Huyết học

1. Thành phần tế bào máu:

Huyết tương: vận chuyển chất dd, hormon, protein. Là chất lỏng màu vàng,
chiếm 55% V máu trong cơ thể.
Hồng cầu/HGB: mang oxy đến tb và loại bỏ CO 2, chiếm khoảng 40 – 45% V
máu. đường kính khoảng 7 - 8 μm, chỗ dày nhất khoảng 2,5 μm và không quá 1
μm ở trung tâm.
Bạch cầu: là 1 phần của hệ miễn dịch, chống lại vk và virus. Có tất cả 5 loại
BC chính nhưng chỉ chiếm 1% V máu trong cơ thể.

Tiểu cầu: hình thành cục máu đông, chống mất máu. Chiếm chưa tới 1% V
máu. Đường kính khoảng 1 μm – 4 μm.
2. Nguyên lý đếm tb máu:
2.1. Thủ công đếm bằng kính hiển vi
Máu toàn phần của thiết bị được pha loãng và được đưa tới buồng đếm của
máy đếm tế bào.
6
N ∗ DF ∗10
Số lượng tế bào / lít =
A∗ D

106: Hệ số chuyển đổi cho số tế bào / lít

A: Vùng đếm
N: Số tế bào đếm được
DF: Hệ số pha loãng
D: Độ sâu của buồng đếm
2.2. Trở kháng điện (duy trì dòng điện không đổi): đo RBC, WBC, PLT
Nguyên lý: Mẫu máu pha loãng được đưa vào buồng đếm. Trong buồng đếm
có đặt một khe đếm có lỗ đủ nhỏ đủ cho tế bào máu đi qua. Đặt hai bản điện
cực giữa hai bên của khe đếm và buồng đếm, khi tế bào đi qua khe đếm sẽ làm
thay đổi trở kháng của dòng điện một chiều, sau đó làm xuất hiện xung điện.
(Mỗi xung điện biểu thị 1 tế bào đi qua khe đo, tùy kích thước tb mà xung nhận
đc cao hay thấp ⟶ biết đc kích thước tb)
Nguyên nhân đếm sai: tb không đi qua tâm khe đếm. Sau khi đếm tb quay lại
gần khe đếm. Nhiều tb đi qua khe đếm cùng lúc.
Công nghệ DynaHelix Flow: giúp sắp xếp các tế bào WBC, RBC và PLT để
làm tăng độ chính xác khi đếm bằng cách sử dụng thêm dòng dung dịch Sheath
Rinse (dòng di chuyển theo hình xoắn ốc). => Cấu trúc hình học đặc biệt của
buồng đếm và tốc độ chảy cao của dòng dung dịch Sheath Rinse ép dòng tế bào
dịch chuyển theo thứ tự từng tế bào một⟶ ngăn nguy cơ tế bào quay lại.
Công nghệ DynaScatter Laser phân tích và phân biệt bạch cầu ở trạng thái gần
như nguyên bản. Máy dò tán xạ 3 góc cải tiến cung cấp khả năng phát hiện
bạch cầu tốt hơn bằng phép đo tán xạ ánh sáng chính xác thông qua sự khác
nhau về cấu trúc các loại bạch cầu:
 FSS – Forward small angle scattered light (góc tán xạ nhỏ ở phía
trước): thu thông tin về kích thước của WBC
 FLS – Forward large angle scattered light (góc tán xạ lớn ở phía
trước): thể hiện thông tin về cấu trúc tb và độ phức tạp của nhân
 SDS – Side angle scattered light (góc tán xạ bên): thu thông tin về
hình dạng và cấu trúc các hạt trong bào tương
3 thông số này đc vẽ trong ma trận 3 chiều ⟶ tách cụm tốt hơn so với các pp
2 chiều thông thường.
2.3. Quang học (cường độ phát sáng không đổi): đo HGB
Nguyên lý: Máu được hút và pha loãng trong buồng đo WBC, sau đó được ly
giải bởi hóa chất Hemolynac 310. Đèn LED chiếu ánh sáng đơn sắc có bước
sóng 540nm xuyên qua mẫu đã ly giải. Một phần ánh sáng truyền qua sẽ được
hấp thụ bởi mẫu, phần còn lại được truyền đến cảm biến (HBG Amp).
2.4. Tán xạ laser: chia bạch cầu làm 2 loại
Bắt màu Không bắt màu
Netrophin Lymphocyte
Eosinopphin ⟶ bắt màu mạnh Basophin ⟶ kích thước lớn hơn
Monocyte ⟶ kích thước lớn
Nguyên lý: Mẫu máu được pha loãng và thêm dung dịch ly giải hồng cầu
Hemolynac 510. Lần lượt từng tế bào có nhân trong mẫu đi qua flowcell, các tế
bào sẽ được chiếu xạ bằng tia laser. Dựa trên sự tán xạ ánh sáng (được phát
hiện bởi các cảm biến quang) khi cho chùm tia sáng chiếu qua tế bào máu,
người ta phân biệt được 5 loại thành phần bạch cầu. (Các tb có KT lớn nhỏ
khác nhau sẽ cho ra tán xạ khác nhau, từ đó chuyển tín hiệu thành biểu đồ để
thấy sự phức tạp của nhân).
MÁY XÉT NGHIỆM CÔNG THỨC MÁU TỰ ĐỘNG
Nội dung: Lịch sử phát triển, nguyên lý đo, các sai sót do phương pháp đo của
từng máy, kết quả bị ảnh hưởng do mẫu máu và cách khắc phục.....
Xét nghiệm Công thức máu (Complete Blood Count = CBC) hay còn gọi là
Huyết đồ là một trong những xét nghiệm định lượng xuất hiện đầu tiên trong số
các xét nghiệm định lượng và hiện nay xét nghiệm công thức máu được sử
dụng khá phổ biến trong lâm sàng.
Ban đầu người ta đếm bằng cách cho mẫu máu cần xét nghiệm vào một buồng
đếm rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học. Các kỹ thuật sau này có liên
quan đến phương pháp dòng chảy đếm số lượng tế bào máu một cách tự động
dựa trên phương pháp điện trở kháng hoặc tán xạ ánh sáng/ kỹ thuật huỳnh
quang khi cho từng tế bào một đi qua khe đếm.
Xét nghiệm công thức máu lần đầu tiên được thực hiện bởi ông Karl Vierordt –
một nhà sinh lý học người Đức tại Đại học Tu¨ bingen, nghiên cứu được công
bố vào năm 1852. Ông lấy máu bệnh nhân cho vào ống mao quản sau đó ông
trải một thể tích máu đã biết trên một lame kính và đếm dưới kính hiển vi
quang học.
Những năm sau đó phương pháp này được cải tiến lên bằng một số phương
pháp như sử dụng ống mao quản hình e-lip hoặc khắc mạng lưới các ô vuông
lên buồng đếm để đếm các tế bào dễ dàng hơn. Những cải tiến này làm cho
việc đếm số lượng chính xác hơn nhưng chậm, mất nhiều thời gian.
Các máy xét nghiệm công thức máu tự động hiện nay chủ yếu dựa trên 2
phương pháp điện và phương pháp đo quang:
1. Phương pháp đo quang:
1.1 Lịch sử:
Vào cuối những năm 1940, ông Wallace Coulter đã nghiên cứu một phương
pháp đánh giá các hạt trong nước sơn. Những trải nghiệm trong hải quân và
việc chứng kiến hậu quả sau vụ nổ bom nguyên tử vào cuối chiến tranh thế giới
thứ 2 đã thúc đẩy ông tìm kiếm cách thức để ứng dụng kỹ thuật của mình vào
việc đếm tế bào máu. Trong một phát minh được gọi là hiệu ứng Coulter, ông
đã chế tạo được một dụng cụ phân tích tế bào máu đơn giản có thể đếm số
lượng tế bào máu một cách nhanh chóng. Hiệu ứng Coulter dựa trên nguyên lý
các tế bào máu là chất dẫn điện kém so với với dung dịch muối và khi cho các
tế bào máu riêng lẻ đi qua một lỗ nhỏ cùng lúc với dòng điện làm giảm cường
độ dòng điện, khi càng nhiều tế bào đi qua thì điện trở xuất hiện càng lớn do
các hạt có tính chất cản trở điện. Độ lớn của xung điện tỉ lệ với thể tích của tế
bào, số lượng xung điện tương ứng với số lượng tế bào. Đây chính là nền tảng
để đếm và phân loại tế bào dựa trên kích thước. Khái niệm đơn giản này đã làm
nền tảng cho sự phát triển của các thế hệ máy phân tích huyêt học tự động hiện
đại sau này.
Sau phát minh của ông Coulter vào năm 1953, sau này có nhiều sự cải tiến hơn,
phổ biến là đếm tế bào dòng chảy bằng cách cho tế bào chảy trực tiếp qua kênh
đếm (flow cell) hoặc buồng đếm (chamber) thay vì đi qua một khe hở
(aperture) như trước.
Năm 1965, ông Fulwyler sử dụng phương pháp đếm của ông Coulter để đo thể
tích tế bào. Phương pháp của ông Fulwyler và phương pháp dựa trên huỳnh
quang của ông Julius và cộng sự là nền tảng quan trọng cho kỹ thuật phân loại
tế bào tự động sau này.
1.2 Nguyên lý:
Nguyên lý tập trung thủy động lực học (Hydrodynamic focusing)
+Hỗn dịch pha loãng tế bào được chuyển từ buồng trộn tới buồng đếm
+Hỗn dịch được bơm vào dòng dung dịch Sheath đang chảy nhanh
+Hai dòng dịch này chảy với tốc độ khác nhau và không bị lẫn vào nhau
+Cấu trúc đặc biệt của buồng đếm + Tốc độ chảy cao của dòng dung dịch
Sheath ép dòng tế bào dịch chuyển theo thứ tự từng tế bào
• Ánh sáng tán xạ gồm ánh sáng tán xạ thẳng- forward scatter (FSC) và ánh
sáng tán xạ bên - side scatter (SSC).
• FSC bao gồm các ánh sáng bị nhiễu xạ,dùng để phân biệt về kích thước hoặc
thể tích tế bào
SSC bao gồm hầu hết các ánh sáng khúc xạ và ánh xạ, được thu ở góc 90o so
với chùm tia tới laser, tỉ lệ với thành phần các hạt hoặc độ phức tạp bên trong tế
bào
Ghi nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ:
• Ánh sáng được tán xạ qua 4 góc: 0 độ, 10 độ, 90 độ và 90 độ D
• Các tín hiệu ánh sáng tán xạ được tạo ra bởi các hạt đi qua chùm tia lazer
trong một dòng dung dịch được chuyển thành tín hiệu điện và được ghi nhận
nhờ photodetector: photodiode (PDs) và photomultiplier tubes (PMTs).
Photocathode của PMT có độ nhạy cao hơn so với PD. PD có khả năng chuyển
ánh sáng thành photoelectron hiệu quả hơn. PD có khả năng phát hiện các tín
hiệu ánh sáng mạnh hơn được tạo ra bởi FSC. PMTs thường được sử dụng để
phát hiện các tín hiệu yếu hơn được tạo ra bởi SSC và ánh sáng huỳnh quang.
• Phân tích tế bào máu bằng máy đếm laser sẽ phân biệt được 5 loại bạch cầu:
Neutrophil, Lymphocyte, Monocyte, Eosinophil và Basophil
2. Phương pháp dựa trên phép đo điện:
2.1 Lịch sử
Vào cuối những năm 1940, ông Wallace Coulter đã nghiên cứu một phương
pháp đánh giá các hạt trong nước sơn. Những trải nghiệm trong hải quân và
việc chứng kiến hậu quả sau vụ nổ bom nguyên tử vào cuối chiến tranh thế giới
thứ 2 đã thúc đẩy ông tìm kiếm cách thức để ứng dụng kỹ thuật của mình vào
việc đếm tế bào máu. Trong một phát minh được gọi là hiệu ứng Coulter, ông
đã chế tạo được một dụng cụ phân tích tế bào máu đơn giản có thể đếm số
lượng tế bào máu một cách nhanh chóng. Hiệu ứng Coulter dựa trên nguyên lý
các tế bào máu là chất dẫn điện kém so với với dung dịch muối và khi cho các
tế bào máu riêng lẻ đi qua một lỗ nhỏ cùng lúc với dòng điện làm giảm cường
độ dòng điện, khi càng nhiều tế bào đi qua thì điện trở xuất hiện càng lớn do
các hạt có tính chất cản trở điện. Độ lớn của xung điện tỉ lệ với thể tích của tế
bào, số lượng xung điện tương ứng với số lượng tế bào. Đây chính là nền tảng
để đếm và phân loại tế bào dựa trên kích thước. Khái niệm đơn giản này đã làm
nền tảng cho sự phát triển của các thế hệ máy phân tích huyêt học tự động hiện
đại sau này.
Sau phát minh của ông Coulter vào năm 1953 thì có nhiều sự cải tiến hơn sau
này, phổ biến là đếm tế bào dòng chảy bằng cách cho tế bào chảy trực tiếp qua
kênh đếm (flow cell) hoặc buồng đếm (chamber) thay vì đi qua một khe hở
(aperture) như trước.
Năm 1965, ông Fulwyler sử dụng phương pháp đếm của ông Coulter để đo thể
tích tế bào. Phương pháp của ông Fulwyler và phương pháp dựa trên huỳnh
quang của ông Julius và cộng sự là nền tảng quan trọng cho kỹ thuật phân loại
tế bào tự động sau này.
2.2 Nguyên lý:
Buồng đếm gồm 2 ngăn thông nhau qua một lỗ nhỏ nằm trên phiến Aperture. Ở
mỗi ngăn có gắn điện cực, hai điện cực của hai ngăn trái dấu nhau. Giữa hai
điện cực có một điện thế ổn định. Dung môi dẫn điện là hóa chất chạy máy
Tế bào di chuyển từ ngăn trái sang ngăn phải. Tế bào không dẫn điện nên chính
nó tạo ra một điện trở. Do đó khi đi qua lỗ đếm, tế bào làm thay đổi điện thế
vốn ổn định giữa hai điện cực. Sự thay đổi đột ngột điện thế giữa hai điện cực
được máy biểu hiện dưới dạng xung điện. Tế bào có kích thước lớn tạo ra xung
điện có biên độ lớn và ngược lại, tế bào có kích thước nhỏ tạo ra xung điện có
biên độ nhỏ. Tổng số xung điện thu được là tổng số tế bào đi qua lỗ đếm. Biên
độ xung điện còn được dùng để phân loại tế bào.
Phương pháp đo trở kháng sẽ cho kết quả có 3 loại bạch cầu: Granular
(Neutrophil), Mid bao gồm những bạch cầu có kích thước trung bình
(Monocyte, Eosinophil, Basophil ) và bạch cầu Lymphocyte
Trong máu ngoại biên bạch cầu Mono có kích thước lớn nhất trog 5 loại bạch
cầu. Nhưng khi chạy máy, hóa chất sẽ làm vỡ tế bào chất của bạch cầu, chỉ có
nhân tế bào bạch cầu đi vào buồng đếm, do đó kích thước bạch cầu Neutrophil
> Mid (Monocyte, Eosinophil, Basophil ) > Lymphocyte
Trục đứng biểu thị số lượng, trục ngang biểu thị kích thước
3. Những hạn chế trong quá trình phân tích tế bào máu bằng máy đếm tự động:
Ở mỗi máy xét nghiệm công thức máu sẽ có những hạn chế riêng tùy vào
phương pháp đo. Một trong những lỗi sai phổ biến của máy là mảnh vỡ hồng
cầu, bạch cầu, hồng nhỏ bị đếm nhầm thành tiểu cầu làm tăng giả tạo số lượng
tiểu cầu; hay trong một số trường hợp tiểu cầu kết cụm bị đếm nhầm thành
bạch cầu dẫn đến số lượng tiểu cầu bị giảm mà bạch cầu lại tăng. Trong một số
trường hợp hồng cầu bệnh nhân chứa HbS, HbC thì sẽ khó bị ly giải và những
hồng cầu không bị ly giải máy sẽ đếm thành hồng cầu nhân hoặc bạch cầu,
trong trường hợp này nồng độ Hgb sẽ thấp và số lượng hồng cầu nhân, bạch
cầu sẽ tăng cao hơn.
4. Những hạn chế do mẫu máu: Kháng thể lạnh, mỡ máu cao, bilirubin cao,
máu bị tán huyết, tiểu cầu kết cụm, hồng cầu nhân…
Tài liệu tham khảo:
1.https://www.researchgate.net/.../272186770_Development...
2. Bernadette F. Rodak (2012). Hematology Clinical Principles and
Application, Fourth Edition