặc metanol hóa axit bệnh đa xơ cứng NMR

phân tích GC

Tỷ lệ Ara/Xyl mwcủa AXOS Kết cấu

Hình 5.Thủ tục làm sáng tỏ các cấu trúc AXOS.

4.2.7.1 Khối phổ

MS đã được sử dụng trong phân tích cấu trúc của AXOS tinh khiết (I-III). Phân tích phép đo

phổ khối thời gian bay/thời gian ion hóa bằng laser được hỗ trợ bởi ma trận (MALDI-TOF-

MS) (tôi, tôi) đã được thực hiện, sử dụng thiết bị Ultraflex (Bruker Daltonics, Wormer, Hà

Lan) được trang bị laser nitơ ở bước sóng 337nm. Máy quang phổ khối được chọn cho các

ion dương, được gia tốc tới động năng 12 000 V sau thời gian chiết chậm 200 ns. Sau đây,

các ion được phát hiện bằng chế độ phản xạ. Công suất laser thấp nhất cần thiết để thu

được quang phổ tốt đã được sử dụng và ít nhất 100 quang phổ đã được thu thập. Máy

quang phổ khối được hiệu chuẩn bằng hỗn hợp các chất chuẩn maltodextrin (dải khối lượng

365-2309).

Dung dịch ma trận được điều chế bằng cách hòa tan 10 mg axit 2,5-dihydroxybenzoic trong 1 ml

Dung dịch acetonitril-nước 30% (v/v). Các mẫu (1 l) và ma trận (1 l) được hút vào
một tấm MALDI-TOF (Bruker Daltonics) và các hỗn hợp này được để khô dưới
luồng không khí ấm liên tục.
Translated from English to Vietnamese - www.onlinedoctranslator.com

57

Phân tích khối phổ ion hóa Electrospray (ESI-MS) (III) đã được thực hiện, sử dụng
thiết bị sắc ký lỏng/máy dò chọn lọc khối lượng (LC/MSD-Trap-XCT Plus; Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA) ở chế độ ion dương. Mẫu tinh khiết trong axit
formic 0,1% (HCOOH) và rượu isopropyl (IPA), theo tỷ lệ 1:1 (v/v), được bơm trực
tiếp vào máy quang phổ khối, sử dụng bộ lấy mẫu tự động LC và thiết bị được vận
hành mà không cần cột. Khí phun sương là N2và điện áp mao dẫn 3500 V ở 350oC.
Phổ được ghi với dải quét từ 50 đến 1000m/z.

4.2.7.2 Quang phổ NMR

Trước các thí nghiệm NMR, các mẫu được trao đổi ba hoặc bốn lần với đơteri oxit (D2O)
(99,8% D, Merck), được lọc bằng 0,45-m và/hoặc 0,10-m Acrodisc®bộ lọc ống tiêm bằng
màng GHP (Pall Corporation) và cuối cùng được hòa tan trong 40 l (TÔI) hoặc 0,5 ml (II,
III) của D2O. Phổ NMR thu được trên máy quang phổ Varian Unity 500 (Hệ thống Varian
NMR, Palo Alto, CA, USA) hoạt động ở tần số 500 MHz cho
1H. Các phép đo được thực hiện bằng đầu dò gHX nano-NMR (TÔI), hoặc đầu dò gradient

trường xung cộng hưởng ba lần (PFG) 5 mm hoặc tủ đông lạnh 5 mm (TÔI,II). Các phép đo

cho các mẫu polysacarit được thực hiện ở 50 ºC (III) và đối với oligosacarit ở 23 ºC hoặc 25oC

(I-III). Sự dịch chuyển hóa học được báo cáo liên quan đến tiêu chuẩn acetone nội bộ ở mức

2,225 ppm đối với1H (II,III) và 31,55 ppm đối với13C (I-III). Các

1Sự dịch chuyển hóa học H được tham chiếu đến tín hiệu HDO ở mức 4,78 ppm (TÔI).

Một chiều (1D)1Phổ H được tích lũy với độ rộng phổ là 6000 hoặc 8000 Hz và với
thời gian thu được là 2-4 giây. Khi ghi lại quang phổ, một sửa đổi của trình tự biến
đổi Fourier loại bỏ nước (WEFT) đã được sử dụng. Hai chiều (2D)1H-1Tay13C-1Các thí
nghiệm tương quan H là DQF-COSY (quang phổ tương quan được lọc lượng tử
kép), HSQC (tương quan đơn lượng tử hạt nhân), HMQC (tương quan đa lượng tử
hạt nhân) và HMBC (kết nối đa liên kết hạt nhân).
 58

4.2.8 Phương pháp vi sinh vật và sinh học phân tử (IV)

4.2.8.1 Thí nghiệm lên men

Các đặc tính tiền sinh học của AXOS được chuẩn bị trong các nghiên cứu trước đó (TÔI,II) đã được

kiểm chứng (IV.). Các thí nghiệm lên men đã được thực hiện, sử dụng ba chủng vi khuẩn

bifidobacteria tinh khiết khác nhau hoặc hệ vi sinh vật phân hỗn hợp trongtrong ống nghiệmủ với

các loại carbohydrate khác nhau làm chất nền. Carbohydrate được thử nghiệm là: L-arabinose, D-

xylose, XOS, FOS (cơ chất tham chiếu), các chất thủy phân RAX và WAX được điều chế bởi

Shearzyme và A tinh khiết2XX và MỘT2+3XX. RAX và WAX cũng được sử dụng làm chất nền cho quá

trình lên men phân. Các điều kiện của thí nghiệm lên men và các chỉ số sinh trưởng đo được được

tóm tắt trong Bảng 9.

Bảng 9.Trong ống nghiệmcác thí nghiệm lên men của AXOS tiền sinh học tiềm năng bằng vi khuẩn
bifidobacteria tinh khiết và hệ vi sinh vật phân hỗn hợp.
Cuộc thí nghiệm Lên men nuôi cấy thuần túy Quá trình lên men của hệ vi sinh vật trong phân

Chủng vi khuẩn Bifidobacterium Teenis B. Các chủng hỗn hợp từ hệ vi sinh vật
breve đường ruột
B. longum
Môi trường tăng trưởng trung bình trung bình
+ Chiết xuất nấm men 1 g/l + Chiết xuất nấm men 1 g/l
+ dung dịch vitamin + dung dịch vitamin
pH ban đầu 7 7
Khối lượng thử nghiệm 3ml 2ml
chất khử - Na2S
ủ 140 giờ (~ 6 ngày) 48 giờ
37oC trong bóng tối, pH không 37oC trong bóng tối, pH không
Tăng trưởng đo được lắc lắc
chỉ số VFA VFA
Tiêu thụ carbohydrate Tiêu thụ carbohydrate
OD H2
Ô nhiễm (kính hiển vi) Áp lực

4.2.8.2 Tách chiết ADN, tinh sạch, PCR và t-RFLP

Khi bắt đầu thời gian ủ và sau 48 giờ, các mẫu 1 ml được lấy từ các mẫu phân (thể
tích thí nghiệm 2 ml) để chiết xuất DNA. Đồng thời, các mẫu 4 ml được lấy từ quá
trình lên men tham chiếu (thể tích thí nghiệm 10 ml; mẫu đối chứng không có
nguồn carbon bổ sung). Các mẫu được ly tâm trong 2 phút ở 10 000 G ở 4oC, sau
đó phần nổi phía trên được loại bỏ và viên lơ lửng trong 1 ml dung dịch đệm PBS
0,01-M, và quá trình xử lý này được lặp lại ba lần. Sau lần thứ ba
 59

ly tâm, viên được treo trong dung dịch đệm ASL 1,5 ml (đệm ly giải phân; Qiagen
GmbH, Hilden, Đức) và đập hạt (hạt zirconia/silica 0,1 mm) trong 3 phút, sau đó ly
tâm ở 16 000 G ở 4oC trong 3 phút. Quá trình tinh chế DNA tiếp theo được thực
hiện, theo hướng dẫn của bộ Qiagen về "tinh chế DNA từ các mẫu phân" (Qiagen,
Valencia, CA, USA).

Các gen RNA ribosome 16S (rRNA) của vi khuẩn bifidobacteria được khuếch đại bằng phản ứng

chuỗi polymerase (PCR) bằng cách sử dụng bộ mồi đặc hiệu cho vi khuẩn bifidobacteria. Tổng thể

tích của hỗn hợp PCR là 50 l và chứa nước milli-Q, dung dịch đệm phản ứng, Mg2+(25 mM),

deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) (2 mM), mồi chuyển tiếp (25 pmol/l; TET-
Bifido 144f NF, MWG-Biotech AG, Ebersberg, Đức, 5 -́
CCGGAATAGCTCCTGGAAAC-3 ,́ dựa trên mồi Pbi F1 do Roy mô tả và Sirois (2000),
mồi đảo ngược (25 pmol/l; rP2, MWG-Biotech-AG, 5 -́
ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3´ (Weisburg et al., 1991), albumin huyết thanh bò
(BSA; 2%), polymerase và PCR (iCycler Thermal Cycler; Bio-Rad) được bắt đầu với
bước biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút, sau đó là 30 chu kỳ bao gồm biến tính
ở 94oC trong 30 giây, ủ ở 59oC trong 30 giây, độ giãn dài ở 72oC trong 90 giây và
gia hạn cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Gel agarose (1%) được nạp sản phẩm PCR
và chạy điện di trên gel trong 30 phút ở 80 V (nguồn điện Bio-Rad/PowerPac 300)
và các dải trên gel được hiển thị bằng cách sử dụng Bio-Rad Gel Doc™ Hệ thống tài
liệu năm 2000 (tủ phòng tối, đèn chiếu sáng UV, máy ảnh và phần mềm). Dải chứa
sản phẩm PCR quan tâm đã được tinh chế, sử dụng chiết xuất gel theo quy trình
Gel-Out (Công nghệ sinh học A&A, Gdynia, Ba Lan).

Sau phản ứng PCR, các sản phẩm của gen 16S rRNA được đánh dấu huỳnh quang cuối cùng.

Sản phẩm PCR này (10 l) được phân hủy với 1 l enzyme MboI (10 U/l; Fermentas

International Inc., Burlington, Ontario, Canada) trong 6 giờ ở 37oC, sau đó enzyme bị vô hoạt

ở 65oC trong 20 phút. Các đoạn được dán nhãn được phân tích bằng điện di trong trình sắp

xếp trình tự DNA ABI PRISM 373 ở chế độ Quét gen và kích thước của các đoạn được xác

định, sử dụng các tiêu chuẩn của đoạn DNA (GS-500 ROX và GS-1000 ROX; PE Biosystems,

Foster City, CA, USA ). Các phân tích đa hình chiều dài đoạn giới hạn đầu cuối (t-RFLP) đã

được sử dụng cùng với một phân tích cụ thểBifidobacterium

 60

bộ mồi để chứng minh sự thay đổi mật độ trong các mẫu phân do bổ sung
carbohydrate có nguồn gốc từ xylan.
 61

5. KẾT QUẢ

5.1 Thành phần cacbohydrat của nguyên liệu ban đầu (I-IV)

Thành phần của monosacarit trung tính của AX được sử dụng đã được xác định (I-IV).
Tỷ lệ Ara/Xyl cao nhất được tìm thấy trong WBAX (0,60) và thấp nhất trong OSAX (0,09)
(Bảng 10). Trong tất cả AX được nghiên cứu chiết xuất từ cám (WBAX, RBAX và OBAX)
và trong hầu hết AX từ bột (RAX, WAX-hv và WAX-mv), tỷ lệ Ara/Xyl tương đối cao, cho
thấy cấu trúc AX có tính thay thế cao. Ngược lại, trong OSAX, RiHAX và WStAX, mức độ
thay thế arabinose thấp đã được phát hiện (tỷ lệ Ara/Xyl 0,09-0,19).

Bảng 10.Thành phần monosacarit trung tính của AX được chiết xuất từ các nguyên liệu ngũ cốc khác
nhau.
Ara Xyl glc
nguồn AX Ara/Xyl Phương pháp Học
(% trọng lượng) (% trọng lượng) (% trọng lượng)

RAX 27 63 10 0,42 metanol hóa axit TÔI

30 65 5 0,46 h2VÌ THẾ4thủy TÔI,IV.

WAX-hv 30 66 5 0,45 phân Axit metanol *

WAX-mv 32 68 - 0,47 metanol hóa axit II
36 64 - 0,56 thủy phân enzyme§ IV.
WAX-lv 21 76 3 0,28 metanol hóa axit *
WBAX 35 57 số 8 0,60 metanol hóa axit III
RAX 26 62 12 0,43 metanol hóa axit III
OBAX 26 47 27 0,53 metanol hóa axit III
RiHAX 16 74 10 0,19 metanol hóa axit III
BHAX 21 73 6 0,28 metanol hóa axit† III
OSAX 7 82 11 0,09 metanol hóa axit III
10 87 3 0,11 h2VÌ THẾ4thủy phân H *
CCAX 24 73 3 0,33 2VÌ THẾ4thủy phân‡ III
WStAX 10 85 5 0,12 metanol hóa axit III
* Luận văn này (chưa xuất bản),§được phân tích bởi Virkki et al. (2008),†được phân tích bởi Pitkänen et al. (2008),
‡phân tích bởi Ramírez và Saake (kết quả chưa được công bố).

5.2. Cấu trúc của AXOS được điều chế bằng enzyme (I-III)

Sáu AXOS khác nhau đã được điều chế và phân lập (I-III).Các phương pháp tương tự đã được sử

dụng với một số sửa đổi nhỏ trong sản xuất các AXOS khác nhau. Kết quả làm sáng tỏ cấu trúc

của AXOS được thể hiện trong Bảng 11. A3X, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2XX và D2,3X
 62

xuất hiện khá thuần khiết, nhưng A2X không được tinh chế hoàn toàn và nó xảy ra
cùng với A2XX. Hỗn hợp A2X và A2XX được điều trị thêm bằngT. reeseiGH5 xylanase giải
phóng một dư lượng xyloza từ đầu khử của A2XX, tạo thành A2X.A2X không bị tách ra
nữa và do đó phân tích để xác định tỷ lệ Ara/Xyl của A2X đã không được thực hiện.

Bảng 11.Làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS tinh khiết được điều chế từ xylan ngũ cốc.
tr mw
Học AXOS Ara/Xyl Rìu chất liệu enzym
(phút)- (Na bổ sung)
TÔI MỘT3X 31,0 437 0,49 RAX Shearzyme

II MỘT2+3X
33,4 569 0,93 WAX-mv AXH-m +
MỘT2+3XX 34,4 701 0,73 Shearzyme

MỘT2X 28,4 437† na WAX-mv AXH-m +

MỘT2XX 30.1 569 0,36 Cắt tóc +
AXH-d3

Đ.2,3X
III 30.2 569 0,24 OSAX Shearzyme
-
=trtừ phân tích HPAEC-PAD khác nhau một chút giữa các nghiên cứuI-IIInhưng những báo cáo ở đây được
thông qua từ Hình 9.
†=được phân tích từ hỗn hợp hai AXOS na =
không được phân tích

AXOS được phân tích bằng HPAEC-PAD, từ đó chúng được rửa giải với thời gian lưu khác nhau (tr).

Khối lượng phân tử (Mw) thu được bằng phân tích MS và chúng được trình bày dưới dạng sản

phẩm cộng Na (437 = sản phẩm cộng natri của pentotriose, 569 = sản phẩm cộng natri của

pentotetraose, 701 = sản phẩm cộng natri của pentopentaose). Tỷ lệ Ara/Xyl được xác định, sử

dụng phương pháp thủy phân toàn phần bằng enzym hoặc phương pháp metanol hóa bằng axit

để phân hủy AXOS thành monosacarit được định lượng bằng phương pháp GC. AXOS được

nghiên cứu bao gồm một hoặc hai đơn vị arabinose và hai hoặc ba gốc xyloza. Cuối cùng, cấu trúc

chi tiết của AXOS đã được nghiên cứu, sử dụng quang phổ NMR. Kết quả NMR chi tiết (độ dịch

chuyển hóa học và quang phổ) có thể được tìm thấy trong các nghiên cứuI-III. Cấu trúc của AXOS

được hiển thị trong Hình 6. Ngoài sáu AXOS đã được phân tích đầy đủ, cấu trúc của XA3XX và XA3X

đã được làm sáng tỏ, sử dụng phương pháp hỗ trợ MS và enzyme, nhưng cấu trúc của chúng

không được xác nhận bằng phân tích NMR.

 63

Ô
HỒ Ồ
Ồ

Một Ồ đ Ô
CH2OH
HỒ
CH 2O h MỘT3X HỒ Đ.2,3X
Ô Ô Ô
Ô
Ồ
Ô HỒ
Ồ
Ô HỒ
HỒ Ô HỒ Ô Ồ
Ồ Ô
Ồ
Ồ Ô
- - L-Araf-(1-3)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl - - D-XylP-(1-2)---L-Araf-(1-3)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl

b Ồ e Ồ
CH2OH MỘT2+3X CH 2O
h MỘT2+3XX
HỒ HỒ

Ô Ô Ô Ô
Ồ Ồ
Ô HỒ Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ồ
HỒ Ô Ô Ồ
Ô Ô HỒ
Ô Ô Ồ
Ô Ô
Ồ Ồ
HOH2C HOH2C

Ồ Ồ

- - L-Araf-(1-2)-[--L-Araf-(1-3)]---D-XylP-(1-4)-D-Xyl - - L-Araf-(1-2)-[--L-Araf-(1-3)]---D-XylP-(1-4)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl

c f
Ồ Ồ
Ô HỒ Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ồ
HỒ Ô Ô Ồ
HỒ
Ô HỒ
Ô HỒ
Ô Ô Ồ
Ô Ô
Ồ MỘT2X Ồ MỘT2XX
HOH2C HOH2C

Ồ Ồ

- - L-Araf-(1-2)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl - - L-Araf-(1-2)---D-XylP-(1-4)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl

Hình 6.Cấu trúc hóa học của AXOS bị cô lập.

Quá trình tinh chế AXOS được thực hiện ở quy mô chuẩn bị trong đó 1,5 g (TÔI,II) hoặc
5 g (III) của nguyên liệu ban đầu được thủy phân và phân đoạn. Các phần tinh khiết
nhất và cô đặc nhất, được sử dụng để phân tích cấu trúc, đã được định lượng. Nồng độ
của các mẫu AXOS tốt nhất là: A3X 132 g/ml (0,32 mol/ml), A2+3X

215 g/ml (0,39 mol/ml), A2+3XX 461 g/ml (0,68 mol/ml), A2XX 433 g/ml (0,79
mol/ml) và D2,3X 443 g/ml (0,81 mol/ml). Nội dung của A.2X không được xác định.
Độ pha loãng cho các mẫu đường chuẩn được tạo ra từ các phân số này. Các tiêu
chuẩn được sử dụng để xác định và định lượng các mẫu khác có chứa AXOS tương
ứng.

Tổng cộng 1,5 g mẫu RAX với độ tinh khiết 87% trọng lượng (chứa 1,3 g AX nguyên chất), đã

được thủy phân (TÔI). Các sản phẩm định lượng chiếm 28% của AX và năng suất của A3X là

12% sản phẩm định lượng (3% của AX). Tương tự, 1,5 g mẫu WAX có độ tinh khiết 84% khối

lượng (chứa 1,26 g AX nguyên chất) đã được thủy phân, và quá trình thủy phân
 64

sản phẩm MỘT2+3X và A2+3XX bao gồm tất cả 17% của AX (II). Ở một phương pháp thủy phân

khác từ cùng một nguyên liệu ban đầu thu được 11,7% A2Đã thu được XX của AX (II). Sản

lượng AXOS được tính toán từ các phân số bị cô lập (TÔI,II). Sản phẩm thủy phân (III) tương

ứng với 23% OSAX và được định lượng từ dịch thủy phân thay vì các phân đoạn bị cô lập,

như trongTÔIVàII. Hiệu suất của AXOS là 12% từ các sản phẩm được định lượng và 4% là D

2,3x.

Làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS đơn thế từ bột mì AX được trình bày trong Hình 7
làm ví dụ. WAX-mv được thủy phân từng bước với các enzym thành mono-, diand
oligosacarit (Hình 7a). Sau khi phân tách AXOS bằng phương pháp thủy phân và
sắc ký (GPC), TLC được sử dụng để sàng lọc AXOS lần đầu tiên (Hình 7b). Các mẫu
hứa hẹn nhất (phân số 141-150) đã được chọn để phân tích HPAEC-PAD, trong đó
mẫu tiêu biểu nhất (phân số 143) để làm sáng tỏ cấu trúc đã được chọn (Hình 7c).

Họwcủa AXOS được thay thế đơn vì chất phụ gia Na là 569 (Hình 7d), cho thấy cấu
trúc bao gồm bốn đơn vị pentose. AXOS sau đó bị phân hủy hoàn toàn thành
monosacarit và sắc ký đồ HPAEC-PAD trong Hình 7e cho thấy không có oligosacarit
nào không bị phân hủy. Tỷ lệ Ara/Xyl được xác định với GC là 0,36, điều này cho
thấy rằng AXOS bao gồm một gốc arabinose và ba đơn vị xyloza. Lượng AXOS sau
đó được tính toán, dựa trên nồng độ monosacarit. Sử dụng enzyme AXH-m để loại
bỏ --L-Arafđơn vị từ
monosubstituting --D-XylPđơn vị, chúng tôi đã xác nhận rằng độ dài của chuỗi xyloza
bao gồm ba phần dư (Hình 7f). Với quang phổ NMR (Hình 7g), cấu trúc AXOS được chỉ
định để có một liên kết (1-2) --L-Arafcặn (A2) ở trạng thái không khử --

D-XylPđơn vị (X3) xylotriose (Hình 7h). Do đó, cấu trúc hoàn chỉnh là --L-Araf-
(1-2)---D-XylP-(1-4)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl (A2XX).
 65

Một
mV 1000
MỘT WAX-hv được thủy phân từng bước với AXH-m, Shearzyme và AXH-d3
800
600
X2 AXOS
400 X
200 X3
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50

X
1

X X2

X2 X3
66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99 102 105 108 111 X4
X3
X4 114 117 120 123 126 129 132 135 138 141 144 147 150 153 156 159 162 165 168 171 174 177 180 183 186 189 192 195 198 201 204 207

mV 1000
đ AXOS bị cô lập (fr. 143) c
800 569 = P4+ Nà
600 393
400
200 300 400 500 600 700 800

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
mV 1000
Monosaccharid sau khi thủy phân hoàn toàn bằng enzym
e
800
MỘTX
600
400
200
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
mV 1000
Làm sáng tỏ cấu trúc có sự hỗ trợ của
f
800
enzyme AXOS + AXH-m
600
MỘT
400
200 X3
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
tối thiểu

g h
Ồ
Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ô Ồ
HỒ
Ô HỒ
Ô Ồ
Ô
Ồ
HOH2C

Ồ
ppm

Hình 7.Tinh chế AXOS từ dịch thủy phân WAX-hv và làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS
chính. Sắc ký đồ HPAEC-PAD của dịch thủy phân (a), phân tích TLC của các phân
đoạn thu được bằng phương pháp tách sắc ký (GPC) của dịch thủy phân (b) và sắc
ký đồ HPAEC-PAD của AXOS tinh khiết (c). Phổ khối của sắc ký đồ AXOS (d), HPAEC-
PAD của AXOS tinh khiết được thủy phân hoàn toàn thành monosacarit (e) và làm
sáng tỏ thêm cấu trúc của AXOS thu được sau khi loại bỏ arabinose bằng enzym
(f). Vùng dị thường của 1D1Phổ H NMR của oligosacarit (g) và cấu trúc hoàn chỉnh
của AXOS (h).
 66

5.3 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX (I-III)

Cấu trúc của tám arabinoxylan ngũ cốc đã được nghiên cứu, sử dụng phân tích quang phổ NMR

cho các polyme (III) và bằng cách điều tra các sản phẩm thủy phân Shearzyme của AX (I-III). Dữ

liệu NMR của hai AX bổ sung đã được thông qua từ nghiên cứu của Pitkänen et al. (2009), bởi vì

các sản phẩm thủy phân của chúng cũng đã được kiểm tra. Sử dụng phương pháp quang phổ

NMR, người ta đã tìm thấy các gốc đường khác nhau dưới dạng các nhóm thế gắn vào chuỗi chính

xylan. Trong tất cả các loại ngũ cốc AX được kiểm tra, --L-Araf(1-3)-monosubstituting và --L-Araf

(1-2 và 1-3)-dư lượng xyloza đã được thay thế đã được tìm thấy (Bảng 12). Phân tích NMR cho thấy

rằng đơn vị bên chiếm ưu thế nhất trong tất cả các mẫu là --L-

Araf(1-3)đơn sắc. --L-Araf(1-2 và 1-3)-đã thay thế --D-XylPdư lượng phổ biến trong WBAX
và RBAX, nhưng trong WBAX, nhiều đơn vị bị thay thế hơn đã được tìm thấy (III: Hình
1a). Một đỉnh đáng kể đại diện cho --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên được tìm thấy
trong phổ NMR từ BHAX, OSAX và CCAX, và với số lượng ít hơn trong RiHAX và WStAX (
III: Hình 1). Nhóm bên axit 4-Ô-Me---D-GlcA(1-2) đã có mặt trong OSAX, CCAX, WStAX và
ít hơn trong RiHAX. Các kết quả NMR đại diện cho toàn bộ chuỗi AX polyme và cung cấp
một cái nhìn bao quát về cấu trúc của nó. Phân tích NMR định lượng không được thực
hiện, nhưng cường độ của các cực đại từ phổ NMR có thể được so sánh đại khái.

Bảng 12.Sự tồn tại của các đơn vị phụ trong arabinoxylan ngũ cốc theo quang phổ NMR.
+ + + = (các) pic chính, ++ = nhiều, + = có, - = không có trong phổ NMR. Mono hoặc di với --L-
Arafđơn vị đề cập đến sự xuất hiện của --L-Arafdư lượng trong mono-/dissubstituting
- - D-XylPcác đơn vị.
cặn đường
CÂY RÌU - - L-Araf - - L-Araf - - L-Araf - - D-XylP(1-2)---L- 4-Ô-Tôi---Đ-
(1-3) đơn sắc (1-3)đi (1-2) đi Araf(1-3) GlcA(1-2)
RAX* +++ ++ ++ - -
WAX-mv* +++ +++ +++ - -
WBAX +++ +++ +++ - -
RAX +++ ++ ++ - -
OBAX +++ + + - -
RiHAX +++ + + + ++
BHAX +++ + + ++ -
OSAX +++ + + + ++
CCAX +++ + + ++ ++
WStAX +++ + + + ++
*
Thông qua Pitkänen et al. (2009)
 67

Ngoài các đơn vị phụ được trình bày trong Bảng 12, --L-Araf(1-2)Có thể tìm thấy dư
lượng mono từ BHAX, WBAX và RBAX. Các tín hiệu kép rộng có lẽ bắt nguồn từ các đơn
vị phụ --L-Araf(1-2)đơn sắc và --L-Araf(1-3)di được tìm thấy từ các mẫu này trong phép
đo phổ NMR (III, Hình 1). Tuy nhiên, dựa trên quang phổ NMR, sự hiện diện của --L-Ara
f(1-2)Các đơn vị bên đơn trong AX được kiểm tra vẫn chưa chắc chắn.

Các mẫu AX tương tự cũng được thủy phân bằng Shearzyme (I-III) và các sản phẩm thủy

phân đã được xác định và định lượng. Sắc đồ HPAEC-PAD được trình bày trongTÔI: Hình 2,II

: Hình 2 vàIII:Hình 4. Trong tất cả các sản phẩm thủy phân AX ngũ cốc được kiểm tra, chất

thay thế đơn chất A3X được tạo thành nhiều (Bảng 13). nhất là A3X có mặt trong các sản

phẩm thủy phân AX có nguồn gốc từ bột và cám (RAX, WAX-mx, WBAX, RBAX và OBAX), đồng

thời cũng là AXOS chính trong các sản phẩm thủy phân RiHAX, OSAX và WStAX. Đ.2,3X là

oligosacarit phổ biến nhất trong BHAX và CCAX và cũng được tìm thấy với lượng ít hơn trong

OSAX, RiHAX và WStAX. Hơn nữa, thay thế kép AXOS A2+3X và A2+3XX được phát hiện trong tất

cả các mẫu, ngoại trừ RiHAX. Trong BHAX và CCAX, một đỉnh nhỏ đại diện cho A2+3XX đã

được tìm thấy trong sắc ký đồ, nhưng số lượng quá nhỏ để định lượng. AXOS với --L-Araf

(1-2) thế đơn --D-XylPđơn vị (A2X hoặc A2XX) không được xác định từ các sản phẩm thủy

phân. Tổng lượng định lượng của các sản phẩm thủy phân trong tổng lượng AX đã cân là

10-40%. Số tiền cao nhất được định lượng trong WStAX và thấp nhất trong WBAX.

Bảng 13.Phân phối monosacarit, XOS tuyến tính và AXOS trong sản phẩm thủy phân thu
được bằng cách ủ ngũ cốc AX với Shearzyme. Phân phối (wt%) carbohydrate được tính toán
từ các sản phẩm thủy phân được định lượng trong phân tích HPAEC-PAD.
sản phẩm thủy phân
CÂY RÌU Phân phối carbohydrate định lượng (wt%)
MỘT X X2 X3 X4 Đ.2,3X MỘT3X MỘT2+3X MỘT2+3XX
RAX 2 15 56 - - - 20 4 3
WAX-mv 2 12 47 - - - 14 9 16
WBAX 2 17 51 - - - 16 7 7
RAX 3 18 49 - - - 22 5 3
OBAX 4 19 45 - - - 21 5 6
RiHAX 1 18 61 - - 5 15 - -
BHAX - 12 66 1 - 14 4 3 nq
OSAX - 10 68 9 1 4 6 1 1
CCAX 1 13 61 1 - 15 7 2 nq
WStAX - 12 72 3 2 1 7 1 2
nq = không định lượng
 68

Các đặc điểm tương tự của cấu trúc AX được tìm thấy khi kết quả NMR (Bảng 12) và thông

tin thu được từ các sản phẩm thủy phân (Bảng 13) được so sánh. Không tìm thấy AXOS thay

thế kép nào trong dịch thủy phân RiHAX, mặc dù trong phân tích NMR chúng có mặt. Mặt

khác, các yếu tố cấu trúc giống nhau đã xảy ra trong AX ngũ cốc tương ứng trong cả hai

phân tích.

5.4 Hoạt động của Shearzyme (I-III)

Shearzyme, vớiA. aculeatusGH10kết thúc-1,4---D-xylanase là enzyme chính,

sản xuất AXOS chuỗi ngắn với --L-Araf(1-3)đơn âm, --L-Araf(1-2)đơn sắc, --L-
Araf(1-2 và 1-3)di hoặc --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) nhóm thế ở đầu không khử của chuỗi

xyloza. Sự hình thành của A2X và A2XX được thể hiện tốt nhất với chất thủy phân WAX-lv (TÔI

; Hình 1) nhưng những AXOS này không được xác định cho đến khi nghiên cứuII. Phần lớn

AXOS được tạo ra trong quá trình thủy phân Shearzyme mang nhóm thế cuối cùng không

khử và chỉ một lượng nhỏ AXOS được thay thế bên trong (TÔI; Hình 7). Bất chấp các hoạt

động phụ (--xylosidase, --arabinofuranosidase, --glucanase, và --glucosidase)

trong Shearzyme, các chất thủy phân bằng tinh khiếtA. aculeatus endo-1,4---D-xylanase và

Shearzyme tương tự nhau (TÔI; Hình 7) và do đó, để sản xuất AXOS, chỉ có tác động của kết thúc

-1,4---D-xylanase trong Shearzyme là đáng kể. Để Shearzyme hành động, ít nhất một

không được thay thế --D-XylPđơn vị giữa thay thế --D-XylPđơn vị là cần thiết, vì AXOS ngắn nhất

được hình thành trong quá trình thủy phân là A3X, MỘT2X và D2,3X. Ngoài AXOS, xyloza và

xylobiose là những sản phẩm thủy phân chính trong quá trình thủy phân mở rộng.

5.5 Hành vi của AXOS trong sắc ký (I-III)

5.5.1 Tách AXOS trên TLC

TLC được sử dụng trong lần sàng lọc đầu tiên của các phân đoạn thu được từ quá trình tách các

mẫu AX thủy phân (I-III) với AEC và/hoặc GPC. Trong GPC, thứ tự rửa giải của cacbohydrat chủ

yếu dựa trên kích thước của chúng (Hình 7b), nhưng trong TLC, tốc độ rửa giải cũng bị ảnh hưởng

bởi sự hấp phụ khác nhau của cacbohydrat vào tấm silica. tăng dần của
 69

tám AXOS đã được kiểm tra trên tấm TLC và Rfcho mỗi AXOS đã được xác định
(Bảng 14). Trong phân tích TLC, Rfcác giá trị của AXOS tăng theo thứ tự: XA3XX,
MỘT2XX và MỘT2+3XX, D2,3X và XA3X, MỘT2X và A2+3X, MỘT3X (Hình 8). Do đó, trong
số AXOS được nghiên cứu, A3X thăng xa nhất (Rf0,57) trên tấm TLC và XA3XX ít nhất
(Rf0,41). Tuy nhiên, một số Rfcác giá trị của AXOS giống nhau đến mức sự khác biệt
giữa AXOS chỉ dựa trên Rfgiá trị là khó khăn.

Bảng 14.rfcác giá trị thu được từ phân tích

TLC.
cacbohydrat rfgiá trị
X 0,60
X2 0,52
X3 0,45
X4 0,37 X X
XA3XX 0,41 X2 X2
MỘT2XX 0,45
X3 X3
MỘT2+3XX 0,46 X4 X4
Đ.2,3X
0,48
XA3X 0,48
MỘT2X 0,51
MỘT2+3X
0,52
MỘT3X 0,57
XA3XX MỘT2+3XX XA3X MỘT2+3X
MỘT2XX Đ.2,3X MỘT2X MỘT3X

Hình 8.Phân tích TLC của AXOS.

5.5.2 Thứ tự rửa giải của AXOS và phản ứng của chúng trong HPAEC-PAD

AXOS tinh khiết (0,011 mol mỗi loại) được trộn trong dung dịch và thứ tự rửa giải của
AXOS (I-III) và phản hồi của chúng trong hệ thống HPAEC-PAD được sử dụng đã được
nghiên cứu. Thứ tự rửa giải trong HPAEC-PAD là (Hình 9a): A2X, MỘT2XX, D2,3X, MỘT3X,
MỘT2+3X và A2+3XX. Mặc dù A2XX và D2,3Không thể tách hoàn toàn X ra khỏi nhau trong
hỗn hợp, xuất hiện pic tách đôi sau 30 phút và thứ tự rửa giải được xác định

từ các mũi tiêm riêng biệt của các AXOS này. XOS tuyến tính (XX4; 0,011 mol của mỗi
loại) cũng được trộn với sáu AXOS (Hình 9b). Hơn nữa, thêm hai AXOS (XA3X và XA3XX)
được trộn với dung dịch của sáu AXOS và thứ tự rửa giải của tám AXOS này đã được
kiểm tra (Hình 9c). Thứ tự rửa giải của tám AXOS là: A2X, MỘT2XX, D2,3X, MỘT3X và XA3X,
XA3XX, MỘT2+3X, MỘT2+3XX. các trcủa A3X và XA3X hoàn toàn giống nhau và không thể
xác định thứ tự rửa giải của chúng trong hệ thống HPAEC-PAD này.
 70

X MỘT
| \
300 MỘT
6 trục |
MỘT
\
XX
AA Một
mV XXX \|
XX
200 XX
MỘT
AA
|
\|
100 XX
XXX
X3 dư lượng X4

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu
50
X
MỘT
300 MỘT | \
6 TRỤC + XX4 | MỘT
XXAA b
mV XXX \
XX \|
200 XX
MỘT
| AA
100 X X2 XXX \|
X3 4
XXX

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
MỘT
MỘT
X \
\
300 MỘT |
MỘTXXX XXXX
8 TRỤC + XX4 | MỘT c
mV \ +
XXX \
XX AA
200 XX
\|
MỘT XX
| AA
100 X X2 X3 X4XX \|
XXX
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50

Hình 9.Sắc ký đồ HPAEC-PAD của các AXOS khác nhau. Nội dung của AXOS và XX4là
0,011 mol trong các dung dịch, trừ A chưa định lượng2X, XA3X và XA3XX. A = arabinose,
X = xyloza, X2= xylobiose, X3= xylotriose, X4= xylotetraose, \ = liên kết 1-3, | = trái phiếu
1-2.

Các phản hồi cho các AXOS khác nhau là khác nhau trong phân tích HPAEC-PAD.
Do đó, không thể đưa ra kết luận đơn giản về chiều cao pic (mV) trong sắc ký đồ và
số lượng. Từ một3X dường như là đỉnh AXOS chính trong một số sản phẩm thủy
phân, phản ứng của A3X được đặt là 1 và các phản hồi AXOS khác từ Hình 9 được
so sánh với phản hồi trong Bảng 15. Trong hỗn hợp sáu AXOS, một số gốc của X3
và X4bắt nguồn từ Đ.2,3Mẫu X đã được tìm thấy (Hình 9a), làm tăng chiều cao của
các pic tương ứng trong hỗn hợp có thêm X3và X4
(Hình 9b và c). X dư3và X4đã được định lượng và số lượng của chúng đã giảm về mặt lý thuyết.

Ngoài việc so sánh các phản hồi từ hỗn hợp trong Hình 9, so sánh phản ứng tương đối của A2XX

và D2,3X với A3X cũng được thực hiện từ các mẫu nguyên chất để cho thấy hiệu ứng của các đỉnh

chồng lấp. Trong Hình 9, cả hai đầu của đỉnh phân tách đều khá bằng nhau, nhưng phân tích

riêng biệt cho thấy phản hồi tương đối kém hơn một chút đối với D2,3X hơn cho A2XX. Trong hệ

thống gradient HPAEC-PAD được sử dụng, các phản hồi tương đối
 71

cho XX4dường như kém hơn so với AXOS, trong khi sự thay đổi trong các phản hồi cũng được

quan sát giữa các AXOS khác nhau.

Bảng 15.Phản ứng của xyloza, XOS tuyến tính và AXOS so với phản ứng của A3X.
Các cacbohiđrat đều bằng nhau về số mol (0,011 mol). phản hồi = chiều cao (mV)
của đỉnh trong phân tích HPAEC-PAD s (Hình 9a và b).
phản ứng tương đối
cacbohydrat
(cacbohydrat/A3X)
X 0,2
X2 0,2
X3 0,1
X4 0,1
MỘT2XX 0,5 (0,4*)
Đ.2,3X
0,5 (0,3*)
MỘT3X 1
MỘT2+3X
0,7
MỘT2+3XX 0,5
* Được tính toán từ các sắc ký đồ riêng biệt ngoài hỗn hợp mà các AXOS này chồng lên nhau

5.6 Thí nghiệm lên men (IV)

5.6.1 Thành phần cacbohydrat của sản phẩm thủy phân XOS và AX

Thành phần cacbohydrat của hỗn hợp XOS thương mại và các sản phẩm thủy phân RAX và

WAX, được sử dụng làm chất nền trong các thí nghiệm lên men (IV.), đã được phân tích. Hỗn

hợp XOS thương mại chứa chủ yếu là xylobiose (26% trọng lượng) và một lượng nhỏ

xylotriose và xylotetraose (Bảng 16,IV.: Hình 1a). Do đó, trong hỗn hợp này chỉ có 37% lượng

cân được phát hiện là XOS tuyến tính. Ngoài XOS đã được xác định, sản phẩm XOS thương

mại còn chứa một số oligosacarit không xác định lâu hơn với tr

từ 30 đến 35 phút. Các sản phẩm thủy phân RAX và WAX được tạo ra từ AX thương mại chiết

xuất từ lúa mạch đen và bột mì (RAX và WAX-hv, tương ứng). Carbohydrat được xác định và

định lượng trong dịch thủy phân RAX là 14% trọng lượng và trong dịch thủy phân WAX là

20% trọng lượng (Bảng 16,IV.: Hình 1b và 1c). Hai sản phẩm thủy phân chứa lượng xyloza,

xylobiose và A tương tự nhau.3X, nhưng dịch thủy phân WAX có nhiều oligosacarit bị phân

hủy A2+3X và A2+3XX.

 72

Bảng 16.Thành phần carbohydrate của hỗn hợp xylo-oligosacarit thương mại (XOS),
thủy phân AX lúa mạch đen và thủy phân AX lúa mì.
X X2 X3 X4 MỘT3X MỘT2+3X MỘT2+3XX Tổng cộng
cacbohydrat
wt% của AX
XOS - 26 số 8 3 - - - 37
RAX thủy phân (aq.) 2 số 8 - - 4 nq nq 14
WAX thủy phân (aq.) 2 9 - - 4 2 3 20
aq. = dung dịch nước (không đệm), nq = không định lượng

5.6.2. Sự phát triển của các nền văn hóa bifidobacteria tinh khiết

Các ưu tiên cơ chất của ba loài vi khuẩn bifido khác nhau (Bifidobacterium vị thành niên,B.

breveVàB. longum) đã được nghiên cứu bằng cách ủ vi khuẩn với các chất thủy phân
Dxylose, L-arabinose, XOS, RAX và WAX và FOS (chất nền đối chứng). Quá trình lên men của

AXOS thay thế đơn lẻ và kép tinh khiết đã được nghiên cứu bằng cách nuôi cấy hỗn hợp của

ba vi khuẩn bifidobacteria trước đó với A2XX và MỘT2+3XX. Việc sử dụng các chất nền khác

nhau được trình bày trong Bảng 17.

Bảng 17.Sự phát triển của ba loài bifidobacteria và hỗn hợp của chúng.
Tăng trưởng của

Cơ chất B. vị thành niên B. breve B. longum

Mã ATCC 15703 ATCC 15700 ATCC 15707
60 giờ 140 giờ 60 giờ 140 giờ 60 giờ 140 giờ

D-xylose + +++ - - - -
L-arabinose - - - - +++ +++
XOS +++ +++ - - - -
RAX thủy phân + + - + + +
WAX thủy phân + ++ - - + +
FOS +++ +++ ++ ++ +++ +++
Cơ chất Sự phát triển của hỗn hợpB. vị thành niên,B. breveVàB. longum
60 giờ 140 giờ

MỘT2XX +++ +++

MỘT2+3XX - -
FOS +++ +++
Thang điểm: OD < 0,1 (- = không tăng trưởng), 0,1-0,39 (+ = tăng trưởng nhẹ), 0,4-0,69 (++ = tăng trưởng
vừa phải), 0,7-1 (+++ = tăng trưởng mạnh). Hàm lượng axetat, độ pH và mức tiêu thụ carbohydrate trong
các mẫu cũng được đo lường và xem xét trong việc xác định cường độ tăng trưởng. XOS =
xylooligosacarit, RAX thủy phân = thủy phân arabinoxylan lúa mạch đen, WAX thủy phân = thủy phân
arabinoxylan lúa mì, FOS = fructo-oligosacarit (cơ chất đối chứng).
 73

Bifidobacterium vị thành niênđã có thể phát triển trên các sản phẩm thủy phân D-xylose, XOS và

RAX và WAX, trong khiB. longumsử dụng L-arabinose và thủy phân.Bifidobacterium brevechỉ cho

thấy sự tăng trưởng nhẹ trên RAX thủy phân sau 140 giờ. Với thời gian lên men dài hơn, một số

thay đổi cũng được quan sát thấy trong sự phát triển củaB. vị thành niêntrên D-xylose và WAX

thủy phân, vì sự tăng trưởng tăng từ nhẹ sau 60 giờ đến mạnh hoặc trung bình sau 140 giờ. sự

tăng trưởng củaB. vị thành niênVàB. longummạnh trên cơ chất kiểm soát FOS, trong khiB. breve

đã có thể tăng trưởng vừa phải trên FOS. Hỗn hợp bifidobacteria sử dụng gần như hoàn toàn

AXOS tinh khiết thay thế đơn lẻ, nhưng AXOS tinh khiết với dư lượng xyloza thay thế kép không

được lên men.

Thậm chí, thông tin chi tiết hơn về các ưu tiên cơ chất của ba loại vi khuẩn bifido này đã
thu được bằng cách phân tích các cơ chất trước và sau khi ủ, sử dụng sắc ký HPAEC-
PAD. Định lượng cơ chất giúp hiểu rõ hơn về số phận của mono- và oligosacarit trong
quá trình lên men (Hình 10).Bifidobacterium vị thành niênlên men tất cả AXOS (Hình
10b) nhưng tiêu thụ chủ yếu là XOS, khiến Larabinose và một số D-xylose không được
sử dụng.Bifidobacterium longumcũng lên men AXOS, nhưng sử dụng chúng với chiến
lược khác với chiến lược củaB. vị thành niên, vì nó tiêu thụ L-arabinose được giải phóng
chứ không tiêu thụ XOS (Hình 10c).Bifidobacterium brevesử dụng chất thủy phân RAX
kém và không quan sát thấy sự tăng trưởng với chất thủy phân WAX làm chất nền
(Hình 10d).
 74

150 Một
mV WAX thủy phân
X2 2+ 3X
100 X MỘT3XA
316 g/ml g/ml MỘT2+3XX
62 g/ml 121 g/ml 72
91 g/ml
50

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50

MỘT
mV
400
265 g/ml B. vị thành niên b
300
X
200 135 g/ml

100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50

400 B. longum c
mV X2
300 1115 g/ml
200 X3
471 g/ml
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50

400 B. breve đ
mV
300 MỘT2+3
X
X X2
200 g/ml MỘT3X 76 g/ml MỘT2+3XX
84 g/ml 310 84 g/ml 112 g/ml
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50

Hình 10.Phân tích carbohydrate bằng HPAEC-PAD của sản phẩm thủy phân WAX a)
trước khi lên men và b) sau 140 giờ lên men bằngBifidobacterium vị thành niênATCC
15703, c)B. longumATCC 15700 và d)B. breveATCC 15707.

5.6.3 Lên men với hệ vi sinh vật trong phân

Trong quá trình lên men với hệ vi sinh vật trong phân, các yếu tố được đo lường cung cấp

thông tin về sự phát triển của vi khuẩn bifidobacteria là pH, áp suất và sự hình thành VFA và

H2. Sau thời gian ủ, người ta quan sát thấy những thay đổi về độ pH, cho thấy rằng hỗn hợp

hệ vi sinh vật trong phân đã lên men carbohydrate được cung cấp. Trong các mẫu có FOS, L-

arabinose, D-xylose, XOS, và RAX và WAX thủy phân, pH cuối là 5. Với RAX và WAX polyme là

nguồn carbon, độ pH cao hơn một chút (5,5) ở cuối quá trình thủy phân. thời kỳ lên men. Với

oligosacarit tinh khiết A2XX và MỘT2+3XX, độ pH lần lượt là 6 và 4. Áp suất tăng trong tất cả

các mẫu (0,8-2,2 psi) và sự thay đổi ít nhất được phát hiện trong các mẫu được trồng trên A

2+3XX và lớn nhất với RAX thủy phân như một nguồn carbon (Bảng 18). Sự hình thành hydro

(0,2-3,8 v/v %) được phát hiện trong các mẫu với tất cả các nguồn carbon khác ngoại trừ A2+3

XX, trong đó không có

 75

hydro đã được tìm thấy. Hầu hết hydro được hình thành trong các mẫu phát triển
trên xyloza và FOS. Với các mẫu phân, sự thay đổi nồng độ axetat sau thời gian ủ,
so với mẫu đối chứng sau 48 giờ, thường là khoảng 15 mM, nhưng trong các mẫu
có A2XX và MỘT2+3XX, sự thay đổi nồng độ axetat lần lượt là 22 và 31 mM. Trong
hầu hết các mẫu, một số thay đổi về nồng độ propionate và butyrate cũng được
phát hiện (tương ứng là 0,3-6,9 và -1,3-5,8 mM).

Bảng 18.sự hình thành của H2, áp suất và VFA (acetate, propionate và butyrate) trong thời
gian ủ (48 giờ) trong nuôi cấy hệ vi sinh vật trong phân.
h2 Áp lực axetat đề xuất butyrat
cacbohydrat pH cuối
(v/v %) (psi) ( triệu phút) ( triệu phút) ( triệu phút)

D-xylose 5 3,8 1.8 15.3 6,9 0,4

L-arabinose 5 2.0 1.9 15.4 2.6 2.3
XOS 5 2.1 2.0 16.7 4.3 4.0
RAX thủy phân 5 1.4 2.2 13,9 2.2 4,9
WAX thủy phân 5 2.0 2.0 13.4 1.9 2.9
RAX 5,5 0,2 1.1 14.4 2.3 3,5
SÁP 5,5 1.0 1.6 16,0 2.9 5,8
MỘT2XX 6 2.1 1.6 22.1 4.6 5.4
MỘT2+3XX 4 0 0,8 31.2 0,3 - 1.3
FOS 5 4.0 2.0 13,5 1.8 3.3
Áp lực ( psi) và VFA ( mM): Áp suất và sự hình thành VFA được so sánh với mẫu đối chứng
lúc 48 giờ.

Việc sử dụng các loại carbohydrate khác nhau đã được phân tích bằng phương pháp HPAEC-

PAD và những thay đổi trong phân phối bifidobacteria đã được nghiên cứu, bằng cách sử

dụng phân tích t-RFLP. Các sản phẩm thủy phân Larabinose, D-xylose, XOS, FOS, WAX và

RAX, và polyme WAX và RAX được sử dụng gần như hoàn toàn và chỉ còn lại dấu vết của các

hợp chất này (với polyme, dấu vết của XX4) đã được nhìn thấy trong sắc ký đồ HPAEC-PAD.

AXOS đơn thế tinh khiết (A2XX) cũng được lên men hoàn toàn và chỉ có dấu vết của xyloza

được tìm thấy trong sắc ký đồ (Bảng 19). Trong trường hợp AXOS tinh khiết được thay thế

kép (A2+3XX), oligosacarit không được tiêu thụ hoàn toàn (Bảng 19,IV.: Hình 4) và một lượng

nhỏ arabinose, xyloza, xylobiose, xylotriose và AXOS (A2+3XX và MỘT2XX) được phát hiện sau

48 giờ lên men. Kết quả cho thấy rõ ràng rằng trong các mẫu này, A2XX được hình thành

trong quá trình ủ từ A2+3XX bởi vi khuẩn trong hệ vi sinh vật trong phân.
 76

Bảng 19.Việc sử dụng AXOS tinh khiết bằng hệ vi sinh vật trong phân được phân tích bằng
sắc ký HPAEC-PAD.
Trước khi lên men Sau khi lên men
(g/ml) (g/ml)
cacbohydrat MỘT X X2 X3 MỘT2XX MỘT2+3XX
MỘT2XX 2300 - 7 - - - -
MỘT2+3XX 2900 53 28 120 136 25 14

RRNA 16S của vi khuẩn bifido được chiết xuất từ các mẫu được lấy trước và sau khi ủ hệ vi

sinh vật trong phân với hai AXOS tinh khiết và không bổ sung nguồn carbon và được phân

tích, sử dụng t-RFLP để đánh giá tác động của AXOS đối với sự phân bố của vi khuẩn

bifidobacteria. Để phân tích dữ liệu t-RFLP, vi khuẩn bifidobacteria có liên quan được chia

thành hai nhóm dựa trên kích thước chiều dài đoạn cuối đã biết của chúng trong các cặp cơ

sở (bp); nhóm 1:B. pseudocatenulatum(299 bp),B. catenulatum(299 bp) vàB. longum(299 bp);

nhóm 2:B. breve(470 bp),B. trẻ sơ sinh(480 bp),B. vị thành niên(469 bp),B. bifidum (467 bp)

vàB. denti(468 bp). Sự phân bố của hai nhóm bifidobacteria này được đo trước và sau 48 giờ

ủ.

Vi khuẩn nhóm 2 chiếm ưu thế trước khi ủ, nhưng trong các mẫu đối chứng không bổ
sung nguồn carbon, chỉ tìm thấy vi khuẩn bifidobacteria nhóm 1 sau 48 giờ (IV.: Hình
5). Với AXOS thế đơn (A2XX) làm nguồn carbon, sự phân bố của các nhóm bifidobacteria
giống như trong các mẫu đối chứng sau 48 giờ, trong khi với AXOS không được thay
thế (A2+3XX), nhóm 2 cũng chiếm ưu thế sau thời gian ủ bệnh. Trong thí nghiệm này,
AXOS đơn thế (A2XX), gần như được sử dụng hoàn toàn bởi vi khuẩn trong bùn phân,
gây ra sự phát triển hoặc sống sót của vi khuẩn bifidobacteria nhóm 1, cũng như
trường hợp trong các mẫu không có nguồn carbon bổ sung. Với AXOS bị phân hủy lên
men kém hiệu quả hơn, tỷ lệ vi khuẩn bifidobacteria nhóm 1 tăng khoảng 20% trong
quá trình ủ, so với các mẫu đối chứng trước khi ủ. Số lượng bifidobacteria không đạt
được với phương pháp được sử dụng.
 77

6. THẢO LUẬN

6.1 Thành phần cacbohydrat của nguyên liệu ban đầu

Hợp chất cacbohydrat của 10 arabinoxylan được chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây ngũ cốc

đã được phân tích bằng nhiều phương pháp khác nhau. Khi bắt đầu nghiên cứu, H.2VÌ THẾ4

quá trình thủy phân đã được sử dụng, bởi vì trong các thử nghiệm sơ bộ, năng suất monosacarit cao

hơn thu được với H2VÌ THẾ4thủy phân hơn so với quá trình metanol hóa bằng axit trong quá trình phân

hủy RAX (TÔI). Sau đó (II,III), phương pháp metanol hóa bằng axit được chọn làm phương pháp thông

thường cho hầu hết các mẫu vì sản lượng monosacarit cao và độ lặp lại của kết quả tốt hơn so với H2VÌ

THẾ4thủy phân. WAX-mv được thủy phân, sử dụng hỗn hợp enzyme được thiết kế đặc biệt cho bột mì AX

(Virkki et al., 2008) (IV.). Quá trình thủy phân bằng enzyme là một lựa chọn nhẹ nhàng hơn so với quá

trình thủy phân bằng axit hoặc metanol hóa bằng axit để khử polyme hóa AX vì không xảy ra sự phá hủy

không mong muốn các monosacarit được giải phóng. Do đó, quá trình thủy phân bằng enzyme là một

lựa chọn tốt để khử polyme chọn lọc AX, thành monosacarit, nhưng thách thức là tạo ra hỗn hợp bằng

cách bao gồm tất cả các enzyme cần thiết để phân hủy hoàn toàn AX. Quá trình metanol hóa bằng axit

hiện đang dễ dàng thích ứng hơn để phân hủy các AX khác nhau và các polysacarit có thể khác có trong

mẫu.

Hàm lượng arabinose, xyloza và glucose đã được xác định và tỷ lệ Ara/Xyl được
tính toán cho tất cả AX. Tỷ lệ Ara/Xyl đại diện cho số lượng --D-XylPcác đơn vị
được thay thế bằng --L-Arafdư lượng; tỷ lệ Ara/Xyl được tìm thấy càng cao thì càng cao

độ thay thế của AX là. Tuy nhiên, DS không chỉ định phân phối của --L-
Arafđơn vị (số lượng mono- và disubstituting --D-XylPđơn vị) trong chuỗi chính xyloza. Tỷ lệ Ara/Xyl

ảnh hưởng đến hành vi và đặc điểm của AX, chẳng hạn như độ hòa tan trong nước và độ nhớt của

dung dịch AX. AX có tính thay thế cao đang là thách thức đối vớikết thúc-1,4---Dxylanase phân hủy

và DS cao làm giảm sản lượng AXOS thu được trong quá trình thủy phân.

Thành phần monosacarit của WAX-mv thương mại cho thấy cấu trúc AX được thay
thế tương đối cao, mặc dù có sự khác biệt nhỏ giữa các kết quả thu được với quá
trình metanol hóa bằng axit và thủy phân bằng enzyme (tỷ lệ Ara/Xyl lần lượt là
0,47 và 0,56). Các kết quả phù hợp với tỷ lệ Ara/Xyl do nhà sản xuất báo cáo
(Megazyme; 0,61). Trong tài liệu trước đây, tỷ lệ Ara/Xyl được báo cáo cho
 78

bột mì AX dao động từ 0,52 đến 0,80 (MacArthur và D´Appolonia, 1980; Gruppen và
cộng sự, 1991). Tỷ lệ Ara/Xyl đối với RAX (quá trình metanol hóa axit; 0,42 và H2VÌ THẾ4
thủy phân; 0,46) thấp hơn trạng thái của nhà sản xuất (Megazyme) (0,64) hoặc báo
cáo của Cyran et al. (2003 và 2004) (0,67-0,75). Tỷ lệ Ara/Xyl của OSAX (0,09) tương
ứng tốt với tỷ lệ Ara/Xyl được báo cáo bởi nhà sản xuất (Sigma-Aldrich Chemie;
0,08) và Gruppen et al. (1991) (0,12).

Tỷ lệ Ara/Xyl cao nhất trong tất cả các AX được kiểm tra được tìm thấy ở WBAX
(0,60), nhưng các nghiên cứu khác đã báo cáo tỷ lệ Ara/Xyl thậm chí còn cao hơn
đối với cám lúa mì chiết xuất bằng kiềm AX (0,73 và 0,81) (Gruppen et al., 1991;
Nandini và Salimath, 2001). Từ cám lúa mạch đen, cả AX phân nhánh cao (tỷ lệ Ara/
Xyl 0,87) và AX với DS thấp (tỷ lệ Ara/Xyl 0,18) đều được chiết xuất bằng kiềm bởi
Hromádková et al. (1987) và kết quả thu được trong nghiên cứu hiện tại (0,43)
được tìm thấy ở giữa phạm vi đó. Tỷ lệ Ara/Xyl cao hơn cũng được báo cáo đối với
OBAX chiết xuất bằng kiềm (1,07) (MacArthur và D Áppolonia, 1980) so với được
phát hiện trong nghiên cứu này (0,53). Sự thay thế arabinose vừa phải được tìm
thấy trong CCAX (tỷ lệ Ara/Xyl là 0,33), cao hơn đáng kể so với báo cáo trước đó đối
với lõi ngô chiết xuất bằng kiềm AX (0,06-0,11) (Kabel và cộng sự, 2002a; Ramirez
và cộng sự, 2008 ).

Các biến thể tự nhiên trong tỷ lệ Ara/Xyl rất rộng (Izydorczyk và Biliaderis, 1995), điều này giải

thích một phần sự khác biệt về tỷ lệ Ara/Xyl được phát hiện trong các nghiên cứu khác nhau. Hơn

nữa, các quy trình khác nhau được sử dụng trong quá trình tách các mô hạt ngũ cốc, dẫn đến các

bộ phận thực vật hơi khác nhau (phần còn lại từ các lớp mong muốn), điều này có thể dẫn đến sự

khác biệt trong cấu trúc AX được chiết xuất. Sự khác biệt cũng có thể là do các loại ngũ cốc khác

nhau, cũng như các phương pháp chiết xuất và phân tích đa dạng.

6.2 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX

Cấu trúc của tám AX được chiết xuất bằng kiềm từ các phụ phẩm ngũ cốc khác nhau và hai

AX thương mại đã được nghiên cứu, sử dụng phân tích NMR đối với AX cao phân tử và bằng

cách thủy phân AX bằng enzym và nghiên cứu AXOS được tạo ra bằng HPAEC-PAD
 79

sắc ký. Phân tích NMR của các mẫu polyme cung cấp thông tin về toàn bộ phân tử và
do đó, là một phần quan trọng trong việc làm sáng tỏ cấu trúc của AX. Tuy nhiên, có
một số hạn chế trong kỹ thuật NMR; để có kết quả định lượng cần độ hòa tan tổng, độ
phân giải tín hiệu tốt, hàm lượng mẫu phải đủ và điều kiện chạy máy NMR phải tối ưu.
Trong nghiên cứu hiện tại, nồng độ mẫu là phù hợp, nhưng không phải tất cả các mẫu
đều hòa tan hoàn toàn trong D2O và độ phân giải của các đỉnh không hoàn chỉnh do
một số đỉnh chồng lên nhau. Sự chồng chéo của các tín hiệu là điển hình cho các cấu
trúc phức tạp của AX và bắt nguồn từ --L-Arafcác đơn vị gắn với hai gốc xyloza được
thay thế liên tiếp (Hoffmann et al., 1992). Mặc dù vậy, thông tin cấu trúc có giá trị về
phần hòa tan trong nước của AX được chiết xuất bằng kiềm đã thu được, mặc dù các
điều kiện phân tích không thỏa đáng cho phân tích định lượng.

Các sản phẩm thủy phân của AX đã được xác định và định lượng. Tuy nhiên, AXOS thu được

và phân tích chỉ là các oligosacarit ngắn từ phần thủy phân của phân tử AX; do đó, sự xuống

cấp của AX có thể không phải lúc nào cũng hoàn tất. Một số AX có tính thay thế cao, hoặc có

thể xen kẽ giữa các vùng phân nhánh cao và ít phân nhánh (Ewald và Perlin, 1959; Gruppen

et al., 1993), trong đó các vùng thay thế cao hạn chế hoạt động của các enzym. Các sản

phẩm thủy phân được định lượng từ quá trình thủy phân Shearzyme chiếm 28% trọng

lượng của AX (TÔI), trong khi họcIIhơn 40% trọng lượng đã được định lượng. Năng suất cao

hơn trong nghiên cứuIIđã đạt được ít nhất một phần do

loại bỏ có chọn lọc một số --L-Arafnhóm thế từ AX bằng AXH-m

xử lý, tiết lộ nhiều vị trí hơn trên xương sống xyloza có thể truy cập được chokết thúc-1,4---Dxylanaza.

trong học tậpIII, tổng lượng sản phẩm thủy phân định lượng cao nhất là 40% tổng lượng AX đã cân.

Điều này đã đạt được trên WStAX với mức độ thay thế thấp. Sản lượng của các sản phẩm thủy phân được

định lượng cũng thấp một cách đáng ngạc nhiên trong các sản phẩm thủy phân của AX với DS thấp. Mặc

dù thiếu sót về khả năng hòa tan hoàn toàn của AX không ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân thành

công bằng enzym, nhưng khả năng hòa tan hoàn toàn có thể quan trọng hơn so với những gì đã được

xem xét trước đây. Ngoài các sản phẩm thủy phân đã xác định, một số AXOS nhỏ hơn không xác định

cũng thường được tìm thấy. Bằng cách kết hợp các kết quả từ quá trình thủy phân AX với phân tích NMR,

sẽ thu được thông tin chi tiết hơn về cấu trúc của AX.
 80

Cường độ của tín hiệu NMR được so sánh trong các mẫu và tất cả các AX được nghiên
cứu đều sở hữu --L-Araf(1-3) chuỗi bên đơn thế. Xem lại các sản phẩm thủy phân (Bảng
13), oligosacarit A3X thường xuất hiện và rõ ràng là AXOS chiếm ưu thế nhất trong các
sản phẩm thủy phân RAX, WBAX, RBAX, OBAX, RiHAX và WStAX. Trong phân tích NMR,
người ta quan sát thấy sự tương đồng về cấu hình thay thế giữa các AX có nguồn gốc
phân nhánh (Bảng 12), nhưng người ta thấy có sự khác biệt về số lượng chuỗi bên.
Quang phổ NMR cho thấy, WAX-mv (Pitkänen et al., 2009) và WBAX chứa một phần ba
--L-Araf(1-3) được thay thế đơn lẻ --D-XylPdư lượng

và hai phần ba là --L-Araf(1-2) và (1-3) được thay thế kép --D-XylPcác đơn vị (III;
Hình 1), trong khi RAX (Pitkänen et al., 2009) và RBAX chứa hai phần ba --
L-Araf(1-3) thế đơn --D-XylPdư lượng và một phần ba của các đơn vị thay thế kép. Những kết quả

này tương ứng với các báo cáo trước đây về bột mì và lúa mạch đen thương mại AX (Sørensen et

al., 2006; Höije et al., 2008). Mặc dù lúa mì và bột lúa mạch đen và cám AX có tỷ lệ Ara/Xyl tương tự

nhau, nhưng sự khác biệt chính trong sự phân bố của các nhóm thế là

thành lập. Thay thế kép --D-XylPcác đơn vị không thường xuyên hơn trong OBAX so với lúa mạch đen và

lúa mì dựa trên AX, trên NMR sprectra (III; Hình 1). Tất cả các AX được nghiên cứu đều chứa --L-Araf

bị loại --D-XylPđơn vị theo phân tích NMR, nhưng chỉ trong các sản phẩm thủy
phân của RiHAX không tìm thấy AXOS bị thay thế.

Trong dịch thủy phân WAX-mv, 14% khối lượng sản phẩm được định lượng là A3X, trong khi

25% trọng lượng chiếm các oligosacarit được thay thế kép A2+3X và A2+3XX, nhưng trong

WBAX, cùng một lượng AXOS đơn và không được thay thế (tương ứng là 16% trọng lượng và

14% trọng lượng) đã được phát hiện. Khoảng ba phần tư AXOS trong RAX và RBAX được

thay thế một lần và một phần tư bị loại bỏ, trong khi hai phần ba số AXOS được định lượng

là một loại và một phần ba bị loại bỏ trong dịch thủy phân OBAX. Không thể so sánh dễ

dàng giữa các kết quả phép đo phổ NMR và AXOS được định lượng từ các sản phẩm thủy

phân, vì không phải tất cả các sản phẩm thủy phân đều được xác định và AXOS không bị

thủy phân hoàn toàn. Dựa trên quang phổ NMR, OBAX (Ara/Xyl 0,53) chứa các đơn vị gây sốt

thay thế gấp đôi so với RBAX (Ara/Xyl 0,43), nhưng tỷ lệ AXOS không được thay thế trong sản

phẩm thủy phân cao hơn trong OBAX. Điều này có thể cho thấy phân phối --L-Ara đồng đều

hơnfnhóm thế trong chuỗi xyloza của OBAX. Sản lượng của AXOS bị phân hủy vẫn thấp một

cách đáng ngạc nhiên trong dịch thủy phân RBAX,

 81

có lẽ bởi vì một lượng lớn các đơn vị xyloza được thay thế kép nằm ở những khu vực có DS

cao và không có vị trí nào trên xương sống xylan mà enzyme có thể tiếp cận được.

Sự tồn tại của một --D-Xyl khá hiếm gặpP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên đã được báo cáo
trước đây trong lõi ngô AX và vỏ lúa mạch AX (Aspinall, 1959; Ebringerová et al., 1992;
Höije et al., 2006). Ngoài CCAX và BHAX, --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên cũng được
phát hiện ở đây trong RiHAX, OSAX và dấu vết trong WStAX, sử dụng quang phổ NMR.
Những phát hiện này được hỗ trợ bởi các nghiên cứu về các sản phẩm thủy phân AX, vì
oligosacarit D2,3X được HPAEC-PAD xác định từ các nguyên liệu làm từ ngũ cốc giống
như trong phân tích NMR. Đáng ngạc nhiên là trong các sản phẩm thủy phân BHAX và
CCAX, D2,3X là AXOS chiếm ưu thế nhất.

Ngoài các chuỗi bên được xác định, dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của --L-Araf(1-2)

monosubstituting --D-XylPdư lượng trong BHAX đã được tìm thấy bằng quang phổ NMR (III:

Hình 1, tín hiệu ở 5,30 ppm trong BHAX). Đỉnh cao có lẽ đang trình bày --L-Araf
(1-2)mono chồng lên nhau với các tín hiệu bắt nguồn từ --L-Araf(1-3)di và/hoặc 4-O-

Tôi---D-GlcPA(1-2) và không thể phân tích chính xác. Tuy nhiên, trong BHAX,
kích thước của các tín hiệu, biểu thị sự hiện diện của --L-Araf(1-3)di và --L-Araf(1-2)di

chuỗi bên, không bằng nhau như đáng lẽ phải có nếu chỉ bắt nguồn từ --L-Araf dư
lượng liên quan đến thay thế kép. Sự khác biệt về kích thước cực đại cho thấy rõ ràng
sự hiện diện của --L-Araf(1-2) chuỗi bên đơn. Tuy nhiên, trong các mẫu thủy phân

được phân tích bằng HPAEC-PAD, không đủ AXOS với --L-Araf(1-2) thế đơn -- D-XylPđơn
vị (A2X hoặc A2XX) được hình thành trong bất kỳ mẫu nào để xác định rõ ràng. MỘT2XX
trùng với D2,3X, khiến cho việc xác định thậm chí còn khó khăn hơn. Không có bằng
chứng cho các oligosacarit với 4-Ô-Tôi---D-GlcPDư lượng trong BHAX đã được tìm thấy,
nhưng trong RiHAX, OSAX, CCAX và WStAX thì oligosacarit U4m2XX đã được xác định.
Như vậy, 4-Ô-Tôi---D-GlcPMột đơn vị bên đã được tìm thấy trong cùng một AX, sử dụng
phân tích HPAEC-PAD và quang phổ NMR.

Sự xuất hiện của các đơn vị bên, được gắn vào các gốc xyloza của chuỗi chính AX được tìm thấy

trong nghiên cứu này, phù hợp với sự xuất hiện của các nhóm thế AX trong các bộ phận của cây

ngũ cốc tương ứng được báo cáo trong tài liệu. Tuy nhiên, sự tồn tại của --D- phức tạp hơn
 82

XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên trong RiHAX, OSAX và WStAX, ngoài các nguồn BHAX và
CCAX đã biết trước đây, lần đầu tiên được báo cáo ở đây. Rơm rạ, rơm rạ, vỏ trấu và lõi
ngô là những phụ phẩm nông nghiệp không được tiêu thụ và do đó chúng có thể là
nguyên liệu thô có giá trị cho AXOS. Trong quá trình thủy phân AX, được chiết xuất từ
các sản phẩm phụ này, một lượng lớn phức hợp, có thể lên men chậm AXOS với nhóm
phụ --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) (D2,3X) được sản xuất. Mặt khác, một lượng lớn AXOS,
được điều chế từ bột mì và cám AX, được thay thế gấp đôi, điều này cũng rất thú vị do
khả năng lên men chậm của chúng. Tuy nhiên, vì bột được sử dụng làm nguyên liệu
thực phẩm và cám cũng có thể được khai thác trong dinh dưỡng của con người nên
chúng không phải là nguồn hợp lý nhất để chiết xuất AX để sản xuất AXOS. Do đó, AX
có trong bột và cám, có thể bị thủy phân thành AXOStại chỗmà không cần giải nén AX
trước.

6.3 Sản xuất AXOS ở quy mô chuẩn bị

Sáu AXOS khác nhau (A3X, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2X, MỘT2XX, D2,3X) được điều chế bằng

phương pháp enzym từ RAX, WAX-mv và OSAX trên thang chuẩn (bắt đầu từ 1,5 đến 5,0 g

AX). AXOS đã được làm sạch và cấu trúc của chúng được phân tích đầy đủ (I-III). Shearzyme,

vớiAspergillus aculeatusGH10kết thúc-1,4---D-xylanase là enzyme chính,

sở hữu hoạt động cao đối với liên kết xylosidic trước --L-Araf-được thay thế --D-XylPcặn,
do đó tạo thành AXOS với các nhóm thế được gắn vào đầu không khử của chuỗi xyloza
tuyến tính ngắn. Các oligosacarit A2X và D2,3X là tiểu thuyết và cấu trúc chi tiết H1và/
hoặc C13quang phổ NMR của A2+3X và A3X được trình bày lần đầu tiên trong nghiên cứu
này.

AXOS thay thế kép lần đầu tiên được sản xuất với năng suất tốt (A2+3XX 11,8% trọng lượng

của AX (0,22 mmol) và A2+3X 5,6 wt% của AX (0,13 mmol)) và --L-Ara đơn lẻ tương ứngf-(1-2)

AXOS được thay thế cũng có thể được điều chế với năng suất tương tự bằng cách xử lý thêm

AXOS được thay thế kép bằng AXH-d3. Trong số AX bị thủy phân, 11,7 wt% (0,22 mmol) là A2

XX. số lượng của A2X không định lượng được do thiếu mẫu tinh khiết. Tuy nhiên, nếu A.2X

được biến đổi tương tự từ A2+3X, lượng của nó có thể được ước tính là 0,13 mmol. Sản lượng

của A3X (3% của AX, 0,11 mmol) tương đối thấp,
 83

bởi vì RAX (với Ara/Xyl 0,46) đã bị thủy phân vớikết thúc-1,4---D-xylanase không có tiền xử lý,

và có lẽ các khu vực được thay thế cao không bị thủy phân, do cơ chất phân nhánh dày đặc

không phù hợp với vị trí hoạt động của enzyme. Các AXOS khác có sản lượng rõ ràng cao

hơn (A2X, MỘT2XX, MỘT2+3X và A2+3XX) đã được điều chế bằng cách xử lý AX trước với --

arabinofuranosidase (AXH-m) để giảm DS trước khikết thúc-1,4---Dxylanase thủy phân. tinh

khiết D2,3X chỉ được định lượng sau khi phân đoạn từ mẫu tốt nhất chứa 443 g/ml (3,9 mol

trong một phần 5 ml). Hầu hết các nghiên cứu trước đây báo cáo về AXOS tinh khiết đã được

thực hiện trên quy mô phân tích. Bột mì AX (80 mg) được thủy phân bởiA. awamori endo

-1,4---D-xylanase I trong nghiên cứu của Kormelink et al. (1993b), và 50-72% khối lượng sản

phẩm thủy phân (monosacarit, XOS và AXOS) đã được định lượng. Từ dịch thủy phân mạch

nha lúa mạch, thu được tối đa 26nmol AXOS tinh khiết chính (A2XX, MỘT2+3XX và XA2+3XX) đã

được định lượng (Broberg et al., 2000). Nghiên cứu của Ordaz-Ortiz et al. (2004) đã được

thực hiện trên quy mô chuẩn bị và từ bột mì AX (2,5 g) từ đó 8% trọng lượng AXOS được sản

xuất với hai oligosacarit chiếm ưu thế nhất, XA3XX và XA2+3XX, tương ứng với 3% trọng lượng

(0,11 mmol) của AX và 2,3% trọng lượng (0,07 mmol) của AX.

Shearzyme là một chế phẩm thương mại phù hợp để sản xuất AXOS, bởi vì nó có
sẵn rất nhiều với giá tương đối thấp so với các enzyme tinh khiết. AXOS tinh khiết,
được sản xuất trên thang miligam, được sử dụng làm mẫu chuẩn để nhận dạng và
định lượng AXOS tương ứng từ các sản phẩm thủy phân trong đó tất cả các sản
phẩm thủy phân đều có mặt dưới dạng hỗn hợp. Các tiêu chuẩn tự tạo là rất cần
thiết vì các tiêu chuẩn AXOS thương mại không có sẵn. AXOS tinh khiết cũng được
sử dụng làm chất nền cho các nghiên cứu lên men trong đó ảnh hưởng của các
kiểu thay thế khác nhau được đánh giá về khả năng sử dụng AXOS của vi khuẩn
bifidobacteria. Để hiểu vai trò của từng AXOS riêng lẻ trong quá trình lên men, các
AXOS chuỗi ngắn được tinh chế là những mô hình tốt để sử dụng,
 84

6.4 Những thách thức trong việc xác định và định lượng AXOS

Sau khi AXOS được tinh chế và cấu trúc của chúng được đặc trưng đầy đủ, việc nhận dạng

bằng TLC hoặc HPAEC-PAD có thể được thực hiện từ các sản phẩm thủy phân với hỗn hợp

của một số AXOS, sử dụng AXOS tinh khiết làm hợp chất tiêu chuẩn. Tuy nhiên, việc xác định

AXOS từ các sản phẩm thủy phân, chỉ sử dụng một phương pháp, là một thách thức vì trên

TLC, Rfcác giá trị cho A2XX và MỘT2+3XX (0,45 và 0,46), D2,3X và XA3X (0,48) và A2X và A2+3X

(0,51 và 0,52) tương tự nhau (Bảng 14), trong khi ở HPAEC-PAD sắc ký A2XX rửa giải cùng với

D2,3X (30,1 và 30,2 phút) và A3X và XA3X (31,0 phút) đồng rửa giải với cùng thời gian lưu (Hình

9). Việc sử dụng hai phương pháp này thuận lợi cho việc nhận dạng chính xác, vì các AXOS

khác nhau, cùng rửa giải trong HPAEC-PAD, có R tương tự nhau.f

giá trị trên TLC. Việc xác định chính xác AXOS rất quan trọng để định lượng, vì
trong HPAEC-PAD, mỗi oligosacarit yêu cầu carbohydrate tiêu chuẩn tương ứng.

Sự hình thành arabinoxylotrioza (XA3X) rất khó phân tích bằng HPAEC-PAD, do quá trình rửa giải

gần như đồng thời của nó với arabinoxylobiose (A3X) (Kabel và cộng sự, 2002a) (TÔI). Trong các

sản phẩm thủy phân của Shearzyme, một số XA3X ngoài A3X có thể được hình thành. Sự hình

thành của XA3X ngoài A3X được hiển thị trên tấm TLC (TÔI: Hình 7). AXOS chính được hình thành

trong quá trình thủy phân Shearzyme mang --L-Araf(các) đơn vị ở đầu không khử của chuỗi chính

xyloza, và do đó A3X rõ ràng được tạo ra hầu hết và chỉ một lượng nhỏ XA3X thường được hình

thành, như được phân tích bằng TLC.

Một lượng nhỏ --L-Araf(1-2)-các AXOS được thế đơn (A2X và A2XX) có thể được tạo ra
trong quá trình thủy phân AX, vì tất cả AX ngũ cốc đều chứa một lượng nhỏ --L-Ara tự
nhiênf(1-2)nhóm thế đơn (Izydorczyk và Biliaderis, 1995). Tuy nhiên, trong

Chỉ quang phổ NMR BHAX, WBAX và RBAX của AX được nghiên cứu có thể chứa --L-Araf
(1-2)đơn vị một phía, nhưng việc nhận dạng không chắc chắn do các đỉnh của --L-Ara
chồng lên nhauf(1-2)đơn sắc và --L-Araf(1-3)di (III; Hình 1). Chỉ BHAX trong số này

ba AX cũng chứa --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên và oligosacarit D2,3X được tạo

ra trong quá trình thủy phân Shearzyme của BHAX. Nếu một2XX có mặt trong sản
phẩm thủy phân BHAX, nó đồng rửa giải với D2,3X trong HPAEC-PAD. Cường độ cực
đại trong quang phổ NMR cho thấy --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên
 85

phổ biến hơn trong BHAX hơn --L-Araf(1-2)đơn vị bên, nhưng trong HPAEC-PAD A2XX có thể

không được xác định do đồng rửa giải với D2,3X. Tuy nhiên, A.2X có thể được xác định trong

HPAEC-PAD và do đó có sự tồn tại của --L-Araf(1-2)Các đơn vị một bên cũng có thể được hiển

thị từ các sản phẩm thủy phân.

Bột mì không chiết xuất được bằng nước AX chứa các vùng phân nhánh cao và ít phân

nhánh. Các khu vực phân nhánh cao được làm giàu bằng cả --L-Araf(1-2 và 1-3)

bị loại và --L-Araf(1-2) đơn vị xyloza được thay thế đơn, nhưng loại thứ hai không có ở những vùng

ít phân nhánh hơn (Gruppen et al., 1993). Các vùng phân nhánh cao sẽ khó khăn hơn cho các

enzyme hoạt động và do đó, điều này cũng có thể dẫn đến việc đánh giá thấp lượng

- - L-Araf(1-2) các đơn vị xyloza được thay thế đơn trong AX trong khi kiểm tra quá trình thủy phân

các sản phẩm. Tuy nhiên, --L-Araf(1-2)nhóm thế mono thường không phải là nhóm phụ chiếm ưu

thế vì chúng đóng góp dưới 10% nhóm thế trong bột mì không chiết xuất được trong nước AX

(Gruppen và cộng sự, 1993) và chỉ có dấu vết trong bột lúa mạch đen hòa tan trong nước AX

(Vinkx và cộng sự cộng sự, 1995). --L-Araf(1-2)nhóm thế mono có nhiều nhất trong hạt lúa mạch

hòa tan trong kiềm và bột mì AX (22-28% nhóm thế) (Viëtor et al., 1992; Trogh et al., 2005;

Pitkänen et al., 2008) .

Các arabinoxylo-oligosacarit A3X, XA3X, XA3XX, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2X, MỘT2XX và D2,3X

đã được xác định thành công, sử dụng kết hợp TLC và HPAEC-PAD. Định lượng thành công

trong A3X, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2XX và D2,3X trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, nếu cả A2

XX và D2,3X được xác định từ cùng một mẫu thủy phân, định lượng của chúng không chính

xác do rửa giải đồng thời. Tương tự, sự có mặt của A3X và XA3X trong cùng một mẫu cản trở

việc định lượng chính xác do hiện tượng đồng rửa giải.

6.5 Hoạt động của AXOS trong hệ thống HPAEC-PAD

6.5.1 Thứ tự rửa giải của AXOS

Thứ tự rửa giải của AXOS trong hệ thống HPAEC-PAD rất khó dự đoán, do một số tương tác

giữa cột, chất rửa giải và cacbohydrat rửa giải ảnh hưởng đến quá trình rửa giải. HPAEC-

PAD có thể tách các oligosacarit dựa trên sự thay đổi nhỏ về điện tích thực của chúng,
 86

vị trí phân nhánh hoặc đồng phân liên kết (Thayer et al., 1998). Carbohydrat được
phân tách hoàn toàn ở độ pH cao được sử dụng trong phương pháp HPAEC-PAD.
Do đó, điều cần thiết để lưu giữ trong cột sắc ký trao đổi anion là sự có mặt của
các nhóm –OH có sẵn để phân ly và tương tác với vật liệu cột. các trvà pKMộtgiá trị
của carbohydrate tương quan nghịch và trtăng khi khối lượng phân tử tăng (Antec
Leyden). XOS tuyến tính khác nhau tùy theo chuỗi oligosacarit tương đồng và XOS
càng ngắn thì chúng càng sớm rửa giải khỏi cột.

Các arabinose (--L-Araf) các nhóm thế dường như làm tăng thời gian lưu của các phân
tử do arabinoxylobiose rửa giải muộn hơn xylotriose và xylotetraose. Hơn nữa, số
lượng ngày càng tăng của --L-Arafchuỗi bên tăng khả năng lưu giữ trong vật liệu cột.
Như vậy arabinoxylobioses (A2X và A3X) rửa giải trước diarabinoxylobiose (A2+3X), trong
khi arabinoxylotrioses (A2XX và XA3X) rửa giải trước diarabinoxylotriose (A2+3XX). AXOS
với --L-Araf(1-2)đơn vị đơn liên kết với --D-XylPđơn vị ở đầu không khử của chuỗi xyloza
cho thấy khả năng lưu giữ vật liệu cột thấp hơn

hơn AXOS tương ứng với --L-Araf(1-3)nhóm thế đơn. Trên thực tế, kiểu liên kết của
(1-3) đã làm tăng trvề cơ bản, tương ứng tốt với tính axit mạnh hơn của nhóm 2-
OH so với nhóm 3-OH đã báo cáo trước đó (Roberts et al., 1971). Do đó, nhóm thế
ở O-2 của --D-XylPngăn chặn sự tương tác của 2-
nhóm và cột OH, và với nhóm thế ở O-3 của --D-XylP,nhóm 2-OH có tính axit hơn sẽ tự
do phản ứng. Với các AXOS được thay thế tương tự, những chất có chuỗi chính xyloza
ngắn hơn được rửa giải trước. Với --L-Arafđơn vị được gắn vào đầu không khử của
chuỗi xyloza, oligosacarit dường như rửa giải muộn hơn so với AXOS tương ứng có
nhóm thế bên trong. Điều này được kết luận từ quá trình rửa giải đồng thời của A3X và
XA3x.

6.5.2 Phản hồi của AXOS trong PAD

Các phản hồi cho các AXOS khác nhau là khác nhau khi phát hiện ampe kế dạng xung. Việc

sử dụng PAD là thuận lợi, vì không cần tạo dẫn xuất của cacbohydrat được nghiên cứu và

phương pháp này rất nhạy. Mặc dù carbohydrate có thể được phát hiện ở cấp độ picomolar,

nhưng phản ứng không giống nhau đối với những oligosacarit mang tương tự
 87

nhóm thế gắn vào các vị trí khác nhau của chuỗi chính oligosacarit (Lee, 1990). Do đó,
cần có một tiêu chuẩn định lượng cho từng oligosacarit khác nhau được xác định.
Trong nghiên cứu này, phản ứng PAD tương đối tốt nhất trên cơ sở mol thu được đối
với A3X và xấu nhất đối với xylotriose và xylotetraose trong các điều kiện phân tích
HPAEC-PAD được sử dụng khi chiều cao của các pic được so sánh. Trong AXOS, với
double --L-Arafthay thế ở đầu không khử, chiều dài ngày càng tăng của chuỗi xyloza
làm giảm phản ứng PAD; do đó, phản ứng tương đối cho A2+3X tốt hơn cho A2+3XX. Hơn
nữa, chuỗi chính kéo dài trong AXOS với các mẫu thay thế khác nhau đã làm giảm phản
ứng của PAD. Tuy nhiên, AXOS dài hơn cũng bị rửa giải muộn hơn, điều này có thể đã
mở rộng các đỉnh và hạ thấp độ cao của các đỉnh. Phản ứng tương đối yếu nhất của
AXOS được nghiên cứu thu được đối với D2,3X. Vị trí của --L-Araf

nhóm thế giữa hai đơn vị xyloza trong D2,3X, so với thiết bị đầu cuối --L-Araf(các) thiết bị

trong AXOS khác, có thể đã ảnh hưởng đến phản hồi thấp. Ít thông tin về phản ứng PAD của

AXOS được tìm thấy trong tài liệu.

6.6 Thí nghiệm lên men

6.6.1 Sử dụng chất nền

Trong các thí nghiệm lên men, sự phát triển củaB. vị thành niênATCC 15703,B. longum ATCC

15707,B. breveATCC 15700 và hệ vi sinh vật trong phân trên L-arabinose, D-xylose, XOS,

AXOS và trên hỗn hợp của chúng (các chất thủy phân WAX và RAX) đã được thử nghiệm,

đồng thời đánh giá tiềm năng tiền sinh học của AXOS. Các dấu hiệu về sự ưu tiên cơ chất rõ

ràng giữa các chủng vi khuẩn bifido khác nhau đã được tìm thấy.Bifidobacterium vị thành

niênđã có thể phát triển trên XOS, chậm trên D-xylose nhưng không phát triển trên L-
arabinose. Ngược lại,B. longumưa thích L-arabinose và không phát triển trên D-xylose hoặc

XOS tinh khiết. Cả hai chủng đều có thể sử dụng AXOS nhưng với các chiến lược khác nhau,

vì sau khi phân tách L-arabinose,B. vị thành niêntiêu thụ XOS hình thành, trong khiB.

longum lên men L-arabinose được giải phóng.Bifidobacterium brevephát triển kém trên tất
cả các chất nền được cung cấp, mặc dù nó có thể sử dụng từ từ một số xylobiose và AXOS từ

hỗn hợp, vì một số lượng giảm được phát hiện sau khi ủ, so với tình huống ban đầu.

Bifidobacterium vị thành niênVàB. longumđã từng

 88

có thể phát triển như nhau trên các sản phẩm thủy phân AX, nhưng sự phát triển quan sát được rõ ràng

là ít hơn so với trên FOS, cho thấy khả năng lên men bị hạn chế hơn của hỗn hợp giàu XOS và AXOS. Tất

cả các chất nền được cung cấp gần như được sử dụng hoàn toàn bởi vi khuẩn từ hệ vi sinh vật trong

phân.

sự tăng trưởng củaBifidobacterium vị thành niênATCC 15703,B. longumATCC 15707, và

B. breveATCC 15700 trên D-xylose, L-arabinose, XOS và AXOS đã được một số nhóm báo cáo
trước đây và kết quả thu được trong nghiên cứu hiện tại nhìn chung phù hợp với những

điều này.B. vị thành niênATCC 1570 trước đó cho thấy sự tăng trưởng khiêm tốn trên xyloza

(Palframan et al., 2003; Moura et al., 2007), mặc dù Crittenden et al. (2002) và Gullón et al.

(2008) suy đoán về sự bất lực củaB. vị thành niênđể sử dụng xyloza. Trong nghiên cứu hiện

tại, sự phát triển rõ ràng trên xyloza tinh khiết đã được phát hiện sau thời gian ủ kéo dài

(140 giờ). Hơn nữa, phân tích HPAEC-PAD cho thấy xyloza tinh khiết được tiêu thụ bởi

B. vị thành niênATCC 15703; tuy nhiên, không phát hiện thấy giảm hàm lượng xyloza trong các

sản phẩm thủy phân AX. Sự khác biệt này thực sự có thể giải thích các kết luận khác nhau về khả

năng củaB. vị thành niênATCC 15703 để lên men xyloza. Trong các nghiên cứu trước đây, sự tăng

trưởng củaB. longumATCC 15707 được phát hiện với xyloza tinh khiết (Palframan et al., 2003),

trong khi đó trong nghiên cứu hiện tại xyloza được sử dụng bởiB. longumATCC 15707 chỉ khi có

trong hỗn hợp với xylobiose và AXOS. kết quả màB. longumATCC 15707 có thể, nhưngB. vị thành

niênATCC 15703 không thể, việc sử dụng L-arabinose rất phù hợp với dữ liệu đã công bố (Roy và

Ward, 1990; van Laere và cộng sự, 1999; Moura và cộng sự, 2007). Các báo cáo trước đây cũng chỉ

ra sự bất lực củaB. breveATCC 15700 để phát triển trên xyloza và L-arabinose tinh khiết (Mitsuoka,

1982; Roy và Ward, 1990; Palframan và cộng sự, 2003).

Sự phát triển mạnh mẽ củaB. vị thành niênATCC 15703 trên XOS thương mại (X2, X3và X4)

phù hợp với một số báo cáo trước đó (van Laere và cộng sự, 1999, 2000; Moura và cộng sự,

2007; Gullón và cộng sự, 2008). Những phát hiện khác biệt chính giữa nghiên cứu này và các

kết quả trước đó đã được tìm thấy trong khả năng của XOS để thúc đẩy sự phát triển củaB.

longumATCC 15707. Trong nghiên cứu của Crittenden et al. (2002),B. longumATCC 15707
(VTT E-96664) có thể phát triển hiệu quả trên hỗn hợp XOS (Xylo-oligo 70, Suntory Co. Ltd.,

Osaka, Japan), tuy nhiên, chứa hơn 40% monosacarit tự do, bao gồm xyloza và một ít

glucose . Như vậy, sự tăng trưởng củaB. longumcó thể đã xảy ra do việc sử dụng các

monosacarit thay vì XOS. Gullón et al. (2008) báo cáo mức tăng trưởng khiêm tốn củab.
 89

longumATCC 15707 về XOS chế biến từ trấu. Ngoài XOS, sản phẩm còn chứa một số
arabinose và xyloza tự do, và do nguyên liệu thô được sử dụng để sản xuất XOS, nó cũng có

thể chứa một số AXOS, tất cả đều có thể thúc đẩy sự phát triển củaB. longumATCC 15707

(Gullón và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, van Laere et al. (2000) báo cáo khả năng củaB. longum

ATCC 15707 để phát triển trên hỗn hợp XOS không có xyloza (X2, X3và X4). Trong nghiên cứu

hiện tại, XOS là nguồn carbon duy nhất quá thách thức đối vớiB. breveATCC 15700, cũng

được quan sát thấy trong nghiên cứu của Palframan et al. (2003), trong khi Gullón et al.

(2008) đã báo cáo về khả năng phát triển của cùng một dòng trên XOS. Trong hỗn hợp XOS

thương mại (Wako) được sử dụng làm chất nền trong quá trình lên men vi sinh vật trong

phân và bifidobacteria tinh khiết, một số oligosacarit không xác định có thể là AXOS, vì

Moura et al. (2007) đã báo cáo sự hiện diện của AXOS trong sản phẩm XOS thương mại

(Xylo-oligo 95P; Suntory). Tuy nhiên, sự hiện diện có thể có của AXOS là không mong muốn

trong XOS, vì nó có thể ảnh hưởng đến khả năng sử dụng XOS của bifidobacteria khi việc sử

dụng XOS tuyến tính được đánh giá.

Các nghiên cứu với AXOS hiếm hơn so với XOS. van Laere và cộng sự. (2000) báo cáo rằng AXOS

(chủ yếu là L-Arafthay thế kép XOS) được lên men một phần bằngB. vị thành niên ATCC 15703 và

hoàn toàn bởiB. longumATCC 15707. Điều này hỗ trợ dữ liệu của chúng tôi rằng cả hai chủng đều

có thể tiêu thụ AXOS, nhưng chúng tôi đã chứng minh việc sử dụng một phần AXOS của cả hai

loài; I EB. vị thành niênATCC 15703 đã sử dụng XOS xương sống chứ không phải L-Ara đã phát

hànhfthay thế, vàB. longumATCC 15707 sử dụng L-Arafđược phát hành nhưng không phải là XOS

còn lại.

Trong nghiên cứu hiện tại, một phương pháp quy mô nhỏ và môi trường cực kỳ nghèo dinh

dưỡng đã được áp dụng. Việc sử dụng phương pháp quy mô nhỏ này là cần thiết để thử

nghiệm các AXOS tinh khiết khó thu được với số lượng lớn. Để có được kết quả tương

đương, tất cả các thí nghiệm được thực hiện ở quy mô nhỏ. Việc giảm tỷ lệ thể tích nuôi cấy

của các môi trường nuôi cấy thuần túy phải được thực hiện trong các ống nghiệm mà thông

thường 10 ml môi trường được thêm vào để đảm bảo duy trì các điều kiện kỵ khí và phép đo

OD đáng tin cậy. Thể tích nhỏ (3 ml) đã thay đổi tỷ lệ của môi trường và vùng trời, và có thể

khiến việc đạt được các điều kiện kỵ khí hoàn toàn trở nên khó khăn hơn. Hơn nữa, khối

lượng nhỏ này đã cản trở việc sử dụng chất khử natri sunfua (Na2S), cũng có thể đã thay đổi

môi trường tăng trưởng. Thời gian canh tác dài, lên đến 140 h, đã
 90

được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại để đảm bảo tăng trưởng trong các điều kiện hơi không điển hình được

áp dụng. Trong các nghiên cứu được báo cáo khác, thời gian lên men ngắn hơn nhiều đã được sử dụng, độ tinh

khiết và thành phần của XOS và AXOS khác nhau và môi trường cơ bản trung tính khác nhau được áp dụng. Sự

khác biệt giữa nghiên cứu này và các nghiên cứu trước đây có thể đã xảy ra một phần vì những lý do này.

6.6.2 Chiến lược sử dụng cơ chất của bifidobacteria thuần khiết

Bifidobacteria được cho là sử dụng oligosacarit bằng cách vận chuyển các oligosacarit nhỏ

vào tế bào và thủy phân chúng hơn nữa bằng các enzyme nội bào, hoặc bằng cách thủy

phân các oligosacarit bằng các enzyme ngoại bào và vận chuyển các monosacarit được hình

thành vào tế bào (Amaretti et al., 2006). Tăng trưởng mạnh hơn củaB. vị thành niênATCC

15703 trên XOS so với trên xyloza chỉ ra rằng XOS ngắn (X2, X3) được vận chuyển vào bên

trong tế bào chứ không bị thủy phân ngoại bào thành xyloza. Các ưu tiên tương tự của cùng

một chủng vi khuẩn đối với di- và oligosacarit so với monosacarit cũng đã được ghi nhận

trong các nghiên cứu trước đây (Crittenden et al., 2002; Palframan et al., 2003; Amaretti et

al., 2006). Hơn nữa, Palframan et al. (2003) cho thấy rằngB. vị thành niên ATCC 15703 tạo ra

hoạt động --D-xylosidase ngoại bào khi được nuôi cấy trên XOS. Các

sự hiện diện của --D-xylosidase ngoại bào cũng được chỉ ra trong nghiên cứu này, vì xyloza

hình thành được phát hiện sau khi nuôi cấyB. vị thành niênATCC 15703 về sản phẩm thủy

phân XOS và AX. Việc tăng chiều dài chuỗi XOS lên DP 4-6 làm giảm hiệu quả củaB. vị thành

niênATCC 15703 trong việc sử dụng các XOS này (Moura et al., 2007; Gullón et al., 2008), rất
có thể là do XOS dài hơn trước tiên cần được thủy phân bởi một enzyme ngoại bào thành

XOS ngắn hơn. Trái ngược vớiB. vị thành niênATCC 15703, Palframan và cộng sự. (2003) báo

cáo rằngB. longumATCC 15707 cho thấy không có hoạt động --D-xylosidase ngoại bào, đồng

ý với nghiên cứu hiện tại trong đó không phát hiện thấy việc tiêu thụ xylobiose.

Từ dữ liệu thu được, rõ ràng là AXOS bị thủy phân ngoại bào bởi
-Larabinofuranosidase. Cả haiB. vị thành niênATCC 15703 vàB. longumATCC 15707
có thể tách mối liên kết giữa L-arabinose và xyloza, do không phát hiện thấy AXOS
chuỗi ngắn nào sau khi nuôi cấy bằng các sản phẩm thủy phân AX.Bifidobacterium
vị thành niênATCC 15703 được biết là thể hiện hai --Larabinofuranosidase ngoại
bào riêng biệt (van Laere et al., 1999; van Den Broek và Voragen, 2008).
 91

Bifidobacterium longum ATCC 15707 chắc chắn Mà còn sản xuất -

arabinofuranosidase (s) tương tự như các loại khácB. longum(Crittenden et al., 2002;
Gueimonde et al., 2007), mặc dù sự hiện diện của gen mã hóa -L-arabinofuranosidase
vẫn chưa được thể hiện.

Bifidobacterium breveK-110, được phân lập từ ruột người, cũng tạo ra --D-
xylosidase và --L-arabinofuranosidase (Shin và cộng sự, 2003a, 2003b). Mặt khác, kết
quả sơ bộ từ trình tự bộ gen củaB. breveUCC2003 cho thấy không có enzyme phân hủy
AX (van Den Broek và Voragen, 2008). Trong các nghiên cứu hiện tại và trước đây,B.
breveATCC 15700 không thể phát triển trên xylose hoặc L-arabinose (Mitsuoka, 1982;
Roy và Ward, 1990; Palframan và cộng sự, 2003). Degnan và Macfarlane (1993) đã chỉ ra
rằng để vận chuyển L-arabinose,B. breveNCFB 2257 yêu cầu glucose trong môi trường
nuôi cấy, cho thấy có sự đồng vận chuyển. Việc thiếu đồng vận chuyển có thể, ngoài
việc thiếu enzyme để thủy phân (A)XOS, một lời giải thích tiềm năng khác cho sự tăng
trưởng kém củaB. breveATCC 15700 khi xyloza, L-arabinose và (A)XOS là cacbohydrat
duy nhất có trong môi trường canh tác.

Sau khi ủB. vị thành niênvới các sản phẩm thủy phân WAX và RAX, lượng L-arabinose tự do được

tìm thấy trong các mẫu nhiều gấp đôi so với lượng L-arabinose có thể được tạo thành từ AXOS

ngắn, được định lượng trong các sản phẩm thủy phân. Điều này chỉ ra rằng L-arabinose cũng

được giải phóng khỏi AXOS dài hơn, không xác định có trong các mẫu. Hơn nữa,B. longumđã

không thể sử dụng xylobiose và xylotriose từ các sản phẩm thủy phân WAX và RAX, và đáng ngạc

nhiên là lượng XOS ngắn này được phát hiện trong các mẫu sau khi lên men, nhiều hơn 7-8 lần so

với lượng có thể được giải phóng từ AXOS đã định lượng. Trong trường hợp này, xylobiose và

xylotriose bổ sung cũng có thể bắt nguồn từ AXOS dài hơn. Sau khi phát hành L-Arafthay thế,B.

longumcó thể thủy phân XOS thu được hơn nữa, ví dụ như sử dụng xylanase (exo) cụ thể như

được tạo ra bởiAeromonas caviaeME-1 (Kubata và cộng sự, 1994). Sự hình thành nhiều xylobiose

và xylotriose trong quá trình sinh trưởng củaB. longumkhá thú vị vì nó không tiêu thụ những

carbohydrate này.

Một số kết quả liên quan đến việc sử dụng D-xylose, L-arabinose và XOS không
phù hợp với tài liệu, có thể do một số lý do, từ các điều kiện thí nghiệm khác nhau
đến các chất nền khác nhau và khó khăn trong việc giải thích
 92

kết quả. Trong nghiên cứu hiện tại, vi khuẩn bifidobacteria chỉ có thể sử dụng một số
chất nền trong điều kiện khắc nghiệt, khi không có sẵn chất nền phù hợp hơn hoặc
mặt khác, chỉ khi các chất nền khác cũng có mặt để kích hoạt việc sử dụng
carbohydrate khó khăn hơn. Hàm lượng cacbohydrat ban đầu của các chất nền đã
được nghiên cứu và ngoài việc chỉ quan sát sự phát triển của vi khuẩn, HPAEC-PAD còn
theo dõi nồng độ của từng loại cacbohydrat để cung cấp bằng chứng về việc
cacbohydrat nào gây ra sự phát triển.

6.6.3 Các tính năng cụ thể trong việc sử dụng AXOS tinh khiết

Các thí nghiệm lên men với AXOS tinh khiết cho thấy rằng A2XX là một chất nền dễ dàng hơn

so với A được thay thế kép2+3XX, vì loại thứ nhất được lên men hoàn toàn bởi cả hỗn hợp vi

khuẩn bifidobacteria thuần túy và hệ vi sinh vật trong phân, trong khi loại thứ hai chỉ được

sử dụng bởi hỗn hợp vi khuẩn trong phân. Tuy nhiên, ngay cả sau khi hệ vi sinh vật trong

phân phát triển, một số mono- và oligosacarit đã được phát hiện, bao gồm A2XX được hình

thành sau sự phân tách của một L-Arafđơn vị từ D-Xyl được thế képPdư trong A2+3XX. Loại bỏ

L-Ara đầu tiênfđơn vị dường như là một thách thức, nhưng sau đó, có thể đạt được quá trình

lên men hoàn toàn của AXOS thay thế đơn lẻ được hình thành. Tuy nhiên, việc tiêu thụ AXOS

thay thế kép chậm do carbohydrate vẫn được phát hiện sau 48 giờ ủ A2+3XX dễ dàng được sử

dụng trong các quá trình lên men khác. Do đó, có thể giả định rằng chỉ một số loài vi khuẩn

trong hệ vi sinh vật trong phân người có thể giải phóng L-Ara được liên kết --1-3fđơn vị từ D-

Xyl được thay thế képPphần còn lại. Hơn nữa, sau khi lên men hệ vi sinh vật trong phân trên

A2+3XX, độ pH là 4 và sự phát triển của các loài bifidobacteria trong ruột ở độ pH thấp hơn

4,5 là rất hạn chế (Biavati và Mattarelli, 2006), cho thấy rõ ràng rằng các vi khuẩn khác ngoài

bifidobacteria lên men phân hủy AXOS. Điều này được hỗ trợ bởi mô hình lên men đã thay

đổi được thấy trong phân phối VFA ở Bảng 18.

Phân tích t-RFLP của các mẫu phân chỉ ra rằng các AXOS khác nhau có thể dẫn đến sự phân bố

khác nhau của vi khuẩn bifidobacteria, vì không phải tất cả các AXOS đều hỗ trợ sự phát triển của

cùng một loài vi khuẩn bifidobacteria. Với AXOS được thay thế kép làm chất nền, không rõ liệu sự

thay đổi nhỏ trong phân bố bifidobacteria là do vi khuẩn nhóm 2 chết nhanh hơn hay do vi khuẩn

nhóm 1 tăng trưởng nhanh hơn. Phân tích t-RFLP không cung cấp
 93

số lượng vi khuẩn bifidobacteria, nhưng việc giảm số lượng vi khuẩn bifidobacteria có thể

xảy ra nếu các vi khuẩn khác đang sử dụng AXOS bị phân hủy tinh khiết, như đã đề xuất ở

trên. Vì các AXOS được thay thế kép đã được tiêu thụ bởi tinh khiếtB. vị thành niênATCC

15703 vàB. longumATCC 15707 từ sản phẩm thủy phân WAX, A tinh khiết2+3XX có thể đã

không thể kích thích sản xuất --L-arabinofuranosidase thiết yếu. Gueimonde và cộng sự.

(2007) báo cáo rằng GH 51 --L-arabinofuranosidase củaB. longumNIZO B667 được tạo ra bởi

xyloza và ở mức độ thấp hơn bởi L-arabinose.

Một cách thú vị,B. vị thành niênATCC 15703 không lên men L-arabinose, mặc dù nó có -- L-

arabinofuranosidase. Nhu cầu sinh vật này sản xuất các enzym này có thể là để phân giải AXOS để

thu được xyloza, không phải L-arabinose. Nó cũng hấp dẫn để đưa ra giả thuyết rằng

sự giải phóng L-arabinose là kết quả của hành động củaB. vị thành niên--

Larabinofuranosidase có thể cung cấp nguồn carbon cho các vi khuẩn bifidobacteria khác, ví

dụ:B. longum, cho thấy sự hiệp đồng phức tạp của vi khuẩn sinh học. Điều này thực sự đã

được quan sát thấy trong nghiên cứu hiện tại khi tinh khiết A2XX đã được tiêu thụ hoàn toàn

bởi hỗn hợp củaB. vị thành niên,B. breveVàB. longum. Dấu hiệu khác cho thấy có thể có một

sức mạnh tổng hợp linh hoạt giữaB. vị thành niênVàB. longumlà sự tích tụ của xylobiose và

xylotriose bởiB. longumkhi phát triển trên các chất thủy phân AX, vì XOS ngắn là cơ chất ưa

thích củaB. vị thành niên.

Phân tích sắc ký chi tiết của mono- và oligosacarit sau quá trình lên men cho thấy cái nhìn

sâu sắc mới về carbohydrate, đặc biệt là AXOS, được tiêu thụ bởi vi khuẩn bifidobacteria đã

nghiên cứu. Kiến thức mới về sự bất lực củaB. vị thành niênATCC 15703 để tiêu thụ L-

arabinose mà nó tách ra từ các AXOS khác nhau cũng đã thu được. Dựa trên kết quả của

chúng tôi và kết hợp với các nghiên cứu trước đây của các nhóm khác, (A)XOS ngắn hạn hỗ

trợ sự tăng trưởng củaB. vị thành niênATCC 15703, trong khi AXOS được thay thế cao và

thậm chí cả AX polyme, hỗ trợ sự phát triển củaB. longumATCC 15707, chủ yếu sử dụng L-

Araf nhóm thế. AXOS rõ ràng là những ứng cử viên tiềm năng cho prebiotic chọn lọc, nhưng

hiệu quả lên men và hiệu ứng prebiotic dường như phụ thuộc vào loại L-Arafthay thế. AXOS

với D-Xyl được thay thế képPđược lên men kém hiệu quả hơn AXOS với D-Xyl được thay thế

đơn lẻP. Mặc dù bị cô lập A2+3XX không được lên men bởi hỗn hợp các chủng bifidobacteria

tinh khiết, nó được tiêu thụ bởi hệ vi sinh vật phân đa năng. AXOS được thay thế kép cũng

được sử dụng bởiB. vị thành niênMã ATCC 15703

 94

VàB. longumATCC 15707 khi có mặt trong dịch thủy phân cùng với xyloza, XOS và AXOS thế

đơn. Do đó, một hỗn hợp các AXOS thay thế đơn lẻ và kép khác nhau có thể hoạt động như

một chất tiền sinh học, lên men chậm, phù hợp. Kết quả cũng phản ánh sự hợp tác phức tạp

giữa bifidobacteria trong việc tiêu thụ AXOS. Trong nghiên cứu hiện tại, các sacarit tinh khiết

có nguồn gốc từ AX được sử dụng làm nguồn carbon duy nhất, nhưng trong ruột kết cũng

có sẵn các loại carbohydrate khác. Điều này có thể góp phần vào quá trình lên men của

AXOS đầy thách thức thông qua việc kích hoạt các enzym thủy phân, hệ thống vận chuyển

hoặc kích hoạt con đường bifidus. Do đó, cần nghiên cứu thêm về sự tương tác của các

prebiotic giả định khác nhau liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn sinh học.
 95

kết luận

Ngũ cốc AX được thủy phân hiệu quả bởi Shearzyme (A. aculeatusGH 10kết thúc-1,4---

Dxylanase) thành xylose, XOS và AXOS. Enzyme này hoạt động trên liên kết xylosid ở

đầu không khử của chuỗi xyloza, trước cả hai mono --L-Araf(1-2)- và --L-

Araf(1-3)-được thay thế --D-XylPđơn vị, cũng như gấp đôi --L-Araf(1-2)- và (1-3)-
thay thế --D-XylPdư lượng và cũng 2-Ô---D-XylP---L-Arafchuỗi bên gắn vào
- - D-XylPđơn vị. Do đó, Shearzyme tạo ra AXOS chuỗi ngắn với các nhóm thế cuối
cùng không khử. Hiệu suất của XOS và AXOS được khuếch đại, sử dụng kết hợp --
L-arabinofuranosidase khác nhau (AXH-m và AXH-d3) để sửa đổi thay thế
mô hình của AX trướckết thúc-1,4---Điều trị D-xylanase. Hơn nữa, các AXOS thay thế đa dạng

được điều chế bằng quá trình thủy phân từng bước bằng sự kết hợp của các enzym trước

đó.

Sự khác biệt trong cấu trúc của một số AX được chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây ngũ

cốc đã được phát hiện bằng cách nghiên cứu cấu trúc của AX cao phân tử bằng quang phổ NMR

và bằng cách kiểm tra các sản phẩm thủy phân bằng HPAEC-PAD. Hai phương pháp này đang hỗ

trợ, vì quang phổ NMR cung cấp thông tin về toàn bộ phân tử AX từ phần hòa tan trong nước của

mẫu, nhưng thông tin về phần không hòa tan trong nước bị mất. Sử dụng các sản phẩm thủy

phân để làm sáng tỏ AX, khả năng hòa tan hoàn toàn không quan trọng trong việc chuẩn bị các

sản phẩm thủy phân, nhưng các khu vực được thay thế nhiều nhất của AX có thể vẫn còn nguyên

vẹn bởi enzyme. WAX-mv, WBAX, RAX, RBAX và OBAX khá giống nhau với mức DS tương đối cao.

Những loại bột và cám AX này chứa một lượng lớn --L-

Araf(1-3)nhóm thế đơn và --L-Araf(1-2 và 1-3)di dư lượng. Cả BHAX và

CCAX chứa nhiều --D-Xyl ít phổ biến hơnP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên.
RiHAX, WStAX và OSAX có mức DS thấp --L-Arafđơn chất và bị thay thế
dư lượng xyloza, nhưng chúng mang một số --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) nhóm thế.
Ngược lại với những thứ này, bột mì và cám AX, RiHAX, OSAX, CCAX và WStAX chứa

dồi dào 4-Ô-Tôi---D-GlcA(1-2) đơn vị.

AXOS tinh khiết được chuẩn bị với năng suất tốt trong nghiên cứu này là: A3X, MỘT2X, MỘT2XX,

MỘT2+3X, MỘT2+3XX và D2,3X. Với AXOS được thay thế kép, A2+3XX là oligosacarit chính được tạo

thành trong quá trình thủy phân và A2+3X là tiểu phẩm, ngược lại với sản phẩm tương ứng
 96

AXOS đơn thế từ đó A2X là chính và A2XX sản phẩm thủy phân nhỏ. AXOS tinh khiết
là công cụ vô giá để nghiên cứu thứ tự rửa giải và phản ứng trong HPAEC-PAD,
đồng thời chúng còn được sử dụng làm hợp chất chuẩn trong phân tích TLC và
HPAEC-PAD.

Việc tách hoàn toàn AXOS là cần thiết để định lượng chính xác. Với phương pháp
HPAEC-PAD được sử dụng, khả năng tách A tốt3X, MỘT2X, MỘT2+3X và A2+3Đã thu
được XX, nhưng A2XX và D2,3X không tách rời hoàn toàn. Thường là A2XX hiếm khi
có được, vì --L-Araf(1-2)mono là nhóm thế nhỏ trong AX. MỘT2XX và D2,3X được
phân tách trên TLC, có thể được sử dụng kết hợp với HPAEC-PAD để xác định
AXOS. Để định lượng AXOS và các cacbohydrat khác được tạo ra trong quá trình
thủy phân, cần có các tiêu chuẩn tương ứng cho từng hợp chất vì không thể so
sánh chiều cao pic như vậy, do phản ứng với các monosacarit khác nhau, XOS và
AXOS khác nhau trong PAD.

Lần đầu tiên, tiềm năng tiền sinh học của AXOS tinh khiết đã được nghiên cứu trongtrong ống

nghiệm thí nghiệm lên men. Các chất thủy phân AXOS, L-arabinose, D-xylose, XOS, RAX và WAX,

và FOS (kiểm soát tích cực) đã được sử dụng làm chất nền cho hệ vi sinh vật phân và

bifidobacteria tinh khiết. Dựa trên kết quả thu được,B. vị thành niênATCC 15703 có thể sử dụng

XOS, một số D-xylose, nhưng không sử dụng L-arabinose.B. longumATCC 15707 thích Larabinose

hơn, nhưng không thể phát triển trên D-xylose hoặc XOS thuần túy.B. breveATCC 15700 phát triển

kém trên tất cả các chất nền được cung cấp. Thông tin chi tiết mới về số phận của từng AXOS

trong quá trình lên men đã được thu thập. Cả haiB. vị thành niênVàB. longumcó thể phát triển

trên AXOS, nhưng chúng đã lên men oligosacarit với các chiến lược khác nhau, vì sau khi phân

tách L-arabinoseB. vị thành niênsử dụng XOS hình thành, trong khiB. longumsử dụng L-arabinose

được giải phóng. Kết quả cho thấy rằng khả năng phát triển trên một số AXOS nhất định không

phải lúc nào cũng có nghĩa là sử dụng hoàn toàn. AXOS tinh khiết với D-Xyl được thay thế képP

được lên men kém hiệu quả hơn AXOS với D-Xyl được thay thế đơn lẻPbởi sự kết hợp của ba vi

khuẩn bifidobacteria. Tuy nhiên, AXOS thay thế kép cũng được sử dụng bởiB. vị thành niênVàB.

longumkhi có mặt trong dịch thủy phân cùng với xyloza, XOS và AXOS thế đơn. AXOS thay thế kép

được phân lập đã được lên men bởi hệ vi sinh vật phân linh hoạt. Do đó, một hỗn hợp các AXOS

thay thế đơn lẻ và kép khác nhau có thể hoạt động như một chất tiền sinh học lên men chậm, phù

hợp.
 97

Người giới thiệu

AACC. 2001. Định nghĩa về chất xơ. Thế giới thực phẩm ngũ cốc 46, 112-126.

Alonso, JL, Domínguez, H., Garrote, G., Parajó, JC và Vázquez, MJ 2003. Xylooligosacarit:
đặc tính và công nghệ sản xuất. điện tử. J. Môi trường. nông nghiệp. Hóa chất thực
phẩm 2.

Amaretti, A., Tamburini, E., Bernardi, T., Pompei, A., Zanoni, S., Vaccari, G., Matteuzzi, D. và
Rossi, M. 2006. Ưu tiên cơ chất của Bifidobacterium Teenis MB 239: so sánh tăng trưởng
trên carbohydrate đơn và hỗn hợp. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 73, 654-662.

Andersson, R. và Åman, P. 2001. Ngũ cốc arabinoxylan: Sự xuất hiện, cấu trúc và đặc tính.
quảng cáo Công nghệ chất xơ ăn kiêng. 301-314.

Andrewartha, KA, Phillips, DR và Stone, BA 1979. Tính chất dung dịch của
arabinoxylans bột mì và arabinoxylans biến đổi enzym. Cacbohydrat độ phân giải 77,
191- 204.

Angelidaki, I., Petersen, SP và Ahring, BK 1990. Ảnh hưởng của lipid đối với quá trình tiêu
hóa kỵ khí ưa nhiệt và giảm ức chế lipid khi bổ sung bentonit. ứng dụng vi sinh vật. công
nghệ sinh học. 33, 469-472.

Antec Leyden. http://www.jasco.hu/konyvtar/220_002_01.pdf.

Aspinall, GO 1959. Hóa học cấu trúc của hemiaellulose. quảng cáo Cacbohydrat hóa học. 14,
429-468.

Aspinall, GO 1970. Arabinans và Xylans. Trong: Polysacarit. Pergamon Elmsford, New

York, trang 103-115.

Aspinall, GO 1980. Hóa học của polysacarit thành tế bào. hóa sinh. Thực vật 3, 473-500.

Aspinall, GO và Ferrier, RJ 1957. Cấu tạo của hemicellulose vỏ lúa mạch. J. Chem.
Sóc. 4188-4194.

Aspinall, G. và Ferrier, RJ 1958. Tổng hợp 2-[O-(--D-xylopyranosyl)]-L-arabinose và sự phân

lập của nó từ quá trình thủy phân một phần esparto hemicellulose. J. Chem. Sóc. 1501- 1505.

Bacic, A. và Stone, B. 1980. A (1-3)- và (1-4)---glucan trong thành tế bào nội nhũ của lúa
mì. Cacbohydrat độ phân giải 82, 372-377.

Bacic, A. và Stone, BA 1981. Hóa học và tổ chức của các thành phần thành tế bào
aleurone từ lúa mì và lúa mạch. Aust. J. Sinh lý thực vật. 8, 475-495.

Bataillon, M., Mathaly, P., Nunes Cardinali A.-P. và Duchiron, F. 1998. Chiết xuất và tinh chế
arabinoxylan từ cám lúa mì đã tách tinh bột ở quy mô thí điểm. Ind. Cây trồng. sản xuất. 8,
37-43.
 98

Beaugrand, J., Chambat, G., Wong, VWK, Goubet, F., Rémond, C., Paës, G., Benamrouche, S.,
Debeire, P., O'Donohue, M. và Chabbert, B. 2004. Tác động và hiệu quả của endoxylanase
chịu nhiệt GH10 và GH11 đối với cám lúa mì và arabinoxylan có thể chiết xuất bằng kiềm.
Cacbohydrat độ phân giải 339, 2529-2540.

Beldman, G., Osuga, D. và Whitaker, JR 1996. Một số đặc điểm của -

xylopyranosidase, -arabinofuranosidase và arabinoxylan -arabinofuranohydrolase
từ cám lúa mì và lúa mì nảy mầm. J. Khoa học ngũ cốc. 23, 169-180.

Biavati, B. và Mattarelli, P. 2006. Họ bifidobacteriaceae. Trong: Sinh vật nhân sơ. Dworkin,
M., Falkow, S., Rosenberg, E. và Schleifer, K.-H. (Biên tập), Springer, New York, trang
3322-3382.

Bicking, MKL 2006. Lỗi tích hợp trong phân tích sắc ký, Phần I: Các đỉnh có kích
thước xấp xỉ bằng nhau. (Bìa truyện). LC-GC Bắc Mỹ 24, 402-414.

Bielecka, M., Biedrzycka, E. và Majkowska, A. 2002. Lựa chọn men vi sinh và prebiotic cho chế phẩm sinh tổng
hợp và xác nhận tác dụng của chúngtrong cơ thể sốngtính hiệu quả. Thực phẩm Res. quốc tế 35, 125-131.

Biely, P. 1985. Hệ thống phân giải xylan của vi sinh vật. Xu hướng Công nghệ sinh học. 3, 286-290.

Biely, P., Vrsanska, M., Tenkanen, M. và Kluepfel D. 1997. Họ endo---1,4-xylanase: sự

khác biệt về tính chất xúc tác. J. Công nghệ sinh học. 57, 151-166.

Brillouet, JM, Joseleau JP, Utille JP và Lelievre D. 1982. Cô lập, tinh chế và mô tả đặc tính của
phức hợp heteroxylan từ cám lúa mì công nghiệp. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 30,
488-495.

Broberg, A., Thomsen, KK và Duus, JO 2000. Ứng dụng NMR đầu dò nano để xác định
cấu trúc của lượng nanomole thấp arabinoxylan oligosacarit được phân đoạn bằng
HPAEC-PAD phân tích. Cacbohydrat độ phân giải 328, 375-382.

Campbell, JM, Fahey GC, Jr. và Wolf BW 1997a. Các oligosacarit khó tiêu được chọn lọc
ảnh hưởng đến khối lượng ruột già, axit béo chuỗi ngắn phân và phân, pH và hệ vi sinh
vật ở chuột. J. Nutr. 127, 130-136.

Campbell, JM, Fahey, GC, Jr, Demichele, SJ và Garleb, KA 1997b. Đặc điểm trao đổi chất của nam
giới trưởng thành khỏe mạnh khi bị ảnh hưởng bởi việc uống công thức dinh dưỡng dạng lỏng có
chứa dầu cá, oligosacarit, kẹo cao su arabic và vitamin chống oxy hóa. Hóa chất thực phẩm chất
độc. 35, 1165-1176.

Carpita, NC và Gibeaut, DM 1993. Mô hình cấu trúc của thành tế bào sơ cấp ở thực vật có
hoa: tính nhất quán của cấu trúc phân tử với các đặc tính vật lý của thành trong quá trình
tăng trưởng. Nhà máy J. 3, 1-30.

CAZy - EnZymes Hoạt tính Carbohydrate. www.cazy.org

Cleemput, G., van Laere, K., Hessing, M., Van Leuven, F., Torrekens, S. và Delcour,
JA 1997. Xác định và mô tả đặc tính của arabinoxylanase mới từ bột mì. Vật lý thực
vật. 115, 1619-1627.
 99

Cloetens, L., De Preter, V., Swennen, K., Broekaert, WF, Courtin, CM, Delcour, JA, Rutgeerts, P. và
Verbeke, K. 2008. Tác dụng đáp ứng liều lượng của arabinoxylooligosacarit đối với nhu động và trên
đường tiêu hóa sự trao đổi chất của vi khuẩn đại tràng ở những người tình nguyện khỏe mạnh. Mứt. sưu
tầm. Dinh dưỡng. 27, 512.

Collins, MD và Gibson, GR 1999. Probiotic, prebiotic và synbiotic: phương pháp điều chỉnh hệ
sinh thái vi sinh vật trong ruột. Là. J. Lâm sàng. Dinh dưỡng. 69, 1052S-1057.

Collins, T., Gerday, C. và Feller, G. 2005. Các xylanase, các họ xylanase và các
xylanase cực ưa nước. Vi sinh vật FEMS. Kh 29, 3-23.

Courtin, CM và Delcour, JA 2001. Hoạt động tương đối của endoxylanase đối với arabinoxylan có thể chiết xuất
được từ nước và nước không thể chiết xuất được. J. Khoa học ngũ cốc. 33, 301-312.

Crittenden, RG và Playne, MJ 1996. Sản xuất, tính chất và ứng dụng của oligosacarit cấp thực
phẩm. Xu hướng khoa học thực phẩm. công nghệ. 7, 353-361.

Crittenden, R., Karppinen, S., Ojanen, S., Tenkanen, M., Fagerström, R., Mättö, J., Saarela, M.,
Mattila-Sandholm, T. và Poutanen, K. 2002.Trong ống nghiệmlên men carbohydrate chất xơ ngũ
cốc bằng vi khuẩn sinh học và đường ruột. J. Khoa học. Thực phẩm nông nghiệp. 82, 781-789.

Cyran, M., Courtin, CM và Delcour, JA 2003. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan được chiết xuất bằng
nước ở các nhiệt độ khác nhau từ hai loại bột lúa mạch đen có chất lượng làm bánh mì đa dạng. J. Nông
nghiệp. Hóa chất thực phẩm 51, 4404-4416.

Cyran, M., Courtin, CM và Delcour, JA 2004. Tính không đồng nhất trong cấu trúc mịn của arabinoxylan
có thể chiết xuất bằng kiềm được phân lập từ hai loại bột lúa mạch đen có chất lượng làm bánh mì cao
và thấp và sự cùng tồn tại của chúng với các thành phần khác của thành tế bào. J. Nông nghiệp. Hóa
chất thực phẩm 52, 2671-2680.

De Preter, V., Geboes, K., Verbrugghe, K., De Vuyst, L., Vanhoutte, T., Huys, G., Swings, J., Pot, B. và
Verbeke, K. 2004. Thetrong cơ thể sốngsử dụng các chất đánh dấu sinh học được đánh dấu bằng đồng vị
ổn định là lactose-[N]ureide và [H4]tyrosine để đánh giá tác động của pro- và prebiotic đối với hệ vi
khuẩn đường ruột của những người tình nguyện khỏe mạnh. anh J. Nutr. 92, 439.

Degnan, BA và Macfarlane, GT 1993. Vận chuyển và chuyển hóa glucose và arabinose

trongBifidobacterium breve. Vòm. vi sinh vật. 160, 144-151.

Dekker, RFH và Richards, GN 1975. Tinh chế, đặc tính và phương thức hoạt động của
hemicellulase II được sản xuất bởiCeratocystis nghịch lý. Cacbohydrat độ phân giải 42, 107-123.

Delcour, JA, Rouseu, N. và Vanhaesendonck, IP 1999. Phân lập ở quy mô thí điểm các arabinoxylan có thể
chiết xuất từ nước từ lúa mạch đen. Ngũ cốc Chem. 76, 1-2.

Dervilly, G., Leclercq, C., Zimmermann, D., Roue, C., Thibault, JF và Saulnier, L. 2002. Phân lập và
mô tả đặc tính của arabinoxylan tan trong nước có khối lượng mol cao từ lúa mạch và mạch nha
lúa mạch. Cacbohydrat polyme. 47, 143-149.
 100

Dervilly-Pinel, G., Rimsten, L., Saulnier, L., Andersson, R. và Åman, P. 2001. arabinoxylan có thể chiết xuất
bằng nước từ bột lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen và triticale. Bằng chứng về sự hiện diện của các chất
làm mờ axit ferulic và sự tham gia của chúng trong quá trình hình thành gel. J. Khoa học ngũ cốc. 34,
207-214.

Duncan, SH, Louis, P. và Flint, H. 2004. Vi khuẩn sử dụng lactate, được phân lập từ phân người, tạo
ra butyrate như một sản phẩm lên men chính. ứng dụng môi trường. Vi khuẩn. 70, 5810-5817.

Dyson, NA 1998. Diện tích cực đại so với chiều cao cực đại. TRONG:Phương pháp tích hợp sắc ký.
Humana Press, Totowa, NJ USA, trang 83-88.

Ebringerová, A., Hromádková, Z., Petráková, E. và Hricovíni, M. 1990. Đặc điểm cấu trúc của L-
arabino-D-xylan hòa tan trong nước từ cám lúa mạch đen. Cacbohydrat độ phân giải 198, 57-66.

Ebringerová, A., Hromádková, Z., Alfoldi, J. và Berth, G. 1992. Đặc tính cấu trúc và dung dịch
của heteroxylan lõi ngô. Cacbohydrat polyme. 19, 99-105.

Ebringerová, A., Hromádková Z., Burchard W., Dolega R. và Vorwerg W. 1994. Tính chất dung dịch
của arabinoxylan cám lúa mạch đen không tan trong nước. Cacbohydrat polyme. 24, 161- 169.

Ebringerová, A. và Hromádková Z. 1997. Ảnh hưởng của siêu âm đến cấu trúc và tính
chất của heteroxylan vỏ ngô tan trong nước. siêu âm. Sonochem. 4, 305-309.

Ebringerová, A. và Heinze, T. 2000. Xylan và các dẫn xuất của xylan - polyme sinh học có
các đặc tính quý giá. 1. Cấu trúc, quy trình và đặc tính của xylans tự nhiên. Macromol.
Cộng đồng nhanh chóng 21, 542-556.

EFSA (Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu). 2009. Ý kiến khoa học (bản thảo); Giá trị tham
khảo chế độ ăn uống cho carbohydrate và chất xơ. EFSA J. 1-76.

Ewald, CM và Perlin, AS 1959. Sự sắp xếp phân nhánh trong arabino-xylan từ bột
mì. Có thể. J. Chem. 37, 1254-1259.

Faulds, CB, Sancho, AI và Bartolomé, B. 2002. Sự giải phóng axit ferulic mono và dimeric từ ngũ cốc đã qua sử
dụng của nhà sản xuất bia bởi các este feruloyl của nấm. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 60, 489-494.

Fauré, R., Courtin, CM, Delcour, JA, Dumon, C., Faulds, CB, Fincher, GB, Fort, S., Fry, SC,
Halila, S., Kabel, MA, Pouvreau, L., Quemener , B., Rivet, A., Saulnier, L., Schols, HA, Driquez,
H. và O D́onohue, MJ 2009. Một hệ thống đặt tên ngắn gọn và giàu thông tin cho các họa tiết
oligosacarit của heteroxylan được tìm thấy trong thành tế bào thực vật. Aust. J. Chem. 62,
1-5.

Ferré, H., Broberg, A., Duus, JO và Thomsen, KK 2000. Một loại arabinoxylan
arabinofuranohydrolase mới được phân lập từ lúa mạch nảy mầm. Phân tích ưu tiên cơ chất
và tính đặc hiệu bằng đầu dò nano NMR. Ơ. J. Hóa sinh. 267, 6633-6641.

Fincher, GB 1975. Hình thái và thành phần hóa học của thành tế bào nội nhũ lúa mạch. Viện
J. Sản xuất bia 81, 116-122.
 101

Fujimoto, Z., Kaneko, S., Kuno, A., Kobayashi, H., Kusakabe, I. và Mizuno, H. 2004. Cấu trúc
tinh thể của xylooligosaccharide được trang trí liên kết với họ 10 xylanase từ Streptomyces
olivaceoviridisE-86. J. Sinh học. hóa học. 279, 9606-9614.

Fulcher, RG và Duke, TKR 2002. Cấu trúc và tổ chức của ngũ cốc nguyên hạt: Ý nghĩa đối với các
chuyên gia dinh dưỡng và các nhà chế biến.Trong: Thực phẩm nguyên hạt đối với sức khỏe và
bệnh tật. Marquart, L., Slavin, JL và Fulcher, RG (Eds.), Hiệp hội các nhà hóa học ngũ cốc Hoa Kỳ, St.
Paul, Minnesota, Hoa Kỳ, trang 9-45.

Garrote, G. và Parajó, JC 2002. Tự thủy phân không đẳng nhiệt củabạch đàngỗ. Khoa học gỗ
công nghệ. 36, 111-123.

Gibson, GR và Roberfroid, MB 1995. Điều chỉnh chế độ ăn uống của hệ vi sinh vật ruột kết
của con người: giới thiệu khái niệm về prebiotic. J. Nutr. 125, 1401-1412.

Gibson, GR, Probert, HM, van Loo, J., Rastall, RA và Roberfroid, MB 2004. Điều chỉnh chế độ ăn
uống của hệ vi sinh vật đại tràng ở người: cập nhật khái niệm về prebiotic. Dinh dưỡng. độ phân
giải Rev. 17, 259-275.

Glitsø, LV và Bach Knudsen, KE 1999. Xay lúa mạch đen nguyên hạt để thu được các phần có
đặc tính chất xơ khác nhau. J. Khoa học ngũ cốc. 29, 89-97.

Grootaert, C., Delcour, JA, Courtin, CM, Broekaert, WF, Verstraete, W. và Van de Wiele, T.
2007. Chuyển hóa vi sinh vật và tiềm năng tiền sinh học của arabinoxylan oligosacarit trong
ruột người. Xu hướng khoa học thực phẩm. Công nghệ. 18, 64-71.

Grootaert, C., Van den Abbeele, P., Marzorati, M., Broekaert, WF, Courtin, CM, Delcour,
JA, Verstraete, W. và Van de Wiele, T. 2009. So sánh tác dụng tiền sinh học của
arabinoxylan oligosacarit và inulin trong một mô phỏng hệ sinh thái vi khuẩn đường
ruột của con người. Vi sinh vật FEMS. sinh thái. 69, 231-242.

Gruppen, H., Hamer, RJ và Voragen, AGJ 1991. Bari hydroxit như một công cụ để chiết xuất arabinoxylan
tinh khiết từ vật liệu thành tế bào không tan trong nước của bột mì. J. Khoa học ngũ cốc. 13, 275-290.

Gruppen, H., Hoffmann, RA, Kormelink, FJ, Voragen, AG, Kamerling, JP và

Vliegenthart, JF 1992. Đặc tính hóa bằng quang phổ 1H NMR của oligosacarit có
nguồn gốc từ enzym từ arabinoxylan bột mì chiết xuất từ kiềm. Cacbohydrat độ
phân giải 233, 45-64.

Gruppen, H., Kormelink, FJM và Voragen, AGJ 1993. Vật liệu thành tế bào không thể chiết xuất
bằng nước từ bột mì. 3. Mô hình cấu trúc của arabinoxylan. J. Khoa học ngũ cốc. 18, 111- 128.

Gueimonde, M., Noriega, L., Margolles, A. và de los Reyes-Gavilan, C. 2007. Cảm ứng hoạt
động của -L-arabinofuranosidase bởi monomeric carbohydrate trongBifidobacterium
longumvà tính phổ biến của các gen mã hóa. Vòm. vi sinh vật. 187, 145-153.

Gullón, P., Moura, P., Esteves, MP, Girio, FM, Domínguez, H. và Parajó, JC 2008. Đánh giá khả
năng lên men của xylooligosaccharides từ vỏ trấu bằng vi khuẩn probiotic. J. Nông nghiệp.
Hóa chất thực phẩm 56, 7482-7487.
 102

Hardy, MR và Townsend, RR 1988. Tách các đồng phân vị trí của oligosacarit và
glycopeptide bằng sắc ký trao đổi anion hiệu suất cao với phát hiện ampe kế xung.
PNAS, Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 85, 3289-3293.

Härkönen, H., Pessa, E., Suortti, T. và Poutanen, K. 1997. Sự phân bố và một số tính chất của
polysaccharid vách tế bào trong các phần nghiền lúa mạch đen. J. Khoa học ngũ cốc. 26, 95-104.

Henry, RJ 1985. So sánh các loại carbohydrate không chứa tinh bột trong hạt ngũ cốc. J. Khoa học. Thực phẩm
nông nghiệp. 36, 1243-1253.

Hoffmann, RA, Leeflang, BR, de Barse, MM, Kamerling, JP và Vliegenthart, JF 1991.

Xác định đặc điểm bằng quang phổ 1H-nmr của oligosacarit, có nguồn gốc từ
arabinoxylan của nội nhũ trắng của lúa mì, có chứa các nguyên tố -4)[-- L-Araf-
(1-3)]---D-XylP-(1- hoặc - 4)[--L-Araf-(1-2)][--L-Araf-(1-3)]---D-XylP-(1-. Carbonhydr.
Res. 221, 63-81.

Hoffmann, RA, Kamerling, JP và Vliegenthart, JFG 1992. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan
tan trong nước từ nội nhũ của lúa mì. Cacbohydrat độ phân giải 226, 303-311.

Höije, A., Gröndahl, M., Tømmeraas, K. và Gatenholm, P. 2005. Phân lập và mô tả

các đặc tính hóa lý và vật chất của arabinoxylan từ vỏ lúa mạch. Cacbohydrat
polyme. 61, 266-275.

Höije, A., Sandström C., Roubroeks JP, Andersson R., Gohil S. và Gatenholm P. 2006. Bằng chứng
về sự hiện diện của chuỗi bên 2-O---D-xylopyranosyl- -L-arabinofuranose trong vỏ lúa mạch
arabinoxylan . Cacbohydrat độ phân giải 341, 2959-2966.

Höije, A., Sternemalm, E., Heikkinen, S., Tenkanen, M. và Gatenholm, P. 2008. Tính chất vật
liệu của màng từ arabinoxylan được điều chỉnh bằng enzym. Đại phân tử sinh học 9,
2042-2047.

Hollmann, J. và Lindhauer, MG 2005. Phân lập glucuronoarabinoxylan ở quy mô thí điểm từ

cám lúa mì. Cacbohydrat polyme. 59, 225-230.

Holzapfel, WH và Schillinger, U. 2002. Giới thiệu về men vi sinh và tiền sinh học. Thực phẩm Res. quốc tế
35, 109-116.

Hopkins, MJ, Englyst, HN, Macfarlane, S., Furrie, E., Macfarlane, GT và McBain, AJ 2003. Sự
thoái hóa của arabinoxylan liên kết chéo và không liên kết chéo bởi hệ vi sinh vật đường
ruột ở trẻ em. ứng dụng môi trường. vi sinh vật. 69, 6354-6360.

Hromádková, Z. và Ebringerová, A. 1987. Phân lập và mô tả đặc tính của hemiaellulose

từ cám lúa mạch đen. Nahrung 31, 149-156.

Hromádková, Z., Ebringerová, A., Petráková, E. và Schraml, J. 1987. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan
cám lúa mạch đen với mức độ phân nhánh thấp. Cacbohydrat độ phân giải 163, 73-79.

Hromádková, Z. và Ebringerová, A. 1995. Phân lập và mô tả đặc tính của

hemiaellulose của vỏ ngô. hóa học. Bốp. 49, 97-101.
 103

Hughes, SA, Shewry, PR, Li, L., Gibson, GR, Sanz, ML và Rastall, RA 2007.Trong ống nghiệm
lên men bởi hệ vi sinh phân người của lúa mì arabinoxylans. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực
phẩm 55, 4589-4595.

Imaizumi, K., Nakatsu, Y., Sato, M., Sedarnawati, Y. và Sugano, M. 1991. Ảnh hưởng của xylooligosaccharides đối
với đường huyết, lipid huyết thanh và gan và axit béo chuỗi ngắn ở manh tràng ở chuột mắc bệnh tiểu đường.
nông nghiệp. sinh học. hóa học. 55, 199-205.

Ishii, T. 1997. Cấu trúc và chức năng của polysacarit feruloyl hóa. Khoa học thực vật 127,
111-127.

Izydorczyk, MS và Biliaderis, CG 1993. Tính không đồng nhất về cấu trúc của arabinoxylan nội nhũ
lúa mì. Ngũ cốc Chem. 70, 641-646.

Izydorczyk, MS và Biliaderis, CG 1995. Ngũ cốc arabinoxylans: những tiến bộ về cấu

trúc và đặc tính hóa lý. Cacbohydrat polyme. 28, 33-48.

Jaskari, J., Kontula, P., Siitonen, A., Jousimies-Somer, H., Mattila-Sandholm, T. và Poutanen, K.
1998. Beta-glucan và xylan yến mạch thủy phân làm chất nền chọn lọc cho Bifidobacterium
VàLactobacilluschủng. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 49, 175-181.

Jeffries, TW 1990. Sự phân hủy sinh học của phức hợp lignin-carbohydrate. Phân hủy sinh học, 1,
163-176.

Johansson, L., Virkki, L., Anttila, H., Esselström, H., Tuomainen, P. và Sontag-Strohm, T. 2006.
Thủy phân --glucan. Hóa chất thực phẩm 97, 71-79.

Johnson, DC và LaCourse, WR 1990. Sắc ký lỏng với phát hiện điện hóa xung ở các
điện cực vàng và bạch kim. hậu môn. hóa học. 62, 589A-597A.

Johnson, DC, Dobberpuhl, D., Roberts, R. và Vandeberg, P. 1993. Phát hiện bằng phép đo
dòng điện xung của cacbohydrat, amin và các loại lưu huỳnh trong sắc ký ion. Hiện trạng
nghiên cứu. J. Sắc ký đồ. 640, 79-96.

Kabel, MA, Carvalheiro, F., Garrote, G., Avgerinos, E., Koukios, E., Parajó, JC, Girio, FM,
Schols, HA và Voragen, AGJ 2002a. Các sản phẩm phụ giàu xylan được xử lý thủy nhiệt
tạo ra các loại xylo-oligosacarit khác nhau. Cacbohydrat polyme. 50, 47-56.

Kabel, MA, Kortenoeven, L., Schols, HA và Voragen, AGJ 2002b.Trong ống nghiệm khả năng lên
men của các xylo-oligosacarit thay thế khác nhau. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 50,
6205-6210.

Kabel, MA, Schols, HA và Voragen, AGJ 2002c. Xylo-oligosacarit phức hợp được xác định từ gỗ bạch
đàn được xử lý bằng phương pháp thủy nhiệt và hạt đã qua sử dụng của nhà máy bia.
Cacbohydrat Polime., 50, 191-200.

Karppinen, S., Kiiliäinen, K., Liukkonen, K., Forssell, P. và Poutanen, K. 2001. Trích xuất vàtrong
ống nghiệmlên men các phần cám lúa mạch đen. J. Khoa học ngũ cốc. 34, 269-278.
 104

Kellett LE 1990. Xylanase B và arabinofuranosidase từPseudomonas huỳnh quang subsp.

cellulosa chứa các miền liên kết cellulose giống hệt nhau và được mã hóa bởi các gen liền
kề. hóa sinh. J. 272, 369.

Khandke, KM, Vithayathil, PJ và Murthy, SK 1989. Sự phân hủy xylan của gỗ thông rụng lá bởi
enzym của một loại nấm ưa nhiệt,Thermoascus aurantiacus. Vòm. hóa sinh. lý sinh học. 274,
501-510.

Koizumi, K., Kubota, Y., Tanimoto, T. và Okada, Y. 1991. Sắc ký trao đổi anion hiệu
năng cao của D-gluco-oligosacarit đồng nhất và - polysacarit (độ trùng hợp 50) với
phát hiện ampe kế xung. J. Sắc ký đồ. A 464, 365-373.

Kontula, P., Suihko, M.-L., Suortti, T., Tenkanen, M., Mattila-Sandholm, T. và von Wright, A.
2000. Phân lập vi khuẩn axit lactic từ sinh thiết ruột kết của con người sau khi làm giàu trên
dẫn xuất đường sữa và arabinoxylo-oligosacarit lúa mạch đen. Vi sinh vật thực phẩm. 17,
13-22.

Kormelink, FJM, Hoffmann, RA, Gruppen, H., Voragen, AGJ, Kamerling, JP và

Vliegenthart, JFG 1993a. Đặc trưng bởi1Quang phổ H NMR của oligosacarit có nguồn
gốc từ arabinoxylan bột mì có thể chiết xuất bằng kiềm bằng cách tiêu hóa với endo-
(1-4)-beta-D-xylanase III từnấm mốc Aspergillus. Cacbohydrat độ phân giải 249,
369-382.

Kormelink, FJM, Gruppen, H., Viëtor, RJ và Voragen, AGJ 1993b. Phương thức hoạt động của các
enzym phân giải xylan từnấm mốc Aspergillustrên arabinoxylan ngũ cốc có thể chiết xuất bằng
kiềm. Cacbohydrat độ phân giải 249, 355-367.

Kormelink, FJM, Gruppen, H. và Voragen, AGJ 1993c. Phương thức hoạt động của (1-4)--- D-
arabinoxylan arabinofuranohydrolase (AXH) và --L-arabinofuranosidase trên arabinoxylan bột mì
có thể chiết xuất bằng kiềm. Cacbohydrat độ phân giải 249, 345-353.

Kormelink, FJM và Voragen, AGJ 1993. Sự phân hủy các xylan [(glucurono)arabino] khác
nhau bằng sự kết hợp của các enzyme phân hủy xylan tinh khiết. ứng dụng vi sinh vật. công
nghệ sinh học. 38, 688-695.

Kubata, BK, Suzuki, T., Horitsu, H., Kawai, K. và Takamizawa, K. 1994. Làm sạch và mô tả
đặc tính củaAeromonas caviaeME-1 xylanase V, tạo ra xylobiose độc quyền từ xylan.
ứng dụng môi trường. vi sinh vật. 60, 531-535.

Kulkarni, N., Shendye, A. và Rao, M. 1999. Các khía cạnh công nghệ sinh học và phân tử của
xylanase. Vi sinh vật FEMS. Rev. 23, 411-455.

Kusakabe, I., Ohgushi, S., Yasui, T. và Kobayashi, T. 1983. Các nghiên cứu về hệ thống
xylanase của Streptomyces. Phần X. Cấu trúc của arabinoxylo-oligosacarit từ các sản phẩm
thủy phân của arabinoxylan lõi ngô bởi xylanase từ Streptomyces. nông nghiệp. sinh học.
hóa học. 47, 2713-2723.
 105

Lebet, V., Arrigoni, E. và Amadò, R. 1997. Xác định đường trung tính bằng HPAEC-PAD
để mô tả sự phân hủy polysacarit bởi vi khuẩn đường ruột. Zeitschrift fuer
Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A: Food Res. công nghệ. 205, 257-261.

Lee, YC 1990. Sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao để phân tích carbohydrate. hậu
môn. hóa sinh. 189, 151-162.

Lee, YC 1996. Phân tích cacbohydrat bằng sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao. J.
Sắc ký đồ. A, 720, 137-149.

MacArthur, LA và D`Appolonia, BL 1980. So sánh các polysacarit không tinh bột trong yến
mạch và lúa mì. Ngũ cốc Chem. 57, 39-45.

Maes, C. và Delcour, JA 2002. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan chiết xuất được trong nước và không
thể chiết xuất được trong nước trong cám lúa mì. J. Khoa học ngũ cốc. 35, 315-326.

Maes, C., Vangeneugden, B. và Delcour, JA 2004. Hoạt động tương đối của hai endoxylanase đối
với arabinoxylan không chiết xuất được trong nước trong cám lúa mì. J. Khoa học ngũ cốc. 39,
181-186.

Margolles-Clark, E., Tenkanen, M., Luoteri, E. và Penttilä, M. 1996. Ba -- gen galactosidase của
Trichoderma reeseinhân bản vô tính bằng cách biểu hiện trong nấm men. Ơ. J. Hóa sinh. 240,
104-111.

Markwalder, HU và Neukom, H. 1976. Axit diferulic có thể liên kết ngang trong
hemiaellulose từ mầm lúa mì. Hóa thực vật, 15, 836-837.

Maslen, SL, Goubet, F., Adam, A., Dupree, P. và Stephens, E. 2007. Làm sáng tỏ cấu trúc của
các đồng phân arabinoxylan bằng HPLC–MALDI-TOF/TOF-MS/MS pha thường. Cacbohydrat
độ phân giải 342, 724-735.

McNeil, M., Alberheim, P. Taiz, L. và Jones, RL 1975. Cấu trúc của thành tế bào thực vật. VII. Tế bào
aleurone lúa mạch. Vật lý thực vật. 55, 64-68.

Meyer, VR 1995. Định lượng pic sắc ký trong khoảng 0,1 đến 1,0 %. Sắc ký, 40,
15-22.

Mitsuoka, T. 1982. Các xu hướng nghiên cứu gần đây về hệ vi khuẩn đường ruột. Hệ vi sinh Bifidobacteria, 1,
3-24.

Modler, HW 1994. Yếu tố Bifidogen - Nguồn, Trao đổi chất và Ứng dụng. quốc tế
Sữa J. 4, 383-407.

Moura, P., Barata, R., Carvalheiro, F., Gírio, F., Loureiro-Dias, MC và Esteves, MP 2007.Trong ống
nghiệmquá trình lên men xylo-oligosacarit từ quá trình tự thủy phân lõi ngô bởi các chủng
Bifidobacterium và Lactobacillus. LWT - Khoa học thực phẩm. công nghệ. 40, 963-972.

Moure, A., Gullon, P., Dominguez, H. và Parajo, JC 2006. Những tiến bộ trong sản xuất,
tinh chế và ứng dụng xylo-oligosacarit làm phụ gia thực phẩm và dược phẩm dinh
dưỡng. Quy trình Hóa sinh. 41, 1913-1923.
 106

Nandini, CD và Salimath, PV 2001. Thành phần carbohydrate của lúa mì, cám lúa mì, lúa miến và
bajra với chất lượng làm chapati/roti (bánh mì dẹt của Ấn Độ) tốt. Hóa chất thực phẩm 73,
197-203.

Nilsson, M., Andersson, R., Andersson, RE, Autio, K. và Åman, P. 2000. Tính không đồng nhất trong
arabinoxylan lúa mạch đen có thể chiết xuất bằng nước với mức độ thay thế thấp. Cacbohydrat polyme.
41, 397-405.

Okazaki, M., Fujukawa, S. và Matsumoto, N. 1990. Ảnh hưởng của xylooligosaccharide đối với sự phát
triển của vi khuẩn bifidobacteria. Nippon Eiyo, Shokuryo Gakkaishi 43, 395-401.

Ordaz-Ortiz, JJ, Guillon, F., Tranquet, O., Dervilly-Pinel, G., Tran, V. và Saulnier, L. 2004. Tính
đặc hiệu của kháng thể đơn dòng được tạo ra chống lại arabinoxylan của hạt ngũ cốc.
Cacbohydrat polyme. 57, 425-433.

Ordaz-Ortiz, JJ, Devaux, MF và Saulnier, L. 2005. Phân loại các giống lúa mì dựa trên các đặc
điểm cấu trúc của arabinoxylan được tiết lộ khi xử lý bột và hạt bằng endoxylanase. J. Nông
nghiệp. Hóa chất thực phẩm 53, 8349-8356.

Palframan, R., Gibson, GR và Rastall, RA 2003. Sở thích carbohydrate của các loài
Bifidobacterium được phân lập từ ruột người. Curr. là. ruột. vi sinh vật. 4, 71- 75.

Pascal, G. 2008. Prebiotics và an toàn thực phẩm.Trong: Sổ tay Prebiotics.Gibson, GR và

Roberfroid, MB (Eds.), CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, USA, trang 449-470.

Pell, G., Taylor, EJ, Gloster ,TM, Turkenburg, JP, Fontes, CMGA, Ferreira, LMA, Nagy, T.,
Clark, SJ, Davies, GJ và Gilbert, HJ 2004. Các cơ chế theo đó họ 10 glycoside hydrolase
liên kết các chất nền được trang trí. J. Sinh học. hóa học. 279, 9597-9605.

Pitkänen, L., Tuomainen, P., Virkki, L., Aseyev, V. và Tenkanen, M. 2008. So sánh cấu trúc của
arabinoxylan từ hai phân số dòng lúa mạch. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 56,
5069-5077.

Pitkänen, L., Virkki, L., Tenkanen, M. và Tuomainen, P. 2009. Nghiên cứu HPSEC đa đầu dò
toàn diện về các đặc tính dung dịch của arabinoxylan ngũ cốc trong dung dịch nước và dung
dịch DMSO. Biomacromolecules 10, 1962-1969.

Poutanen, K., Sundberg, M., Korte, H. và Puls, J. 1990. Khử acetyl của xylan bằng acetyl esterase
củaTrichoderma reesei. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 33, 506-510.

Puchart, V. và Biely P. 2008. Sản xuất đồng thời endo---1,4-xylanase và xylooligosaccharide

phân nhánh bằng cáchThermomyces lanuginosus. J. Công nghệ sinh học. 137, 34-43.

Puls, J., Schmidt, O. và Granzow, C. 1987. --Glucuronidase trong hai hệ thống phân giải xylan của vi sinh
vật. Enzym vi sinh vật công nghệ. 9, 83-88.

Puls, J. 1993. Phân tích chất nền của rừng và chất thải nông nghiệp.Trong: Chuyển đổi sinh
học của rừng và tàn dư thực vật nông nghiệp.Saddler, JN (Eds.), CAB International,
Wallingford, UK, trang 13-32.
 107

Puls, J., Schroeder, N., Stein, A., Janzon, R. và Saake, B. 2006. Xylan từ bột yến mạch và bột giấy
kraft bạch dương. Macromol. Triệu chứng 232, 85-92.

Puls, J. và Schuseil, J. 1993. Hóa học của hemicellulose: mối quan hệ giữa cấu trúc
hemicellulose và các enzym cần thiết cho quá trình thủy phân. TRONG:Hemicellulose
và hemicellulase. Coughlan, MP và Hazlewood, GP (Eds.), Portland Press, London, UK
trang 1-28.

Ramirez, F., Puls, J., Zúñiga, V. và Saake, B. 2008. Sự hấp thụ của lõi ngô và yến mạch đánh vần
arabinoxylan lên bột giấy kraft gỗ mềm. Holzforschung 62, 329-339.

Roberts, EJ, Wade, CP và Rowland, SP 1971. Ảnh hưởng của nồng độ bazơ đến khả năng phản ứng
của các nhóm hydroxyl trong methyl d-glucopyranoside. Cacbohydrat độ phân giải 17, 393-399.

Roubroeks, JP, Andersson, R. and Åman, P. 2000. Đặc điểm cấu trúc của (1-3),(1-4)-
- - Các phần D-glucan và arabinoxylan được phân lập từ cám lúa mạch đen. Cacbohydrat polyme. 42, 3-
11.

Roy, D. và Ward, P. 1990. Đánh giá các phương pháp nhanh chóng để phân biệt các loài
Bifidobacterium. J. Ứng dụng. vi khuẩn. 69, 739-749.

Roy, D. và Sirois, S. 2000. Phân biệt phân tử của các loài Bifidobacterium với phân
tích giới hạn DNA ribosome khuếch đại và sắp xếp các vùng ngắn của gen ldh. Vi
sinh vật FEMS. Hãy để. 191, 17-24.

Salminen, S., Bouley, CH, Boutro-Ruault, MC, Cummings, JH, Franck, A., Gibson, GR,
Isolauri, E., Moreau, MC, Roberfroid, MB và Rowland, I. 1998. Khoa học thực phẩm chức
năng và sinh lý và chức năng đường tiêu hóa. anh J. Nutr. 80, S147-S171.

Saulnier, L., Marot, C., Chanliaud, E. và Thibault, J. 1995a. Tương tác polysacarit thành tế bào
trong cám ngô. Cacbohydrat polyme. 26, 279-287.

Saulnier, L., Vigoroux, J. và Thibault, J.-F. 1995b. Phân lập và mô tả đặc tính một phần của
oligosacarit ferulo hóa từ cám ngô. Cacbohydrat độ phân giải 272, 241-253.

Scharlau, D., Borowicki, A., Habermann, N., Hofmann, T., Klenow, S., Miene, C., Munjal, U., Stein, K. và
Glei, M. 2009. Cơ chế của ung thư nguyên phát ngăn ngừa bằng butyrate và các sản phẩm khác được
hình thành trong quá trình lên men chất xơ qua trung gian hệ thực vật đường ruột. đột biến. Res./Rev.
đột biến. độ phân giải 682, 39-53.

Schell, MA, Karmirantzou, M., Snel, B., Vilanova, D., Berger, B., Pessi, G., Zwahlen, M.,
Desiere, F., Bork, P., Delley, M., Pridmore , RD và Arigoni, F. 2002. Trình tự bộ gen của
Bifidobacterium longumphản ánh sự thích nghi của nó với đường tiêu hóa của con người.
Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 99, 14422-14427.

Scheppach, W., Bartram HP và Richter F. 1995. Vai trò của axit béo chuỗi ngắn trong việc
ngăn ngừa ung thư đại trực tràng. Ơ. J. Ung thư 31, 1077-1080.

Scheppach, W., Luehrs, H. và Menzel, T. 2001. Những ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe của
việc tiêu thụ carbohydrate ít tiêu hóa. anh J. Nutr. 85, S23-S30.
 108

Schooneveld-Bergmans, MEF, Beldman, G. và Voragen, AGJ 1999. Đặc điểm cấu trúc của
(glucurono)arabinoxylan được chiết xuất từ cám lúa mì bằng bari hydroxit. J. Khoa học
ngũ cốc. 29, 63-75.

Shibuya, N., Misaki, A. và Iwasaki, T. 1983. Cấu trúc của arabinoxylan và

arabinoglucuronoxylan được phân lập từ thành tế bào nội nhũ lúa. nông nghiệp. sinh học.
hóa học. 47, 2223-2230.

Shibuya, N. và Misaki, A. 1978. Cấu trúc của hemiaellulose được phân lập từ thành tế bào nội nhũ
lúa: Phương thức liên kết và trình tự trong xyloglucan, --glucan và arabinoxylan. nông nghiệp.
sinh học. hóa học. 42, 2267-2274.

Shibuya, N., Nakane, R., Yasui, A., Tanaka, K. và Iwasaki, T. 1985. Nghiên cứu so sánh về việc
chuẩn bị thành tế bào từ cám gạo, mầm và nội nhũ. Ngũ cốc Chem. 62, 252-258.

Shiiba, K., Yamada, H., Hara, H., Okada, K. và Nagao, S. 1993. Tinh chế và mô tả đặc
tính của hai arabinoxylan từ cám lúa mì. Ngũ cốc Chem. 70, 209-214.

Shin, H., Lee, J., Lee, J., Han, Y., Han,, MJ và Kim, D. 2003a. thanh lọc và
đặc tính của ginsenoside Ra-thủy phân --D-xylosidase từBifidobacterium breveK-110, một loại vi
khuẩn kỵ khí đường ruột của con người. sinh học. dược phẩm. Bò đực. 26, 1170-1173.

Shin, H., Park, S., Sung, JH và Kim, D. 2003b. Thanh lọc và đặc tính của --L-
arabinopyranosidase và --L-arabinofuranosidase từBifidobacterium breveK-110, một loại vi khuẩn
kỵ khí đường ruột của con người chuyển hóa ginsenoside Rb2 và Rc. ứng dụng môi trường. vi sinh
vật. 69, 7116-7123.

Sjöström, E. 1981.Hóa chất gỗ. Cơ bản và ứng dụng.Nhà xuất bản Học thuật, Inc.,
New York,

Smith, MM và Hartley, RD 1983. Sự xuất hiện và bản chất của sự thay thế axit ferulic của
polysacarit thành tế bào ở thực vật có hạt. Cacbohydrat độ phân giải 118, 65-80.

Snyder, LR 1972. Phương pháp tiếp cận nhanh để lựa chọn các điều kiện thí nghiệm tốt nhất cho
sắc ký lỏng tốc độ cao. 1. Ước tính độ phân giải mẫu ban đầu và độ phân giải cuối cùng theo yêu
cầu của một vấn đề nhất định.J. Sắc ký đồ. Khoa học.10, 200-212.

Sørensen, HR, Jørgensen, CT, Hansen, CH, Jørgensen, CI, Pedersen, S. và Meyer, AS 2006. Một tiểu
thuyết GH43 -L- arabinofuranosidase từmiếng lót Humicola: phương thức hoạt động và sức mạnh
tổng hợp với GH51 -L- arabinofuranosidase trên lúa mì arabinoxylan, Appl. vi sinh vật. công nghệ
sinh học. 73, 850-861.

Sternemalm, E., Höije, A. và Gatenholm, P. 2008. Ảnh hưởng của sự thay thế arabinose đến tính
chất vật liệu của màng arabinoxylan. Cacbohydrat độ phân giải 343, 753-757.

Sun, R., Lawther, JM và Banks, WB 1996. Đặc điểm cấu trúc và phân số của
hemiaellulose rơm lúa mì. Cacbohydrat polyme. 29, 325-331.
 109

Sun, H., Yoshida, S., Park, N. và Kusakabe, I. 2002. Chuẩn bị (1-4)--- xylooligosaccharides
từ quá trình thủy phân bằng axit của xylan hạt bông: tính phù hợp của xylan hạt bông
làm nguyên liệu ban đầu để điều chế (1-4)---xylooligosacarit. Cacbohydrat độ phân giải
337, 657-661.

Sundberg, A., Sundberg. K., Lilandt. C. và Holmbom. B. 1996. Xác định hemiaellulose và
pectin trong sợi gỗ và bột giấy bằng phương pháp metanol axit và sắc ký khí. Bắc Âu.
bột giấy. độ phân giải J. 11, 216-219, 226.

Suwa, Y., Koga, K., Fujikawa, S., Okazaki, M., Irie, T. và Nakada, T. 1999
Bifidobacterium bifidumthúc đẩy tăng sinh có chứa xylooligosaccharide, US Patent
5939309.

Swennen, K., Courtin, CM, Lindemans, GC và Delcour, JA 2006. Sản xuất quy mô lớn và
đặc tính của arabinoxylooligosacarit cám lúa mì. J. Khoa học. Thực phẩm nông nghiệp.
86, 1722-1731.

Tenkanen, M. 2004. Cắt hemicellulose bằng enzym. Triệu chứng ACS Ser. 864, 292- 311.

Tenkanen, M., Luoteri, E. và Teleman, A. 1996. Ảnh hưởng của các nhóm bên đối với hành động của
- - xylosidaza từTrichoderma reeseichống lại xylo-oligosacarit thay thế. Thư tháng 2.
399, 303-306.

Tenkanen, M. và Siika-aho, M. 2000. Một --glucuronidase củaxã Schizophyllum tác dụng lên cao
phân tử xylan. J. Công nghệ sinh học. 78, 149-161.

Tenkanen, M., Bürgermeister, M., Vršanská, M., Biely, P., Saloheimo, M. và Siika-aho, M. 2003. Một
xylanase mới XYN IV từTrichoderma reeseivà hành động của nó trên các xylan khác nhau.Trong:
Những tiến bộ gần đây về enzyme trong chế biến ngũ cốc.Courtin, C., Veraverbeke, W. và Delcour,
J. (Eds.). ACCO, Leuven, Bỉ, trang 41-46.

Thayer, JR, Rohrer, JS, Avdalovic, N. và Gearing, RP 1998. Những cải tiến đối với quá trình khử
muối trong dây chuyền của oligosacarit được phân tách bằng sắc ký trao đổi anion pH cao với
phát hiện ampe kế xung. hậu môn. hóa sinh. 256, 207-216.

Trogh, I., Croes, E., Courtin, CM và Delcour, JA 2005. Khả năng phân hủy bằng enzym của các phân đoạn
arabinoxylan hòa tan trong kiềm của bột lúa mạch không vỏ bởi các endoxylanase. J. Nông nghiệp. Hóa chất
thực phẩm 53, 7243-7250.

Van Craeyveld, V., Swennen, K., Dornez, E., Van de Wiele, T., Marzorati, M., Vestraete,
W., Delaedt, Y., Onagbesan, O., Decuypere, E., Buyse, J., De Ketelaere, B., Broekaert,
WF, Delcour, JA và Courtin, CM 2008. Các arabinoxylooligosacarit có nguồn gốc từ lúa mì
khác nhau về cấu trúc có các đặc tính lên men và tiền sinh học khác nhau ở chuột. J. Nutr.
138, 2348-2355.

Van Craeyveld, V., Holopainen, U., Selinheimo, E., Poutanen, K., Delcour, JA và Courtin, CM 2009.
Xay xát khô cám lúa mì và lúa mạch đen rộng rãi dẫn đến sản xuất tại chỗ các oligosacarit
arabinoxylan thông qua quá trình phân mảnh kích thước nano . J. Nông nghiệp. Hóa chất thực
phẩm 57, 8467-8473.
 110

Van den Broek, LAM, Lloyd, RM, Beldman, G., Verdoes, JC, McCleary, BV và Voragen, AGJ
2005. Nhân bản vô tính và mô tả đặc điểm của arabinoxylan arabinofuranohydrolase-
D3 (AXHd3) từBifidobacterium vị thành niênDSM20083. ứng dụng vi sinh vật. công
nghệ sinh học. 67, 641-647.

Van den Broek, LAM, Hinz, SWA, Beldman, G., Vincken, J.-P. và Voragen, AGJ 2008.Bifidobacterium
carbohydrase-vai trò của chúng trong việc phân hủy và tổng hợp prebiotic (tiềm năng). mol. Dinh
dưỡng. Thực phẩm Res. 52, 146-163.

Van den Broek, LAM và Voragen, AGJ 2008. Bifidobacterium glycoside hydrolase và (tiềm năng)
prebiotic. đổi mới. Khoa học thực phẩm nổi lên. công nghệ. 9, 401-407.

Van Laere, KMJ, Beldman, G. và Voragen, AGJ 1997. Một arabinofuranohydrolase

mới từBifidobacterium vị thành niêncó thể loại bỏ dư lượng arabinosyl khỏi các
đơn vị xyloza thay thế kép trong arabinoxylan. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ
sinh học. 47, 231-235.

Van Laere, KMJ, Voragen, CHL, Kroef, T., Van den Broek, LAM, Beldman, G. và Voragen, AGJ
1999. Tinh chế và phương thức hoạt động của hai arabinoxylan arabinofuranohydrolases
khác nhau từBifidobacterium vị thành niênDSM 20083. Ứng dụng. vi sinh vật. công nghệ
sinh học. 51, 606-613.

Van Laere, KMJ, Hartemink, R., Bosveld, M., Schols, HA và Voragen, AGJ 2000. Sự lên men của các
polysacarit có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật và các oligosacarit tương ứng của chúng bởi vi
khuẩn đường ruột. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 48, 1644-1652.

Van Loo, J., Cummings, J., Delzenne, N., Englyst, H., Franck, A., Hopkins, M., Kok, N.,
Macfarlane, G., Newton, D., Quigley, M. , Roberfroid, M., van Vliet, T. và van den Heuvel,
E. 1999. Đặc tính thực phẩm chức năng của oligosacarit không tiêu hóa: một báo cáo
đồng thuận từ dự án ENDO (DGXII AIRII-CT94-1095). anh J. Nutr. 81, 121- 132.

Vardakou, M., Katapodis, P., Samiotaki, M., Kekos, D., Panayotou, G. và Christakopoulos, P. 2003.
Phương thức hoạt động của họ 10 và 11 endoxylanase trên arabinoxylan không thể chiết xuất
được trong nước. quốc tế J. Sinh học. Macromol. 33, 129-134.

Vardakou, M., Palop CN, Gasson, M., Narbad, A. và Christakopoulos, P. 2007.Trong ống nghiệm quá trình
lên men liên tục ba giai đoạn của các phần arabinoxylan lúa mì và kích hoạt hoạt động hydrolase của hệ
vi sinh vật đường ruột. quốc tế J. Sinh học. Macromol. 41, 584-589.

Vardakou, M., Palop, CN, Christakopoulos, P., Faulds, CB, Gasson, MA và Narbad, A. 2008. Đánh
giá các đặc tính tiền sinh học của các phần arabinoxylan lúa mì và cảm ứng hoạt động hydrolase
trong hệ vi sinh đường ruột. quốc tế J. Vi sinh vật thực phẩm. 123, 166-170.

Vázquez, MJ, Alonso, JL, Domínguez, H. và Parajó, JC 2000. Xylooligosacarit. Sản xuất và ứng
dụng. Xu hướng khoa học thực phẩm. công nghệ. 11, 387-393.

Verwimp, T., Van Craeyveld, V., Courtin, CM và Delcour, JA 2007. Sự thay đổi trong cấu trúc của các arabinoxylan
có thể chiết xuất bằng kiềm từ bột lúa mạch đen. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 55, 1985- 1992.
 111

Viëtor, RJ, Angelino, SAGF và Voragen, AGJ 1992. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan từ vật
liệu vách tế bào lúa mạch và mạch nha. J. Khoa học ngũ cốc. 15, 213-222.

Viëtor, RJ, Hoffmann, RA, Angelino, S., AGF, Voragen, AGJ, Kamerling, JP và Vliegenthart, JFG
1994. Cấu trúc của các oligome nhỏ được giải phóng khỏi arabinoxylan lúa mạch bởi
endoxylanase từnấm mốc Aspergillus. Cacbohydrat độ phân giải 254, 245-255.

Vinkx, CJA, Delcour, JA, Verbruggen, MA và Gruppen, H. 1995. Các arabinoxylan hòa tan trong nước của lúa
mạch đen cũng khác nhau về hàm lượng xyloza 2 chất thay thế đơn của chúng. Ngũ cốc Chem. 72, 227- 228.

Virkki, L., Johansson, L., Ylinen, M., Maunu, S. và Ekholm, P. 2005. Đặc tính cấu trúc của các
polysacarit không tinh bột không tan trong nước của yến mạch và lúa mạch. Cacbohydrat
polyme. 59, 357-366.

Virkki, L., Maina, HN, Johansson, L. và Tenkanen, M. 2008. Phương pháp dựa trên enzyme mới để
phân tích arabinoxylan lúa mì hòa tan trong nước. Cacbohydrat độ phân giải 343, 521-529.

Visek, W. 1978. Điều chỉnh chế độ ăn uống và tăng trưởng tế bào bằng amoniac. Là. J. Lâm sàng. Dinh dưỡng. 31,
216S-220.

Voragen, AGJ 1998. Các khía cạnh công nghệ của carbohydrate liên quan đến thực phẩm chức năng. Xu hướng
khoa học thực phẩm. công nghệ. 9, 328-335.

Weisburg, WG, Barns, SB, Pelletier, DA và Lane, DJ 1991. Khuếch đại DNA ribosome 16S
cho nghiên cứu phát sinh loài. J. Vi khuẩn. 173, 697-703.

Wende, G. và Fry, SC 1997. 2-Ô---D-xylopyranosyl-(5-Ô-feruloyl)-L-arabinose, một thành phần

phổ biến của thành tế bào cỏ. hóa chất thực vật. 44, 1019-1030.

Westerlund, E., Andersson, R. và Åman, P. 1993. Phân lập và xác định đặc tính hóa học của --glucans và
arabinoxylans hỗn hợp liên kết hòa tan trong nước trong các phân đoạn nghiền yến mạch. Cacbohydrat
polyme. 20, 115-123.

Whistler, RL và McGilvray, DI 1955. 2-O- -D-Xylopyranosyl-L-arabinose từ

hemicellulose-B của lõi ngô1,2. Mứt. hóa học. Sóc. 77, 1884-1885.

Wilkie, KCB 1979. Hemicelluloses của cỏ và ngũ cốc. quảng cáo Cacbohydrat hóa học. hóa
sinh. 36, 215-264.

Wolin, EA, Wolin, MJ và Wolfe, RS 1963. Hình thành khí mê-tan bằng chất chiết xuất từ vi khuẩn. J.
Sinh học. hóa học. 238, 2882-2886.

Wollowski, I., Rechkemmer G. và Pool-Zobel, BL 2001. Vai trò bảo vệ của men vi sinh và prebiotic
trong ung thư ruột kết. Là. J. Lâm sàng. Dinh dưỡng. 73, 451S-455.

Wong, JMWRD, de Souza, RRD, Kendall, CWC, Emam, A. và Jenkins, DJA 2006. Sức khỏe
đại tràng: Quá trình lên men và axit béo chuỗi ngắn. J. Lâm sàng. tiêu hóa. 40, 235-243.
 112

Yuan, X., Wang, J. và Yao, H. 2005. Feruloyl oligosacarit kích thích sự phát triển của
Bifidobacterium bifidum. Kỵ khí 11, 225-229.