Professional Documents
Culture Documents
thermofisher cn-抗体片段化
thermofisher cn-抗体片段化
简介
有时,研究或利用免疫球蛋白的部分活性而不受其他分子片段的干扰,是非常有用的。可以选择性地将免
疫球蛋白分子切割成具有离散特征的片段。使用还原剂和蛋白酶消化或切割免疫球蛋白蛋白质的部分结
构,完成抗体片段化。尽管可以对所有免疫球蛋白类别进行片段化,但只有小鼠、兔和人 IgG 和 IgM 片段
化的步骤得到了很好地表征。
两组主要关注的抗体片段是(a)抗原结合片段(例如 Fab)和(b)不结合抗原的可结晶片段(例如
Fc)。可以得到几种类型的抗原结合片段,但每种都至少包含重和轻免疫球蛋白链(分别为 VH 和 VL)的
可变区,通常通过二硫键结合在一起以保留抗体结合位点。Fc 片段由免疫球蛋白的重链恒定区(Fc 区)
组成,并介导细胞效应功能。
抗体片段化有点费力,需要优化酶介导的蛋白质消化,并且需要充足的抗体(例如 10 mg)来有效实现。
因此,通常仅在可大量获得目标抗体且特定应用需要时才进行片段化。
市场上很少有现成的一抗(1°Ab),因为任何特定产品的需求都有限。因此,除了定制抗体生产
外,每个实验室可根据特定需求执行片段化操作。
1/8
抗体 IgG 结构和裂解位点的片段化。常用的抗体片段可通过还原铰链区二硫化物或通过木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或无花果蛋
白酶消化来制备,包括半 IgG、Fab、F(ab')2 和 Fc。
了解更多
免疫球蛋白介绍
免疫球蛋白结构和分类
抗体片段的优点
抗体片段是整个抗体分子中的小型功能元件,与完整抗体相比,抗体片段在某些免疫化学实验技术和应用
中具有多种优势:
了解更多
技术要点 59:二抗:片段特异性指南
如何挑选二抗
2/8
抗体片段的类型
F(ab')2、Fab、Fab’ 和 Fv 是可以从 IgG 和 IgM 的可变区产生的抗原结合片段。这些抗原结合片段的分
子量(MW)、化合价和 Fc 含量不同。Fc 片段完全由免疫球蛋白的重链恒定区产生。这些片段和其他一
些独特片段结构可以从五聚体 IgM 产生,包括“IgG”型片段、反向“IgG”型片段和五聚体 Fc 片段。
F(ab')2 片段
Fab’ 片段
Fab 片段
Fv 片段
"rIgG"片段
Fc 片段
3/8
IgG—制备 Fab、F(ab')2 和 Fc 片段
免疫球蛋白单体(IgG)的铰链区非常容易受酶蛋白水解的影响。该位点的切割产生 F(ab')2 或 Fab 片
段以及 Fc 片段。Fc 片段根据所使用的酶和条件可保持完整或进一步降解。以下讨论了使用三种不同酶进
行的蛋白水解 IgG 片段化。一般来说,蛋白水解是使用游离酶在溶液中完成的。我们开发了固定化酶产
品,可以更好地控制消化并有效分离蛋白酶中的反应产物。因此,下图是指酶“树脂”。大多数操作步骤还包
括蛋白 A 树脂抗体纯化步骤,用于分离 Fab 和 Fc 片段。
木瓜蛋白酶消化:Fab 源于 IgG 抗体
木瓜蛋白酶是一种非特异性巯基内肽酶,活性位点上含有巯基,必须在还原形式下才具有活性。当在还原
剂存在的情况下将 IgG 分子与木瓜蛋白酶一起孵育时,铰链区的一个或多个肽键断裂,产生三个大小相似
的片段:两个 Fab 片段和一个 Fc 片段(1)。当 Fc 片段为目标片段时,应选择木瓜蛋白酶,因为它可产
生完整的 50,000 道尔顿 Fc 片段。
通过木瓜蛋白酶消化和片段化制备抗体 Fab。
木瓜蛋白酶
硫醇型蛋白酶
MW 23,000
等电点 pI = 1.5
最佳 pH = 6.5(4-9.5)
A280,1% = 25
固定化还增加了酶的稳定性,尤其是抵抗热变性和抵抗自溶的稳定性,使活性维持时间更长。木瓜蛋白酶
树脂可再生和重新利用,降低了成本。可以通过消化时间或穿过色谱柱的流速调节裂解,得到可重现的消
4/8
化物。我们的 Pierce Fab 制备试剂盒已针对消化人 IgG进行了优化。该试剂盒还可成功用于小鼠和兔 IgG
的消化,提供了有关如何更改方案用于其他种类 IgG 的建议。该步骤要求 IgG 能与蛋白 A 结合,因为它将
用于从 Fab 片段中分离 Fc。
胃蛋白酶消化:F(ab')2 源于 IgG
通过胃蛋白酶消化和裂解制备抗体 F(ab')2。
胃蛋白酶
酸性蛋白酶
MW 35,000
等电点 pI = 11
最佳 pH = 1(1-5)
A280,1% = 14.7
固定化的胃蛋白酶(胃蛋白酶琼脂糖树脂)可以在任何分析应用中代替游离胃蛋白酶。胃蛋白酶树脂允许
通过快速去除样品中的酶来停止反应而实现消化控制。消除了开发离子交换方法来分离片段与蛋白酶的必
要。同样,固定化增加了胃蛋白酶抗热变性和自溶的稳定性,使活性维持的时间更长。我们的 Pierce F
(ab')2 制备试剂盒已针对人 IgG 消化进行了优化。该试剂盒还可成功用于兔和小鼠 IgG 消化。
无花果蛋白酶消化:小鼠 IgG1 片段
5/8
通过无花果蛋白酶消化和裂解制备小鼠 IgG1 Fab 和 F(ab')2。
无花果蛋白酶
硫醇型蛋白酶
MW 26,000
等电点 pI = 1.5
最佳 pH = 6.5(4-9.5)
A280,1% = 21
固定化的无花果蛋白酶(无花果蛋白酶琼脂糖树脂)比游离的无花果蛋白酶能够更好地控制消化反应,因
为它可产生不含自消化产物的抗体片段。此外,无花果蛋白酶树脂允许从抗体片段产物中完全、快速地去
除无花果蛋白酶。我们的 Pierce IgG1 Fab 和 F(ab')2 制备试剂盒开发用于从完整鼠 IgG1 抗体中温和生
产和纯化 Fab 或 F(ab')2 片段。得到的片段类型受消化过程中所用半胱氨酸激活剂特定浓度的控制。
IgM 片段化
IgM 的尺寸较大,为体外实验分析带来挑战。例如,完整 IgM 不能有效穿透组织进行免疫组织化学研究。
因此,有必要为这类分析制备较小的活性片段。此外,由于 IgM 分子难以渗透细胞膜,因此对于体内研究
来说不甚理想。与完整 IgM 相比,清除碎片的速度更快。
6/8
IgM 抗体片段的制备方法。
可以根据还原时间和/或温度,使用 2-巯基乙胺·HCl(2-MEA)控制还原反应,获得不同比例的“IgG”型和/
或还原 IgG(“rIgG”)(10)。部分还原小鼠 IgM 也可产生反向“IgG”型片段。
胰蛋白酶
丝氨酸蛋白酶
MW 24,000
等电点 pI = 1.5
最佳 pH = 8
A280,1% = 14.3
7/8
参考文献
1. Coulter, A. and Harris, R. (1983).J. Immunol.Meth.59, 199–203.
2. Goding, J. (1983).Monoclonal Antibodies: Principles and Practice.Academic Press Inc., London,
U.K.
3. Mariani, M., et al.(1991).Mol.Immunol.28, 69-77.
4. Sykaluk, L. (1992).Pierce Chemical Company, unpublished results.
5. Buguslawski, S.J., et al.(1989).J. Immunol.Meth.120, 51-56.
6. Milenic, D.E., et al.(1989).J. Immunol.Meth.120, 71-83.
7. Milstein, C.P., et al.(1975).Biochem.J. 151, 615–624.
8. Beale, D. and Van Dort, T. (1982).Comp.Biochem.Physiol.71B(3), 475–482.
9. Plaut, A.G. and Tomasi, Jr., T.B.(1970).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 65(2), 318–322.
10. Bevan, M.J., et al.(1972).Progr.Biophys.Molec.Biol.25, 131.
仅供科研使用,不可用于诊断目的。
8/8