10/9/2023

проф. Б. Галунска
1

1. Токсичност на кислорода.
2. Активни кислородни форми. Видове.
3. Източници за образуването им в
организма.
4. Физиологична роля.
5. Концепция за оксидативния стрес

О2 е токсичен!
Токсичност на кислорода
Бирадикал (О2) – инициира образуването на
свободни радикали (СР) – О2-; Н2О2; ОН.
Силен окислител (акцептор на електрони)

Реагира със свободни радикали, образувайки

още по-активни молекули : О2 + NO → ONOO-
Кислородът образува СР и затова е токсичен!
3

1
 10/9/2023

Кислороден парадокс

Кислородът: жизнено необходим и

смъртоносна отрова

Активни Кислородни Форми

(АКФ)
Свободен радикал (СР)
Всяка частица, която съдържа 1 или повече несдвоени
електрона и може да съществува самостоятелно.
• силно реактивоспособни
• инициират верижни реакции на СРО като отнемат
електрон от биомолекулите (под формата на Н-атом)

Молекули с нерадикалова природа

Молекули със силен окислителен потенциал, които могат
да инициират образуването на други оксиданти.

Видове активни кислородни и

азотни форми
Радикали Нерадикали
Супероксиден О2 ─ Водороден H2O2
пероксид
Хидроксилен НО• Хипохлориста HOCl
кисeлина
Пероксилен RСO•2 Озон O3
Алкоксилен, алкилен R, RO• Синглетен кислород 1O
2

Хидропероксилен HO2• Пероксинитрит ONOO-

Азотен оксид NO• 6

2
 10/9/2023

Източници на АКФ

1. В човешкия организъм при окисление на

субстрати, свързано с едноелектронен пренос
2. Под действие на ендогенни фактори
3. Под влияние на екзогенни фактори

Веднъж образували се АКФ реагират помежду си и с

биомолекулите в клетките и отключват верижни
реакции на свободнорадикалово окисление.

Екзогенни източници на АКФ

Радиация
 UV лъчи, йонизираща радиация, γ лъчи
Съединения, образуващи пероксиди
 О3, 1О2
Вещества, иницииращи образуване на О2
 Хинони, нитроароматни, хербициди
Вещества, които се метаболизират до CР
 Полихлорирани алкани, полифеноли, феноли
Молекули, освобождаващи железни йони
 феритин
8

Механизми за образуване на
АКФ в клетките

АКФ се образуват нормално при

метаболизма.
Около 3-5% от кислорода се превръща в
АКФ.
Основен източник в клетките са всички
аеробни окислителни процеси на
едноелектронен пренос.
9

3
 10/9/2023

Механизми за образуване на АКФ

в клетките
1. Митохондриална дихателна верига
е- е- +2Н+ е- +Н+ е- +Н+
О 2 → О 2 → Н2О2 → НО → Н2О
→
Н2О
2. ФАД-зависими ензими
 Оксидази (Cu2+) – ксантин оксидаза,
оксидаза на ВМК, моноаминооксидаза
 Mонооксигенази (Fe3+) – цитохром Р450
 Диоксигенази (Fe3+)
3. Неензимно автоокисление на:
 ПНВМК в мембраните
 SH-групи в протеини 10

 АК, еластин, колаген

Биологично важни АКФ (1)

1. Супероксиден радикал (О2 ─)
 Образува се спонтанно в аеробни пространства
О2 + е- → О2 ─
 Ендогенни източници са
 Митохондриална дихателна верига (1-3% от О2)

 ФАД-зависими ензими

 Липоксигеназа и циклооксигеназа

 НАДФH-оксидаза (фагоцитоза)

 Източник е за получаването на други АКФ

 H2O2

 НО•
11

Биологично важни АКФ (2)

2. Хидроксилен радикал (НО•)

 Най-силният оксидант, директно атакува
всички биомолекули
 Образува се от Н2О2 с участието на О2 ─
в присъствие на йони на преходни метали (Fe,
Cu и др.) не свързани с белтък

Н2О2 + O2·•― HO· + HO- + О2

Cu+/Fe2+ Cu2+/Fe 3+
12

4
 10/9/2023

Биологично важни АКФ (3)

3. Водороден пероксид (H2O2)
2О2─ + 2Н+→ Н2О2 + О2
 Преминава през мембрани и пренася
радикаловата атака на далечни
разстояния
 Ендогенни източници
 Дихателна верига в митохондриите
 Активирани фагоцити (НAДФH-
оксидаза)
 Ксантиноксидаза, глюкозооксидаза,
 D-аминоацидоксидази 13

Биологично важни АКФ (3)

3. Водороден пероксид (H2O2)
 Ендогенни източници

Неензимна реакция на Неензимна реакция на

Хабер-Вайс Фентон

14

Биологично важни АКФ (4)

4. Азотен оксид (NO)

Ендотелни L-аргинин + O L-цитрулин + NO
2
Невронални NO-С
Макрофаги НAДФH НAДФ+
NO-С = NO-синтаза

Във високи концентрации NO е токсичен


Ковалентна модификация (нитриране) на:
 SH-групи
 Тирозин Нитротирозин
 с О2 образува ONOO (токсичен пероксинитрит)
15

5
 10/9/2023

Физиологични функции на АКФ

Физиологичните функции на АKФ се изявяват

при ниски концентрации.
1. Медиаторни функции
 В ниски концентрации NO регулира
съдовия тонус
2. Регулация на сигнални пътища
 Н2О2 регулира сигнални пътища и
експресия на специфични гени
3. При процеса фагоцитоза

16

Образуване на СР при фагоцитоза

и възпаление
Генерирането на свободни радикали е част от
антимикробната защитна система при човека
Цел: унищожаване на нахлуващи микроорганизми,
туморни клетки и други клетки, белязани за
отстраняване.

17

Образуване на СР при респираторния

взрив при фагоцитоза и възпаление

Ензими във фагозомата, продуциращи АКФ

НАДФН оксидаза – продуцира супероксиден радикал
Супероксидният радикал продуцира Н2О2
Н2О2 продуцира ОН-радикал (р-я на Фентон)
Миелопероксидаза – продуцира HOCl
Индуцируема NO-синтаза – продуцира NO-радикал
NO+O2- = пероксинитрит и други активни азот-
кислородни форми
атака върху мембраните и други компоненти на
фагоцитираните клетки и лизиране

18

6
 10/9/2023

Образуване на СР при респираторния

взрив при фагоцитоза и възпаление

19

Молекулни механизми на
радикалова токсичност

20

Във високи концентрации АКФ са силно

реактивоспoсобни и потенциално опасни:
канцерогенни, мутагенни, участват в патогенезата
на много болести.

Прицелни места за действието им са:

Липиди  Протеини  Нуклеинови

киселини

Оксидативно променени
липиди, протеини, нуклеинови киселини
21

7
 10/9/2023

Клетъчно увреждане медиирано от АКФ

Увреждане на:
 протеини
 мембрани
 митохондрии
 ДНК
 повишаване на
клетъчния
пермеабилитет
 масивен инфлукс на
калций
 набъбване на клетката
 клетъчен лизис
22

Клетъчно увреждане медиирано от АКФ

Нормална клетка Клетки увредени от АКФ

23

Оксидативно увреждане на клетъчни

протеини
 Нарушена функция
на ензими
↑ концентрации АКФ  Фрагментиране,
омрежване на
протеини
Окисление на АК
 ↑ чувствителност
към протеолитична
атака
 Отключване на
автоимунни реакции
24

8
 10/9/2023

Оксидативно увреждане на ДНК

Включва
 Модификация на базите
 Фрагментиране на ДНК
 Модификация и фрагментиране
на дезоксирибозата
Последици
 Оксидативно променените бази
водят до мутации
 Окислението на Т (тимин) блокира
репликацията
25

Оксидативно увреждане на
мембранните липиди
(липидна пероксидация)

Липидна пероксидация - “неензимен,

автокаталитичен, верижен, свободнорадикалов
процес на окисление на мембранните липиди,
който може да се инициира от всяка АКФ (СР
или нерадикал)”

26

Защо мембранните липиди са

прицелни места за действие на АКФ?
 Съдържат голямо количество ПНМК
–СН=СН-СН=СН- (арахидонова, линолова,
линоленова), които лесно се окисляват
 Съдържат често метални йони –
инициатори на свободнорадикаловия
окислителен процес
 О2 е много по-разтворим в липидната среда
на мембраните
 Активни са процеси на 1е- пренос →
образува се О2•, който е по-стабилен в
липидна среда
27

9
 10/9/2023

Последици от липидното пероксидиране

 ↓ флуидност на мембраните
 Загуба на мембранен интегритет
 Промяна в мембранния пермеабилитет →
промяна в йонните потоци
 Лизис на мембраните
 Излив на лизозомни ензими → задълбочаване
на увреждането

28

АНТИОКСИДАНТНА ЗАЩИТА
НА ОРГАНИЗМА

29

Стратегия на
антиоксидантната защита
1. Превенция - да се предотврати
образуването на АКФ и последващите
увреждания
2. Инактивиране/захващане на вече
образувани АКФ
3. Репарация (поправка) на оксидативно
увредените биомолекули (протеини,
липиди, ДНК) 30

10
 10/9/2023

Антиоксидант

ВСЯКО ВЕЩЕСТВО, СПОСОБНО В

НИСКИ КОНЦЕНТРАЦИИ СПРЯМО
ТЕЗИ НА ОКИСЛЯЕМИЯ СУБСТРАТ, ДА
ЗАБАВИ ИЛИ ПРЕКЪСНЕ НЕГОВОТО
ОКИСЛЕНИЕ

31

АКФ и антиоксиданти, които ги инактивират

АКФ Антиоксидант
Синглетен кислород витамин А
1O
2
алфа-токоферол

Супероксиден радикал супероксиддисмутаза

O2- глутатион свързани ензими
витамин C
Водороден пероксид каталаза
H2O2 глутатион свързани ензими

Липидни пероксиди алфа-токоферол

глутатион свързани ензими
LOOH
Хидроксилен радикал витамин C
OH
32

Ензимни антиоксиданти
Супероксид дисмутаза (СОД)
 3 изоформи – цитозолнa (Cu-Zn); митохондриална
(Mn), екстрацелуларна (Cu, Zn)

Биологична роля
 катализира превръщането на супероксидния радикал
(О2•-) във водороден прекис (Н2О2)
СОД
2O2·- + 2 H+  H2O2 + O2

 СОД е първият антиоксидантен ензим, появил се в

хода на еволюцията
 СОД захваща О2• и предпазва клетките от увреждане
(но... продуцира Н2О2 , който е токсичен!) 33

11
 10/9/2023

Ензимни антиоксиданти
Каталаза (КАТ)
Биологична роля

КАТ (в пероксизоми)
2 Н2О2 Н2О + О2
инактивира Н2О2 и намалява риска от
образуване на НО●
предпазва от иницииране на липидна
пероксидация

34

Ензимни антиоксиданти
Глутатион

Биологична роля
 Най-важният вътреклетъчен тиолов АО
 Инактивира H2O2, и липидни
хидропероксиди на мастни к-ни, окислен
холестерол
 Обезврежда лекарства, канцерогени,
тежки метали (Hg)

35

Ензимни антиоксиданти
Глутатион

глицин
глицин

цистеин
цистеин

γ-глутамилов
γ-глутамилов
остатък
остатък

Редуциран глутатион - GSH 36

Окислен глутатион - GSSG

12
 10/9/2023

Глутатион-свързани ензими

Антиоксидантната си активност глутатионът

осъществява с глутатион-свързани ензими:
 глутатион пероксидаза (ГП) с кофактор Se
 глутатион редуктаза (ГР) с кофактор НАДФН

37

Глутатион-свързани ензими

Н2О2 GSH
НАДФ+
(ЛООН) (редуциран
токсични глутатион)
Глутатион Глутатион
пероксидаза редуктаза
Н2О GSSG
(ЛОН) (окислен
нетоксични НАДФН
глутатион)

ЛООН – липиден хидропероксид

38
ЛОН – липиден алкохол

Неензимни екзогенни
антиоксиданти, прекъсващи СРО
Аскорбат (вит. C) α-токоферол (вит.E)

TOH + R· TO· +RH

AscH- + R· Asc·- + RH
 Основен водоразтворим АО
в кръвната плазма
 Регенерира алфа-токоферола
 Не се синтезира при човек
 Повечето растения
синтезират витамин С от
глюкоза
 Кофактор на диоксигенази и
хидроксилази (! биосинтез на
колаген!)
 Основен липоразтворим АО
в мембрани
 Вгражда се в мембраните и в
липопротеиновите к-си и
предпазва от окисление
ПНМК
 Предпазва липопротеините
(LDL) от окисление
 Прекъсва липидното
пероксидиране на
мембранните липиди
39

13
 10/9/2023

Неензимни екзогенни
антиоксиданти, прекъсващи СРО
OH

HO O
O
1. L-aскорбат (витамин С)
HO OH

40

Неензимни екзогенни
антиоксиданти, прекъсващи СРО

Функции на вит. С
 Не се синтезира при човек
 Повечето растения синтезират витамин С от
глюкоза
 Главен водоразтворим АО в кръвната
плазма
 Отдава електрони на СР
 Участва в регенерацията на алфа-
токоферола (вит. Е)
 Кофактор на диоксигенази и хидроксилази
( биосинтез на колаген!)
41

Неензимни екзогенни
антиоксиданти, прекъсващи СРО
2. Токофероли (витамин Е)
CH3
HO
CH3
H3C O
CH3 CH3 H CH3 H CH3
CH3
2R 4’R 8’R
-Toкоферол
Съдържа се в растителни масла, маргарини,
ядки, семена, зелени листни зеленчуци 42

14
 10/9/2023

Неензимни екзогенни
антиоксиданти, прекъсващи СРО

Функции на витамин Е
Главен липоразтворим АО в мембранните
структури
Прекъсва липидното пероксидиране на
мембранните липиди
Вгражда се в мембраните и в
липопротеиновите к-си и предпазва от
окисление ПНМК

43

Витамините Е и С действат
координирано като антиоксиданти
В мембраните аскорбатът и
токоферолът действат координирано.
 Витамин С редуцира и регенерира
токоферола.
 Този механизъм играе важна роля при
предпазването на LDL-липопротеините от
окисление, тъй като в тях отсъстват
ензими, които могат да регенерират
токоферола.
44

Витамините Е и С действат
координирано като антиоксиданти

НАДФH + H+
дехидроаскорбат

НАДФ+ GSH
R· RH
аскорбат аскорбилов радикал·

α-токоферол семихинон α-токоферол

RH R·
45

15
 10/9/2023

Витамините Е и С действат координирано

като антиоксиданти
H2O

OO OH
R R

R
O

1. О2 окислява
мембранни мембранните
липиди липиди
X H
2. Образуваният
X пероксиден
радикал е свързан
O2 OO към повърхността
на мембраната
вит. E
3. Редукция на
пероксидния
a b c радикал от вит. E 46

Витамините Е и С действат координирано

като антиоксиданти
H2 O - Asc
AscH FA-CoA
Px
G

OOH O OH
PhGPx
PLA 2

R R R R

R R
O O
Мембранни липиди

4. Регенериране на вит.Е
от аскорбат (Asc) вит. E
5. Поправка на
мембранните липиди от
ензима фосфолипаза А2
(PLA2)

47

d e

Неензимни екзогенни антиоксиданти,

прекъсващи СРО
Каротеноиди
Бета-каротен, зеаксантин, лутеин:
• захващат супероксидни радикали
• лутеин и зеаксантин - намаляват честотата на свързаната с
възрастта дегенерация на макулата
– в макулата на ретината - макулни каротеноиди
бета-каротен

зеаксантин

лутеин
48

16
 10/9/2023

Неензимни екзогенни антиоксиданти,

прекъсващи СРО
Флавоноиди
• инхибират ензимите, отговорни за производството на
супероксидни аниони (ксантиноксидаза)
• хелатират Fe и Cu - правят невъзможно участието на тези
метали в реакцията на Фентон
• донори на електрони за супероксидния радикал и липидните
пероксиди

49

Неензимни ендогенни антиоксиданти

Мелатонин
мелатонин:
• хормон на пинеалната жлеза
• продуцира се и от ГИТ
• открива се в храни, гъби, бактерии

50

Промени в нивата на мелатонина с

възрастта

51

17
 10/9/2023

Антиоксидантна роля на мелатонин

1. Мелатонинът
• захваща свободни радикали (кинуренов метаболитен
път на мелатонин)
• потиска възпалението и оксидативния стрес
• потиска про-оксидантни ензими (5-, 12-липоксигенази,
NO-синтаза)
• активира антиоксидантни ензими (СОД, ензими от
GSH-цикъл)
2. В митохондриите
•  липидна пероксидация
•  окисление на белтъци & ДНК
• възстановява GSH
• възстановява мембранния потенциал в присъствие
на Н2O2 52

Неензимни екзогенни
антиоксиданти, прекъсващи СРО
Пикочна киселина
Катаболитен продукт от пуриновата обмяна
Главен антиоксидант на кръвната плазма
Заедно с белтъчните тиоли представлява
основната част от капацитета на кръвната
плазма за захващане на свободни радикали
Захваща ОН-радикали

53

Концепция за оксидативния
стрес
Норма = Равновесие
АО АКФ = АО АКФ

Оксидативен стрес
АО
хиперпродукция на АКФ
АКФ

АО Оксидативен стрес
изчерпване на АО АКФ
54

Антиоксиданти (АО) Оксиданти (АКФ)

18
 10/9/2023

Оксидативен стрес
Оксидативният стрес е резултат от дисбаланс
между продукцията на АКФ и тяхното
елиминиране от клетъчните антиоксидантни
механизми, при който доминират АКФ.

Продължителният оксидативен стрес лежи в

патогенезата на много заболявания като:
възпаление, диабет, сърдечно-съдови,
невродегенеративни болести и др.

55

Оксидативен стрес
↑↑↑АКФ

окисление на ДНК, протеини, липиди

увреждане на митохондрии,
мембрани, клетки, тъкани

инсулти

инфаркт
стареене
56

диабет

Роля на свободните радикали при исхемия и

последваща реперфузия
Активиране на ензима ксантиноксидаза
ксантиноксидаза тип D
норма
ксантин+ H2O пикочна к-на НЕ се образуват СР!
НАД+ НАДH+H+

исхемия
↓ O2 приток
Nifedipin ▐ ↓ATФ
(Ca2+антагонист) ц. Ca++
Ca-протеази

ксантиноксидаза тип O
ксантин + H2O Пикочна к-на+ H+Н2О2
2O2 2O2•- H2O2 1O + HO• +HO-
▬ 2
Fe2+
реперфузия ▬
Allopurinol Тъканна увреда
57
Oxypurinol Desferoxamine
флавоноиди

19
 10/9/2023

Роля на АКФ в невроналната дегенерация при

болестта на Паркинсон
1.Допамин се разгражда от
моноаминооксидаза, която генерира
H2O2
2.О2- се продуцира в ДВ в
митохондриите – СОД го превръща
в H2O2
3. Нивата на Fe се увеличават –
протича реакцията на Фентон –
генериране на OH-
4.NO, продуциран от индуцируемата
NOS реагира със О2- - активни
азотни форми
5.Инициират се реакции на липидна
перокисидация, окисление на
протеини и дегенерация на
моторните неврони
58
6.Намалена продукция на допамин

20